CN112881563A

CN112881563A - 检测过度加热肉制品的方法

Info

Publication number: CN112881563A
Application number: CN202110173003.5A
Authority: CN
Inventors: 张峰; 闫晓婷; 杨敏莉; 李银龙; 贺木易; 刘通
Original assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Current assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Priority date: 2021-02-08
Filing date: 2021-02-08
Publication date: 2021-06-01
Anticipated expiration: 2041-02-08
Also published as: CN112881563B

Abstract

本发明公开了一种检测过度加热肉制品的方法。该方法包括：利用碱性有机溶液将待测肉制品进行第一均质处理，以便得到第一均质后样本；将所述第一均质后样本进行第一超声离心处理，以便得到第一上清液和第一沉淀；利用酸性有机溶液将所述第一沉淀进行第二均质处理，以便得到第二均质后样本；将所述第二均质后样本进行第二超声离心处理，以便得到第二上清液；将所述第一上清液和所述第二上清液干燥后复溶，以便得到待测液；以及利用超高效液相色谱‑质谱系统对所述待测液进行检测，以便得到加热相关标志物，基于所述标志物确认所述待测肉制品是否过度加热。该方法样品处理简单、检测的准确性、选择性和灵敏度较高。

Description

检测过度加热肉制品的方法

技术领域

本发明涉及分析化学领域，具体地，涉及检测过度加热肉制品的方法。

背景技术

肉类富含蛋白质、脂肪和微量元素，是为人类提供营养的重要食品。此外，它还是铁、锌、硒等可吸收的微量元素和维生素的重要来源，在人类饮食结构中发挥着重要作用。在人类饮食的进化过程中，热处理在食物的制备中起着重要的作用，可以提高食物的口感、风味、消化率等。然而，不科学的加工技术，例如，过度加热，使肉制品存在隐患。在加热过程中，美拉德反应引起的脂质氧化以及相关的副反应将产生大量化合物，使烤肉具有诱人的风味。然而，在某些情况下,极高温度处理会导致致癌物质的形成，产生许多对人类健康有害的化合物,包括已知的杂环芳香胺类物质,多环芳烃类物质、脂质过氧化物和自由基等。国际癌症研究机构(IARC)评估了加工肉制品消费与罹患癌症风险之间的相关性，其中加工肉制品被列为一类致癌物。大量研究表明，过度食用加工制品会增加人患结肠癌、乳腺癌和胃癌的风险。而烤鸭、烤乳猪、新疆烤肉等烤制产品则是中国著名的传统食品，以其独特的香味和诱人的风味享誉世界，是人类饮食不可缺少的组成部分。此外，市场上的烧烤产品，如即食肉类，由于其方便和美味越来越受欢迎。因此，应建立相关的方法来监测热处理程度，以最大限度地提高其营养和健康，并将其潜在危害降到最低。

肉类加工终点温度的检测方法有很多，大致可以将其分为两类。一，加热后的感官评价，是最直观、最容易被接受的鉴别方法。但是，这种方法不够准确和客观，受个体差异的影响较大；二,通过将物理参数的变化与温度建立起联系，来实现对温度的判断，如ELISA,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，凝固测试，红外光谱法,差示扫描量热法等。提供了更科学、准确、耐用的检测温度的方法。然而这些方法效率低，操作繁琐。此外，这些方法主要针对低温(40-80℃)。对于高温加工的判断，却未见报道。

由此，检测过度加热肉制品的方法有待改进。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种检测过度加热肉制品的方法，基于超高效液相色谱-串联高分辨质谱技术，结合化学计量学检测过度加热肉制品，具有快速、简便和高效的优点。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种检测过度加热肉制品的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：利用碱性有机溶液将待测肉制品进行第一均质处理，以便得到第一均质后样本；将所述第一均质后样本进行第一超声离心处理，以便得到第一上清液和第一沉淀；利用酸性有机溶液将所述第一沉淀进行第二均质处理，以便得到第二均质后样本；将所述第二均质后样本进行第二超声离心处理，以便得到第二上清液；将所述第一上清液和所述第二上清液干燥后复溶，以便得到待测液；以及利用超高效液相色谱-质谱系统对所述待测液进行检测，以便得到加热相关标志物，基于所述标志物确认所述待测肉制品是否过度加热。

根据本发明实施例的检测过度加热肉制品的方法，采用超高效液相色谱-串联高分辨质谱对待测肉制品进行检测，并基于加热相关标志物判断待测肉制品是否过度加热。该方法样品处理简单、检测的准确性、选择性和灵敏度较高。

另外，根据本发明上述实施例的检测过度加热肉制品的方法，还可以具有如下附加的技术特征：

根据本发明的实施例，所述碱性有机溶液为含有NaOH的乙酸乙酯溶液。

根据本发明的实施例，所述酸性有机溶液为含有HCL的正己烷溶液。

根据本发明的实施例，所述超高效液相色谱-质谱系统的色谱条件为：色谱条件：色谱柱Waters BEH C18，规格为2.1×50mm,1.8μm粒径；柱温：40℃；流速：0.3mL/min；进样量：5μL。

根据本发明的实施例，所述色谱的洗脱条件为：A：10mM醋酸铵，B：乙腈，流速为0.3mL/min。初始梯度为30％B和70％A，保持3mins。

根据本发明的实施例，所述超高效液相色谱-质谱系统的质谱条件为：离子源：HESI源；离子源参数：离子传输管温度350℃；喷雾电压：3.6kV；鞘气流速：40arb，辅助气流速：10arb；正、负模式下的t-SIM扫描和MS/MS扫描的分辨率分别为35000FWHM和17500；自动增益控制(AGC)目标：SIM和MS/MS分别为5e4和2s5；隔离窗口：4.0m/z。

根据本发明的实施例，利用超高效液相色谱-质谱系统对所述待测液进行检测，基于标志物的浓度，判断所述待测肉制品的加热温度，以便确认所述待测肉制品是否过度加热。

根据本发明的实施例，所述肉制品为猪肉制品。

根据本发明的实施例，所述标志物为选自肌酸、肌酸酐、PhIP(2-氨基-1-甲基-6-苯基-咪唑[4,5-b]吡啶)和毒嘧啶至少一种。

根据本发明的实施例，所述肌酸的浓度为48.17±0.95～14.59±1.13ng，则加热温度为150-180摄氏度；所述肌酸的浓度为14.59±1.13～4.00±0.14ng，则加热温度为180-200摄氏度；所述肌酸的浓度为4.00±0.14～0.30±0.01ng，则加热温度为200-230摄氏度。

根据本发明的实施例，所述肌酸酐的浓度为97.00±4.38～137.04±6.90ng，则加热温度为150-180摄氏度；所述肌酸酐的浓度为137.04±6.90～167.43±4.22ng，则加热温度为180-200摄氏度；所述肌酸酐的浓度为167.43±4.22～275.58±5.82ng，则加热温度为200-230摄氏度。

根据本发明的实施例，所述PhIP的浓度为0.25±0.005～0.58±0.02ng，则加热温度为150-180摄氏度；所述PhIP的浓度为0.58±0.02～2.06±0.12ng，则加热温度为180-200摄氏度；所述PhIP的浓度为2.06±0.12～14.95±0.63ng，则加热温度为200-230摄氏度。

根据本发明的实施例，所述毒嘧啶的浓度为0.52±0.02～1.05±0.02ng，则加热温度为150-180摄氏度；所述毒嘧啶的浓度为1.05±0.02～8.04±0.29ng，则加热温度为180-200摄氏度；所述毒嘧啶的浓度为8.04±0.29～25.02±1.25ng，则加热温度为200-230摄氏度。

根据本发明的实施例，利用所述超高效液相色谱-质谱系统对所述待测液进行所述检测后，基于OPLS-DA模型，确定所述标志物的浓度。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明一个实施例的100℃及230℃条件加热下正、负模式下的总离子流示意图；

图2显示了根据本发明一个实施例的PCA模拟验证的结果示意图；

图3显示了根据本发明一个实施例的OPLS-DA模拟验证的结果示意图；

图4显示了根据本发明一个实施例的OPLS-DA模拟验证的结果示意图；

图5显示了根据本发明一个实施例的VIP结果示意图；

图6显示了根据本发明一个实施例的标志物质谱二级谱图示意图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。

根据本发明实施例的检测过度加热肉制品的方法，根据标志物的含量，能够在150-230℃范围内准确判断猪肉的加热温度。

根据本发明的实施例，该碱性有机溶液为含有NaOH的乙酸乙酯溶液。由此，有效提取肉制品中的碱性化合物。

根据本发明的实施例，该酸性有机溶液为含有HCL的正己烷溶液。由此，有效提取肉制品中的酸性化合物。

根据本发明的实施例，该超高效液相色谱-质谱系统的色谱条件为：色谱条件：色谱柱Waters BEH C18，规格为2.1×50mm,1.8μm粒径；柱温：40℃；流速：0.3mL/min；进样量：5μL。由此，有效分离待测液中的各化合物，峰型好，检测的准确性高。

根据本发明的实施例，该色谱的洗脱条件为：A：10mM醋酸铵，B：乙腈，流速为0.3mL/min。初始梯度为30％B和70％A，保持3mins。由此，待测液中的各化合物分离效果好。

根据本发明的实施例，所述超高效液相色谱-质谱系统的质谱条件为：离子源：HESI源；离子源参数：离子传输管温度350℃；喷雾电压：3.6kV；鞘气流速：40arb，辅助气流速：10arb；正、负模式下的t-SIM扫描和MS/MS扫描的分辨率分别为35000FWHM和17500；自动增益控制(AGC)目标：SIM和MS/MS分别为5e4和2s5；隔离窗口：4.0m/z。由此，待测液中的化合物的检测的准确度和灵敏度高。

根据本发明的实施例，利用超高效液相色谱-质谱系统对待测液进行检测，基于标志物的浓度，判断该待测肉制品的加热温度，确认待测肉制品是否过度加热。

根据本发明的实施例，该肉制品为猪肉制品。根据本发明的实施例，该标志物为选自肌酸、肌酸酐、PhIP(2-氨基-1-甲基-6-苯基-咪唑[4,5-b]吡啶)和毒嘧啶至少一种。发明人研究发现，上述化合物在过度加热猪肉制品和非过度加热猪肉制品中存在显著差异，并且在150-230℃范围内，基于上述化合物的浓度可以比较准确地确定加热温度。具体的，可以基于上述标志物中的任意一种或几种判断猪肉制品的加热温度。

根据本发明的实施例，利用超高效液相色谱-质谱系统对待测液进行所述检测后，基于OPLS-DA模型，确定标志物的浓度。

下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Sigma公司。

实施例1

本实施例中，基于超高效液相色谱-串联高分辨质谱结合化学计量学，利用本发明实施例的方法对不同加热温度的猪肉进行过度加热检测，并判断加热温度，具体如下：

1.1试剂与仪器

Q-Exactive-Ultimate 3000超高效液相色谱-质谱仪(美国Thermo Fisher公司)；分离色谱柱为C18色谱柱(ACQUITY UPLC BEH C18(3.0mm×100mm,1.7μm))；均质器(德国IKA公司)；高速离心机(美国Beckman Coulter公司)；涡旋混匀器(美国ScientificInstruments公司)。

甲醇(色谱纯，美国Thermo Fisher公司)；甲酸(色谱级，北京百灵威科技有限公司)；实验用水由Milli-Q超纯水系统制备。

1.2样本的采集与制备

1.2.1样本采集：为避免筛选出的标志物和猪肉产地相关，新鲜里脊瘦肉从三个有代表性的地区：北京、黑龙江和浙江当地的批发市场购买。猪肉在-20℃保存。为保证不同的样本间唯一变量为加热温度，同一产地的猪肉来自同一块。取猪肉5±0.1g，切成大小为4cm*4cm*3mm的片状。将烤箱提前预热至相应的处理温度，在100℃、160℃、200℃、230℃条件下烘烤，每面5分钟。烤盘上抹大豆油后使用，不添加盐和香料。烤制10mins后室温冷却，切至小块备用。-20℃保存。

1.2.2非靶向代谢物提取：为避免化合物信息的丢失，采用两步提取法以提取烤猪肉中尽可能多的、具有不同理化性质的化合物。

A.碱性化合物提取：将烤好的猪肉放入50mL EP管中，加入5mL 1mol/l NaOH，7mL乙酸乙酯。在室温下6000rpm均质1min，每个样品之间用甲醇/水(1:1)彻底清洗匀浆器，避免样品间交叉污染。然后进行2min涡旋和30min的超声提取。之后在4℃，9000rpm的条件下离心10min，收集上清液中为碱性化合物。

B.在剩余的沉淀物中加入10ml 1mol/l HCL和5ml正己烷，按照步骤(A)的方法进行处理，其上清液中为酸化合物。

C.将(A)和(B)两步上清液在氮气下吹干，共同复溶于1ml乙腈中，然后在4℃13000rpm条件下离心10min，0.22μm微孔滤膜(尼龙膜)过滤后进行上机待测。

1.2.3标志物定量：准确称量2g烤猪肉，加入50mL Eppendorf管中，加入5mL 1molL^-1NaOH，乙酸乙酯10mL。然后采用上述的均质、涡旋、超声提取、离心等步骤(非靶向代谢物提取)。上清液在氮气下蒸发干燥，用1ml乙腈复溶。将浓缩物转移到2ml的Eppendorf管中，管中装有50mg的C18粉末。然后涡旋3mins，并以13000rpm离心5mins。上清液经0.22μm尼龙注射器滤器过滤后，进行质谱分析。

1.3色谱与质谱工作条件

色谱条件：色谱柱Waters BEH C18(2.1×50mm,1.8μm particle size)；柱温：40℃；流速：0.3mL/min；进样量：5μL。

筛查色谱参数：流动相为溶液A：10mM醋酸铵和B：乙腈，流速为0.3mL/min。初始梯度为30％B，保持1min，9min增加到65％，10min增加到95％，保持7mins，2min内恢复到初始状态，保持2mins。

定量色谱参数：流动相为溶液A：10mM醋酸铵和B：乙腈，流速为0.3mL/min。初始梯度为30％B和70％A，保持3mins。

质谱条件：UHPLC-Q-Orbitrap分析仪(Thermo Fisher Scientifi)。离子源：HESI源；离子源参数：离子传输管温度350℃；喷雾电压：3.6kV；鞘气流速：40arb，辅助气流速：10arb。

筛查色谱参数：正、负模式下的全扫描和MS/MS扫描的分辨率分别为70,000FWHM和17,500FWHM。扫描范围为100-1000m/z。AGC目标：le6，一级最大离子注入时间：100ms。碰撞池采用梯度碰撞能量：40％、50％、60％

定量质谱参数：正、负模式下的t-SIM扫描和MS/MS扫描的分辨率分别为35,000FWHM和17,500，AGC目标：SIM和MS/MS分别为5e4和2s5，隔离窗口设置为4.0m/z。

1.4数据处理和差异标志物的鉴定

使用Xcalibur(3.0版ThermoFisher Scientific,Waltham,Massachusetts)对原始数据进行峰检测、峰比对、峰面积归一化和过滤等操作。根据QC样品中所有特征的峰值面积计算CV％值，以评估数据的精度；根据指南，CV＞10％的化合物不稳定，需从数据中剔除。随后，根据p-value和log2差异倍数(fold-change)过滤出具有统计学意义的化合物。将筛选后的化合物信心提交到SIMCA 14.1软件(Umetrics,Sweden)进行统计分析。然后，建立OPLS-DA模型，计算变量的VIP值。

1.5定量数据分析

准确称取标志物标准品各约10mg分别置于10mL容量瓶中，用少量乙腈溶解后，再用乙腈定容至10mL，可得1mg/mL的标准品储备液，置于-20℃冰箱中保存，待用。分别精密移取标准品储备液100μL至10mL容量瓶中，用乙腈定容至10mL,混匀，可得到10μg/mL标志物混合标准溶液，混标溶液储存于4℃冰箱中待用。原液用乙腈依次稀释至0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10、20、50、100、200、250μg/L。使用美国Thermo Fisher Scientific公司的Xcalibur3.2.63定性分析软件计算外标法中标志物的峰面积，构建R²＞0.999标准曲线。然后根据标准曲线方程计算不同温度加工后猪肉中目标化合物的浓度。

2结果与讨论

2.1不同加热温度猪肉代谢轮廓分析

100℃处理的猪肉有机提取物与230℃处理的猪肉有机提取物有明显差异。从图1可以看出，一些化合物的含量增加了，而另一些化合物含量则减少了。从原始数据中共提取出了11549个化合物。

2.2主成分分析

采用PCA来确定不同温度下的猪肉样本是否呈明显的温度聚集趋势。在不同温度下烤猪肉样本的PCA得分图中，100℃、160℃、200℃、230℃和QC样本的聚类差异显著。如PCA图所示(图2-5)，QC样本紧密聚集，说明仪器漂移极小。并且不同温度处理的猪肉样品组之间的明显分离是由于样品间的真实生物学差异造成的，而不是仪器漂移造成的。PCA得分图显示不同温度处理的猪肉之间存在明显分离。100℃处理的猪肉与230℃加热的猪肉明显分离，这说明在高温处理过程中代谢产物变化较大。整个PCA图的聚合趋势主要基于温度，而不是猪肉的产地。因此，我们可以得出如下结论：加工处理温度对所选择物质浓度的影响比产地对其影响更大。

2.3正交偏最小二乘判别分析与差异标志物的鉴定

对OPLS-DA模型进行模拟验证，如图4所示，R2(R2<0.5)and Q2(Q2<0)表明模型可信度高。以同时满足VIP≥0.9、P-value<0.05和log2 fold-change>1或<-1 3个条件为原则筛选出显著差异物质。最后，数据库初步匹配(质量偏差<10ppm)，在排除其中的大分子物质和后选定4个潜在标志物。后根据标准品对比结果，4种标志物(肌酸，肌酐，毒嘧啶，PhIP)的保留时间和质谱二级数据与标准品一致(图6)，故选为最终标志物。表1为所选标志物的所选标志物的M/Z、fold change、P值(P-values)和VIP值。

表1所选标志物的M/Z、fold change、P-值及VIP值

2.4标志物的定量

随着加工温度的升高，烤制猪肉中毒嘧啶及PhIP的含量稳步上升。当温度从150℃升高到180℃时，标志物的含量变化很小。而当温度超过180℃时，标志物的浓度开始显著增加。表2为不同温度所选标志物的含量变化。

表2标志物在150-230℃内的含量变化

实施例2

将曾加热到200℃左右的猪肉，采用本发明实施例的方法，利用实施例1获得的标志物，进行加热温度判断。检测方法如下：

1)前处理准确称量2g烤猪肉，加入50mL Eppendorf管中，加入5mL 1mol L^-1NaOH，乙酸乙酯10mL。然后采用上述的均质、涡旋、超声提取、离心等步骤(非靶向代谢物提取)。上清液在氮气下蒸发干燥，用1ml乙腈复溶。将浓缩物转移到2ml的Eppendorf管中，管中装有50mg的C18粉末。然后涡旋3mins，并以13000rpm离心5mins。上清液经0.22μm尼龙注射器滤器过滤后，进行质谱分析。

2)定量分析

定量质谱参数：正、负模式下的t-SIM扫描和MS/MS扫描的分辨率分别为35,000FWHM和17,500。AGC目标：SIM和MS/MS分别为5e4和2s5。隔离窗口设置为4.0m/z。

建立标准曲线：使用美国Thermo Fisher Scientific公司的Xcalibur3.2.63定性分析软件计算外标法中标志物的峰面积，构建R²＞0.999标准曲线。然后根据标准曲线方程计算不同温度加工后猪肉中目标化合物的浓度。

3)样品测量结果如下：

根据实施例1中所述的方法，由此可以算出所选标志物的含量分别为14.6ng/g、135.2ng/g、0.56ng/g及1.05ng/g，由此可以推断出加热温度为180-200℃，与该肉曾加热到200℃左右的实际情况相符，表明本发明实施例的方法，可以准确判断是否为过度加热肉制品，以及加热的温度范围。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims

1.一种检测过度加热肉制品的方法，其特征在于，包括：

利用碱性有机溶液将待测肉制品进行第一均质处理，以便得到第一均质后样本；

将所述第一均质后样本进行第一超声离心处理，以便得到第一上清液和第一沉淀；

利用酸性有机溶液将所述第一沉淀进行第二均质处理，以便得到第二均质后样本；

将所述第二均质后样本进行第二超声离心处理，以便得到第二上清液；

将所述第一上清液和所述第二上清液干燥后复溶，以便得到待测液；以及

利用超高效液相色谱-质谱系统对所述待测液进行检测，以便得到加热相关标志物，基于所述标志物确认所述待测肉制品是否过度加热。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述碱性有机溶液为含有NaOH的乙酸乙酯溶液，

任选地，所述酸性有机溶液为含有HCL的正己烷溶液。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述超高效液相色谱-质谱系统的色谱条件为：

色谱条件：色谱柱Waters BEH C18，规格为2.1×50mm,1.8μm粒径；

柱温：40℃；

流速：0.3mL/min；

进样量：5μL。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述色谱的洗脱条件为：A：10mM醋酸铵，B：乙腈，流速为0.3mL/min。初始梯度为30％B和70％A，保持3mins。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述超高效液相色谱-质谱系统的质谱条件为：

离子源：HESI源；

离子源参数：离子传输管温度350℃；

喷雾电压：3.6kV；

鞘气流速：40arb，辅助气流速：10arb；

正、负模式下的t-SIM扫描和MS/MS扫描的分辨率分别为35000FWHM和17500；

自动增益控制(AGC)目标：SIM和MS/MS分别为5e4和2s5；

隔离窗口：4.0m/z。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，利用超高效液相色谱-质谱系统对所述待测液进行检测，基于所述标志物的浓度，判断所述待测肉制品的加热温度，以便确认所述待测肉制品是否过度加热。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述肉制品为猪肉制品。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述标志物为选自肌酸、肌酸酐、2-氨基-1-甲基-6-苯基-咪唑[4,5-b]吡啶(PhIP)和毒嘧啶至少一种。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述肌酸的浓度为48.17±0.95～14.59±1.13ng，则加热温度为150-180摄氏度；

所述肌酸的浓度为14.59±1.13～4.00±0.14ng，则加热温度为180-200摄氏度；

所述肌酸的浓度为4.00±0.14～0.30±0.01ng，则加热温度为200-230摄氏度，

任选地，所述肌酸酐的浓度为97.00±4.38～137.04±6.90ng，则加热温度为150-180摄氏度；

所述肌酸酐的浓度为137.04±6.90～167.43±4.22ng，则加热温度为180-200摄氏度；

所述肌酸酐的浓度为167.43±4.22～275.58±5.82ng，则加热温度为200-230摄氏度，

任选地，所述PhIP的浓度为0.25±0.005～0.58±0.02ng，则加热温度为150-180摄氏度；

所述PhIP的浓度为0.58±0.02～2.06±0.12ng，则加热温度为180-200摄氏度；

所述PhIP的浓度为2.06±0.12～14.95±0.63ng，则加热温度为200-230摄氏度，

任选地，所述毒嘧啶的浓度为0.52±0.02～1.05±0.02ng，则加热温度为150-180摄氏度；

所述毒嘧啶的浓度为1.05±0.02～8.04±0.29ng，则加热温度为180-200摄氏度；

所述毒嘧啶的浓度为8.04±0.29～25.02±1.25ng，则加热温度为200-230摄氏度。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，利用所述超高效液相色谱-质谱系统对所述待测液进行所述检测后，基于OPLS-DA模型，确定所述标志物的浓度。