CN112826757A - 一种抑菌消炎的复合胶原蛋白精华液及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抑菌消炎的复合胶原蛋白精华液及其制备方法与应用。该精华液，按质量份数计，包括：0.05‑1份胶原蛋白、0.00125‑0.1份人工合成抗菌肽、0.01‑2份酸性物质、0.01‑1份pH调节剂、100份水。本发明在配方中添加抗菌消炎的人工合成抗菌肽，对痤疮丙酸杆菌、表皮葡萄球菌具有很好的抑制、杀灭作用，对痤疮丙酸杆菌引起的炎症反应及炎症因子的分泌具有很好的抑制作用。将抗菌肽复配于胶原蛋白精华液中，可增加真皮层胶原蛋白的合成，促进皮肤修复，抑制瘢痕产生，减少痤疮引起的色素沉着；对于痤疮后期引起的皮肤痘印、瘢痕有良好修复效果。该复合胶原蛋白精华液可以有效的改善痤疮及修复皮损。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药及消炎祛痘化妆品产品领域，具体涉及一种抑菌消炎的复合胶原蛋白精华液及其制备方法与应用。
背景技术
痤疮，又叫“青春痘”，常见于青少年时期，是一种毛囊皮脂腺慢性炎症性疾病，临床常见以好发于面颊、额部及胸背等处的非炎症性皮损黑头粉刺、白头粉刺，炎症性皮损丘疹、脓疱、结节、囊肿为主，是常见的皮肤疾病之一，最终可能形成色素沉着、毛孔粗大甚至留下瘢痕样损害。研究表明，痤疮的发病机理主要是：雄性激素分泌增多，同时使皮脂腺功能亢进，皮脂腺增生，合成和分泌皮脂增多；毛囊漏斗部和皮脂腺导管角化过度，毛囊壁上脱落的上皮细胞和皮脂混合使毛孔堵塞；毛孔堵塞后形成厌氧环境，毛囊内微生物尤其是痤疮丙酸杆菌大量繁殖；痤疮丙酸杆菌是一种革兰氏厌氧菌，生长代谢过程中分泌酯酶，分解皮脂，形成游离脂肪酸，刺激皮肤炎症反应，形成炎症性皮损。痤疮丙酸杆菌是导致痤疮炎症发生的首要因素。
目前西医治疗痤疮的药物主要是：抗雄激素及抑制皮脂分泌的药物：如安体舒通，己烯雌酚等；抗毛囊皮脂导管角化的药物：如阿达帕林，全反式维甲酸，壬二酸等；抗菌、抗感染的药物：如克林霉素，四环素，红霉素等。痤疮治疗的药物和方法虽然较多，但同时也存在很多问题，主要是：部分药物疗效明显，但是毒副作用也同样明显，如肝肾功能损害、致畸等；另一方面虽然抗生素治疗细菌感染引起的疾病具有显著疗效，但是随着不合理的应用抗生素导致细菌耐药性增强，耐药菌株的增多使得临床细菌感染率、病死率逐年攀升(Alkhawaja,E.；Hammadi,S.；Abdelmalek,M.；Mahasneh,N.；Alkhawaja,B.；Abdelmalek,S.M.,Antibiotic resistant Cutibacterium acnes among acne patients in Jordan:across sectional study.BMC Dermatol 2020,20(1),17.)。
抗菌肽是一类具有抗菌活性的多肽的总称，不同的抗菌肽通常具有共同的特点：短肽，强阳离子性，广谱抗菌活性，抗菌效果强，杀菌速度快且由于抗菌肽特殊的作用机制不易形成耐药性，无药物屏障且不影响真核细胞，随着耐药性细菌的增生，抗菌肽得到了人们越来越广泛的关注。
胶原蛋白作为一种皮肤结构蛋白，是皮肤真皮层的主要成分，具有支撑肌肤弹性、皮肤修复、促进肌肤胶原蛋白再生、保湿等作用。对于痤疮后期瘢痕修复具有良好的效果，胶原蛋白可以诱导表皮细胞增殖、分化、引导上皮细胞迁入缺损区，促进创面上皮细胞修复，同时还可以修复毛囊壁损伤，抑制酪氨酸酶活性，防止黑色素形成，减少色沉。
发明内容
为了克服现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种抑菌消炎的复合胶原蛋白精华液及其制备方法与应用。
本发明提供了一种抑菌消炎的复合胶原蛋白精华液及其制备方法与应用，用于皮肤痤疮治疗与修复，抗菌肽可以快速抑制痤疮丙酸杆菌的过度繁殖以及抑制痤疮丙酸杆菌引起的炎症反应和炎症因子的释放，可以有效治疗炎症性痤疮。同时复合生物活性胶原蛋白，可以有效修复痤疮引起的皮肤瘢痕、凹陷，促进皮肤胶原蛋白再生，减少色素沉着。
本发明通过复合具有抗菌消炎作用的抗菌肽与具有皮肤修复作用的胶原蛋白制备一种复合胶原蛋白精华液，对于皮肤痤疮具有良好的抗菌、消炎以及修复效果。
本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。
本发明提供的一种抑菌消炎的复合胶原蛋白精华液，其特征在于，按照质量份数计，包括：
优选地，所述水为超纯水。
进一步地，所述胶原蛋白为从牛蹄筋中提取的Ι型胶原蛋白，所述胶原蛋白的分子量为117kDa-400kDa。
进一步地，所述人工合成抗菌肽为合成抗菌肽HHC36，所述人工合成抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述人工合成抗菌肽的纯度≥95％；人工合成抗菌肽的纯度可通过质谱和高效液相色谱确定。所述抗菌肽HHC36含有9个氨基酸，可采用固相合成的方法合成。本发明在配方中所添加的具有抗菌消炎作用的人工合成抗菌肽(抗菌肽HHC36)，对痤疮丙酸杆菌、表皮葡萄球菌具有很好的抑制、杀灭作用。
进一步地，所述酸性物质为醋酸、盐酸、柠檬酸等中的一种或以上。
优选地，所述酸性物质为柠檬酸。
进一步地，所述pH调节剂为氢氧化钠。
优选地，所述pH调节剂可以使用氢氧化钠配制为氢氧化钠溶液后再使用。
本发明提供一种制备上述的抑菌消炎的复合胶原蛋白精华液的方法，包括如下步骤：
(1)配制酸性溶液：将酸性物质加入水(优选超纯水)中，溶解均匀，得到稀酸溶液；
(2)将胶原蛋白凝胶加入步骤(1)所述稀酸溶液中，用高速剪切混合乳化器在冰浴的条件下进行剪切乳化处理，得到均相胶原蛋白原液；
(3)往步骤(2)所述均相胶原蛋白原液中加入pH调节剂，调节均相胶原蛋白原液的pH值为4.0-6.0，得到调节pH后的胶原蛋白原液；
(4)将人工合成抗菌肽加入步骤(3)所述调节pH后的胶原蛋白原液中，搅拌处理，得到所述抑菌消炎的复合胶原蛋白精华液。
进一步地，步骤(1)所述稀酸溶液的浓度为0.01M-0.1M，所述稀酸溶液的pH值为2.0-3.0。
进一步地，步骤(2)所述剪切乳化处理的转速为3000-7500转/分钟，所述剪切乳化处理的时间为10-50分钟；所述均相胶原蛋白原液中，胶原蛋白的质量百分比浓度为0.05wt％-1wt％。
优选地，步骤(2)所述剪切乳化处理的转速为6000转/分钟，所述剪切乳化处理的时间为30分钟。
进一步地，步骤(4)所述搅拌处理的温度为4-6℃，搅拌处理的时间为4-5小时；在所述抑菌消炎的复合胶原蛋白精华液中，人工合成抗菌肽的质量百分比浓度为0.0125‰-1‰。
优选地，步骤(4)所述搅拌处理的方式为磁力搅拌。
本发明制备的抑菌消炎的复合胶原蛋白精华液可以保存在4-6℃的环境下。
本发明提供的抑菌消炎的复合胶原蛋白精华液在制备消炎祛痘化妆品中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：
(1)本发明提供的制备方法中，所使用的原料人工合成抗菌肽HHC36，合成后经质谱和高效液相色谱确定其纯度≥95％，实验数据证明抗菌肽HHC36对痤疮丙酸杆菌，表皮葡萄球菌具有良好的抑菌效果；同时对痤疮丙酸杆菌引起的炎症反应及炎症因子的分泌具有很好的抑制作用；
(2)本发明提供的抑菌消炎的复合胶原蛋白精华液是一种综合治疗痤疮皮损、生物安全性好、效果温和、对皮肤无刺激的皮肤痤疮修复产品；
(3)本发明提供的制备方法中，将抗菌肽复配于胶原蛋白精华液中，可增加真皮层胶原蛋白的合成，促进皮肤修复，抑制瘢痕产生，减少痤疮引起的色素沉着；对于痤疮后期引起的皮肤痘印、瘢痕具有良好的修复效果；
(4)本发明提供的抑菌消炎的复合胶原蛋白精华液可以有效的改善痤疮及修复皮损，具有良好的临床应用前景。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。
实施例1
测试抗菌肽对痤疮丙酸杆菌ATCC6919(购自美国模式培养物集存库，编号为6919)，表皮葡萄球菌ATCC12228(购自美国模式培养物集存库，编号为12228)的最低抑菌浓度。
(1)分别配制强化梭菌培养基、营养肉汤、大豆酪蛋白琼脂培养基、营养琼脂，并在121℃条件下高温高压灭菌20分钟；待大豆酪蛋白琼脂培养基冷却至45-50℃，每1000mL培养基加入50mL无菌脱纤维羊血，混合均匀倒入一次性无菌培养皿中，制备羊血琼脂固体培养基；营养琼脂直接倒入一次性无菌培养皿中，制备营养琼脂固体培养基；每个培养皿装入15-20mL培养基，冷却凝固备用；
(2)复苏痤疮丙酸杆菌，表皮葡萄球菌：取-80℃甘油保存的菌液，加到摇菌管中，再加入5mL强化梭菌培养基或营养肉汤(在含复苏痤疮丙酸杆菌的摇菌管中加入强化梭菌培养基，在含营养肉汤的的摇菌管中加入营养肉汤)，复苏痤疮丙酸杆菌于37℃厌氧培养箱中培养48h，复苏表皮葡萄球菌于37℃恒温震荡培养箱中培养18h。采用划线法取痤疮丙酸杆菌菌液接种于血琼脂固体培养基，37℃厌氧培养箱培养48h；取表皮葡萄球菌菌液接种于营养琼脂固体培养基上，37℃恒温培养箱分别培养18h。培养完成后，分别挑取菌株加入5mL液体培养基中继续培养，分别于48h、18h取菌液，得到痤疮丙酸杆菌原液和表皮葡萄球菌原液，分别稀释至5×105CFU/mL的菌液备用；
(3)取抗菌肽HHC36(即人工合成抗菌肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)溶解于无菌水中，制备10mg/mL母液，使用0.22μm滤膜过滤除菌，分别使用母液配置500、250、125、62.5、31.2、15.6μg/mL抗菌肽溶液；
(4)取稀释至5×105CFU/mL的菌液900μL加入到2mL EP管中，每管加入100μL稀释至不同浓度的抗菌肽溶液(每管仅加入一种浓度的抗菌肽溶液)，最终抗菌肽溶液浓度为50、25、12.5、6.25、3.12、1.56μg/mL，以无菌水作为空白对照，分别于37℃恒温震荡培养箱(含痤疮丙酸杆菌菌液的EP管，每管加入200μL无菌液体石蜡液封，形成厌氧环境)培养4h后，每个EP管中分别取10μL菌液均匀涂布于固体培养基上，痤疮丙酸杆菌接种于血琼脂固体培养基上37℃厌氧培养箱培养48h，表皮葡萄球菌接种于营养琼脂固体培养基上37℃恒温箱培养18h。
(5)观察最低抑菌浓度，以EP管中无明显浑浊且菌液澄清，同时对应接种的平板固体培养基上无明显菌落生长作为抗菌肽最低抑菌浓度。
上述所有步骤中痤疮丙酸杆菌均在厌氧环境下培养。
(6)综合两种观察方法，表1a和表1b为抗菌肽HHC36抗痤疮丙酸杆菌ATCC6919的最低抑菌浓度实验结果。表2a和表2b为抗菌肽HHC36抗表皮葡萄球菌ATCC12228的最低抑菌浓度实验结果。由表1a、表1b、表2a及表2b的结果表明抗菌肽HHC36在6.25μg/mL时即可抑制大部分痤疮丙酸杆菌和表皮葡萄球菌生长，在12.5μg/mL时可以完全抑制痤疮丙酸杆菌和表皮葡萄球菌生长，杀菌快速，具有良好的抗菌效果。
表1a
| HHC36浓度(μg/mL) | 0 | 1.56 | 3.12 | 6.25 | 12.5 | 25 | 50 |
| OD630平均值 | 0.756 | 0.750 | 0.633 | 0.368 | 0 | 0 | 0 |
表1b
| HHC36浓度(μg/mL) | 0 | 1.56 | 3.12 | 6.25 | 12.5 | 25 | 50 |
| 平均增长菌落数 | 345 | 321 | 209 | 7 | 0 | 0 | 0 |
表2a
| HHC36浓度(μg/mL) | 0 | 1.56 | 3.12 | 6.25 | 12.5 | 25 | 50 |
| OD630平均值 | 0.416 | 0.411 | 0.384 | 0.198 | 0 | 0 | 0 |
表2b
实施例2
一种抑菌消炎的复合胶原蛋白精华液的制备方法，包括如下步骤：
(1)配制酸性溶液：将酸性物质(柠檬酸)加入100mL超纯水中，柠檬酸的质量相对于水质量的2％，待搅拌溶解均匀后，配成0.1M，pH为2的稀酸溶液，得到稀酸溶液；
(2)取胶原蛋白凝胶加入步骤(1)中的酸性溶液中，用高速剪切混合乳化器在冰浴条件下以转速为6000转/分钟的速率搅拌30分钟，制备得到胶原蛋白的质量分数为0.05wt％的均相胶原蛋白原液。
(3)采用pH调节剂(0.1M的氢氧化钠溶液)调节均相胶原蛋白原液的pH值为4.0。
(4)将人工合成抗菌肽加入到步骤(3)中的均相胶原蛋白原液中，得到混合液，在所述混合液中人工合成抗菌肽的质量百分比浓度为0.0125‰，在4℃条件下磁力搅拌4小时，得到所述抑菌消炎的复合胶原蛋白精华液。
(5)将制备的抑菌消炎的复合胶原蛋白精华液保存至4-6℃环境下。
实施例3
一种抑菌消炎的复合胶原蛋白精华液的制备方法，包括如下步骤：
(1)配制酸性溶液：将酸性物质(100μL浓盐酸溶液)加入100mL超纯水中，待搅拌混合均匀后，配成0.01M，pH为2.0的稀酸溶液。
(2)取胶原蛋白凝胶加入步骤(1)中的酸性溶液中，用高速剪切混合乳化器在冰浴条件下以转速为3000转/分钟的速率搅拌50分钟，制备得到胶原蛋白质量分数为0.07wt％的均相胶原蛋白原液。
(3)采用pH调节剂(0.1M的氢氧化钠溶液)调节均相胶原蛋白原液的pH值为5.0。
(4)将人工合成抗菌肽加入到步骤(3)中的均相胶原蛋白原液中，得到混合液，在所述混合液中人工合成抗菌肽的质量百分比浓度为0.05‰，在5℃条件下磁力搅拌4.5小时，得到所述抑菌消炎的复合胶原蛋白精华液。
(5)将制备的抑菌消炎的复合胶原蛋白精华液保存至4-6℃环境下。
实施例4
一种抑菌消炎的复合胶原蛋白精华液的制备方法，包括如下步骤：
(1)配制酸性溶液：将酸性物质(0.572mL醋酸)加入100mL超纯水中，待搅拌混合均匀后，配成0.1M，pH为3.0的稀酸溶液。
(2)取胶原蛋白凝胶加入步骤(1)中的酸性溶液中，用高速剪切混合乳化器在冰浴条件下以转速为7500转/分钟的速率搅拌30分钟，制备得到胶原蛋白质量分数为1wt％的均相胶原蛋白原液。
(3)采用pH调节剂(0.1M的氢氧化钠溶液)调节均相胶原蛋白原液的pH值为6.0。
(4)将人工合成抗菌肽加入到步骤(3)中的均相胶原蛋白原液中，得到混合液，在所述混合液中人工合成抗菌肽的质量百分比浓度为1‰，在6℃条件下磁力搅拌5小时，得到所述抑菌消炎的复合胶原蛋白精华液。
(5)将制备的抑菌消炎的复合胶原蛋白精华液保存至4-6℃环境下。
实施例5
测试所述抑菌消炎的复合胶原蛋白精华液对痤疮丙酸杆菌、表皮葡萄球菌的抑菌活性，采用抑菌圈法测试复合胶原蛋白精华液的抗菌活性。
(1)配制大豆酪蛋白琼脂培养基、营养琼脂培养基，121℃，灭菌20分钟，待培养基冷却至45-50℃，大豆酪蛋白琼脂培养基加无菌脱纤维羊血，每1000mL培养基加入50mL羊血，倒入一次性无菌培养皿中，每个培养皿倒入15-20mL培养基，冷却凝固备用，待血琼脂平板凝固后在培养皿底部等距划分为四个区域，做好标记。营养琼脂培养基冷却至45-50℃倒入一次性无菌培养皿中，每个培养皿倒入15-20mL培养基，冷却凝固备用，待血琼脂平板凝固后在培养皿底部等距划分为四个区域，做好标记；
(2)取实施例1中步骤(2)培养的痤疮丙酸杆菌原液、表皮葡萄球菌原液分别稀释至1×108CFU/mL备用；
(3)取步骤(2)中稀释的菌液100μL加入步骤(1)中的血琼脂平板上，用一次性L涂布棒将菌液在平板上涂布均匀，静置15分钟；
(4)待菌液被平板吸收后，取直径6mm打孔器，在酒精灯上灭菌，冷却后，在步骤(1)中做好标记的每区域中心位置打孔；
(5)将加入含不同浓度人工合成抗菌肽的胶原蛋白精华液加入到步骤(4)打好的孔中，以不加抗菌肽的胶原蛋白原液作为空白对照，每种菌液做三个平行皿；
(6)接种痤疮丙酸杆菌菌液血琼脂培养基于37℃厌氧培养箱培养48h，接种表皮葡萄球菌的营养琼脂培养基于37℃恒温培养箱培养18h。
(7)测量并记录抑菌圈直径结果如表3a和表3b所示，从结果观察可以看出，人工合成抗菌肽加入到胶原蛋白原液中仍然对痤疮丙酸杆菌、表皮葡萄球菌有较好的抑菌活性。表3a为胶原蛋白原液和复合胶原蛋白精华液抗痤疮丙酸杆菌ATCC6919的抑菌圈实验结果。表3b为胶原蛋白原液和复合胶原蛋白精华液抗表皮葡萄球菌ATCC12228的抑菌圈实验结果。
表3a
| HHC36浓度(μg/mL) | 0 | 12.5 | 25 | 50 | 100 |
| 平均抑菌圈直径(mm) | 6 | 10 | 14 | 17 | 20 |
表3b
| HHC36浓度(μg/mL) | 0 | 12.5 | 25 | 50 | 100 |
| 平均抑菌圈直径(mm) | 6 | 7 | 9 | 10 | 16 |
以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 中新国际联合研究院
<120> 一种抑菌消炎的复合胶原蛋白精华液及其制备方法与应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工合成(人工序列)
<400> 10
Lys Arg Trp Trp Lys Trp Trp Arg Arg
1 5
Claims (10)
1.一种抑菌消炎的复合胶原蛋白精华液，其特征在于，按照质量份数计，包括：
2.根据权利要求1所述的抑菌消炎的复合胶原蛋白精华液，其特征在于，所述胶原蛋白为从牛蹄筋中提取的Ι型胶原蛋白，所述胶原蛋白的分子量为117kDa-400kDa。
3.根据权利要求1所述的抑菌消炎的复合胶原蛋白精华液，其特征在于，所述人工合成抗菌肽为合成抗菌肽HHC36，所述人工合成抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.根据权利要求1所述的抑菌消炎的复合胶原蛋白精华液，其特征在于，所述酸性物质为醋酸、盐酸、柠檬酸中的一种以上。
5.根据权利要求1所述的抑菌消炎的复合胶原蛋白精华液，其特征在于，所述pH调节剂为氢氧化钠。
6.一种制备权利要求1-5任一项所述的抑菌消炎的复合胶原蛋白精华液的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将酸性物质加入水中，溶解均匀，得到稀酸溶液；
(2)将胶原蛋白加入步骤(1)所述稀酸溶液中，在冰浴的条件下进行剪切乳化处理，得到均相胶原蛋白原液；
(3)往步骤(2)所述均相胶原蛋白原液中加入pH调节剂，调节均相胶原蛋白原液的pH值为4.0-6.0，得到调节pH后的胶原蛋白原液；
(4)将人工合成抗菌肽加入步骤(3)所述调节pH后的胶原蛋白原液中，搅拌处理，得到所述抑菌消炎的复合胶原蛋白精华液。
7.根据权利要求6所述的抑菌消炎的复合胶原蛋白精华液的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述稀酸溶液的浓度为0.01M-0.1M，所述稀酸溶液的pH值为2.0-3.0。
8.根据权利要求6所述的抑菌消炎的复合胶原蛋白精华液的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述剪切乳化处理的转速为3000-7500转/分钟，所述剪切乳化处理的时间为10-50分钟；所述均相胶原蛋白原液中，胶原蛋白的质量百分比浓度为0.05wt％-1wt％。
9.根据权利要求6所述的抑菌消炎的复合胶原蛋白精华液的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述搅拌处理的温度为4-6℃，搅拌处理的时间为4-5小时；在所述抑菌消炎的复合胶原蛋白精华液中，人工合成抗菌肽的质量百分比浓度为0.0125‰-1‰。
10.权利要求1-5任一项所述的抑菌消炎的复合胶原蛋白精华液在制备消炎祛痘化妆品中的应用。
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Cited By (1)
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