CN112870433B - DFO和rhBMP-2协同激发成骨的复合支架及其制备方法和应用 - Google Patents

DFO和rhBMP-2协同激发成骨的复合支架及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了DFO和rhBMP‑2协同激发成骨的复合支架及其制备方法和应用。本发明的载DFO和rhBMP‑2的复合支架，以表面接枝有DFO的MBG支架为基体，所述基体表面载有PEGS凝胶层，所述PEGS凝胶层内部载有rhBMP‑2。本发明通过精确控制DFO和rhBMP‑2在材料中的固载方式和空间分布调控其在体内外的功能发挥，通过激活低氧诱导因子HIF‑1α及其下游多种因子表达功能联合rhBMP‑2协同实现“靶细胞快速富集‑血管新生‑原位引导骨再生”的全方位修复。

Description

DFO和rhBMP-2协同激发成骨的复合支架及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及材料科学及医学领域，具体涉及微纳多级结构MBG支架和功能化PEGS为基质构建同时负载DFO和rhBMP-2的制备方法及其应用，特别是用于自身再生能力弱的骨病患者的支架材料。
背景技术
骨组织修复与再生的过程主要为骨骼的重建以及在重建过程中一系列的时空协调机制，包括特定微环境的形成、骨基质细胞的募集、血管的重建以及原位诱导内成骨等。因此，构建有利于激发靶细胞募集和血管重建的微环境是实现快速启动成骨过程的关键，是优化和强化引导骨再生材料的主要手段。研究表明，低氧微环境可通过激活低氧诱导因子HIF-1α，从而激活其下游VEGF、SDF-1及其他与血管生成和干细胞募集相关信号因子的表达。由此可见，低氧微环境产生的HIF-1α可激发多个成骨启动功能因子，为同时快速激活骨修复初期靶细胞富集和血管形成提供新的思路。而如何构建低氧微环境是过程的关键。近年来研究发现，临床上使用的缺氧模拟剂去铁胺DFO能够通过螯合铁离子，竞争铁离子与α酮戊二酸间的结合位点，降低脯氨酸羟化酶的活性，抑制HIF-1α的降解来并稳定其活性，从而有效地诱导血管新生/血管形成以及内源性骨再生和骨缺损的愈合。然而，高剂量的DFO不仅具有较大的细胞毒性和血管内半衰期较短等突出问题，而且对rhBMP-2的成骨活性有一定的负面影响。因此，尚需研究设计功能基体材料，使其能够负载DFO和rhBMP-2且精确调控DFO和rhBMP-2在体内外的时空分布，降低负面效应。
发明内容
本发明的目的在于提供一种“时空负载、时序释放”低氧模拟药物DFO和生长因子rhBMP-2的大孔/微米孔/介孔多级结构MBG复合支架及制备方法和应用。
本发明的第一方面，提供一种载DFO和rhBMP-2的复合支架，所述复合支架以表面接枝有DFO的MBG支架为基体，所述基体表面载有PEGS凝胶层，所述PEGS凝胶层内部载有rhBMP-2。
在另一优选例中，所述基体表面具有两层PEGS凝胶层，第一PEGS凝胶层在所述基体表面，第二PEGS凝胶层在所述第一PEGS凝胶层表面，所述rhBMP-2在所述第二PEGS凝胶层内。
本发明的“时空负载、时序释放”低氧模拟药物DFO和生长因子rhBMP-2的大孔/微米孔/介孔多级结构MBG复合支架，以多级结构介孔生物玻璃为基体，在其介孔内外表面分别通过戊二醛化学交联和叠氮化PEG聚癸二酸丙三醇酯(PEGS)固载DFO和rhBMP-2。
本发明的复合支架是一种能够模拟低氧微环境，使低氧诱导因子HIF-1α的高效、稳定表达的支架，通过化学接枝药物DFO可原位提升多种与血管生成和祖细胞募集相关的信号因子的表达水平。
在另一优选例中，rhBMP-2与DFO通过PEGS涂层进行隔离后分别固载在MBG支架上，rhBMP-2与DFO同时存在多级孔的孔表面。
在另一优选例中，所述MBG支架为具有200μm-500μm大孔，1-3μm微孔和2-5nm介孔的多级孔MBG支架。
在另一优选例中，所述多级孔MBG支架具有良好的连通孔结构。
在另一优选例中，所述表面接枝是指内、外表面接枝，即MBG支架内、外表面均接枝有DFO。
在另一优选例中，所述基体表面是指基体内、外表面，即基体内、外表面均负载有PEGS涂层。
在另一优选例中，所述复合支架的铁离子螯合能力为5-20μmol/g。
在另一优选例中，所述复合支架的铁离子螯合能力为8-15μmol/g，较佳为10μmol/g。
在另一优选例中30天体外rhBMP-2因子释放在10～24wt％。
在另一优选例中，所述PEGS凝胶层厚度在1-2μm。
在另一优选例中，所述rhBMP-2的负载量为0.005-0.1μg rhBMP-2/mg支架。
在另一优选例中，所述rhBMP-2的负载量为0.01-0.08μg rhBMP-2/mg支架，较佳为0.02-0.05μg rhBMP-2/mg支架。
本发明的第二方面，提供第一方面所述的复合支架的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
i)提供MBG支架和PEGS预聚体；
ii)将DFO接枝在MBG支架表面，获得基体；
iii)将叠氮化PEGS预聚体与rhBMP-2混合，涂覆于步骤ii)获得的所述基体支架的表面，再涂覆炔基化PEGS预聚体形成内部载有rhBMP-2的PEGS凝胶层，从而获得所述复合支架；
或者将将叠氮化PEGS预聚体和炔基化PEGS预聚体溶液先后涂覆于MBG-DFO支架上形成PEGS凝胶隔离层，再负载rhBMP-2，形成内部载有rhBMP-2的PEGS凝胶层，从而获得所述复合支架。
在本发明中，通过硅氧烷偶联剂-戊二醛-DFO将低氧模拟药物化学接枝在MBG支架介孔内外表面得到MBG-DFO支架。在另一优选例中，步骤ii)中将DFO接枝在MBG支架表面时，使用APTMS，戊二醛和DFO的希夫碱反应共价连接DFO。
在另一优选例中，步骤ii)中通过以下步骤将DFO接枝在MBG支架表面：
ii-1)MBG支架与3-氨丙基三甲氧硅烷(APTMS)反应，得到表面氨基化的MBG支架MBG-NH2；
ii-2)MBG-NH2与戊二醛反应，得到中间产物MBG-CHO支架；
ii-3)MBG-CHO支架与DFO反应，将DFO接枝在MBG支架表面，得到MBG-DFO支架。
在另一优选例中，步骤ii-1)中，3-氨丙基三甲氧硅烷(APTMS)的加入量是0.5-2ml/gMBG支架。
在另一优选例中，将MBG支架干燥后浸入无水甲苯中，然后加入3-氨丙基三甲氧硅烷(APTMS)并使其溶解于甲苯中，将混合物在80℃下反应24小时。弃去上清液，用甲苯和无水乙醇分别洗涤支架3次，然后将支架放置于60℃真空烘箱中干燥24小时，得到表面氨基化的MBG支架(MBG-NH2)。
在另一优选例中，步骤ii-2)中，每克MBG-NH2加入1-4ml 25％戊二醛。
在另一优选例中，将表面氨基化的MBG支架(MBG-NH2)浸入超纯水中，加入戊二醛，将混合物在37℃下搅拌反应6小时，得到中间产物MBG-CHO支架，用超纯水洗涤支架3次并干燥。
在另一优选例中，步骤ii-3)中，DFO的加入量为0.1-0.8g DFO/g MBG-CHO支架，较佳为0.5g DFO/g MBG-CHO支架。
在另一优选例中，将MBG-CHO支架与DFO加入超纯水中，于37℃下反应6小时，然后用超纯水洗涤支架并放置于60℃真空烘箱中干燥，得到MBG-DFO支架。
在另一优选例中，所述叠氮化PEGS预聚体通过以下步骤获得：
(a-1)PEG、癸二酰氯和三乙胺反应得到癸二酰氯化PEG；癸二酰氯化PEG与缩水甘油、三乙胺反应得到两端成环的长链单体；该单体与癸二酸和四丁基溴化铵通过开环反应得到侧链含有裸露羟基的PEGS分子，标记为HPEGS；HPEGS与马来酸酐反应生成马来酸功能化PEGS，标记为HPEGS-M；
(a-2)在二环己基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺与HPEGS-M的分离产物中加入3-叠氮基丙胺和三乙胺反应得到叠氮化PEGS预聚体，标记为HPEGS-Az。
在另一优选例中，将功能化的PEGS预聚体：叠氮化PEGS预聚体PEGS-Az和炔基化PEGS预聚体PEGS-DBCO分别溶解在PBS溶液中，使用注射器在室温下先后滴加在MBG-DFO支架上在分钟内形成PEGS凝胶隔离层。
在另一优选例中，将叠氮化PEGS预聚体和炔基化PEGS预聚体溶液先后涂覆于MBG-DFO支架上形成PEGS凝胶隔离层后，再负载rhBMP-2通过以下步骤实现：将叠氮化PEGS预聚体与rhBMP-2均匀混合后涂覆于PEGS凝胶隔离层后再涂覆炔基化PEGS预聚体，形成内部载有rhBMP-2的PEGS凝胶层。
在另一优选例中，预聚体溶液浓度为20-40wt％，较佳为30wt％。
在另一优选例中，所述炔基化PEGS预聚体通过以下步骤获得：
(a-1)PEG、癸二酰氯和三乙胺反应得到癸二酰氯化PEG；癸二酰氯化PEG与缩水甘油、三乙胺反应得到两端成环的长链单体；该单体与癸二酸和四丁基溴化铵通过开环反应得到侧链含有裸露羟基的PEGS分子，标记为HPEGS；HPEGS与马来酸酐反应生成马来酸功能化PEGS，标记为HPEGS-M；
(a-2)加入3-叠氮基丙胺和三乙胺反应得到叠氮化PEGS预聚体，标记为HPEGS-Az；
HPEGS-M与二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺反应后，加入氨基化二苯基环辛炔和三乙胺，反应得到炔基化PEGS预聚体，标记为HPEGS-DBCO。
本发明的第三方面，提供第一方面所述的复合支架的用途，用于制备骨组织修复材料或用作生长因子、药物负载基质或载体。
在另一优选例中，所述骨组织修改材料为骨缺损填充材料或引导骨再生材料。
本发明以具有激活低氧诱导因子HIF-1α及其下游多种因子表达功能的缺氧模拟剂去铁胺(DFO)和rhBMP-2联合构建原位激发再生材料。所述复合支架以多级结构介孔生物玻璃为基体，在其介孔内外表面分别通过戊二醛化学交联和叠氮化PEG聚癸二酸丙三醇酯(PEGS)固载DFO和rhBMP-2。通过精确控制DFO和rhBMP-2在材料中的固载方式和空间分布调控其在体内外的功能发挥，通过激活低氧诱导因子HIF-1α及其下游多种因子表达功能联合rhBMP-2协同实现“靶细胞快速富集-血管新生-原位引导骨再生”的全方位修复。从细胞水平和动物原位缺损修复实验全面阐明DFO与rhBMP-2的时空分布和时序释放对细胞募集、血管形成和成骨分化等过程的调控规律，提出模拟低氧微环境与rhBMP-2协同激发骨再生的理论模型。这种低氧模拟药物/rhBMP-2复合支架促进了骨修复过程，提高骨修复质量，是一种具有临床应用前景的骨修复支架。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。说明书中所揭示的各个特征，可以被任何提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
通过阅读以下参照附图对非限制性实施例所做的详细描述，本发明的其他特征、目的和优点将会变得更加明显：
图1为本发明“隔离式”负载低氧模拟药物DFO和生长因子rhBMP-2的多级结构介孔生物玻璃复合支架材料的结构示意图。
图2为支架表征图：(A)自上而下，MBG、及其依次接枝APTMS(MBG-NH2)、戊二醛(MBG-CHO)和DFO(MBG-DFO)的红外光谱图；(B)MBG(下)、MBG-DFO(上)的固体核磁共振谱图；(C)PEGS预聚体和水凝胶的红外光谱图，自上而下是PEGS-Az预聚物，PEGS-DBCO预聚物，PEGS水凝胶；(D)PEGS水凝胶形貌；(E)B@M和D@M+B@P复合支架的rhBMP-2缓释曲线；(F)通过EDS面扫描检测D@M+B@P复合支架的铁离子螯合能力；(G)SEM和TEM分析复合支架大孔/介孔结构和形貌。
图3为通过HIF-1α蛋白免疫荧光染色分析各组支架材料的模拟低氧微环境能力。
图4为通过BMSCs和HUVECs细胞迁移实验分析各组支架材料的体外细胞募集能力。
图5示出各组支架材料促进细胞成血管和成骨能力：(A)HUVECs体外芽体生长和成血管相关蛋白VEGF表达；(B)ALP染色。
图6示出通过大鼠股骨远端缺损修复的动物实验分析B@M和D@M+B@P复合支架的体内成血管和成骨能力：(A)血管生成Micro-CT；(B)骨缺损修复Micro-CT。
图7为对术后2周、4周和8周的组织切片进行成骨相关蛋白Col I免疫荧光染色图，对各组复合支架的骨修复能力进行分析。
具体实施方式
本申请的发明人结合临床需求经过广泛而深入地研究，通过DFO所创造的低氧微环境可同时激活多种生长因子，与rhBMP-2联合可实现快速激发和高效成骨。考虑到游离DFO对机体的毒性及其对rhBMP-2诱导成骨活性的潜在影响，通过希夫碱反应将DFO化学接枝于MBG支架孔表面，用具有优异的生物相容性的PEGS水凝胶将DFO与rhBMP-2隔离，同时水凝胶包裹因子rhBMP-2后可持续释放，实现两者在材料中不同空间分布，以及体内的不同时序释放。发明人探究DFO与rhBMP-2协同调控组织形成的规律与机制，制备可以快速富集骨组织修复过程中成骨相关细胞的和促进其分化以及血管的形成的复合支架，实现“快速激发和高效成骨”。在此基础上，完成了本发明。
术语说明
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。
如本文所用，术语“MBG”、“多级结构介孔生物玻璃”可互换使用。
如本文所用，术语“F127”、“聚氧乙烯聚氧丙烯醚”可互换使用。
如本文所用，术语“PEGS”、“PEG化聚癸二酸甘油酯”可互换使用。
如本文所用，术语“DFO”、“去铁胺”可互换使。
如本文所用，术语“PEG”、“聚乙二醇”可互换使用。
如本文所用，术语“B@M”、“D@M+B@P”、其中@代表负载，+代表包裹。
在本发明中，在MBG支架上负载rhBMP-2得到B@M支架；在MBG-DFO支架上涂覆包裹rhBMP-2的PEGS水凝胶，得到D@M+B@P支架。
如本文所用，术语“磷酸盐缓冲液”、“PBS”可互换使用。
如本文所用，术语“大鼠间充质干细胞”、“rBMSCs”可互换使用。
复合支架
目前，关于低氧模拟药物DFO在血管化以及骨前体细胞募集方面的作用已经得到广泛认可，同时rhBMP-2则是目前公认的诱导成骨分化的生长因子，那么根据这两种FDA批准的DFO与rhBMP-2的药物和因子的不同功能与特性设计构建新型功能基体材料将会是构建激发再生材料的理想方案。然而，高剂量的DFO不仅具有较大的细胞毒性和血管内半衰期较短等突出问题，而且对rhBMP-2的成骨活性有一定的负面影响。为此，本申请开发出一种复合支架，能够负载DFO和rhBMP-2且精确调控DFO和rhBMP-2在体内外的时空分布，旨在降低负面效应，从而最大限度地协同引导骨组织再生。
本申请的复合支架具有激活HIF信号通路及协同成骨能力。本申请通过对支架上负载药物和因子的差异，研究了MBG支架，单一负载rhBMP-2的MBG支架，以及“时空负载、时序释放”DFO和rhBMP-2的MBG支架对间充质干细胞和的血管内皮细胞募集和迁移，体外成血管分化、成骨分化的影响及体内骨组织修复过程。最终得到新型高效的骨修复生物材料并深入研究协同促进成骨的基本规律和基质。提出并建立低氧微环境、rhBMP-2及其与支架材料协同原位激发骨再生的理论模型。该发明紧密结合临床需求，具备临床应用前景。
制备方法
本发明中，聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯预聚体的制备方法包括以下步骤：
在无水无氧的手套箱里称取分子量600-3000g/mol的PEG，癸二酰氯，三乙胺，缩水甘油。将PEG与一定量的癸二酰氯和三乙胺在低温环境(最佳0度)下反应24小时得到癸二酰氯化PEG。
然后将该产物与缩水甘油在甲苯溶液中混合均匀，低温环境下与三乙胺反应得到两端成环的长链单体。
进一步将该单体与癸二酸和四丁基溴化铵混溶于DMF溶液中，通过开环反应得到侧链含有丰富裸露羟基的PEGS高分子聚合物(HPEGS)。
透析纯化获得纯化的PEGS高分子聚合物所述聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯预聚体用于后续叠氮化和炔基化修饰。
马来酸功能化PGES(HPEGS-M)的制备方法包括以下步骤：
在无水无氧的手套箱里称取分子量600-3000g/mol的PEG，癸二酰氯，三乙胺，缩水甘油。将PEG与一定量的癸二酰氯和三乙胺在低温环境(最佳0度)下反应24小时得到癸二酰氯化PEG。
然后将该产物与缩水甘油在甲苯溶液中混合均匀，低温环境下与三乙胺反应得到两端成环的长链单体。
进一步将该单体与癸二酸和四丁基溴化铵混溶于DMF溶液中，通过开环反应得到侧链含有丰富裸露羟基的PEGS大分子(HPEGS)。将HPEGS分子与等量的马来酸酐混合于二甲基甲酰胺(DMF)溶液中反应生成马来酸功能化PEGS(HPEGS-M)。
叠氮基团功能化HPEGS-Az的制备方法包括以下步骤：
将二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶解二甲基亚砜(DMSO)中，于氩气环境中加入到含有HPEGS-M的DMSO溶液中，室温静得到沉淀物质。在该分离产物中加入3-叠氮基丙胺和三乙胺反应得到HPEGS-Az。
炔基化PEGS预聚物HPEGS-DBCO的制备方法包括以下步骤：
将HPEGS-M在氩气环境下加入到含DCC/NHS的DMSO溶液中，进一步加入氨基化二苯基环辛炔和三乙胺，于室温下反应得到HPEGS-DBCO。
在另一优选例中，所述PEG分子量600-3000g/mol，羧基接枝率20％-60％。通过凝胶渗透色谱得到PEGS预聚物HPEGS-M重均分子量约为30000Da的HPEGS-M。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件(如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件)或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1
炔基化PEGS预聚物和叠氮化PEGS预聚物的制备
在无水无氧的手套箱里称取5g环氧化PEG(Mn＝500D)，2.02g癸二酸和44mg四丁基溴化铵作为催化剂。将上述物质溶解于二甲基甲酰胺(DMF)并混合，加热(最佳100度)反应72小时得到侧链含有丰富裸露羟基的PEGS大分子。通过凝胶渗透色谱得到PEGS高分子数均分子量约为10000Da。将该PEGS(7g)与羟基等摩尔量的马来酸酐(2g)混合于DMF溶液中，100℃反应1小时生成马来酸功能化PEGS。
叠氮化PEGS的制备方法包括以下步骤：
在氩气环境中，将4.12g二环己基碳二亚胺(DCC)和2.3g N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶解二甲基亚砜(DMSO)中，并加入到含有9g上述马来酸化PEGS的DMSO溶液中。充分混合后，加入100mg 3-叠氮基丙胺和100mg三乙胺室温反应过夜得到叠氮化PEGS。
炔基化PEGS的制备方法与叠氮化PEGS类似，包括以下步骤：
在氩气环境中，将4.12g二环己基碳二亚胺(DCC)和2.3g N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶解二甲基亚砜(DMSO)中，并加入到含有9g上述马来酸化PEGS的DMSO溶液中。充分混合后，加入100mg氨基化二苯并环馨炔和100mg三乙胺室温反应过夜得到炔基化PEGS。
实施例2
本实施例涉及MBG、B@M和D@M+B@P支架的可控制备
(a)大孔/微米孔/介孔多级结构MBG支架的制备
参考文献Niu H,Lin D,Tang W,et al.Surface topography regulatesosteogenic differentiation of MSCs via crosstalk between FAK/MAPK and ILK/β-catenin pathways in a hierarchically porous environment.ACS BiomaterialsScience&Engineering,2017，制备大孔/微米孔/介孔多级结构MBG支架。分别以PU海绵、聚丙烯酸微球、F127为大孔、微米孔、介孔模扳剂制备介孔大小为2-20nm的多级孔MBG支架。
(b)MBG-DFO支架的制备
MBG的氨基化：将200mg MBG支架干燥后浸入100mL无水甲苯中，然后加入600μL 3-氨丙基三甲氧硅烷(APTMS)并使其溶解于甲苯中，将混合物在80℃下反应24小时。弃去上清液，用甲苯和无水乙醇分别洗涤支架3次，然后将支架放置于60℃真空烘箱中干燥24小时，得到表面氨基化的MBG支架(MBG-NH2)。
MBG-DFO的合成：将上述反应得到的200mg MBG-NH2支架浸入100mL超纯水中，加入4mL戊二醛(25％)，将混合物在37℃下搅拌反应6小时，得到中间产物MBG-CHO支架，用超纯水洗涤支架3次并干燥。然后，将200mg MBG-CHO支架与100mg DFO加入100mL超纯水中，于37℃下反应6小时，然后用超纯水洗涤支架并放置于60℃真空烘箱中干燥，得到MBG-DFO支架。
(c)B@M(MBG负载rhBMP-2)支架的制备
使用PBS测量支架(10mm×10mm×3mm3)的饱和吸附体积为250μL。将1μg的rhBMP-2溶解于125μL浓度为30％的炔基化PEGS预聚物中，先涂覆于MBG支架，再涂覆125微升浓度为30％的叠氮化PEGS预聚物来交联，等待数分钟交联，得到负载了rhBMP-2的MBG支架，命名为B@M。
对于制备D@M+B@P支架，先在MBG-DFO支架表面涂覆一层PEGS水凝胶涂层，然后将包裹rhBMP-2的水凝胶涂覆表面，具体地，先用30％的炔基化PEGS预聚物涂覆MBG-DFO支架，再涂覆125微升浓度为30％的叠氮化PEGS预聚物来交联，交联后形成PEGS水凝胶涂层。将1μg的rhBMP-2溶解于125μL浓度为30％的炔基化PEGS预聚物中，先涂覆于涂覆有PEGS水凝胶涂层的MBG-DFO支架，再涂覆125微升浓度为30％的叠氮化PEGS预聚物来交联，交联后得到D@M+B@P支架。如图1所示，形成了固载DFO和rhBMP-2的复合支架。涂覆凝胶的厚度通过SEM图可观察计算，约为2μm。
实施例3
本实施例涉及复合支架的DFO接枝和铁离子螯合能力表征及rhBMP-2的缓释能力表征
为了检测实施例1制备的叠氮基团功能化HPEGS-Az和炔基化PEGS预聚物HPEGS-DBCO和实施例2制备的MBG-DFO是否成功合成，使用红外光谱仪(Nicolet6700，美国)并通过衰减全反射的方法对材料的化学组成进行测定。使用热熔涂膜法对产物进行分析，收集范围为4000-800cm-1，通过分析红外光谱图中各个基团的特征振动峰分析材料的化学结构。并结合使用碳核磁共振测定法对MBG-DFO的化学结构进行分析。对于铁离子螯合能力表征，通过电感耦合等离子体发射光谱法(ICP-OES)和能谱分析(EDS)对MBG-DFO支架进行定量和定性分析。
对于rhBMP-2的缓释能力表征，首先将含有2μg的rhBMP-2的B@M支架(20mg)在-40℃下真空冷冻干燥过夜，浸泡于PBS中，分别于1，2，3，4，7，10，14，21，28天测试溶液中rhBMP-2的含量，使用酶联免疫吸附试验ELISA测试rhBMP-2的含量来制作释放曲线。
Figure BDA0002903738130000131
从图2的A-C中可以看出。DFO已经成功接枝到MBG支架上，并且功能化PEGS(叠氮基团功能化HPEGS-Az和炔基化PEGS预聚物HPEGS-DBCO)也成功合成。
如图2中E所示，B@M支架和D@M+B@P支架都可以缓慢释放rhBMP-2，D@M+B@P支架具有更好的缓释作用。28天累计释放rhBMP-2的百分率约为20％。
分别制备30％浓度的炔基化PEGS和叠氮化PEGS，再进行混合后等待数分钟制备凝胶。由图2的D可见功能化的PEGS预聚体可形成水凝胶。
图2的F为铁离子螯合EDS图，接枝DFO后支架具有强烈的铁离子螯合能力，根据吸附定量测试可得螯合能力约为10μmol/g。
图2的G为D@M+B@P复合支架的SEM图，可见支架复合后仍具有孔结构。
实施例4
本实施例涉及各组支架材料的模拟低氧微环境能力
为研究各组支架材料的模拟低氧微环境能力，通过对HIF-1α进行荧光染色，对rBMSCs细胞低氧环境相关蛋白的表达进行检测。将rBMSCs以1×105个细胞/孔的密度接种在各组支架上，培养24小时后固定细胞，进行免疫荧光染色观察。
如图3所示，对HIF-1α蛋白在rBMSCs细胞内的分布和核内聚集情况进行了研究。结果显示，MBG和B@M组差异不大，HIF-1α蛋白均大量分布在细胞质内，细胞核内几乎没有表达。但是D@M+B@P组的HIF-1α蛋白几乎全部聚集在细胞核内，表明D@M+B@P组具有最优的HIF-1α核内聚集和表达能力。
实施例5
本实施例涉及各组支架材料的体外细胞募集能力
为了探究各组支架材料的体外细胞募集能力，以BMSCs和HUVECs为细胞研究对象，使用聚碳酸酯膜Transwell 24孔板(膜孔径8μm，Corning，美国)对各组材料募集rBMSCs和HUVECs细胞能力进行检测。消化细胞并重悬，细胞悬液内加入2％FBS，以细胞密度1×104个细胞/孔将细胞接种至Transwell上室(每孔100μL)。向下室加入各组支架材料和2％FBS的培基，培养24小时后，吸去上室培基，用棉签小心将上室细胞擦去，使用显微镜对下室细胞进行拍照，并对多个视野内的细胞数量进行统计。
如图4所示，与MBG组和B@M组相比，D@M+B@P组明显增加了rBMSCs和HUVECs迁移数量，促进了早期干细胞和内皮募集；结果表明，接枝DFO能诱导干细胞和内皮细胞迁移，且两者具有协同作用，精准调控DFO和rhBMP-2的时空分布能够显著促进干细胞早期募集，为后续成骨分化提供良好的细胞微环境。
实施例6
本实施例涉及各组支架材料体外促进细胞成血管和成骨能力在体外通过人脐静脉内皮细胞的成管能力来分析各组支架材料体外促进细胞成血管能力。将HUVECs以2×104个细胞/孔的密度接种在24孔板中的各组支架上，每2天更换培基，培养7天。吸去培基，用PBS洗涤支架3次，在支架上加入200μL胰酶，收集细胞消化液。将不含生长因子的基质胶(BDBiosciences)在4℃下解冻，冰上操作将100μL基质胶加入48孔板中。然后将48孔板放于37℃凝胶30分钟。将上述细胞消化浮液以2×104个细胞/孔的细胞密度接种在基质胶上。将孔板放在37℃细胞培养箱中培养4小时后，通过光学显微镜观察芽体形成，并使用NIH ImageJ 1.45软件对每个区域的毛细管总长度和分叉点数量进行计算。通过荧光染色VEGF蛋白，对HUVECs中成血管相关蛋白的表达进行检测。将HUVECs以1×105个细胞/孔的密度接种在各组支架上。培养24小时后，用PBS洗涤支架3次，在支架上加入200μL胰酶，收集细胞消化液并将其重悬于新的24孔板中，加入培基24小时。吸去培基，用PBS清洗支架后，每孔加入1mL2.5％戊二醛固定细胞15分钟，用PBS清洗支架3次，然后每孔加入1mL 0.1％Triton X-100溶液，渗透细胞15分钟。随后，每孔加入1mL 5％BSA溶液，孵育细胞1小时。吸掉封闭液后，用BSA溶液将VEGF一抗原液以1：500稀释并加入孔板中，在4℃下染色过夜。然后，吸掉一抗并清洗3次，加入Alexa
Figure BDA0002903738130000151
标记的二抗溶液(用BSA溶液以1：500稀释二抗原液)，在室温下避光孵育2小时。使用FITC-鬼笔环肽(Sigma，St Louis，USA)对HUVECs细胞骨架进行荧光染色。在避光环境下，每孔加入1mL浓度为5μg/mL的FITC-鬼笔环肽溶液，室温孵育45分钟，用PBS清洗3次。使用激光共聚焦显微镜(CLSM，A1，Nikon，Japan)对各组细胞的染色情况进行观察。
对于各组支架的成骨活性，通过检测碱性磷酸酶ALP活性来研究MBG、B@M和D@M+B@P支架对rBMSC的成骨诱导效果。将经过灭菌处理的支架放在24孔板中，每孔加入1mLα-MEM培基浸润支架24小时。然后吸掉培基，将rBMSCs细胞悬液以2×104个细胞/孔的密度接种于24孔板各支架上，放在37℃培养箱中培养，每2天更换新鲜培基。细胞培养3天和7天后，检测ALP活性。
如图5中A所示，通过对内皮细胞的成管图像和VEGF蛋白免疫荧光染色检测成血管能力。MBG组在培养4小时后，HUVECs没有出现明显的芽体生长；观察B@M组，细胞之间交流增强，已经有芽体的雏形产生。而D@M+B@P组的芽体发生情况非常显著，细胞之间丝状伪足相连并形成管状，其中D@M+B@P组具有最优的芽体生长能力。MBG支架培养的HUVECs细胞的VEGF表达较弱；与MBG组相比，B@M组细胞的VEGF表达少量增加，但没有显著性差异，而D@M+B@P组进一步促进了VEGF的表达，具有最高的VEGF表达。
如图5中B所示，负载rhBMP-2的实验组(B@M和D@M+B@P)的ALP表达显著高于MBG。
实施例7
本实施例涉及复合支架原位修复大鼠股骨缺损的表征
采用大鼠股骨远端缺损模型，研究了不同支架在体内的骨修复能力。实验所使用的雄性SD大鼠(平均体重300g，8周龄)均购于中国上海国家组织工程学中心，动物实验过程和实验动物护理均获得上海交通大学医学院附属第六人民医院动物研究委员会的批准。实验将大鼠随机分为两组进行：B@M和D@M+B@P。在手术之前，腹腔注射2.5％戊巴比妥钠(35mg/kg体重)对大鼠进行麻醉，然后在每只大鼠的股骨远端部位制切开1cm的线性皮肤切口，解剖肌肉暴露股骨髁。使用3mm直径的环锯(Surgident，Korea)在垂直于轴的方向钻出3mm直径的双皮质缺损，用生理盐水冲洗缺损处以避免组织热坏死，同时冲洗出骨碎片。随后，将支架植入缺陷处，然后逐层缝合伤口。术后连续三天肌肉注射抗生素以防感染。为了检测骨缺损处血管的形成，术后2、4和8周对上述实验大鼠实施安乐死，并用血管造影剂(Microfil，Flowtech，USA)进行血管灌注。术后2、4和8周取出股骨髁样品，放于4％多聚甲醛溶液中固定，然后通过Micro-CT对股骨髁样品进行检测。
如图6中A所示，通过微血管造影成像研究了材料植入2、4和8周后缺损部位的血管形成情况。从micro-CT图像中可以观察到明显的新形成的血管网络和骨缺损的轮廓。结果表明，术后2周时，B@M组只有少量新血管形成，而D@M+B@P组可见较多血管生成并延伸至缺损边缘。D@M+B@P组在术后各个时间点的血管体积均为最高，在缺损中心和周围均分布有大量血管网络，表明DFO和rhBMP-2隔开分布可以快速激发血管生成，协同快速实现骨组织再生。
如图6中B所示，Micro-CT结果直观表明了各组在大鼠股骨远端缺损的骨修复过程。单一负载rhBMP-2的B@M组在2周时缺损区域的骨体积显著低于D@M+B@P组，仅在靠近未缺损骨的附近区域依靠诱导能力形成了少量新骨组织；在8周时修复完全。相比于B@M组，D@M+B@P组在术后2周时形成大量骨小梁，并在4周时快速完成骨再生。证明了DFO和BMP-2隔开分布可以快速激发骨修复、实现骨再生。
实施例8
本实施例涉及复合支架原位修复大鼠股骨缺损的成骨相关蛋白Col I免疫荧光染色
在大鼠股骨远端植入材料后分别于2周，4周，8周取出整段股骨样品，进行脱钙、石蜡包埋和切片。并通过成骨相关蛋白Col I免疫荧光染色观察其成骨情况，来分析各组支架的体内成骨效果。具体实验方法如下：石蜡包埋与切片：样品浸泡4％中性多聚甲醛溶液，置于4℃冰箱内固定1周后，浸泡10％EDTA使样品脱钙至样品完全软化。采用梯度乙醇浸泡的方法进行脱水，依次在梯度乙醇中浸泡。将脱水后的样品放在模具中，60℃石蜡浸泡样品3小时后，冷却并包埋得到蜡块，将蜡块切成4.5μm厚度的切片。免疫组化染色：依次浸泡二甲苯，无水乙醇，乙醇和纯水进行脱蜡复水。再进行柠檬酸缓冲液抗原修复用10％山羊血清室温孵育60分钟进行封闭，然后按照抗体说明书配置一抗溶液并4℃孵育一抗过夜。PBST终止反应并清洗。37℃孵育HRP标记的羊抗小鼠IgG二抗30分钟，PBST终止反应并清洗。使用DAB显色试剂盒避光孵育至组织显示棕色后，流水冲洗10分钟，用苏木素染色。依次浸泡95％乙醇1分钟×2次，无水乙醇2分钟×2次，二甲苯2分钟×2次。最后用树脂和载玻片封片，用倒置显微镜进行观察和拍摄。
如图7显示，随着时间增长，负载rhBMP-2的两组支架上细胞的一型胶原表达显著增加，相比于B@M组，D@M+B@P组在后期具有更丰富的一型胶原表达。说明结合模拟低氧药物DFO和骨形态发生蛋白BMP-2具有更佳的成骨效果。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (19)

1.一种载DFO和rhBMP-2的复合支架，其特征在于，所述复合支架以表面接枝有DFO的MBG支架为基体，所述基体表面载有PEGS凝胶层，所述PEGS凝胶层内部载有rhBMP-2,
其中，所述基体表面具有两层PEGS凝胶层，第一PEGS凝胶层在所述基体表面，第二PEGS凝胶层在所述第一PEGS凝胶层表面，所述rhBMP-2在所述第二PEGS凝胶层内。
2.如权利要求1所述的复合支架，其特征在于，所述MBG支架为具有200 μm - 500 μm大孔，1-3 μm微孔和2-5 nm介孔的多级孔MBG支架。
3.如权利要求1所述的复合支架，其特征在于，所述表面接枝是指内、外表面接枝，即MBG支架内、外表面均接枝有DFO。
4.如权利要求1所述的复合支架，其特征在于，所述基体表面是指基体内、外表面，即基体内、外表面均负载有PEGS涂层。
5.如权利要求1所述的复合支架，其特征在于，所述复合支架的铁离子螯合能力为5-20μmol/g。
6.如权利要求1所述的复合支架，其特征在于，所述复合支架的铁离子螯合能力为8-15μmol/g。
7.如权利要求1所述的复合支架，其特征在于，所述复合支架的铁离子螯合能力为10 μmol/g。
8.如权利要求1所述的复合支架，其特征在于，所述PEGS凝胶层厚度在1-2 μm。
9.如权利要求1所述的复合支架，其特征在于，所述rhBMP-2的负载量为0.005-0.1 μgrhBMP-2/mg支架。
10.如权利要求1所述的复合支架，其特征在于，所述rhBMP-2的负载量为0.01-0.08 μgrhBMP-2/mg支架。
11.如权利要求1所述的复合支架的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
i) 提供MBG支架和PEGS预聚体；
ii) 将DFO接枝在MBG支架表面，获得基体；
iii) 将叠氮化PEGS预聚体和炔基化PEGS预聚体溶液先后涂覆于MBG-DFO支架上形成PEGS凝胶隔离层，再负载rhBMP-2，形成内部载有rhBMP-2的PEGS凝胶层，从而获得所述复合支架，
其中，所述的再负载rhBMP-2通过以下步骤实现：将叠氮化PEGS预聚体与rhBMP-2均匀混合后涂覆于PEGS凝胶隔离层后再涂覆炔基化PEGS预聚体，形成内部载有rhBMP-2的PEGS凝胶层。
12.如权利要求11所述的制备方法，其特征在于，步骤ii)中通过以下步骤将DFO接枝在MBG支架表面：
ii-1) MBG支架与3-氨丙基三甲氧硅烷（APTMS）反应，得到表面氨基化的MBG支架MBG-NH2；
ii-2) MBG-NH2与戊二醛反应，得到中间产物MBG-CHO支架；
ii-3) MBG-CHO支架与DFO反应，将DFO接枝在MBG支架表面，得到MBG-DFO支架。
13.如权利要求12所述的制备方法，其特征在于，步骤ii-1)中，3-氨丙基三甲氧硅烷（APTMS）的加入量是0.5-2 ml/gMBG支架。
14.如权利要求12所述的制备方法，其特征在于，步骤ii-2)中，每克MBG-NH2加入1-4ml25%戊二醛。
15.如权利要求12所述的制备方法，其特征在于，步骤ii-3)中，DFO的加入量为0.1-0.8g DFO / g MBG-CHO支架。
16.如权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述叠氮化PEGS预聚体通过以下步骤获得：
(a-1) PEG、癸二酰氯和三乙胺反应得到癸二酰氯化PEG；癸二酰氯化PEG与缩水甘油、三乙胺反应得到两端成环的长链单体；该单体与癸二酸和四丁基溴化铵通过开环反应得到侧链含有裸露羟基的PEGS分子，标记为HPEGS；HPEGS与马来酸酐反应生成马来酸功能化PEGS，标记为HPEGS-M；
(a-2) 在二环己基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺与HPEGS-M的分离产物中加入3-叠氮基丙胺和三乙胺反应得到叠氮化PEGS预聚体，标记为HPEGS-Az。
17.如权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述炔基化PEGS预聚体通过以下步骤获得：
(a-1) PEG、癸二酰氯和三乙胺反应得到癸二酰氯化PEG；癸二酰氯化PEG与缩水甘油、三乙胺反应得到两端成环的长链单体；该单体与癸二酸和四丁基溴化铵通过开环反应得到侧链含有裸露羟基的PEGS分子，标记为HPEGS；HPEGS与马来酸酐反应生成马来酸功能化PEGS，标记为HPEGS-M；
(a-2) HPEGS-M与二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺反应后，加入氨基化二苯基环辛炔和三乙胺，反应得到炔基化PEGS预聚体，标记为HPEGS-DBCO。
18.如权利要求1所述的复合支架的用途，其特征在于，用于制备骨组织修复材料或用作生长因子、药物负载基质或载体。
19.如权利要求18所述的用途，其特征在于，所述骨组织修复材料为骨缺损填充材料或引导骨再生材料。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150283182A1 (en) * 2008-10-30 2015-10-08 Vanderbilt University INJECTABLE ALLOGRAFT PUR COMPOSITE CARRYING rhBMP2
AU2014252769B2 (en) * 2013-04-10 2017-11-30 The University Of Melbourne Biodegradable network polymers for regenerative medicine and tissue engineering
CN103623466B (zh) * 2013-12-19 2015-07-01 华东理工大学 一种功能化的介孔生物玻璃多孔支架及其制备方法以及应用
CN104645417B (zh) * 2015-03-11 2017-10-20 华东理工大学 一种介孔生物玻璃/聚癸二酸甘油酯复合支架及其制备方法和应用
CN109705359B (zh) * 2018-12-27 2020-09-25 华东理工大学 一种改性聚乙二醇-聚癸二酸(pegs)可注射生物弹性体及其制备方法和应用
CN110101903B (zh) * 2019-04-09 2021-11-02 温州医科大学 一种可诱导低氧的bg复合支架及其应用
CN110237304A (zh) * 2019-06-26 2019-09-17 上海市第六人民医院 一种多级结构支架及其制备方法
CN110665065B (zh) * 2019-11-01 2021-09-07 北京市创伤骨科研究所 一种负载去铁胺的人工骨膜及其制备方法
CN112137768A (zh) * 2020-10-23 2020-12-29 上海交通大学医学院附属第九人民医院 一种分层仿生孔道-多孔复合支架

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Bioactive Injectable Hydrogels Containing Desferrioxamine and Bioglass for Diabetic Wound Healing;Kong Lingzhi等;《ACS APPLIED MATERIALS & INTERFACES》;20180816;第10卷(第36期);第30103-30114页 *
Potential of growth factor incorporated mesoporous bioactive glass for in vivo bone regeneration;Lalzawmliana, V.等;《JOURNAL OF THE MECHANICAL BEHAVIOR OF BIOMEDICAL MATERIALS》;20181212;第91卷;第182-192页 *
RhBMP-2 loaded MBG/PEGylated poly(glycerol sebacate) composite scaffolds for rapid bone regeneration;Chai Yanjun等;《JOURNAL OF MATERIALS CHEMISTRY B》;20170628;第5卷(第24期);第4633-4647页 *

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