CN112891623B - 负载egcg纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架及其制备方法 - Google Patents

负载egcg纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本申请发明公开了一种负载EGCG纳米颗粒的壳聚糖‑海藻酸钠复合支架及其制备方法，该支架由壳聚糖、海藻酸钠以及包载EGCG的壳聚糖纳米颗粒组成。该支架具有很好的EGCG缓释性，较大的孔隙度有利于细胞的贴附。有效提高EGCG缓释效果又不影响孔隙率并促进间充质干细胞增殖。

Description

负载EGCG纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架及其制备 方法
技术领域
本申请涉及组织工程支架材料领域，具体涉及一种具有促进间充质干细胞增殖的负载EGCG纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架及其制备方法。
背景技术
随着组织工程和临床药物的快速发展，干细胞治疗制备关注。然而干细胞来源不足是限制组织工程应用于临床的重要因素。因此体外扩增干细胞对于组织工程实现临床应用具有重要的意义。传统的二维细胞培养存在不足，例如培养的空间受到限制和无法模拟细胞体内的微环境。三维体外培养干细胞有望提高干细胞体外扩增，，成为一种有前景的组织工程领域发展方向。三维培养能够模拟干细胞的体内的微环境，有利于干细胞的体外扩增。在体外扩增过程中功能性小分子天然化合物备受关注。其中黄酮类化合物在自然界中含量丰富，通过激活相关的信号通路促进间充质干细胞的增殖。(2R,3R)-5,7-二羟基-2-(3,4,5-三羟基苯基)色烷-3-基3,4,5-三羟基苯酸酯(EGCG)是一种存在于绿茶中的天然类黄酮，据报道EGCG能够促进间充质干细胞增殖。由于EGCG容易被细胞代谢，生物利用率低。因此在培养过程中需要不断的添加EGCG。构建具有缓释作用的系统成为提高EGCG的生物利用率的有效方法。
构建具有缓释系统支架的方法有直接将功能小分子加入到支架中，让小分子直接包裹在支架材料中，这种方法往往缓释效果不理想，较短时间内支架中的功能小分子便释放完全达不到长期发挥功能性的目的。另外也有首先将功能小分子包载进微球，然后再将微球包裹进支架材料中，这种方法所制备的功能性支架，虽然显著延长了功能小分子释放的时间，提高了缓释效果，但往往包载功能小分子微球的引入，会使得支架材料的空隙堵塞，降低支架材料的孔隙率，不利于营养物质和气体的运输，进而影响干细胞的在支架上的生长。。
海藻酸钠和壳聚糖这两种天然聚合物与细胞外基质(ECM)具有相似的化学结构。壳聚糖是一种安全且无毒的阳离子多糖，已被证明具有良好的生物降解性与生物相容性。海藻酸钠是食品和药物管理局(FDA)批准的天然生物材料之一，可用于生物医学领域。然而，海藻酸钠水凝胶通常由于脆性和低机械稳定性限制了其在生物医学领域中的应用。而壳聚糖的引入可以改善海藻酸钠的缺点。因此寻找合适的方法提高EGCG的利用效率并与改善后的海藻酸钠水凝胶相结合构建具有缓释系统作用的支架，成为满足组织工程要求的关键。
发明内容
本申请实施例提供一种负载EGCG纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架及其制备方法，可以解决现有组织工程支架的方法无法达到长期发挥功能性的目的和造成支架材料的空隙堵塞，降低支架材料的孔隙率，不利于营养物质和气体的运输，进而影响干细胞的在支架上的生长的问题。
本申请实施例提供一种负载EGCG纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架，用于间充质干细胞增殖，所述负载EGCG纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架由包载EGCG的壳聚糖纳米颗粒、壳聚糖以及海藻酸钠组成，且所述包载EGCG的壳聚糖纳米颗粒、所述壳聚糖、所述海藻酸钠的质量比为1:3-8:3-8；其中，所述EGCG为(2R,3R)-5,7-二羟基-2-(3,4,5-三羟基苯基)色烷-3-基3,4,5-三羟基苯酸酯。
此外，本申请实施例还提供一种负载EGCG纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架的制备方法，包括以下步骤：S1)制备质量浓度为2mg/ml～8mg/ml的包载EGCG的壳聚糖纳米颗粒悬浮液；S2)提供质量浓度为10mg/ml～40mg/ml的壳聚糖溶液、质量浓度为10mg/ml～40mg/ml的海藻酸钠溶液；将所述壳聚糖溶液、所述海藻酸钠溶液与所述包载EGCG的壳聚糖纳米颗粒悬浮液混合，其中所述壳聚糖溶液与所述海藻酸钠溶液的体积比为1-2:1-2，且包载EGCG的壳聚糖纳米颗粒、壳聚糖、海藻酸钠的质量比为1:3-8:3-8，得到负载EGCG纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架的混合液，将所述负载EGCG纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架的混合液冷冻干燥制备得到负载EGCG纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架冻干品；S3)将所述负载EGCG纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架冻干品在质量浓度为20mg/ml～40mg/ml氯化钙溶液中浸泡10分钟至20分钟，然后在体积浓度为0.50％v/v-2.0％v/v戊二醛溶液中浸泡10分钟至20分钟,之后冷冻干燥得到所述负载EGCG纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架。
进一步地，在所述步骤S1)中包括S11)将EGCG加入到质量浓度为1mg/ml～10mg/ml的壳聚糖溶液中并充分混合，使EGCG与壳聚糖质量比为1:25～1:100，得到壳聚糖-EGCG混合液，并调节所述壳聚糖-EGCG混合液的pH值至4～5.5；S12)将三磷酸钠溶液滴加至所述壳聚糖-EGCG混合液中，使所述壳聚糖-EGCG混合液和三磷酸钠溶液体积比为7：3～8：2,所述三磷酸钠溶液的质量浓度为1mg/ml～4mg/ml；连续搅拌1小时，形成的纳米悬浮液用高速离心机以10000rpm-20000rpm的高速离心20分钟-60分钟，离心后，再经过-70℃至-85℃温度速冻后，于-15℃至-25℃的温度下冷冻干燥时间12小时至36小时，得到包载EGCG的壳聚糖纳米颗粒；S13)将包载EGCG的壳聚糖纳米颗粒加入到纯化水中，制成质量浓度为2mg/ml～8mg/ml的包载EGCG的壳聚糖纳米颗粒悬浮液。
进一步地，在所述步骤S2)中包括将制备的所述负载EGCG纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架的混合液置入于聚氟乙烯板的模型孔中，经过-70℃至-85℃温度速冻后，在-15℃至-25℃的温度下冷冻干燥时间为12小时至36小时，得到所述负载EGCG纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架冻干品。
本发明的有益效果：本发明提供一种负载EGCG纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架及其制备方法。该制备方法简单方便，所使用到的材料成本低，可以大大减小制备成本。使用该制备方法所制成的负载EGCG纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架，具有长时间的有效释放EGCG的能力，更好的孔隙率和促进间充质干细胞增殖的功能。该负载EGCG纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架，既能有效的提高EGCG缓释效果又不影响孔隙率并促进间充质干细胞增殖。本发明有效提高了骨髓间充质干细胞的增殖效率，适合应用于间充质干细胞的体外扩增。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是现有负载纳米颗粒壳聚糖-海藻酸钠复合支架的制备流程图；
图2是本申请实施例1的用以促进间充质干细胞增殖的负载EGCG纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架的制备步骤S1)其还包括的步骤S11)-S13)；
图3是本申请实施例1用以促进间充质干细胞增殖的负载EGCG纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架的制备流程
图4是本申请实施例1的负载EGCG纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架的扫描电镜形貌图；
图5是图4的局部放大图；
图6是本申请实施例2的负载EGCG纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架的扫描电镜形貌图；
图7是是图6的局部放大图；
图8是本申请实施例3的负载EGCG纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架的扫描电镜形貌图；
图9是是图8的局部放大图；
图10是本申请实施例4的负载EGCG纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架的扫描电镜形貌图；
图11是是图10的局部放大图；
图12是本申请实施例的负载EGCG纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架用于间充质干细胞培养时，细胞的生长曲线；
图13是本申请实施例的负载EGCG纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架EGCG释放曲线图。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
本申请实施例提供一种负载EGCG纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架及其制备方法。以下分别进行详细说明。需说明的是，以下实施例的描述顺序不作为对实施例优选顺序的限定。另外，在本申请的描述中，术语“包括”是指“包括但不限于”。用语第一、第二、第三等仅仅作为标示使用，并没有强加数字要求或建立顺序。本发明的各种实施例可以以一个范围的型式存在；应当理解，以一范围型式的描述仅仅是因为方便及简洁，不应理解为对本发明范围的硬性限制；因此，应当认为所述的范围描述已经具体公开所有可能的子范围以及该范围内的单一数值。例如，应当认为从1到6的范围描述已经具体公开子范围，例如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及所数范围内的单一数字，例如1、2、3、4、5及6，此不管范围为何皆适用。另外，每当在本文中指出数值范围，是指包括所指范围内的任何引用的数字(分数或整数)。
本发明提供了一种负载EGCG纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架，用于间充质干细胞增殖，所述负载EGCG纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架由包载EGCG的壳聚糖纳米颗粒、壳聚糖以及海藻酸钠组成，且所述包载EGCG的壳聚糖纳米颗粒、所述壳聚糖、所述海藻酸钠的质量比为1:3-8:3-8；其中，所述EGCG为(2R,3R)-5,7-二羟基-2-(3,4,5-三羟基苯基)色烷-3-基3,4,5-三羟基苯酸酯。
此外，本发明还提供一种负载EGCG纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架的制备方法，包括以下步骤：S1)制备质量浓度为2mg/ml～8mg/ml的包载EGCG的壳聚糖纳米颗粒悬浮液；在所述步骤S1)中包括S11)将EGCG加入到质量浓度为1mg/ml～10mg/ml的壳聚糖溶液中并充分混合，使EGCG与壳聚糖质量比为1:25～1:100，得到壳聚糖-EGCG混合液，并调节所述壳聚糖-EGCG混合液的pH值至4～5.5；S12)将三磷酸钠溶液滴加至所述壳聚糖-EGCG混合液中，使所述壳聚糖-EGCG混合液和三磷酸钠溶液体积比为7：3～8：2,所述三磷酸钠溶液的质量浓度为1mg/ml～4mg/ml；连续搅拌1小时，形成的纳米悬浮液用高速离心机以10000rpm-20000rpm的高速离心20分钟-60分钟，离心后，再经过-70℃至-85℃温度速冻后，于-15℃至-25℃的温度下冷冻干燥时间12小时至36小时，得到包载EGCG的壳聚糖纳米颗粒；S13)将包载EGCG的壳聚糖纳米颗粒加入到纯化水中，制成质量浓度为2mg/ml～8mg/ml的包载EGCG的壳聚糖纳米颗粒悬浮液。
S2)提供质量浓度为10mg/ml～40mg/ml的壳聚糖溶液、质量浓度为10mg/ml～40mg/ml的海藻酸钠溶液；将所述壳聚糖溶液、所述海藻酸钠溶液与所述包载EGCG的壳聚糖纳米颗粒悬浮液混合，其中所述壳聚糖溶液与所述海藻酸钠溶液的体积比为1-2:1-2，且包载EGCG的壳聚糖纳米颗粒、壳聚糖、海藻酸钠的质量比为1:3-8:3-8，得到负载EGCG纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架的混合液，将所述负载EGCG纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架的混合液冷冻干燥制备得到负载EGCG纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架冻干品；S3)将所述负载EGCG纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架冻干品在质量浓度为20mg/ml～40mg/ml氯化钙溶液中浸泡10分钟至20分钟，然后在体积浓度为0.50％v/v-2.0％v/v戊二醛溶液中浸泡10分钟至20分钟,之后冷冻干燥得到所述负载EGCG纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架。在所述步骤S2)中包括将制备的所述负载EGCG纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架的混合液置入于聚氟乙烯板的模型孔中，经过-70℃至-85℃温度速冻后，在-15℃至-25℃的温度下冷冻干燥时间为12小时至36小时，得到所述负载EGCG纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架冻干品。
下面结合具体实施例对本发明的负载EGCG纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架的制备方法进行进一步解释。
实施例1
参见图1，本实施例1提供一种负载纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架的制备方法，用于间充质干细胞增殖，包括步骤S1)’-步骤S3)’。
具体的
S1)’配制质量浓度为5mg/ml的壳聚糖溶液，用浓度为1N的NaOH调节壳聚糖溶液pH至4.8，得到壳聚糖混合液。将质量浓度为2mg/ml的三磷酸钠溶液按滴加至所述壳聚糖混合液中，其中，所述三磷酸钠溶液与所述壳聚糖混合液的体积比为1：4。之后连续搅拌1h后，再置于离心机中以15000rpm的转速离心30分钟，再用蒸馏水洗涤2次后，放入-80℃中速冻，然后在-20℃下冷冻干燥24h制备得到壳聚糖纳米颗粒。将壳聚糖纳米颗粒加入到纯化水中，制成质量浓度为4mg/ml的壳聚糖纳米颗粒悬浮液。
S2)’取质量浓度为4mg/ml的所述壳聚糖纳米颗粒悬浮液、质量浓度为20mg/ml的壳聚糖溶液加入至质量浓度为20mg/ml的海藻酸钠溶液中，在温度为25℃条件下搅拌30分钟。之后将搅拌后的溶液加入至聚氟乙烯板的模型孔中，每个模型孔加入250μl的搅拌后的溶液，再在温度-20℃条件下冷冻24h，之后再在-20℃条件下冷冻干燥24h，得到壳聚糖-海藻酸钠复合支架冻干品。
S3)’将得到壳聚糖-海藻酸钠复合支架冻干品在质量浓度为30mg/ml的CaCl2溶液中浸泡15分钟，然后在体积浓度为1％v/v的戊二醛水溶液中浸泡15分钟，再次冻干，获得负载纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架。
电镜扫描
本实施例1的负载纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架的形貌参见图4和图5所示。图5是图4材料的局部放大图。在本实施例中，可以看出负载纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架成多孔的网络结构，且壳聚糖纳米颗粒均匀分布中复合支架中。
细胞增殖实验
对实施例1制备的负载纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架进行间充质干细胞的体外增殖研究：通过CCK-8(细胞计数试剂)方法测量HUMSC(脐带间充质干细胞)在本实施例1的负载纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架上的增殖。培养1、3、5和7天(2×104细胞)后，首先用200μL无血清α-MEM培养基和每孔含量为体积浓度为10％v/v的CCK-8溶液替换培养基。在37℃温度下温育2小时后，在450nm波长下测定了水溶性甲赞染料的产生，细胞在本实施例1的负载纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架上的增殖情况参阅图12所示。可以看出，本实施例中，在负载纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架上细胞随着时间增长而增殖。
实施例2
参见图2，本实施例中一种负载EGCG纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架的制备方法，包括步骤S1)-步骤S3)。
具体的
S1)制备质量浓度为4mg/ml包载EGCG的壳聚糖纳米颗粒悬浮液；本步骤中包括步骤S11)至步骤S13)。参见图3，S11)制备壳聚糖-EGCG混合液，即将EGCG加入质量浓度为5mg/ml的壳聚糖溶液中，直至EGCG的浓度达到25μM，并充分混合，之后用浓度为1N的NaOH调节壳聚糖溶液的pH至4.8，得到壳聚糖-EGCG混合液。S12)将三磷酸钠溶液滴加至所述壳聚糖-EGCG混合液中，之后连续搅拌1h后，形成的纳米颗粒悬浮液用高速离心机以15000rpm离心30分钟，再用蒸馏水洗涤2次后，放入-80℃中速冻，然后在-20℃下冷冻干燥24h制备得到包载EGCG的纳米颗粒。S13)将包载EGCG的壳聚糖纳米颗粒加入到纯化水中，制成质量浓度为4mg/ml的包载EGCG的壳聚糖纳米颗粒悬浮液。
S2)提供质量浓度为20mg/ml壳聚糖溶液、质量浓度为20mg/ml的海藻酸钠溶液；将所述壳聚糖溶液、所述海藻酸钠溶液与所述质量浓度为4mg/ml的包载EGCG的壳聚糖纳米颗粒悬浮液混合，得到负载EGCG纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架的混合液，将制备的所述负载EGCG纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架的混合液置入于聚氟乙烯板的模型孔中，每个模型孔加入250μl的搅拌后的溶液，再在温度-20℃条件下冷冻24h，之后再在-20℃条件下冷冻干燥24h，得到负载EGCG纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架冻干品。
S3)将所述负载EGCG纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架冻干品在质量浓度为30mg/ml氯化钙溶液中浸泡10分钟至20分钟，然后在体积浓度为1.0％v/v戊二醛溶液中浸泡10分钟至20分钟,之后冷冻干燥得到所述负载EGCG纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架。
电镜扫描
本实施例2的负载EGCG纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架的形貌参见图6和图7所示。图7是图6材料的局部放大图。在本实施例2负载EGCG纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架的形貌成多孔的网络结构，且包载EGCG的壳聚糖纳米颗粒均匀分布在复合支架中。相比于实施例1，本实施2的支架中负载了EGCG。
细胞增殖实验
按照实施例1的方法，对本实施例2的负载EGCG纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架进行细胞增殖，参见图12所示，在本实施例2负载EGCG纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架上，细胞随着时间增长增殖，且相比实施例1，本实施例2的细胞增殖量较大。
EGCG释放研究
对实施例2制备的负载EGCG纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架进行EGCG释放研究：将同等重量的实施例2制备的负载EGCG纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架加入24孔板中，37℃下每孔加入1ml的磷酸缓冲盐溶液(PBS)，浸泡负载EGCG纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架。每隔两天取出1ml的溶液，即提取液，加入1ml的新鲜磷酸缓冲盐溶液(PBS)。在273nm波长下测定所述提取液的吸光度。然后根据标准EGCG曲线的斜率确定EGCG释放浓度。测定EGCG随时间变化的释放率。参见图13所示，可看出本实施例中，EGCG随时间的变化释放率增大，第10天释放率最大超过0.5μm，第10天以后逐渐减小，第16天低于0.5μm。
实施例3
参见图2，本实施例中一种负载EGCG纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架的制备方法，包括步骤S1)-步骤S3)。
具体的
S1)制备质量浓度为4mg/ml包载EGCG的壳聚糖纳米颗粒悬浮液；本步骤中包括步骤S11)至步骤S13)。参见图3，S11)制备壳聚糖-EGCG混合液，即将EGCG加入质量浓度为5mg/ml的壳聚糖溶液中，直至EGCG的浓度达到50μM，并充分混合，之后用浓度为1N的NaOH调节壳聚糖溶液的PH至4.8，得到壳聚糖-EGCG混合液。S12)将三磷酸钠溶液滴加至所述壳聚糖-EGCG混合液中，之后连续搅拌1h后，形成的纳米颗粒悬浮液用高速离心机以15000rpm离心30分钟，再用蒸馏水洗涤2次后，放入-80℃中速冻，然后在-20℃下冷冻干燥24h制备得到包载EGCG的纳米颗粒。S13)将包载EGCG的壳聚糖纳米颗粒加入到纯化水中，制成质量浓度为4mg/ml的包载EGCG的壳聚糖纳米颗粒悬浮液。
S2)提供质量浓度为20mg/ml壳聚糖溶液、质量浓度为20mg/ml的海藻酸钠溶液；将所述壳聚糖溶液、所述海藻酸钠溶液与所述质量浓度为4mg/ml的包载EGCG的壳聚糖纳米颗粒悬浮液混合，得到负载EGCG纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架的混合液，将制备的所述负载EGCG纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架的混合液置入于聚氟乙烯板的模型孔中，每个模型孔加入250μl的搅拌后的溶液，再在温度-20℃条件下冷冻24h，之后再在-20℃条件下冷冻干燥24h，得到负载EGCG纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架冻干品。
S3)将所述负载EGCG纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架冻干品在质量浓度为30mg/ml氯化钙溶液中浸泡10分钟至20分钟，然后在体积浓度为1.0％v/v戊二醛溶液中浸泡10分钟至20分钟,之后冷冻干燥得到所述负载EGCG纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架。
电镜扫描
本实施例3的负载EGCG纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架的形貌参见图8和图9所示。图9是图8材料的局部放大图。在本实施例3负载EGCG纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架成多孔的网络结构，且包载EGCG的壳聚糖纳米颗粒均匀分布在复合支架中。相比于实施例1中，本实施例3负载了EGCG，相比于实施例2，本实施例3的EGCG的负载量较大。
细胞增殖实验
按照实施例1的方法，对本实施例3的负载EGCG纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架进行细胞增殖，参见图12所示，在本实施例3负载EGCG纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架上，细胞随着时间增长增殖，且相比实施例1，本实施例3的细胞增殖量较大，相比于实施例2，本实施例3的细胞增殖量也较大。
EGCG释放研究
对实施例3制备的负载EGCG纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架进行EGCG释放研究：将同等重量的实施例3制备的负载EGCG纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架加入24孔板中，37℃下每孔加入1ml的磷酸缓冲盐溶液(PBS)，浸泡壳聚糖-海藻酸钠复合支。每隔两天取出1ml的溶液，即提取液，加入1ml的新鲜磷酸缓冲盐溶液(PBS)。在273nm波长下测定所述提取液的吸光度。然后根据标准EGCG曲线的斜率确定EGCG释放浓度。测定EGCG随时间变化的释放率。参见图13所示，可看出本实施例中，EGCG随时间的变化释放率增大，第10天释放率最大超过1.5μm，第10天以后逐渐减小，第16天低于1.0μm。本实施例的ECGC释放率大于实施例2的ECGC释放率。
实施例4
参见图2，本实施例中一种负载EGCG纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架的制备方法，包括步骤S1)-步骤S3)。
具体的
S1)制备质量浓度为4mg/ml包载EGCG的壳聚糖纳米颗粒悬浮液；本步骤中包括步骤S11)至步骤S13)。参见图3，S11)制备壳聚糖-EGCG混合液，即将EGCG加入质量浓度为5mg/ml的壳聚糖溶液中，直至EGCG的浓度达到100μM，并充分混合，之后用浓度为1N的NaOH调节壳聚糖溶液的PH至4.8，得到壳聚糖-EGCG混合液。S12)将三磷酸钠溶液滴加至所述壳聚糖-EGCG混合液中，之后连续搅拌1h后，形成的纳米颗粒悬浮液用高速离心机以15000rpm离心30分钟，再用蒸馏水洗涤2次后，放入-80℃中速冻，然后在-20℃下冷冻干燥24h制备得到包载EGCG的纳米颗粒。S13)将包载EGCG的壳聚糖纳米颗粒加入到纯化水中，制成质量浓度为4mg/ml的包载EGCG的壳聚糖纳米颗粒悬浮液。
S2)提供质量浓度为20mg/ml壳聚糖溶液、质量浓度为20mg/ml的海藻酸钠溶液；将所述壳聚糖溶液、所述海藻酸钠溶液与所述质量浓度为4mg/ml的包载EGCG的壳聚糖纳米颗粒悬浮液混合，得到负载EGCG纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架的混合液，将制备的所述负载EGCG纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架的混合液置入于聚氟乙烯板的模型孔中，每个模型孔加入250μl的搅拌后的溶液，再在温度-20℃条件下冷冻24h，之后再在-20℃条件下冷冻干燥24h，得到负载EGCG纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架冻干品。
S3)将所述的负载EGCG纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架冻干品在质量浓度为30mg/ml氯化钙溶液中浸泡10分钟至20分钟，然后在体积浓度为1.0％v/v戊二醛溶液中浸泡10分钟至20分钟,之后冷冻干燥得到所述负载EGCG纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架。
电镜扫描
本实施例4的负载EGCG纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架的形貌参见图10和图11所示。图11是图10材料的局部放大图。在本实施例4负载EGCG纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架成多孔的网络结构，且包载EGCG壳聚糖纳米颗粒均匀分布在复合支架中。相比于实施例1，本实施例4负载了EGCG，相比于实施例2，本实施例4的EGCG的负载量较大，相比于实施例3，本实施例4的EGCG的负载量也较大。
细胞增殖实验
按照实施例1的方法，对本实施例4的负载EGCG纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架进行细胞增殖，参见图12所示，在本实施例4负载EGCG纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架上，细胞随着时间增长增殖，且相比实施例1，本实施例4的细胞增殖量较大，相比于实施例2，本实施例4的细胞增殖量也较大，相比实施例3，本实施例4的细胞增殖量较小。
EGCG释放研究
对实施例4制备的负载EGCG纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架进行EGCG释放研究：将同等重量的实施例4制备的负载EGCG纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架加入24孔板中，37℃下每孔加入1ml的磷酸缓冲盐溶液(PBS)，浸泡壳聚糖-海藻酸钠复合支。每隔两天取出1ml的溶液，即提取液，加入1ml的新鲜磷酸缓冲盐溶液(PBS)。在273nm波长下测定所述提取液的吸光度。然后根据标准EGCG曲线的斜率确定EGCG释放浓度。测定EGCG随时间变化的释放率。参见图13所示，可看出本实施例4中，EGCG随时间的变化释放率增大，第10天释放率最大超过3.0μm，第10天以后逐渐减小，第16天低于1.0μm。本实施例4的ECGC释放率大于实施例2与实施例3的ECGC释放率。
当然本发明中并不仅限于上述实施例，还可以调整各组分之间的质量比或者体积百分比形成其他的可行方案。例如制备所述包载EGCG的壳聚糖纳米颗粒悬浮液时，所述EGCG与壳聚糖质量比可以为1:10；也可以是1:100；所述壳聚糖-EGCG混合液和三磷酸钠溶液体积比可以为7：2；也可以是3：2；也可以是7:8；上述的方案仅限于用以说明本发明的其他可行方案，并不用以限定本案。
以上对本申请实施例所提供的一种负载EGCG纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本申请的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本申请的方法及其核心思想；同时，对于本领域的技术人员，依据本申请的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本申请的限制。

Claims (4)

1.一种负载 EGCG 纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架，用于间充质干细胞增殖，其特征在于，所述负载 EGCG 纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架由包载 EGCG 的壳聚糖纳米颗粒、壳聚糖以及海藻酸钠组成，且所述包载EGCG 的壳聚糖纳米颗粒、所述壳聚糖、所述海藻酸钠的质量比为1:3-8:3-8；其中，所述 EGCG 为(2R,3R)-5,7-二羟基-2-(3,4,5-三羟基苯基)色烷-3-基3,4,5-三羟基苯酸酯。
2.一种负载 EGCG 纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1)制备质量浓度为 2 mg/ml～8 mg/ml 的包载 EGCG 的壳聚糖纳米颗粒悬浮液；
S2)提供质量浓度为 10 mg/ml～40 mg/ml 的壳聚糖溶液、质量浓度为 10 mg/ml～40mg/ml 的海藻酸钠溶液；将所述壳聚糖溶液、所述海藻酸钠溶液与所述包载 EGCG 的壳聚糖纳米颗粒悬浮液混合，其中所述壳聚糖溶液与所述海藻酸钠溶液的体积比为 1-2:1-2，且包载 EGCG 的壳聚糖纳米颗粒、壳聚糖、海藻酸钠的质量比为1:3-8:3-8，得到负载 EGCG纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架的混合液，将所述负载 EGCG 纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架的混合液冷冻干燥制备得到负载 EGCG 纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架冻干品；
S3)将所述负载 EGCG 纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架冻干品在质量浓度为20mg/ml～40 mg/ml 氯化钙溶液中浸泡 10 分钟至 20 分钟，然后在体积浓度为 0.50 %v/v-2.0 % v/v 戊二醛溶液中浸泡 10 分钟至 20 分钟，之后冷冻干燥得到所述负载EGCG 纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架。
3.根据权利要求 2 所述的负载 EGCG 纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架的制备方法，其特征在于，在所述步骤 S1)中包括
S11) 将 EGCG 加入到质量浓度为5mg/ml 的壳聚糖溶液中并充分混合，直至 EGCG的浓度达到25μM~100μM，得到壳聚糖-EGCG 混合液，并调节所述壳聚糖-EGCG 混合液的 pH值至 4～5.5；
S12) 将三磷酸钠溶液滴加至所述壳聚糖-EGCG 混合液中，使所述壳聚糖-EGCG 混合液和三磷酸钠溶液体积比为 7：3～8：2，所述三磷酸钠溶液的质量浓度为 1 mg/ml～4 mg/ml；连续搅拌 1 小时，形成的纳米悬浮液用高速离心机以 10000 rpm-20000rpm 的高速离心 20 分钟-60 分钟，离心后，再经过-70℃至-85℃温度速冻后，于-15℃至-25℃的温度下冷冻干燥时间 12 小时至 36 小时，得到包载 EGCG 的壳聚糖纳米颗粒；
S13) 将包载 EGCG 的壳聚糖纳米颗粒加入到纯化水中，制成质量浓度为2 mg/ml～8mg/ml 的包载 EGCG 的壳聚糖纳米颗粒悬浮液。
4.根据权利要求 2 所述的负载 EGCG 纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架的制备方法，其特征在于，在所述步骤 S2)中包括将制备的所述负载 EGCG纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架的混合液置入于聚氟乙烯板的模型孔中，经过-70℃至-85℃温度速冻后，在-15℃至-25℃的温度下冷冻干燥时间为 12 小时至 36 小时，得到所述负载 EGCG 纳米颗粒的壳聚糖-海藻酸钠复合支架冻干品。
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