CN112891642A - 一种生物因子涂层支架及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医疗器械技术领域，公开了一种生物因子涂层支架及其制备方法，包括：PDA涂层的Ni‑Ti支架；肝素钠涂层的DA支架；VEGF涂层的DA‑Hep支架；抗CD34抗体涂层的DA‑Hep支架；不含肝素的支架；同时装载PDA、生物因子和肝素的支架。利用多巴胺DA自聚合形成聚多巴胺PDA，在金属表面与金属形成不可逆的有机络合物，使PDA作为连接支架与生物因子媒介涂层；在支架表面构建成聚多巴胺PDA涂层后，利用席夫碱反应和迈克尔加成依次加载肝素Hep、血管内皮生长因子VEGF和抗CD34抗体，获得生物因子涂层支架。本发明有效地捕获血液循环中的内皮祖细胞，促进动脉瘤颈周围的内皮细胞增殖与迁移。
Description
技术领域
本发明属于医疗器械技术领域，尤其涉及一种生物因子涂层支架及其制备方法。
背景技术
目前，颅内动脉瘤破裂出血是仅次于脑梗塞及高血压性脑出血的第三位的脑卒中原因，患病率约3％，对人类的生命威胁极大。而目前用以治疗颅内动脉瘤的支架均为裸支架，不能很好的促进瘤颈的内皮化，导致应用支架治疗后动脉瘤的复发率仍高于10％以上。因此，亟需一种新的生物因子涂层支架及其制备方法。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：目前用以治疗颅内动脉瘤的支架均为裸支架，不能很好的促进瘤颈的内皮化，导致应用支架治疗后动脉瘤的复发率仍高于10％以上。
解决以上问题及缺陷的难度为：为了解决内皮化不足的问题，现有的方法是不断增加了裸支架的金属履盖率，如密网孔支架的的应用，较以往非密网孔的支架的内皮化作用更强了，但内皮化作用仍未达到理想的效果，有的案例在1年甚至是5年仍未达到完全内皮化；另外，不断增加的金属履盖率增加了血栓事件的发生概率，从而也限制了该类型的支架在一些脑血管中的应用，且密网孔支架的植入手术难度远远大于非密网孔支架。如何在支架表面达到快速内皮化作用且兼具良好的生物相溶性成为该研究的难点。本发明选用VEGF、抗CD34抗体作为内皮化的关键因子，它们分别通过促原位内皮细胞的增殖与迁移、扑获循环中的内皮祖细胞的作用机制在支架上较快速的形成内皮化，将VEGF、抗CD34抗体及肝素稳定地涂层在支架上且平稳的释放又成为该研究的关键点。
解决以上问题及缺陷的意义为：该生物涂层支架具有快速的促内皮作用及理想的生物相溶性，其意义在于该发明很可能将使得支架具备更佳的内皮化用用，明显缩短动脉瘤的治愈时间、提高动脉瘤的治愈率，而且显著降低其植入血管后的致血栓性，因而缩短抗血小板药物的使用时间及降低其使用强度，从而进一步减少相关并发症的发生。
发明内容
针对目前临床上广泛应用的裸支架存在的不足，本发明提供了一种生物因子涂层支架及其制备方法。
本发明是这样实现的，一种生物因子涂层支架，所述生物因子涂层支架包括：具有PDA涂层的Ni-Ti支架(简称DA)；具有肝素钠涂层的DA支架(简称DA-Hep)；具有VEGF涂层的DA-Hep支架(简称为DA-VEGF-Hep)；具有抗CD34抗体涂层的DA-Hep支架(简称为DA-CD34-Hep)；不含肝素的支架(表示为DA-VEGF/CD34)；同时装载PDA、生物因子和肝素的支架(表示DA-VEGF/CD34-Hep)。本发明的另一目的在于提供一种应用所述的生物因子涂层支架的生物因子涂层支架的制备方法，所述生物因子涂层支架的制备方法包括以下步骤：
步骤一，将多巴胺溶解于Tris-Hcl缓冲溶液(10.0mM，pH＝8.5)中，制成2mg/mL的多巴胺溶液。然后，将Ni-Ti材质的支架浸入多巴胺溶液中。摇匀24小时后，用去离子水冲洗支架，再干燥24小时，得到涂有PDA的支架(简称DA)。
步骤二，在支架表面构建成聚多巴胺PDA涂层后，将肝素钠溶液(5mg/mL,pH＝7.2)滴入DA支架中，持续1h。然后将支架样品冲洗干燥(简称DA-Hep)。
步骤三，对于构建VEGF涂层，在4℃下，将DA-Hep支架样品用1.0μg/mL VEGF溶液浸泡48小时，然后用磷酸盐缓冲盐水缓冲液(PBS)冲洗，得到DA-VEGF-Hep样品，晾干备用。
对于构建抗CD34抗体涂层，DA-Hep支架样品用2.0μg/mL抗CD34抗体溶液在4℃条件下浸泡48小时，用PBS缓冲液冲洗后晾干，得到DA-CD34-Hep。
为了实验的目的，本发明还制作了不含肝素的支架(表示为DA-VEGF/CD34)和同时装载PDA、生物因子和肝素的支架(表示DA-VEGF/CD34-Hep)进行比较。
进一步，所述生物因子涂层支架的表征及分析方法还包括：激光共聚焦(LSCM)分析支架表面涂层的负载情况；接触角分析；血小板激活分析以及凝血时间分析；蛋白质吸附释放实验分析；使用酶标仪进行OD值测量细胞增殖速率，并使用SPSS22.0统计数据。
进一步，电子显微镜以及CCK-8细胞计数曲线，确定所述生物因子涂层支架在静态环境和动态环境下内皮祖细胞的捕获能力。
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明提供的生物因子涂层支架，利用多巴胺(DA)自聚合形成聚多巴胺(PDA)，可以在金属表面与金属形成不可逆的有机络合物的原理，使PDA作为连接支架与生物因子媒介涂层；在支架表面构建成聚多巴胺(PDA)涂层后，利用席夫碱反应和迈克尔加成依次加载肝素(Hep)、血管内皮生长因子(VEGF)和抗CD34抗体，具备更好的生物相容性，并且能够有效地捕获血液循环中的内皮祖细胞和促进动脉瘤颈周围的内皮细胞增殖与迁移。
本发明构建得到的生物因子涂层支架，在细胞实验层面证实了它相比现在临床上所使用的裸支架具有更好的生物相容性、更有效的内皮细胞促增殖效果和更强效的内皮祖细胞捕获能力；在生物相容性方面，新的生物因子涂层支架相对比裸支架有了明显的提高，它的水接触角下降至0°；血小板激活率下降了10％；APTT延长超过180s，PT延长超过3s；蛋白吸附率从903.9μg/cm2下降至39.5μg/cm2。
本发明对内皮细胞的影响方面，无论是对内皮细胞的促迁移作用还是促增殖作用，生物因子涂层支架均表现得更高效，使用酶标仪进行OD值测量细胞增殖速率，并使用SPSS22.0统计数据后，上述实验结果均有统计学意义(P＜0.05)。
本发明在对内皮祖细胞的影响方面，生物因子涂层支架无论是在静态环境或者动态环境下，相对于裸支架都具备更强的内皮祖细胞捕获能力。通过扫描电镜以及CCK-8细胞计数曲线，在静态环境下，裸支架捕获的内皮祖细胞为2205/cm2，少于生物因子涂层支架的11540/cm2(P＜0.05)；而在动态环境下，裸支架仅捕获到1802/cm2，而生物因子涂层支架则为9420/cm2(P＜0.05)。
总之，本发明所具备的优点及积极效果为：使颅内支架具备更好的生物相容性，并且能够有效地捕获血液循环中的内皮祖细胞和促进动脉瘤颈周围的内皮细胞增殖与迁移，从而达到快速内皮化的作用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的生物因子涂层支架及其制备方法流程图。
图2是本发明实施例提供的生物因子涂层支架及其制备方法原理图。
图3是本发明实施例提供的对比效果图；A支架表面的水接触角大幅度下降；B加载有肝素钠的DA-VEGF/CD34-Hep组的血小板激活率为88.9％，对比其他三组有明显下降(P＜0.05)；C加载有肝素钠的DA-VEGF/CD34-Hep组的APTT时间明显延长，大于180s，PT时间相较于其他三组时间延长大于3s(延长时间＞3s有意义)；D对比空白组，随着多巴胺、VEGF、抗CD34、肝素钠的逐层负载，材料表面对牛血清白蛋白的粘附从空白组平均每单位面积吸附903.9μg白蛋白，到DA组638.6μg/cm2，DA-VEGF/CD34组383.7μg/cm2，最后到DA-VEGF/CD34-Hep下降至39.5μg/cm2(P＜0.05)。
图4是本发明实施例提供的新型生物因子涂层支架的LSCM图。
图5是本发明实施例提供的新型生物因子涂层支架捕获EPCs实验示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种生物因子涂层支架及其制备方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
本发明实施例提供的生物因子涂层支架包括：具有PDA涂层的Ni-Ti支架(简称DA)；具有肝素钠涂层的DA支架(简称DA-Hep)；具有VEGF涂层的DA-Hep支架(简称DA-VEGF-Hep)；具有抗CD34抗体涂层的DA-Hep支架(简称DA-CD34-Hep)；不含肝素的支架(表示为DA-VEGF/CD34)和同时装载PDA、生物因子和肝素的支架(简称DA-VEGF/CD34-Hep)。
如图1所示，本发明实施例提供的生物因子涂层支架的制备方法包括以下步骤：
S101，利用多巴胺DA自聚合形成聚多巴胺PDA，在金属表面与金属形成不可逆的有机络合物，使PDA作为连接支架与生物因子媒介涂层；
S102，在支架表面构建成聚多巴胺PDA涂层后，利用席夫碱反应和迈克尔加成依次加载肝素Hep、血管内皮生长因子VEGF和抗CD34抗体，获得生物因子涂层支架。
本发明提供的生物因子涂层支架的制备方法业内的普通技术人员还可以采用其他的步骤实施，图1的本发明提供的生物因子涂层支架的制备方法仅仅是一个具体实施例而已。
本发明实施例提供的生物因子涂层支架及其制备方法原理图如图2所示。
本发明具体包括以下步骤：
步骤一，将多巴胺溶解于Tris-Hcl缓冲溶液(10.0mM，pH＝8.5)中，制成2mg/mL的多巴胺溶液。然后，将Ni-Ti材质的支架浸入多巴胺溶液中。摇匀24小时后，用去离子水冲洗支架，再干燥24小时，得到涂有PDA的支架(简称DA)。
步骤二，在支架表面构建成聚多巴胺PDA涂层后，将肝素钠溶液(5mg/mL,pH＝7.2)滴入DA支架中，持续1h。然后将支架样品冲洗干燥(简称DA-Hep)。
步骤三，对于构建VEGF涂层，在4℃下，将DA-Hep支架样品用1.0μg/mL VEGF溶液浸泡48小时，然后用磷酸盐缓冲盐水缓冲液(PBS)冲洗，得到DA-VEGF-Hep样品，晾干备用。
对于构建抗CD34抗体涂层，DA-Hep支架样品用2.0μg/mL抗CD34抗体溶液在4℃条件下浸泡48小时，用PBS缓冲液冲洗后晾干，得到DA-CD34-Hep。
为了实验的目的，本发明还制作了不含肝素的支架(表示为DA-VEGF/CD34)和同时装载PDA、生物因子和肝素的支架(表示DA-VEGF/CD34-Hep)进行比较。
进一步，所述生物因子涂层支架的表征及分析方法还包括：激光共聚焦(LSCM)分析支架表面涂层的负载情况；接触角分析；血小板激活分析以及凝血时间分析；蛋白质吸附释放实验分析；使用酶标仪进行OD值测量细胞增殖速率，并使用SPSS22.0统计数据。
进一步，电子显微镜以及CCK-8细胞计数曲线，确定所述生物因子涂层支架在静态环境和动态环境下内皮祖细胞的捕获能力。
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的描述。
针对目前临床上广泛应用的裸支架存在的不足，本发明构建了生物因子涂层支架，它具备更好的生物相容性，并且能够有效地捕获血液循环中的内皮祖细胞和促进动脉瘤颈周围的内皮细胞增殖及迁移。
1、发明内容
(1)利用多巴胺(DA)自聚合形成聚多巴胺(PDA)，可以在金属表面与金属形成不可逆的有机络合物的原理，使PDA作为连接支架与生物因子媒介涂层。
(2)在支架表面构建成聚多巴胺(PDA)涂层后，利用席夫碱反应和迈克尔加成依次加载肝素(Hep)、血管内皮生长因子(VEGF)和抗CD34抗体。
2、技术效果
(1)通过上述技术构建出生物因子涂层支架，本发明在细胞实验层面证实了它相比现在临床上所使用的裸支架具有更好的生物相容性、更有效的内皮细胞促增殖效果和更强效的内皮祖细胞捕获能力。
(2)在生物相容性方面，新的生物因子涂层支架相对比裸支架有了明显的提高，它的水接触角下降至0°；血小板激活率下降了10％；APTT延长超过180s，PT延长超过3s；蛋白吸附率从903.9μg/cm2下降至39.5μg/cm2。
对内皮细胞的影响方面，无论是对内皮细胞的促迁移作用还是促增殖作用，生物因子涂层支架均表现得更高效，使用酶标仪进行OD值测量细胞增殖速率，并使用SPSS22.0统计数据后，上述实验结果均有统计学意义(P＜0.05)。
在对内皮祖细胞的影响方面，生物因子涂层支架无论是在静态环境或者动态环境下，相对于裸支架都具备更强的内皮祖细胞捕获能力。通过扫描电镜以及CCK-8细胞计数曲线，在静态环境下，裸支架捕获的内皮祖细胞为2205/cm2，少于生物因子涂层支架的11540/cm2(P＜0.05)；而在动态环境下，裸支架仅捕获到1802/cm2，而生物因子涂层支架则为9420/cm2(P＜0.05)。
下面结合实验对本发明的技术效果作详细的描述。
如图3所示，A支架表面的水接触角大幅度下降；B加载有肝素钠的DA-VEGF/CD34-Hep组的血小板激活率为88.9％，对比其他三组有明显下降(P＜0.05)；C加载有肝素钠的DA-VEGF/CD34-Hep组的APTT时间明显延长，大于180s，PT时间相较于其他三组时间延长大于3s(延长时间＞3s有意义)；D对比空白组，随着多巴胺、VEGF、抗CD34、肝素钠的逐层负载，材料表面对牛血清白蛋白的粘附从空白组平均每单位面积吸附903.9μg白蛋白，到DA组638.6μg/cm2，DA-VEGF/CD34组383.7μg/cm2，最后到DA-VEGF/CD34-Hep下降至39.5μg/cm2(P＜0.05)。
图4显示本发明的生物因子涂层支架构建方法使裸支架上均匀涂覆了生物因子，表明支架成功负载VEGF或抗CD34抗体。
图5表明DA-CD34-Hep支架捕获EPCs能力最强，且新型生物因子涂层支架比裸支架更能促进HUVECS增殖。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种生物因子涂层支架的制备方法，其特征在于，所述生物因子涂层支架的制备方法包括：
利用多巴胺DA自聚合形成聚多巴胺PDA，在金属表面与金属形成不可逆的有机络合物，使PDA作为连接支架与生物因子媒介涂层；
在支架表面构建成聚多巴胺PDA涂层后，利用席夫碱反应和迈克尔加成依次加载肝素Hep、血管内皮生长因子VEGF和抗CD34抗体，获得生物因子涂层支架。
2.如权利要求1所述的生物因子涂层支架的制备方法，其特征在于，所述生物因子涂层支架的制备方法还包括：使用酶标仪进行OD值测量细胞增殖速率，并使用SPSS22.0统计数据。
3.如权利要求1所述的生物因子涂层支架的制备方法，其特征在于，所述生物因子涂层支架的制备方法还包括：通过扫描电镜以及CCK-8细胞计数曲线，确定所述生物因子涂层支架在静态环境和动态环境下内皮祖细胞的捕获能力。
4.如权利要求1所述的生物因子涂层支架的制备方法，其特征在于，所述生物因子涂层支架的制备方法具体包括：
步骤一，将多巴胺溶解于Tris-Hcl缓冲溶液10.0mM，pH＝8.5中，制成2mg/mL的多巴胺溶液；将Ni-Ti材质的支架浸入多巴胺溶液中。摇匀24小时后，用去离子水冲洗支架，再干燥24小时，得到涂有PDA的支架；
步骤二，在支架表面构建成聚多巴胺PDA涂层后，将肝素钠溶液5mg/mL,pH＝7.2滴入DA支架中，持续1h；将支架样品冲洗干燥；
步骤三，对于构建VEGF涂层，在4℃下，将DA-Hep支架样品用1.0μg/mL VEGF溶液浸泡48小时，然后用磷酸盐缓冲盐水缓冲液PBS冲洗，得到DA-VEGF-Hep样品，晾干备用。
5.如权利要求4所述的生物因子涂层支架的制备方法，其特征在于，所述生物因子涂层支架的制备方法构建抗CD34抗体涂层，DA-Hep支架样品用2.0μg/mL抗CD34抗体溶液在4℃条件下浸泡48小时，用PBS缓冲液冲洗后晾干，得到DA-CD34-Hep。
6.如权利要求1所述的生物因子涂层支架的制备方法，其特征在于，所述生物因子涂层支架的制备方法的生物因子涂层支架的表征及分析方法还包括：激光共聚焦LSCM分析支架表面涂层的负载情况；接触角分析；血小板激活分析以及凝血时间分析；蛋白质吸附释放实验分析；使用酶标仪进行OD值测量细胞增殖速率，并使用SPSS22.0统计数据。
7.一种由权利要求1～6任意一项所述生物因子涂层支架的制备方法制备的生物因子涂层支架，具有PDA涂层的Ni-Ti支架；具有肝素钠涂层的DA支架；具有VEGF涂层的DA-Hep支架；具有抗CD34抗体涂层的DA-Hep支架；不含肝素的支架；同时装载PDA、生物因子和肝素的支架。
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