CN112876532A

CN112876532A - 一种基于光化学的蛋白质标记方法

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Publication number: CN112876532A
Application number: CN201911196728.5A
Authority: CN
Inventors: 王方军; 罗盼; 刘哲益; 肖春雷
Original assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Current assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date: 2019-11-29
Filing date: 2019-11-29
Publication date: 2021-06-01
Anticipated expiration: 2039-11-29
Also published as: CN112876532B

Abstract

本发明涉及一种基于光化学反应的蛋白质原位标记新方法。该方法利用光照射于流经纳升流通池中的蛋白质样品溶液，激发样品溶液中的卤离子产生卤素自由基，并与水溶液中的溶解氧联合作用于蛋白质，从而实现对蛋白质的氧化标记。本发明操作简便，无需添加双氧水，因此消除了现有方法中双氧水对蛋白质活性结构的影响，可在生物兼容性的缓冲液中实现蛋白质的原位标记，结合后续质谱分析可以实现对蛋白质结构的表征。

Description

一种基于光化学的蛋白质标记方法

技术领域

本发明涉及一种基于光化学的蛋白质原位标记新方法，可利用光源产生的光作用于含有卤离子的蛋白质溶液并产生活性氧物种用于蛋白质的原位标记。

背景技术

蛋白质足迹法是一种将化学修饰或者降解反应用于检测蛋白质溶剂可接触面积的变化从而实现对蛋白质结构和构象的动态变化进行分析的技术。基于蛋白质降解的分析技术通常依赖于分子尺寸较大的蛋白酶而导致其对目标蛋白质的空间分辨率低，而基于小分子的化学修饰技术可以有效克服这一缺陷。多数小分子印迹试剂的目标反应基团通常较为单一，而羟基自由基能与蛋白质上多种氨基酸侧链发生高活性反应，可以提供丰富的位点和结构信息，因此，在目前蛋白质足迹法中应用最为广泛。

目前常用的羟基自由基产生方法主要包括电子脉冲辐射、水同步辐射、激光光解双氧水、Fenton和Fenton-like反应、歧化过氧亚硝酸等方法。激光光解双氧水是目前蛋白质足迹法中最常用的羟基自由基产生方法，其通过紫外激光诱导水溶液中过氧化氢发生均裂而生成羟基自由基。然而，长时间激光照射、过氧化氢及其产生的羟基自由基均会对蛋白质的结构产生负面影响，从而影响蛋白质构象的准确检测。目前，通过采用纳升流通池可以实现对蛋白质的单脉冲照射，同时在蛋白质缓冲液中加入自由基清除剂可以降低瞬时高浓度羟基自由基对蛋白质结构的影响。但是，双氧水对蛋白质结构的影响依旧无法避免。本发明提出了一种卤离子介导的蛋白质足迹法，由光源产生的光照射于流经纳升流通池中的蛋白质样品溶液，激发样品溶液中的卤离子产生卤素自由基，并与溶液中的溶解氧联合作用于蛋白质，从而实现对蛋白质的化学标记，通过质谱分析检测标记位点及标记效率从而得到蛋白质结构信息。该方法不仅避免了常规方法中双氧水对蛋白结构的影响，并可获得与激光裂解双氧水标记方法同等的氧化标记效果，因此可以获得更加准确的蛋白质结构信息。

发明内容

本发明涉及一种新型的基于光化学反应的蛋白质原位标记新方法。通过光照射于流经纳升流通池中的蛋白质样品溶液，激发样品溶液中的卤离子产生卤素自由基，并与水溶液中的溶解氧联合作用于蛋白质，从而实现对蛋白质的原位标记。该方法简便快捷，且无需常规方法中的双氧水，可以得到更加准确的蛋白质结构信息。

本发明提供但不限制于下述基于光辅助的蛋白质原位标记新方法：

1)样品溶于含卤离子和自由基清除剂的缓冲液中；

2)光波长为130～700nm,能量为10μJ～100mJ，脉冲频率为1-100 1；

3)样品溶液经由注射泵注射到毛细管中，并在流经光窗时被光束照射并迅速氧化标记样品溶液中的蛋白质，收集标记后的样品于离心管中；

4)标记后的样品溶液依据样品性质进行后续样品处理后并使用质谱进行相应的分析检测。

本发明的最大特征在于：基于卤离子的光化学反应并联合溶解氧在能保持蛋白质结构的条件下实现对蛋白质的氧化标记，避免了常规分析中双氧水可能对蛋白结构的影响。体现本发明特征与优点的典型实施例将在以下的说明中详细叙述。以下描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。所描述的实施例仅用于图示说明，而不是对本发明范围的限制。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明操作简便，无需添加双氧水，因此消除了现有方法中双氧水对蛋白质活性结构的影响，可在生物兼容性的缓冲液中实现蛋白质的原位标记，结合后续质谱分析可以实现对蛋白质结构的表征。

附图说明

图1为BSA酶解肽段溶液体系进行光标记前后的十条肽段MALDI质谱分析结果对比图；

图2为不含卤素离子的溶液条件下，缓冲液浓度对BSA酶解物示例肽段氧化效果的影响结果图；

图3为BSA完整蛋白溶液体系的光标记数据库匹配结果。

具体实施方式

实施例1

牛血清白蛋白酶解液的标记分析：

1、装置搭建：截取一段75μm石英毛细管，一端通过二通阀与注射泵相连接，然后用火焰将毛细管开一个长度大约为2mm的窗口，光源产生的193nm光通过250mm聚焦透镜聚焦于毛细管窗口上(光斑直径大约2mm)，光能量大约6mJ，光频率设定为8Hz，光照射总时间为30s；

2、取100μg预先用trypsin酶解好的BSA酶解肽段溶于150μL含有150mM氯离子的0.1mM PBS缓冲液(pH＝7)，再添加1mM谷氨酰胺水溶液作为自由基清除剂，最终BSA酶解肽段溶液浓度为1μM,样品溶液中溶解氧气浓度为15mg/mL.

3、将样品溶液吸入500μL注射器中，注射泵流速设定为20μL/min，样品溶液经由注射泵注射到毛细管中，在经过光窗时被聚焦后的光作用于蛋白溶液产生的活性氧自由基迅速氧化标记，最终流入装有过氧化氢酶和甲硫氨酸混合溶液的离心管中。，每一个实验进行三次重复；

4、分别取标记前后的混合样品溶液0.5μL点靶，待晾干后在上方滴加0.5μLDHB基质待溶液干燥；

5、将标记前后的样品点靶后进行AB Sciex 5800飞行时间质谱仪检测。

分析结果：由图1可见，对于BSA酶解蛋白溶液，很多条酶解肽段可以被高度氧化标记，包括SLHTLFGDELCK、QEPERNECFLSHKDDSPDLPK、NECFLSHKDDSPDLPK、LKPDPNTLCDEFK、AWSVAR、YICDNQDTISSK、DAIPENLPPLTADFAEDK、DVCK RPCFSALTPDETYVPK、TVMENFVAFVDK、CCAADDKEACFAVEGPK等。结果说明在不添加双氧水的条件下，光照射样品溶液可以产生活性氧物种用于样品氧化标记。根据质谱可以鉴定出被氧化的氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸。

实施例2

不含卤素离子的牛血清白蛋白酶解液标记分析：

1、装置搭建：截取一段75μm毛细管，一端通过二通阀与注射泵相连接，然后用火焰将毛细管远离注射器的末端开一个宽度大约为2mm的窗口，光源产生的400nm光通过250mm聚焦透镜聚焦于毛细管窗口上(光斑大约2mm)，光能量大约100mJ，光频率设定为10Hz，光照射总时间为2min；

2、取五管冻干后的100μg BSA酶解肽段分别溶于150μL的0mM、0.01mM、0.1mM、1mM、10mM不含氯离子的PB缓冲液(pH＝2)，再添加20mM谷氨酰胺水溶液作为自由基清除剂，最终BSA酶解肽段溶液浓度为1mM,样品溶液中溶解氧气浓度为1mg/mL；

3、将样品溶液吸入500μL注射器中，注射泵流速设定为20μL/min，样品溶液经由注射泵注射到毛细管中，在经过光窗时被聚焦后的光作用于蛋白溶液产生的活性氧自由基迅速氧化标记，最终流入装有过氧化氢酶和甲硫氨酸混合溶液的离心管中。每一个实验进行三次重复；

4、取标记后混合样品溶液0.5μL点靶，待晾干后在上方滴加0.5μL DHB基质待溶液干燥；

5、将样品进行AB Sciex 5800飞行时间质谱仪检测。

分析结果：选择肽段³¹⁹DAIPENLPPLTADFAEDKDVCK³⁴⁰、⁵⁰⁸RPCFSALTPDETYVPK⁵²³来分析实验结果。由图2可见，在不含氯离子，改变PB缓冲液浓度的条件下，BSA trypsin酶解肽几乎不能被氧化。由本实验得知光源产生的光作用于流经纳升流通池中的样品溶液，激发氯离子产生氯自由基，并与水溶液中的溶解氧联合作用于蛋白质进行氧化标记。

实施例3

不同卤素离子的牛血清白蛋白酶解液标记分析：

1、装置搭建：截取一段75μm毛细管，一端通过二通阀与注射泵相连接，然后用火焰将毛细管远离注射器的末端开一个宽度大约为2mm的窗口，光源产生的300nm光通过250mm聚焦透镜聚焦于毛细管窗口上(光斑大约2mm)，光能量大约40mJ，光频率设定为1Hz，光照射总时间为10min；

2、取五管冻干后的100μg BSA酶解肽段分别溶于150μL的含10mM氯离子、10mM氟离子、10mM溴离子、10mM碘离子的PBS缓冲液(pH＝7)，再添加50mM谷氨酰胺水溶液作为自由基清除剂，最终BSA酶解肽段溶液浓度为100μM,样品溶液中溶解氧气浓度为50mg/mL；

5、将样品进行AB Sciex 5800飞行时间质谱仪检测。

分析结果：由质谱检验结果得知当蛋白溶液中添加的氯离子替换成其他卤素离子包括氟溴碘离子都可对蛋白质进行标记。因此当光源产生的光作用于流经纳升流通池中的样品溶液，激发卤素离子产生卤素自由基，并与水溶液中的溶解氧联合作用于蛋白质进行氧化标记。

实施例4

牛血清白蛋白完整蛋白的标记分析：

1、装置搭建：截取一段75μm毛细管，一端通过二通阀与注射泵相连接，然后用火焰将毛细管远离注射器的末端开一个宽度大约为2mm的窗口，光源产生的130nm光通过250mm聚焦透镜聚焦于毛细管窗口上(光斑大约2mm)，光能量大约100μJ，光频率设定为100Hz,样品溶液中溶解氧气浓度为100mg/mL，光照射总时间为30s；

2、取100μg BSA完整蛋白溶于150μL的含有1M氯离子的500mM碳酸氢铵缓冲液(pH＝10)，再添加100mM苯丙酰胺水溶液作为自由基清除剂，最终BSA完整蛋白溶液浓度为10μM；

4、将标记前后的样品经trypsin过夜酶解后除盐；

5、将冻干样品复溶后上样0.1μg进行LTQ Orbitrap Elite质谱仪分析检测后进行数据库匹配。

分析结果：由图3可见，对于BSA完整蛋白溶液酶解后经高分辨质谱检测以及与BSA数据库匹配结果可以看出，光标记后，一些酶解肽段的标记效率有显著提升，例如DTHKSEIAHRFK、VASLRETYGDMADCCEK、ETYGDMADCCEK、ETYGDMADCCEKQEPER、KFWGKYLYEIAR、IETMREK、ALKAWSVAR、CCTKPESERMPCTEDYLSLILNR、MPCTEDYLSLILNR、LFTFHADICTLPDTEKQIK、TVMENFVAFVDK、TVMENFVAFVDKCCAADDKEACFAVEGPK。此外由质谱数据可以得知亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺侧链可以被氧化标记。结果说明在不添加双氧水的条件下，光照射样品溶液可以用于蛋白结构的氧化标记。

Claims

1.一种基于光化学的蛋白质标记方法，其特征在于：利用光照射含有卤离子的蛋白质溶液，于含有溶解氧的溶液中直接实现对蛋白质的氧化标记。

2.根据权利要求1所述的蛋白质标记方法，其特征为：于含有卤离子的蛋白质水溶液中，光激发卤离子产生卤素自由基，并与水溶液中的溶解氧联合作用于蛋白质，从而实现蛋白质的氨基酸侧链进行氧化标记。

3.根据权利要求1或2所述的蛋白质标记方法，其特征为：含有卤离子的蛋白质溶液流经带透光光窗的纳升流通池，在光激发下实现蛋白质氧化标记。

4.根据权利要求1-3所述的蛋白质标记方法，其特征为：纳升流通池为石英、MgF₂、LiF等透光材质制成的透明流通池。

5.根据权利要求1-3所述的蛋白质标记方法，其特征在于：所述的光源发射波长为130～700nm，光能量为100μJ～100mJ，光频率为1-100Hz，光照射总时间为30s-10min；

所述的卤离子包括氯离子、溴离子、氟离子和碘离子中的一种或二种以上，其于溶液中的浓度为10mM～1M；

溶液中氧气含量在1～100mg/L。

6.根据权利要求1-5任一所述的蛋白质标记方法，其特征在于：所述的蛋白质溶液中包含但不限于具有pH缓冲性能的离子盐和自由基清除剂；

所述的离子盐包括但不限于磷酸钠或碳酸氢铵，pH值2～10，缓冲盐浓度为0.01mM～500mM；

所述的自由基清除剂为具有降低自由基浓度功能的溶液，包括但不限于谷氨酰胺或苯丙氨酸等中的一种或二种，清除剂浓度为1mM～100mM。

7.根据权利要求1或2所述的蛋白质标记方法，其特征在于：所述的蛋白质溶液中包括单一蛋白质、蛋白质混合物、蛋白质-小分子混合物或蛋白质-蛋白质复合物，其于溶液中的浓度为1μM-1mM。

8.根据权利要求2所述的蛋白质标记方法，其特征为：氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸中的一种或二种以上。