CN112899174A - 一种治理污水用复合生物酶的制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种治理污水用复合生物酶的制备方法与应用。(1)配制硫酸钙缓冲液：(2)制备麦芽汁；(3)制备麦芽汁琼脂培养基；(4)制备酵母菌富集培养基；(5)将菌种活化和培养得到酵母泥；(6)材料发酵：将原糖、作物和水混合粉碎，然后密封发酵，得到发酵液A；(7)将酵母泥和发酵液A混合于发酵罐中并搅拌，发酵得到发酵液B；(8)向发酵液B中加入有机酸并搅拌均匀，得到混合液；将混合液过滤，消毒，得到复合生物酶。应用：将所制备的复合生物酶用于污水处理中。本发明的制备方法简单、安全环保没有任何毒害残留且成本低；将本发明制备的复合生物酶用于治理无水时，其水处理效果好，对生态系统安全可靠，不会造成二次污染。

Description

一种治理污水用复合生物酶的制备方法与应用
技术领域
本发明涉及生物制剂技术领域，具体涉及一种治理污水用复合生物酶的制备方法与应用。
背景技术
目前在污水治理中的主要方法是通过微生物分解污染物来达到治理污水的目的，在治理过程中经常采用投放化学药剂来提高效果和效率。这样虽然节省了时间，但同时增加了污水治理的负担，容易形成二次污染。
发明内容
本发明的目的在于提供一种简单的复合生物酶的制备方法，并将其用于治理污水中，制备过程安全环保，没有毒害残留且成本较低，不会造成二次污染。
本发明是通过如下技术方案实现的：
一种治理污水用复合生物酶的制备方法，包括如下步骤：
(1)配制硫酸钙缓冲液：将水合硫酸钙、醋酸钠和冰醋酸加入水中溶解，得到硫酸钙缓冲液；
(2)制备麦芽汁：将麦芽用水浸泡，然后研磨成汁并稀释；
(3)制备麦芽汁琼脂培养基：将琼脂加入稀释后的麦芽汁中并调节pH至酸性，高压灭菌，得到麦芽汁琼脂培养基；
(4)制备酵母菌富集培养基：将葡萄糖、尿素、硫酸铵、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、水合硫酸镁、水合硫酸铁、酵母膏以及孟加拉红加入水中并搅拌均匀，得到酵母菌富集培养基，调节pH至酸性；
(5)菌种活化和培养：将菌种加入所述酵母菌富集培养基中培养，使菌种充分活化；将活化后的菌种再置于所述麦芽汁琼脂培养基中培养，培养后离心，然后将沉淀物取出置于所述硫酸钙缓冲液中摇匀，然后再次离心，得到沉淀的酵母泥；
(6)原材料发酵：将原糖、作物和水混合粉碎，然后密封发酵，得到发酵液A；所述的作物为新鲜蔬菜、水果皮和秸秆的组合物；
(7)将所述的酵母泥和所述发酵液A混合于发酵罐中并搅拌，发酵得到发酵液B；然后向所述发酵液B中加入有机酸并搅拌均匀，得到混合液；将所述混合液过滤，消毒，得到治理污水用复合生物酶。
进一步地，步骤(1)配制硫酸钙缓冲液：将0.5-0.6g的水合硫酸钙、6.0-7.0g的醋酸钠和4.0-5.0g的冰醋酸加入水中并搅拌均匀，充分溶解，溶解后定容至1.0L，即得到硫酸钙缓冲液。
进一步地，步骤(2)制备麦芽汁：将麦芽用水浸泡18-24小时，然后研磨成汁，然后加水稀释至浓度为10-15Brix。白利度(Brix)指液体中糖的百分比浓度。
进一步地，步骤(3)制备麦芽汁琼脂培养基：将琼脂加入稀释后的麦芽汁中并加热使之充分溶解，然后用试剂调节体系pH为5-6，并在110-120℃下高压灭菌30-60分钟，即得到麦芽汁琼脂培养基；所述的琼脂占所述麦芽汁琼脂培养基2.0-5.0wt％。具体的，所述的试剂选自氢氧化钠溶液、盐酸、无菌水。优选将体系的pH调节为5.4。
进一步地，步骤(4)制备酵母菌富集培养基：所述的酵母菌富集培养基包括如下质量分数的组分：葡萄糖5-10％、尿素0.1-0.5％、硫酸铵0.1-0.3％、磷酸二氢钾0.2-0.5％、磷酸氢二钠0.05-0.1％、水合硫酸镁0.1-0.5％、水合硫酸铁0.01-0.05％、酵母膏0.05-0.1％、孟加拉红0.003-0.005％、余量为水；用试剂将所述酵母菌富集培养基调节至pH为4-5。具体的，所述的试剂选择氢氧化钠溶液、盐酸、无菌水。优选地，将所述酵母菌富集培养基调节至pH为4.5。
进一步地，步骤(5)菌种活化和培养：将啤酒酵母菌(菌种)加入所述酵母菌富集培养基中培养1.0-1.5天，使菌种充分活化；将活化后的菌种再置于所述麦芽汁琼脂培养基中在25-30℃的生化培养箱中培养4-45天，培养后在2500-3000rpm的速率下离心5-10分钟，去除离心后的上清液将沉淀物取出置于所述硫酸钙缓冲液中摇匀，然后再次以2500-3000rpm的速率离心5-10分钟，即得到沉淀的酵母泥；所述啤酒酵母菌与所述酵母菌富集培养基的质量体积比为3.0-5.0mg/ml；所述的酵母菌富集培养基与所述麦芽汁琼脂培养基的体积比为1：(2-3)；所述的啤酒酵母菌与所述硫酸钙缓冲液的质量体积比为0.5-1.0mg/ml。
进一步地，步骤(6)原材料发酵：将原糖、作物和水按质量比1：(3-5)：10的比例混合粉碎，然后加入到发酵罐中在22-25℃下密封发酵50-60天，即得到发酵液A；所述的作物由新鲜蔬菜、水果皮和秸秆按质量比1：1：1混合而成。所述的原糖是指以甘蔗、甜菜榨糖取汁，经过简单的过滤、澄清，通过沸腾浓缩、煮炼结晶、离心分蜜制成的工业用原料糖。
进一步地，步骤(7)将所述的酵母泥和所述发酵液A混合于发酵罐中并搅拌均匀，在25-28℃下发酵15-20天，得到发酵液B；向所述发酵液B中加入木醋液(有机酸)并搅拌20-24小时，得到混合液；将所述混合液依次进行离心过滤、板式过滤、膜过滤，然后进行巴氏消毒，即得到治理污水用复合生物酶；所述的酵母泥和所述发酵液A的质量比为1：(4500-5000)；所述木醋液占所述混合液10-15wt％。
一种治理污水用复合生物酶的应用，其特征在于，将上述的制备方法制得的复合生物酶用于污水治理中。
进一步地，所述的复合生物酶与所述污水的质量体积比为0.2-0.5mg/L(0.2-0.5ppm)。优选的，当所述污水的初始COD高于50时可以按照0.5mg/L的比例添加，低于50时可以按照0.2mg/L的比例进行添加。
本发明的有益效果：
本发明的复合生物酶的制备方法，其制备工艺简单，成本低，生产过程安全环保，没有任何毒害残留；且所述制备的复合生物酶无毒无害，可实现完全降解。将本发明制备的复合生物酶用于治理无水时，其水处理效果好，对生态系统安全可靠，不会造成二次污染。
具体实施方式
下面将结合具体的实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种治理污水用复合生物酶的制备方法，包括如下步骤：
(1)配制硫酸钙缓冲液：取0.51g的水合硫酸钙(CaSO4·2H2O)、6.80g的醋酸钠(CH3COONa)和4.05g的冰醋酸(CH3COOH)加入100.0ml的水中并搅拌均匀，使其充分溶解，溶解后定容至1.0L，即得到硫酸钙缓冲液；
(2)制备麦芽汁：将1.0kg的麦芽用水浸泡24小时，然后研磨成汁，然后加水稀释至浓度为12Brix；
(3)制备麦芽汁琼脂培养基：将琼脂加入稀释后的麦芽汁中并加热使之充分溶解，然后调节体系pH为5.4，并在110℃下高压灭菌30分钟，即可得到麦芽汁琼脂培养基，且所述的琼脂占所述麦芽汁琼脂培养基2.0wt％；具体是通过氢氧化钠溶液、盐酸、无菌水几种试剂进行pH调节；
(4)制备酵母菌富集培养基：将葡萄糖、尿素、硫酸铵、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、水合硫酸镁、水合硫酸铁、酵母膏以及孟加拉红加入水中并搅拌均匀，得到酵母菌富集培养基并调节pH为4.5；所述的酵母菌富集培养基包括如下质量分数的组分：葡萄糖5.0wt％、尿素0.1wt％、硫酸铵0.1wt％、磷酸二氢钾0.25wt％、磷酸氢二钠0.05wt％、水合硫酸镁0.1wt％、水合硫酸铁0.01wt％、酵母膏0.05wt％、孟加拉红0.003wt％以及水94.337wt％；
(5)菌种活化和培养：将0.5g的啤酒酵母菌加入装有150ml酵母菌富集培养基的250ml的三角瓶中培养1.0天后，对菌液进行稀释，在培养皿上进行平板培养，划线分离，重复此过程2次，使菌种充分活化；将活化后的啤酒酵母菌再置于装有300ml麦芽汁琼脂培养基的三角瓶中，并在25℃的生化培养箱中培养25天，培养后取出摇匀，然后在2500转/分钟的转速下离心5分钟，离心后去除上清液得到沉淀物，将所得沉淀物置于上述配制的硫酸钙缓冲液中摇匀，然后再以2500转/分钟的速率离心5分钟，即得到沉淀的酵母泥；
(6)原材料发酵：将原糖、作物和水按质量比1：3：10的比例混合粉碎，然后加入到发酵罐中，在25℃下密封发酵60天，即得到发酵液A；所述的作物由新鲜蔬菜、水果皮和秸秆按质量比1：1：1混合而成；
(7)将上述所得的全部酵母泥和上述发酵液A混合加入新的发酵罐中并搅拌均匀，然后在25℃下发酵15天，即可得到发酵液B；向所述发酵液B中加入木醋液(有机酸)并搅拌24小时，得到混合液；然后将所述的混合液依次进行离心过滤、板式过滤、膜过滤，然后进行巴氏消毒，即得到治理污水用复合生物酶；且所述的酵母泥和所述发酵液A的质量比为1：5000；所述木醋液占所述混合液12wt％。
实施例2
一种治理污水用复合生物酶的制备方法，包括如下步骤：
(1)配制硫酸钙缓冲液：取0.55g的水合硫酸钙(CaSO4·2H2O)、6.0g的醋酸钠(CH3COONa)和4.50g的冰醋酸(CH3COOH)加入100.0ml的水中并搅拌均匀，使其充分溶解，溶解后定容至1.0L，即得到硫酸钙缓冲液；
(2)制备麦芽汁：将1.0kg的麦芽用水浸泡20小时，然后研磨成汁，然后加水稀释至浓度为15Brix；
(3)制备麦芽汁琼脂培养基：将琼脂加入稀释后的麦芽汁中并加热使之充分溶解，然后调节体系pH为5.0，并在120℃下高压灭菌45分钟，即可得到麦芽汁琼脂培养基，且所述的琼脂占所述麦芽汁琼脂培养基3.0wt％；
(4)制备酵母菌富集培养基：将葡萄糖、尿素、硫酸铵、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、水合硫酸镁、水合硫酸铁、酵母膏以及孟加拉红加入水中并搅拌均匀，得到酵母菌富集培养基并调节pH为5.0；所述的酵母菌富集培养基包括如下质量分数的组分：葡萄糖10.0wt％、尿素0.3wt％、硫酸铵0.2wt％、磷酸二氢钾0.35wt％、磷酸氢二钠0.07wt％、水合硫酸镁0.3wt％、水合硫酸铁0.05wt％、酵母膏0.1wt％、孟加拉红0.004wt％以及水88.626wt％；
(5)菌种活化和培养：将0.5g的啤酒酵母菌加入装有150ml酵母菌富集培养基的250ml的三角瓶中培养1.5天后，对菌液进行稀释，在培养皿上进行平板培养，划线分离，重复此过程3次，使菌种充分活化；将活化后的啤酒酵母菌再置于装有300ml麦芽汁琼脂培养基的三角瓶中，并在30℃的生化培养箱中培养10天，培养后取出摇匀，然后在3000转/分钟的转速下离心8分钟，离心后去除上清液得到沉淀物，将所得沉淀物置于上述配制的硫酸钙缓冲液中摇匀，然后以2800转/分钟的速率离心10分钟，即得到沉淀的酵母泥；
(6)原材料发酵：将原糖、作物和水按质量比1：4：10的比例混合粉碎，然后加入到发酵罐中，在23℃下密封发酵50天，即得到发酵液A；所述的作物由新鲜蔬菜、水果皮和秸秆按质量比1：1：1混合而成；
(7)将上述所得的全部酵母泥和上述发酵液A混合加入新的发酵罐中并搅拌均匀，然后在27℃下发酵20天，即可得到发酵液B；向所述发酵液B中加入木醋液(有机酸)并搅拌20小时，得到混合液；然后将所述的混合液依次进行离心过滤、板式过滤、膜过滤，然后进行巴氏消毒，即得到治理污水用复合生物酶；且所述的酵母泥和所述发酵液A的质量比为1：4800；所述木醋液占所述混合液15wt％。
实施例3
一种治理污水用复合生物酶的制备方法，包括如下步骤：
(1)配制硫酸钙缓冲液：取0.60g的水合硫酸钙(CaSO4·2H2O)、7.0g的醋酸钠(CH3COONa)和5.0g的冰醋酸(CH3COOH)加入到100.0ml的水中并搅拌均匀，使其充分溶解，溶解后定容至1.0L，即得到硫酸钙缓冲液；
(2)制备麦芽汁：将1.0kg的麦芽用水浸泡18小时，然后研磨成汁，然后加水稀释至浓度为10Brix；
(3)制备麦芽汁琼脂培养基：将琼脂加入稀释后的麦芽汁中并加热使之充分溶解，然后调节体系pH为6.0，并在110℃下高压灭菌60分钟，即可得到麦芽汁琼脂培养基，且所述的琼脂占所述麦芽汁琼脂培养基5.0wt％；
(4)制备酵母菌富集培养基：将葡萄糖、尿素、硫酸铵、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、水合硫酸镁、水合硫酸铁、酵母膏以及孟加拉红加入水中并搅拌均匀，得到酵母菌富集培养基并调节pH为4.0；所述的酵母菌富集培养基包括如下质量分数的组分：葡萄糖7.0wt％、尿素0.2wt％、硫酸铵0.3wt％、磷酸二氢钾0.50wt％、磷酸氢二钠0.1wt％、水合硫酸镁0.5wt％、水合硫酸铁0.02wt％、酵母膏0.08wt％、孟加拉红0.005wt％以及水91.295wt％；
(5)菌种活化和培养：将0.5g的啤酒酵母菌加入装有150ml酵母菌富集培养基的250ml的三角瓶中培养1.5天后，对菌液进行稀释，在培养皿上进行平板培养，划线分离，重复此过程3次，使菌种充分活化；将活化后的啤酒酵母菌再置于装有300ml麦芽汁琼脂培养基的三角瓶中，并在28℃的生化培养箱中培养45天，培养后取出摇匀，然后在2700转/分钟的转速下离心10分钟，离心后去除上清液得到沉淀物，将所得沉淀物置于上述配制的硫酸钙缓冲液中摇匀，然后以3000转/分钟的速率离心7分钟，即得到沉淀的酵母泥；
(6)原材料发酵：将原糖、作物和水按质量比1：5：10的比例混合粉碎，然后加入到发酵罐中，在22℃下密封发酵55天，即得到发酵液A；所述的作物由新鲜蔬菜、水果皮和秸秆按质量比1：1：1混合而成；
(7)将上述所得的全部酵母泥和上述发酵液A混合加入新的发酵罐中并搅拌均匀，然后在28℃下发酵16天，即可得到发酵液B；向所述发酵液B中加入木醋液(有机酸)并搅拌22小时，得到混合液；然后将所述的混合液依次进行离心过滤、板式过滤、膜过滤，然后进行巴氏消毒，即得到治理污水用复合生物酶；且所述的酵母泥和所述发酵液A的质量比为1：4500；所述木醋液占所述混合液10wt％。
应用例1
取上述实施例1制得的复合生物酶并将其用于治理污水中，污水样本采集于武汉某开放水域(试验原水)，然后加入实施例1制得的复合生物酶，且按照每升污水加入0.2mg的复合生物酶的比例添加，将添加完复合生物酶后的污水静置，然后每隔一段时间从该水中取一次样本，并测试其TP、NH3-N和CODCr数值；测试结果如表1所示：
表1为加入实施例1制得的复合生物酶后污水采样的测试数据
采样时间 TP NH3-N CODCr
试验原水 2019.12.01 0.082 0.08 23.2
样本1 2019.12.02 0.078 0.17 27.47
样本2 2019.12.04 0.071 0.09 21.4
样本3 2019.12.11 0.057 0.06 18.87
样本4 2019.12.19 0.045 0.06 12.06
由表1的测试结果可以看出，试验原水初始的TP、NH3-N和CODCr数值分别为0.082、0.08和23.2；经过实施例1所得复合生物酶短时间的处理后(即样本1、样本2)，其NH3-N、CODCr数值有所升高，这是因为本发明所制备的复合生物酶里面含有营养物质，短时间内会让试验原水的COD有所上升，但是后期会被微生物吸收分解，不会影响原水；从样本4的结果可以看出经过本发明制备的复合生物酶十几天的处理后，试验原水的TP、NH3-N和CODCr数值均明显降低，表明了本发明制备的复合生物酶的水处理效果好，并且本发明制备的复合生物酶对生态系统安全可靠，不会造成二次污染。
上述为本发明的较佳实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。凡由本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种治理污水用复合生物酶的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
(1)配制硫酸钙缓冲液：将水合硫酸钙、醋酸钠和冰醋酸加入水中溶解，得到硫酸钙缓冲液；
(2)制备麦芽汁：将麦芽用水浸泡，然后研磨成汁并稀释；
(3)制备麦芽汁琼脂培养基：将琼脂加入稀释后的麦芽汁中并调节pH至酸性，高压灭菌，得到麦芽汁琼脂培养基；
(4)制备酵母菌富集培养基：将葡萄糖、尿素、硫酸铵、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、水合硫酸镁、水合硫酸铁、酵母膏以及孟加拉红加入水中并搅拌均匀，得到酵母菌富集培养基，调节pH至酸性；
(5)菌种活化和培养：将菌种加入所述酵母菌富集培养基中培养，使菌种充分活化；将活化后的菌种再置于所述麦芽汁琼脂培养基中培养，培养后离心，然后将沉淀物取出置于所述硫酸钙缓冲液中摇匀，然后再次离心，得到沉淀的酵母泥；
(6)原材料发酵：将原糖、作物和水混合粉碎，然后密封发酵，得到发酵液A；所述的作物为新鲜蔬菜、水果皮和秸秆的组合物；
(7)将所述的酵母泥和所述发酵液A混合于发酵罐中并搅拌，发酵得到发酵液B；向所述发酵液B中加入有机酸并搅拌，得到混合液；将所述混合液过滤，消毒，得到治理污水用复合生物酶。
2.根据权利要求1所述的一种治理污水用复合生物酶的制备方法，其特征在于，步骤(1)配制硫酸钙缓冲液：将0.5-0.6g的水合硫酸钙、6.0-7.0g的醋酸钠和4.0-5.0g的冰醋酸加入水中并搅拌均匀，充分溶解，溶解后定容至1.0L，得到硫酸钙缓冲液。
3.根据权利要求1所述的一种治理污水用复合生物酶的制备方法，其特征在于，步骤(2)制备麦芽汁：将麦芽用水浸泡18-24小时，然后研磨成汁，然后加水稀释至浓度为10-15Brix。
4.根据权利要求1所述的一种治理污水用复合生物酶的制备方法，其特征在于，步骤(3)制备麦芽汁琼脂培养基：将琼脂加入稀释后的麦芽汁中并加热使之充分溶解，然后调节体系pH为5-6，并在110-120℃下高压灭菌30-60分钟，即得到麦芽汁琼脂培养基；所述的琼脂占所述麦芽汁琼脂培养基2.0-5.0wt％。
5.根据权利要求1所述的一种治理污水用复合生物酶的制备方法，其特征在于，步骤(4)制备酵母菌富集培养基：所述的酵母菌富集培养基包括如下质量分数的组分：葡萄糖5.0-10.0％、尿素0.1-0.5％、硫酸铵0.1-0.3％、磷酸二氢钾0.2-0.5％、磷酸氢二钠0.05-0.1％、水合硫酸镁0.1-0.5％、水合硫酸铁0.01-0.05％、酵母膏0.05-0.1％、孟加拉红0.003-0.005％、余量为水；将所述酵母菌富集培养基调节至pH为4-5。
6.根据权利要求1所述的一种治理污水用复合生物酶的制备方法，其特征在于，步骤(5)菌种活化和培养：将啤酒酵母菌加入所述酵母菌富集培养基中培养1.0-1.5天，使菌种充分活化；将活化后的菌种再置于所述麦芽汁琼脂培养基中在25-30℃的生化培养箱中培养4-45天，培养后在2500-3000rpm的速率下离心5-10分钟，去除离心后的上清液将沉淀物取出置于所述硫酸钙缓冲液中摇匀，然后再次以2500-3000rpm的速率离心5-10分钟，即得到沉淀的酵母泥；所述啤酒酵母菌与所述酵母菌富集培养基的质量体积比为3.0-5.0mg/ml；所述酵母菌富集培养基与所述麦芽汁琼脂培养基的体积比为1：(2-3)；所述啤酒酵母菌与所述硫酸钙缓冲液的质量体积比为0.5-1.0mg/ml。
7.根据权利要求1所述的一种治理污水用复合生物酶的制备方法，其特征在于，步骤(6)原材料发酵：将原糖、作物和水按质量比1：(3-5)：10的比例混合粉碎，然后加入到发酵罐中在22-25℃下密封发酵50-60天，即得到发酵液A；所述的作物由新鲜蔬菜、水果皮和秸秆按质量比1：1：1混合而成。
8.根据权利要求1所述的一种治理污水用复合生物酶的制备方法，其特征在于，步骤(7)将所述的酵母泥和所述发酵液A混合于发酵罐中并搅拌均匀，在25-28℃下发酵15-20天，得到发酵液B；向所述发酵液B中加入木醋液并搅拌20-24小时，得到混合液；将所述混合液依次进行离心过滤、板式过滤、膜过滤，然后进行巴氏消毒，即得到治理污水用复合生物酶；所述的酵母泥和所述发酵液A的质量比为1：(4500-5000)；所述的木醋液占所述混合液10-15wt％。
9.一种治理污水用复合生物酶的应用，其特征在于，将权利要求1-8任一项所述的制备方法制得的复合生物酶用于污水治理中。
10.根据权利要求9所述的一种治理污水用复合生物酶的应用，其特征在于，所述的复合生物酶与所述污水的质量体积比为0.2-0.5mg/L。
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