CN112834734A - 通过纳米机械学分析预测癌症发展的方法 - Google Patents

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CN112834734A CN202011566792.0A CN202011566792A CN112834734A CN 112834734 A CN112834734 A CN 112834734A CN 202011566792 A CN202011566792 A CN 202011566792A CN 112834734 A CN112834734 A CN 112834734A
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马可·罗帕里克
玛利亚·普洛狄耐克
埃伦·奥柏曼
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Universitaet Basel
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Abstract

本发明涉及通过纳米机械学测量对原发性肿瘤样品或相关淋巴结的转移可能性进行分期的方法和/或用于确定复发或发病可能性的方法。

Description

通过纳米机械学分析预测癌症发展的方法
分案申请声明
本申请是第201580058782.7号中国专利申请的分案申请。
背景
在发达国家的女性中，乳腺癌为最频发的恶性肿瘤以及第二常见的 癌症死亡致因。另外，尽管原发性肿瘤很少致死，但是转移灶是大部分 癌症相关死亡的致因。虽然有一些作为转移灶发展的预后标志物的参数， 但是尽管作出了很大努力，仍然不可能准确预测个体的风险。因此，对 于可能已被单独的手术和抗激素治疗治愈的患者，也常常给予辅助治疗。 目前的乳腺癌分类，包括预后和预测标志物，仍主要基于临床和组织病 理学标准，即，患者年龄、肿瘤大小、淋巴结受累情况、肿瘤的组织学 类型、雌激素和黄体酮受体的表达、HER2/neu和Ki-67和肿瘤分级。
但是，仅基于临床病理学参数的风险分级可能带来误导。特别是在 早期HER2/neu阴性乳腺癌(即，I、IIA、IIB和IIIA期)，这些临床病理学因 素不足以作出特别是关于辅助化疗的临床决定，因为可能会发生明显的 过度治疗或治疗不足。自2007年以来，国际指导方针推荐向已建立的风 险评价加入其他测试。
因此，对乳腺癌的研究的主要目标是开发出预后标志物，其得到高 质量认证测试的评价，能够常规使用并且成本可以可接受。这些标志物 应当有助于优化癌症诊断、为治疗选择定向并支持患者复诊。
但是，所有目前已有的测试都有一定的缺点。通常，它们仅对分界 明确的患者亚群有效，例如，在患中度分化肿瘤的淋巴结阴性患者中。 此外，这些测试主要在中心研究机构进行，而将肿瘤样品送至中心实验 室需要时间。此外，对于样品处理没有本地(质量)控制。除了遗传和微环 境因素之外，近期数据表明，癌症细胞与其环境的物理相互作用是转移 过程的关键参数。尽管如此，试图理解癌症生物机械学的努力已被大大 偏向组织水平和单细胞实验之间。因此，一些发现是有争议的，原因在 于：1)缺乏天然组织环境和2)用于解释肿瘤内不均质性的测量/分析不 足。这强调了用亚细胞解析度来研究整体组织片段能提供对癌变相关的 机械学改变的更全面了解。这促使我们开发基于原子力显微镜(AFM)的诊 断装置，称为
Figure BDA0002861894530000021
(“自动化的且可靠的组织诊断工具(Automated andReliable Tissue Diagnostics)”；US8,756,711 B2，US 2014338073 A1， WO 2014090971A1，WO 2015001119 A1，WO 2015018865 A1，通过引 用将上述文献并入本文)，用于在接近自然生理条件下、利用在纳米级别 空间解析度下解析的前所未有的硬度灵敏性，测量来自人类患者的无掺 杂组织活检样品的硬度特征。在持续约2小时过程中，ARTIDIS测试利用约10nm的锐利触针或尖端在活检样品表面上制造约10000个极小的压 痕。
因此，基于这样的背景，本发明的目标是提供可靠且简单的对癌症 进行分期和/或提供关于癌症的预后和/或预测信息的方法。
独立权利要求的主题实现该目标。
定义
在本说明书的背景下，术语硬度或弹性指组织样品或组织对施加的 力产生形变的抵抗性。硬度或弹性被测量为组织样品的弹性模数，单位 为帕斯卡(Pa)。软组织样品的特征为低硬度值，硬组织的特征为升高的硬 度值。
这样的形变力可以通过撞击组织样品或组织的触针(例如，作为原子 力显微镜的一部分)被施加于组织样品或组织，其中触针或组织样品在垂 直方向相对于彼此移动。为了测量样品上的多个点，可以另外在横向移 动触针或样品，其中在本发明的含义中，横向表示与垂直方向正交的方 向。
触针可以为具有锋利末端或作为探针的附接胶体颗粒的悬臂。在本 发明的含义中，悬臂表示仅在一端固定的梁或臂。样品表面和末端之间 的排斥或吸引力所造成的悬臂的偏转可以通过光学检测，例如，干涉仪 或聚焦于悬臂背部并反射于裂缝光电二极管上的激光，其中光电二极管 将悬臂的偏转记录为电压差，其可以被转换为纳米。可选地，悬臂的偏 转可以通过压电传感器检测，其中悬臂的张力被转换为电荷。此外，可 选地，可以使用自感应悬臂，例如Piezo-Resistive Sensing Active(PRSA) 探针，例如，其为具有整合的压电电阻器桥和加热器的硅悬臂。有利的 是，使用这样的悬臂时，不需要激光调节。
在本说明书的背景下，术语区域指由(测量)点的网格界定的区域，其 中每个点对应于上文所述的触针的压痕踪迹，并且每个点距其下一点不 大于100μm，优选50μm、20μm、10μm或1μm。作为非限制性的示 例，区域的尺寸为25μm2、50μm2、100μm2、200μm2、300μm2、400μm2、 500μm2、600μm2、750μm2、1000μm2、5000μm2或10.000μm2，并且 两个区域的几何中心点相隔至少100μm、200μm、300μm、400μm、500 μm或1mm。
对任何给定样品测量的力和压痕深度取决于悬臂弹簧常数和尖端半 径.
在本说明书的背景下，术语空间解析度指组织或组织样品上两个点 之间的最小距离，通过这样的最小距离所述两个点能在它们的硬度方面 被区分开。至少1mm，优选100μm、10μm或1μm的空间解析度表示 两个点仍能被区分开的最大距离为1mm，优选100μm、10μm或1μm。 至少100μm，优选10μm或1μm的空间解析度还包括更高的解析度。 高于1μm的解析度表示具有小于1μm的距离的两个点仍能被区分开。 高于100μm的解析度的实例为10μm和1μm。高于1μm的解析度的实 例为0.5μm、0.1μm和10nm.
在本说明书的背景下，术语组织样品指包含连续细胞和细胞外基质 的组织样品。这样的组织样品可以通过活检或手术切除获得。
在本说明书的背景下，术语手术切除样本指代表器官或机体的已被 从所述器官或机体取出的至少一部分的样品。手术切除样本还可以包含 整体器官或身体部分。
在本说明书的背景下，术语组织活检样品指通过活检获得并包含连 续细胞和细胞外基质的组织样品。
在本说明书的背景下，术语活检指移除组织部分或组织用于检查的 方法。这样的活检可以为针吸活检、钻取活检、真空辅助针芯活检、芯 针活检或钳夹活检。可以借助于合适的工具实施移除，例如空心针、圆 尖刀或手术刀。组织活检样品还可以通过内窥镜或内窥镜方法获得。
活检过程可以由合适的方法指导，例如超声或CT(X线计算机体层 成像)，其中肿瘤或明显病变可以被检测到或定位。
在本说明书的背景下，术语正常组织指具有同样生理功能的连续细 胞和细胞外基质的集合，其特征为正常、受控的生长以及正常细胞和细 胞外功能和结构。
在本说明书的背景下，术语肿瘤指由瘤性细胞的异常生长形成的赘 生物或病变。肿瘤可以为良性的、恶化前的或恶性的。来自人乳腺癌的 组织活检样品的分类是优选的。在本说明书的背景下，术语良性病变或 肿瘤指不具备转移能力的肿瘤。
在本说明书的背景下，术语原发性肿瘤指与周围器官或组织起源于 相同组织类型的肿瘤。
在本说明书的背景下，术语转移灶(metastasis或metastases)指已从原 发性肿瘤传播至远处部位(例如，不同器官)的肿瘤。
在本说明书的背景下，术语恶性或“恶性肿瘤”指肿瘤穿透基底膜、 侵袭邻近组织或在身体中传播的能力。恶性肿瘤与恶性赘生物或癌症同 义，特别是与侵袭性癌症。
在本说明书的背景下，术语肿瘤边界被定义为肿瘤和邻近组织之间 的圆形、平滑、界限清楚的(常见于良性肿瘤)或不规则、界限不清的(通 常是恶性肿瘤的情况)边界。组织学定义为能发现肿瘤细胞的肿瘤的最外 部(图1B)。
在本说明书的背景下，术语邻近组织被定义为组织或器官的除肿瘤 之外的部分(图1C)。邻近组织通常围绕原发性肿瘤，但也可以认为是器 官的组织的不存在肿瘤的任何部分。
在本说明书的背景下，术语邻近淋巴结或邻近原发性肿瘤的淋巴结 特别是指从肿瘤引出的淋巴结。这样的邻近淋巴结也被称为前哨淋巴结。
在本说明书的背景下，术语腋窝淋巴结指从乳房外象限引出淋巴管、 从胸壁和肚脐水平上方的腹部引出表浅淋巴管和从上肢引出淋巴管的淋 巴结。腋窝淋巴结也被称为腋下淋巴结。
在本说明书的背景下，术语硬度分布指从个体组织活检样品测定的 不同硬度值的频率。测定的硬度分布还可以拟合为高斯函数。单峰硬度 分布是具有单一最大值的离散的硬度值的分布，其表明样品具有均匀硬 度。双峰分布函数具有两个最大值。这样的分布可以由具有两个不同硬 度部分的样品造成，例如，软的肿瘤核心和硬的边缘。在本发明的含义 中，三峰硬度分布表示特征为三个局部最大值的分布。三峰分布可以表 明正常组织、特征为坚硬基质的边界区域和软肿瘤核心已贡献于组成所 述分布的值。至少双峰硬度分布的样品具有双峰、三峰或n峰(n为>1的 整数)分布函数。
在本说明书的背景下，术语不均匀硬度分布指n峰分布函数(n为>1 的整数)。
在本说明书的背景下，多个硬度值指至少100、200、300、400、500、 900、1000、1600、2500、3600、4900、6400、8100或10000个硬度值。
预后标志物提供癌症发生和/或复发的风险，或换言之，给出疾病发 展可能性的指示。
预测标志物提供患者对具体治疗的响应的指示。
在本说明书的背景下，术语峰指硬度值分布中的局部最大值，并且 表示样品中或直接相邻值中具有最高频率的硬度值。
在本说明书的背景下，当有关于硬度值分布使用时，术语最大频率， 指特征为将硬度值的频率相对于硬度值绘制的图的局部或绝对最大值的 硬度值。因此，如果第一最大频率的硬度值与第二最大频率的硬度值相 同或基本相同，则第一最大频率于第二最大频率相同或基本相同。
在本说明书的背景下，术语生理条件指保护活检组织样品的结构完 整性和机械学性质所必需的条件，其通过任何化学或物理试剂维持组织 的活力，并且特别包括在采集后将样品保存于生理缓冲液中，例如磷酸 盐缓冲盐水、林格氏液或移植缓冲液(例如Custodiol)，以及在20、25、 30或37℃下实施硬度测定。林格氏液还可以补充葡萄糖和蛋白酶混合 物。此外，活检组织样品的硬度测定可以在采集后1h、2h、6h、12h、 24h、48h或72h内实施，这不会改变样品的机械学性质。“生理条件” 特别不包含冷冻组织或解冻组织或石蜡包埋样品。
描述
本发明基于以下意外发现：转移病变的特征为与转移病变所源自的 原发性肿瘤具有相似的纳米机械学表型。
按照本发明的第一方面，提供对获自肿瘤的组织活检样品进行分类 的方法。该方法包括以至少100μm(即，多个点中的每个与相邻点具有100 μm或更小的距离)、50μm、20μm、10μm或1μm的空间解析度测定样品 上多个点的硬度值，得到硬度分布，并为所述样品指定恶性概率。
在一些实施方案中，为表现出至少双峰硬度分布的样品指定高恶性 概率，其中至少双峰硬度分布的特征为第一峰表现出高于第二峰至少两 倍的硬度值。
在一些实施方案中，表现出具有低于1kPa的最大频率的不均匀硬度 分布的样品被分类为侵袭性癌症样本，或指定为高恶性概率。在一些实 施方案中，表现出具有0.3kPa至0.8kPa的最大频率的不均匀硬度分布的 样品被分类为侵袭性癌症样本，或指定为高恶性概率。在一些实施方案 中，表现出具有0.4kPa至0.8kPa的最大频率的不均匀硬度分布的样品被 分类为侵袭性癌症样本，或指定为高恶性概率。在一些实施方案中，表 现出具有0.4kPa至0.7kPa的最大频率的不均匀硬度分布的样品被分类为 侵袭性癌症样本，或指定为高恶性概率。在一些实施方案中，表现出具 有0.3kPa至0.6kPa的最大频率的不均匀硬度分布的样品被分类为侵袭性 癌症样本，或指定为高恶性概率。
在一些实施方案中，硬度分布中表现出指数式衰减的样品被分类为 肿瘤组织。在一些实施方案中，硬度分布中表现出从0.4kPa至10kPa的指 数式衰减的样品被分类为肿瘤组织。在一些实施方案中，硬度分布中表 现出从0.4kPa至15kPa的指数式衰减的样品被分类为肿瘤组织。在一些实 施方案中，硬度分布中表现出从0.4kPa至20kPa的指数式衰减的样品被分 类为肿瘤组织。
在一些实施方案中，本发明的方法应用于第一样品和第二样品。
在一些实施方案中，第一样品为原发性肿瘤样品，第二样品取自邻 近采样部位(原发性肿瘤位点)的淋巴结，如果发生以下情况，则第二样品 被分类为淋巴结转移灶，
-第一样品和第二样品均表现出具有低于1kPa、特别是0.3kPa至0.8 kPa、0.4kPa至0.8kPa、0.4kPa至0.7kPa或0.3kPa至0.6kPa的最大频率的 不均匀硬度分布，并且
-第二样品的最大频率与第一样品的最大频率相同。
在一些实施方案中，
-第一频率(或硬度)分布获自样品的第一位点，第二频率(或硬度)分 布获自样品的第二位点，并且
-第一位点对应于肿瘤组织学分类为肿瘤组织的一部分，第二位点 对应于组织学分类为超过肿瘤边界的组织(邻近组织)，并且
-第一频率分布的特征为具有低于1kPa、特别是0.3kPa至0.8kPa、 0.4kPa至0.8kPa、0.4kPa至0.7kPa或0.3kPa至0.6kPa的最大频率的不均 匀硬度分布，并且
-如果第二频率分布的特征在于不存在最大频率低于1kPa的硬度分 布，则将肿瘤样品分类为具有低概率已扩散至邻近淋巴结。
在一些实施方案中，如果第二频率分布最大值的特征在于存在最大 频率低于1kPa的硬度分布，则肿瘤样品被分类为具有高概率已扩散至邻 近淋巴结。
根据本发明的一个方面，提供对获自患者的组织样品进行分类的方 法，其中组织样品疑似包含继发性肿瘤组织。所述方法包括：
-测定原发性肿瘤样品上第一多个点中每一个的硬度值，得到第一 硬度分布，
-测定所述组织样品上第二多个点中每一个的硬度值，得到第二硬 度分布，
其中
-如果所述第一硬度分布和所述第二硬度分布均表现出不均匀硬度 分布，则将所述组织样品分类为转移灶，所述不均匀硬度分布在低于1kPa 的基本相同的硬度值处具有最大频率。
在一些实施方案中，组织样品为组织活检样品或手术切除样本。
在一些实施方案中，以至少100μm、50μm、20μm、10μm或1μm 的空间解析度测定所述第一和所述第二多个点。
在一些实施方案中，组织样品取自或获自淋巴结，特别是邻近肿瘤 样品的采样部位的淋巴结或腋窝淋巴结.
在一些实施方案中，表现出低于0.5kPa的最大频率的原发性肿瘤样 品被分类为转移性肿瘤.
根据本发明的一个方面，提供对获自肿瘤的组织样品进行分类的方 法。所述方法包括：
-以至少100μm、50μm、20μm、10μm或1μm的空间解析度测 定所述样品上多个点中每一个的硬度值，得到硬度分布，
-为所述样品指定恶性概率，
其中
-所述方法应用于第一样品和第二样品，第一样品为原发性肿瘤样 品，第二样品为取自或获自淋巴结、特别是邻近第一样品的采样部位的 淋巴结或腋窝淋巴结的样品，并且
-如果第一样品和第二样品均表现出具有低于1kPa的最大频率不均 匀硬度分布，并且第二样品的最大频率与第一样品的最大频率相同，则 第二样品被分类为淋巴结转移灶。
在一些实施方案中，组织样品为组织活检样品或手术切除样本。
在一些实施方案中，表现出低于0.5kPa的最大频率的原发性肿瘤样 品被分类为转移性肿瘤或具有高概率已扩散至邻近组织，特别是邻近淋 巴结或腋窝淋巴结。
在一些实施方案中，原发性肿瘤样品、特别是原发性肿瘤活检样品 包含至少一部分肿瘤核心和至少一部分肿瘤边缘。
在一些实施方案中，原发性肿瘤样品、特别是原发性肿瘤活检样品 代表上文所述的肿瘤截面的至少一半，并表现出从肿瘤核心至边缘的明 显定向。在一些实施方案中，原发性肿瘤活检样品是圆柱形或棱柱形活 检样品。
根据本发明的一个方面，提供对获自肿瘤的组织样品进行分类的方 法。所述方法包括
-以至少100μm、50μm、20μm、10μm或1μm的空间解析度测 定所述样品上多个点的硬度值，得到硬度分布，
-为所述样品指定恶性概率，
其中
-第一频率或硬度分布获自样品的第一位点，第二频率或硬度分布 获自所述样品的第二位点，并且
-第一位点对应于肿瘤组织学分类为肿瘤组织的一部分，第二位点 对应于邻近组织、特别是组织学分类为超过肿瘤边界的组织，并且
-如果第一频率或硬度分布的特征为具有低于1kPa的最大频率的不 均匀硬度分布并且第二频率或硬度分布的特征在于不存在最大频率低于 1kPa的硬度分布，则肿瘤样品被分类为具有低概率已扩散至邻近组织， 特别是邻近淋巴结或腋窝淋巴结，和/或
-如果第二频率或硬度分布的特征在于存在最大频率低于1kPa的硬 度分布，则肿瘤样品被分类为具有高概率已扩散至邻近组织，特别是邻 近淋巴结或腋窝淋巴结。
在一些实施方案中，组织样品为组织活检样品或手术切除样本。
在一些实施方案中，表现出低于0.5kPa的最大频率、特别是在第一 频率或硬度分布表现出低于0.5kPa的最大频率的肿瘤样品被分类为具有 高概率已扩散至邻近组织，特别是邻近淋巴结。.
在一些实施方案中，肿瘤样品包括原发性肿瘤的核心和边缘或边界 以及邻近原发性肿瘤的组织，并任选地包括一个或多个邻近淋巴结或腋 窝淋巴结，特别是一个或多个淋巴结。
在一些实施方案中，多个点被安排为n1×n2个点的网格，所述网格界 定区域，其中n1和n2彼此独立地为>1的整数。
在一些实施方案中，对于一个区域，测量5×5个点(产生25个点)、7×7 个点、10×10个点、15×15个点、20×20个点、50×50个点或100×100个 点的网格。在一些实施方案中，区域界定为24×24个点的网格，尺寸为 400μm2。
在一些实施方案中，测定相同样品的至少两个不同区域的硬度值， 并且所述区域的几何中心之间的距离为所述空间解析度的倍数，所述倍 数为空间解析度的至少10倍。在一些实施方案中，倍数为20、30或50。
在一些实施方案中，活检样品的区域位于样品的表面上，沿着样品 的纵轴跨越1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、 9mm、10mm、15mm或20mm的距离。
在一些实施方案中，多个点包括100、400、900、1000、1600、2500、 3600、4900、6400、8100、10000或20000个硬度值。
在一些实施方案中，表现出单峰硬度分布的样品被指定为高概率为 非恶性。
在一些实施方案中，组织活检样品为直径至少为7μm的圆柱形或棱 柱形活检样品。在一些实施方案中，活检组织样品为直径至少为0.5mm 的圆柱形或棱柱形活检样品。
在一些实施方案中，肿瘤为人乳腺癌或淋巴结、肺、骨、肝或脑转 移灶。
在一些实施方案中，在生理条件下测定硬度值。
在一些实施方案中，测定乳腺活检样品的硬度，并且
-表现出特征为1.1kPa至1.5kPa的峰的硬度分布的样品被指定为 高概率为正常乳腺组织，
-表现出特征为1.9kPa至3.7kPa的峰的硬度分布的样品被指定为 高概率为良性病变，并且
-表现出特征为0.31kPa至0.75kPa和位于大于1.2kPa的值的峰的 硬度分布的样品被指定为高概率为恶性肿瘤。
在一些实施方案中，表现出特征为0.31kPa至0.75kPa和1.2kPa至 2.0kPa的峰的硬度分布的样品被指定为高概率为恶性肿瘤。
根据本发明的另一个方面，提供对癌症进行分析或预后癌症发展的 方法。所述方法包括
-获得来自原发性肿瘤的第一组织样品和第二组织样品，特别是来 自邻近原发性肿瘤的组织，特别是位于组织学肿瘤边界5mm至10mm内 或距组织学肿瘤边界不大于5mm至10mm，来自邻近淋巴结或腋窝淋巴 结，
-测定第一活检样品上多个点的硬度值和第二活检样品上多个点的 硬度值，所述多个点中的每一个的特征为至少100μm、50μm、20μm、 10μm或1μm的空间解析度，得到第一和第二样品中每一个的硬度分布，
-为第一样品指定恶性概率，并且为第二样品指定被原发性肿瘤侵 袭的概率。
在一些实施方案中，提供获自原发性肿瘤的第一样品。在一些实施 方案中，提供第二样品，其获自邻近原发性肿瘤的组织，特别是位于组 织学肿瘤边界5mm至10mm内或距组织学肿瘤边界不大于5mm，来自 邻近淋巴结或腋窝淋巴结。
在一些实施方案中，第一样品代表上文所述的原发性肿瘤截面的至 少一半，并表现出从原发性肿瘤核心至边缘的明显定向。
在一些实施方案中，第一组织样品和/或第二组织活检样品为组织活 检样品或手术切除样本。
在一些实施方案中，
-如果所述第一样品的特征为至少双峰硬度分布，所述硬度分布具 有的第一峰比第二峰表现出至少两倍更高的硬度值，则将所述第一样品 指定为高恶性概率，和/或
-如果所述第二样品的特征为至少双峰硬度分布，所述硬度分布的 特征为第一峰表现出至少两倍高于第二峰的硬度值(或不均匀硬度谱)，则 将所述第二样品指定为高概率被所述原发性肿瘤侵袭。
在一些实施方案中，邻近原发性肿瘤的组织包含于淋巴结中，特别 是邻近淋巴结(邻近原发性肿瘤)或腋窝淋巴结。
在一些实施方案中，表现出低于0.5kPa的第二的第一样品被分类为 转移性肿瘤。
根据本发明的另一个方面，提供对癌症进行分期和/或确定癌症发病 的方法。所述方法包括：
-从邻近原发性肿瘤的组织获得组织样品，
-以至少100μm、50μm、20μm、10μm或1μm的的空间解析度 测定所述样品上多个点的硬度值，得到硬度分布，
-为所述样品指定被所述原发性肿瘤侵袭的概率。
在一些实施方案中，提供来自邻近原发性肿瘤的组织的组织样品。
在一些实施方案中，如果所述硬度分布的特征为最大值为 0.2kPa-1kPa，特别是0.3kPa-0.8kPa，则所述样品被指定为高概率被所述 原发性肿瘤侵袭。
在一些实施方案中，表现出至少双峰硬度分布的样品被指定为高概 率被所述原发性肿瘤侵袭，其中所述至少双峰硬度分布的特征为第一峰 表现出高于第二峰至少两倍的硬度值。
在一些实施方案中，组织样品为组织活检样品或手术切除样本。
根据本发明的另一个方面，提供对获自肿瘤的组织样品进行分类的 方法，所述方法包括：
-以至少100μm、50μm、20μm、10μm或1μm的空间解析度测 定所述样品上多个点的硬度值，得到硬度分布，
-为所述样品指定恶性概率，
其中
-表现出峰低于0.5kPa的至少双峰硬度分布的样品被分类为转移性 肿瘤。
在一些实施方案中，组织样品获自乳腺癌，特别是人乳腺癌。
在一些实施方案中，组织样品为组织活检样品或手术切除样本。
在一些实施方案中，上文所述的肿瘤或上文所述的原发性肿瘤为乳 腺癌、肾肿瘤、前列腺肿瘤、脑肿瘤、肺肿瘤、卵巢肿瘤、胰腺肿瘤、 或胃肿瘤、肝肿瘤、皮肤肿瘤或胃肿瘤。
根据本发明的另一个方面，提供肿瘤样品诊断装置。所述装置包括 原子力显微镜和与其连接的计算机，所述计算机被配置为能运行实施前 文所述的本发明任一方法的程序。
在之前描述的任何方法的一些实施方案中，空间解析度为20μm、10 μm、5μm或1μm。
无论在任何单个分离特征的可选方案在本文中被陈述为“实施方案” 的情况，应当理解这样的可选方案可以自由组合而形成的本文公开的发 明的独立实施方案。
通过下文实例和附图进一步描述本发明，从实例附图中可以得出其 他实施方案和优势。这些实例仅意欲描述本发明，而不是限制其范围。
附图简要描述
图1展示肿瘤A、肿瘤边界B和邻近组织C。
图2展示原发性肿瘤和邻近组织的软纳米机械学特征，其显示出淋 巴结转移灶中检测到的通常表型。(A)两个癌症患者的纳米机械学特征 显示双峰分布，在患者1病例中为指数式衰减，对特异癌症细胞群体的 峰值位于0.39+/-0.21kPa，并且对于周围细胞和组织的基质组分为3.66 +/-2.14kPa衰减至10kPa。具有正常乳腺组织的病理组织学特征的邻近组织表现出1.9+/-0.7kPa(上方)的均一的硬度峰。对患者2测得尖锐分 布和总体较软的表型，对于细胞的峰值分别位于0.45+/-0.18kPa和1.05 +/-0.55kPa(下方)。该患者的邻近组织展示出双峰分布，具有0.4+/-0.2 kPa的非常突出的软峰以及1.05+/-0.5kPa的较硬的峰。在病理组织学分 子中，该组织被标记为非恶性。因此在本文中，我们使用术语“损坏的”健康，因为该组织硬度值和双峰分布不对应于对来自对照患者的健康乳 腺样品所测得的值。(B)患者1具有癌症阴性淋巴结，其表现出3.02+/- 2.10kPa的硬度值(上方)。来自患者2的含有乳腺癌转移灶的淋巴结表现 出双峰硬度分布，癌性区域的峰值为0.49+/-0.23kPa，其直接对应于原 发性肿瘤和邻近(“损坏的”健康组织)中发现的“软”癌症细胞表型，而对淋巴结其余部分测得的值为2.11+/-0.78kPa(下方)。
图3展示来自两个乳腺癌患者的手术切除样本的AFM后组织学总 结。两个样品的H&E染色表现出相似的特征；即，结缔组织和正常上皮 不是显著不同与正常乳腺(上方)。两个病例中的原发性肿瘤均表现出侵袭 性乳腺癌细胞，具有已引发致密的纤维组织反应的细胞浸润巢(中间)。来 自患者2的对应淋巴结的H&E染色展现的乳腺癌细胞的巢相似于原发性 肿瘤(下右)，而来自患者1的淋巴结无癌细胞(下左)。
图4展示代表没有受累淋巴结N0(n＝10)和有受累淋巴结N+(n＝11) 的患者的原发性肿瘤(活检样品和手术切除样本)的纳米机械学特征的标 准化图。N+患者清楚地表现出在癌症区域向更软值的位移(低于1kPa)。 他们的峰在0.325kPa，而N0患者的峰在0.625kPa。两个分布保持地非 常宽，图中高于2kPa的部分在两个病例中看起来非常相似。
图5展示代表对应于图4所示原发性肿瘤的未受累和受累淋巴结的 纳米机械学特征的标准化图。癌细胞阳性(N+)淋巴结在0.4kPa周围具有 强的软峰，而癌症阴性(N-)淋巴结缺少软峰。
实施例：
为了将初步结果转用至临床背景，针对通过肿瘤手术切除获得的非 固定的(在生理水性环境或冷冻组织中测量)人乳腺癌样品的分析，优化了 ARTIDIS技术。为了该目的，从经历乳房肿瘤切除术或乳房切除术操作 的56个患者的手术切除样本中收集152个组织样品，包括不同分期和级别 的原发性乳腺癌、淋巴结转移灶和非肿瘤人乳腺组织。
样品的纳米机械学测量按照US 8,756,711B2中公开的实施。简单而 言，通过在整体样品表面均匀低分布FV图来解释可能的不均匀性，以系 统性方式检查每个样品。利用测微螺旋或自动定位系统在扫描间保持约 500μm的规定距离。由此每个样本获得约10至15个FV图，取决于全 部活检样品的尺寸。
在通过AFM分析样品时，利用2组分、5五分钟快速干燥环氧树脂 胶，将活检样品粘于培养皿上。在2分钟预干燥步骤(以避免环氧树脂和 样本缓冲液混合)之后，将样本平放于胶上，以优化压痕角度和避免来自 外部组件的影响(例如，悬臂保持器)。移液枪头，作为“斜坡”，被直接置 于每个样本的不平坦部分下方，以保持高度一致性。在处理样本的任何时间，都尽量减少使用多余的力(例如，撕扯或拉伸)。在补充有蛋白酶抑 制剂的无菌缓冲液环境或移植缓冲液中实施所有准备步骤，以避免污染 和确保样本保持在接近体内的状态。将固定好的样本保持在冰冷林格氏 液或Custodiol中，直至纳米机械学测试，纳米机械学测试在室温或37℃ 下进行。
对于尖锐的锥体尖端(205-μm长氮化硅悬臂，标定悬臂弹簧常数k＝ 0.06N m-1，共振频率[air]＝18kHz)，在每次实验前，利用热调谐方法测 定悬臂的准确弹簧常数k，而偏转灵敏度在流体中测定，利用固态玻璃基 地作为无限硬度参考材料。
活检样品的接触硬度(弹性模数，E)测量按照以下推出；在给定位点、 以定向的方式、在负载和卸载过程中记录。负载–位移曲线，也指定为力 压痕曲线。利用测微螺旋或自动定位系统在扫描间保持约500μm的规定 距离。在16μm/s的压痕速度下，个体数据集由1024负载–位移曲线组成。 由此每个样本获得约15至20个力体积图(force volume map)。如果可能 的话，在每秒约1个负载和卸载循环的速度、在32x32个点的网格上、 扫描尺寸20x20μm，制作力体积图(FV)。每个负载位移曲线由至少512 个数据点组成，而Z长度被设定为5μm至8μm，取决于分析区域的性质。 每个FV图被设定为20x20μm2，目的在于，(i)优化实验时间以及(ii) 提供足够大的区域去并入组织内的全部组分(例如，细胞和细胞外基质)。最大施加负载力被设定为1.8nN，压痕深度约150至3000nm。另外获得 72x72FV图(每幅图5184个力–位移曲线，像素大小为277nm)，以增加 感兴趣的关键区域的空间解析度。
利用之前描述的方法分析力压痕曲线(Loparic，et al.，Biophysical Journal，.98(11):p.2731-40，2010，Plodinec，et al.，Journal of Structural Biology，.174(3):p.476-484，2011)。简单而言，LabVIEW(National Instrument，US)开发了软件用于自动化分析FV数据。测定接触点。通过 将压电位移转换至指示悬臂的弯曲的尖端-样品距离获得力曲线，并通过 将悬臂偏转d乘以弹簧常数k而获得负载F。通过实施线性拟合至力曲线的上部50％分析卸载力曲线，力曲线的上部50％界定最大负载F＝1.8nN和 负载0.9nN之间的硬度。对于力曲线的外来影响(例如粘附)可以通过该操 作避免。泊松比被设定为0.5。根据Oliver和Pharr的方法(Oliver et al., Journal of Materials Research,7(6),1564-1583,1992)确定杨氏模量。斜率 值在空间水平绘制，分析和展示于ARTIDIS脱机软件。
AFM后，将组织样品固定并以定向方式进行石蜡包埋。ARTIDIS数 据已确认初始发现：所有癌样品表现出不均匀硬度表型，其中相比于周 围非肿瘤和形态学正常乳腺组织，具有特征性的2倍更软的表型。患者的 无乳腺癌的健康乳腺组织表现出平均硬度值约1.6kPa。
最重要的是，图2和图3所示数据表明：
1)来自乳腺癌患者的肿瘤组织表现出从0.4kPa的不均匀分布和幅度 能够至20kPa的指数式衰减。我们通过0.4至0.8kPa的特征性软峰鉴定 侵袭性乳腺癌样品。来自相同患者的对应淋巴结转移灶硬度分布的特征 为不均匀硬度谱，具有0.4至0.8kPa的特征性软峰，与原发性乳腺癌组 织相似。
2)这些患者额组织学认定为“非恶性”的邻近组织表现出双峰分布， 具有从0.4至0.8kPa的突出的软硬度峰。根据纳米机械学分析得出这些 组织的存在为癌性的，而组织学认定非恶性，这是预后不良的指示。此 外，对应于健康乳腺组织的1.2至1.9kPa的硬度值也存在。
3)对于仅在原发性肿瘤检测出软硬度峰，而在邻近组织中没有软峰 的患者病例，不存在淋巴结转移灶。
4)当测量脂肪组织时，存在0.2kPa的特异性硬度峰。
5)由于随着年龄增长乳腺组织中脂肪组分通常增加，常常测量到 0.2kPa的脂肪特异性硬度峰。
此外，图4和5中关于已经传播至邻近淋巴结的肿瘤所示的数据表 现出癌症区域中向较软值的位移。
因此，为了评估乳腺癌患者的癌症侵袭性和预后，重要的是不仅要 考虑原发性肿瘤，还需要考虑邻近组织的纳米机械学响应。
本文提供的数据证明了利用ARTIDIS的纳米机械学分析在临床中的 以下应用性：
1)癌症发生、发展和复发的预后。
2)预测治疗响应。
3)基于原发性肿瘤和邻近组织的纳米机械学特征组合，确定合适的 治疗和复诊方案。
4)筛查组织学“非恶性”组织(即，用标准筛查方法(例如超声、乳房X 线照相术或实施局部活检后进行H&E染色)未观察到明显病理学改变的 非恶性乳腺组织)的软硬度峰，目的在于在固体瘤生长和出现症状前很长 时间就鉴定出局部侵袭性癌细胞的存在和肿瘤的侵袭程度。
5)利用ARTIDIS纳米机械学分析的筛查特别适合于具有发展癌症高 风险的携带遗传突变的患者，例如BRCA 1和BRCA2或任何其他。
本发明的纳米机械学分析方法非常适合于日常实践，因为其允许样 本的快速现场评估，并且不会产生观察者间变异，例如，用其他标志物(例 如Ki-67)时。
本发明的方法基于以下原则：
1.在肿瘤(癌症)开始发展前，组织(细胞和细胞外基质)在纳米尺度上 经历机械学/结构改变。
2.第1点的改变存在于器官或邻近组织上(例如，扩散/多病灶表现)。
3.癌症会首先发生的确切位置取决于特定的局部微环境条件(例如， 细胞和周围细胞外基质之间的改变和相互作用，以及它们内部之间的改 变和相互作用)。
4.器官/邻近组织的纳米机械学特征测量的能检测出第1点的具体改 变。
5.器官/邻近组织的纳米机械学特征的测量能区分年龄相关机械学改 变与肿瘤前、肿瘤和炎症相关改变。
6.器官/邻近组织的纳米机械学特征的测量能将不同类型和/或程度 的机械学改变与肿瘤发展和/或传播转移灶的能力关联起来。
7.第6点的结果可用作肿瘤发展和进展预后和/或预测标志物的。在 实践中，这可用于针对具体疾病更好地治疗患者。
8.本发明的方法学通常应用于检测乳腺肿瘤(例如，筛查)，以及作 为已存在的肿瘤或肿瘤相关转移灶(但不限于乳腺组织)的预后标志物。其 还可以用于其他器官特异性肿瘤，炎性或医学相关疾病，如前列腺癌、 结肠直肠癌、肺癌、恶性黑色素瘤、肝癌、皮炎、胃炎等。
9.利用推荐的方法，诸如发育异常、化生、增生(瘤前改变)和年龄相 关改变的具体状态可以被特异性检测到，并与肿瘤相关改变区分开。

Claims (9)

1.对获自肿瘤的组织样品进行分类的方法，包括
-以至少100μm的空间解析度测定所述样品上多个点的硬度值，得到硬度分布，
-为所述样品指定恶性概率，其中表现出具有低于1kPa的最大频率的不均匀硬度分布的样品，指定为高恶性概率，其中不均匀硬度分布是具有最大值n，n>1的整数的n峰分布。
其中
-肿瘤样品包括原发性肿瘤的核心和边缘或边界以及邻近原发性肿瘤的组织，并且其中
-第一硬度分布获自所述样品的第一位点，第二硬度分布获自所述样品的第二位点，并且
-所述第一位点对应于所述肿瘤的被组织学分类为肿瘤组织的一部分，所述第二位点对应于邻近组织，是组织学分类为超出肿瘤边界的组织，并且
-如果所述第一硬度分布为具有低于1kPa的最大频率的不均匀硬度分布，并且所述第二硬度分布的特征在于不存在低于1kPa的硬度分布最大频率，则将所述肿瘤分类为具有低概率已扩散至所述邻近组织、特别是邻近淋巴结或腋窝淋巴结，和/或
-如果所述第二硬度分布的特征在于存在低于1kPa的硬度分布最大频率，则将所述肿瘤分类为具有高概率已扩散至所述邻近组织、特别是邻近淋巴结或腋窝淋巴结。
2.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述组织样品为组织活检样品或手术切除样本。
3.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多个点被安排为n1×n2个点的网格，所述网格界定区域。
4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中测定所述组织样品的至少两个不同区域的硬度值，并且所述区域的几何中心之间的距离为所述空间解析度的至少10倍。
5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多个点包括100、400、900、1000、1600、2500、3600、4900、6400、8100或10000个硬度值。
6.如前述权利要求中任一项所述的方法，特征在于所述组织样品为直径至少7μm的圆柱形或棱柱形活检样品。
7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述肿瘤为人乳腺癌或淋巴结、肺、骨、肝或脑转移灶。
8.如前述权利要求中任一项所述的方法，特征在于在生理条件下测定所述硬度值。
9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中表现出低于0.5kPa的最大频率的原发性肿瘤样品被分类为转移性肿瘤或分类为具有高概率已扩散至邻近组织、特别是所述邻近淋巴结或所述腋窝淋巴结。
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