CN112824894A - 糖肽解析装置 - Google Patents
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Abstract
提供一种糖肽解析装置，准确估计糖型的洗脱时间范围来全面性的解析糖型。该装置具备：谱制作部，基于对包含源自目标糖蛋白质的糖肽的试样进行LC/MS分析得到的数据制作每个洗脱时间的MS/MS谱；肽质量计算部，从洗脱时间不同的多个MS/MS谱中选定糖肽关联谱，根据该谱计算肽的质量；相似性判定部，判定糖肽关联谱与此外的所有MS/MS谱的相似性；谱筛选部，筛选出相似性高的MS/MS谱作为糖型关联谱；洗脱时间范围估计部，基于糖型关联谱的在时间轴上的出现频度分布来估计洗脱时间范围；糖链组成估计部，选出与在估计出的洗脱时间范围内收集到的MS谱上检测到的离子峰中肽质量以上的质量对应的离子峰，基于该峰估计糖链组成。
Description
技术领域
本发明涉及一种糖肽解析装置，更详细地说，涉及一种利用色谱质谱分析来对糖肽或者糖蛋白质中的糖链的结构进行解析的装置。
背景技术
在真核生物中，存在于生物体内的蛋白质大多接受糖链修饰而作为糖蛋白质被发现。该糖链修饰在蛋白质的结构、机能的调节中发挥着重要的作用。另外，通过近年来的研究，免疫疾病等各种疾病与糖链结构异常、糖化异常之间的关联性也逐渐变得明确。因此，糖蛋白质、糖肽的结构解析在生命科学、医疗、医药品开发等各种领域中都是非常重要的。
糖链的结构是非常多样的，在糖蛋白质中，存在很多的初级结构相同而糖链结构、糖链修饰位置不同的异构体(糖型(glycoform))。糖链结构、糖链的携带方法的差异导致糖蛋白质的物理性质和化学性质发生变化，对糖蛋白质的生理机能造成大的影响。因此，在进行糖蛋白质的机能解析的基础上解析糖链结构、糖链的修饰位置的不同是很重要的，期望确立一种全面地解析糖型的方法。
以往的一般的糖蛋白质的糖链解析的过程如下所示。
(1)精制糖蛋白质。
(2)通过酵素消化来将糖蛋白质分解为糖肽而得到肽混合物。
(3)从肽混合物中选择性地提取糖肽并将其浓缩。
(4)通过使用反相柱的液相色谱仪(LC)，按氨基酸序列等不同的每种糖肽来将糖肽分离。
(5)将通过LC分离得到的糖肽分别提供给质谱分析装置，执行MS/MS分析来获取MS/MS谱。
(6)通过对MS/MS谱进行解析，来进行糖链的组成、结构的解析。
在上述MS/MS分析时，如下的数据依赖性解析(DDA＝Data DependentAcquisition)是有用的：首先执行不进行离子的裂解操作的质谱分析(MS分析)，从由此得到的质谱提取例如信号强度大的峰等满足规定条件的峰后自动地进行将该峰作为目标的MS/MS分析(参照专利文献1、非专利文献1等)。然而，在这样的以往的糖链解析方法中存在如下问题。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2008-298427号公报
专利文献2：日本特开2016-194500号公报
专利文献3：国际公开第2017/145496号刊
非专利文献
非专利文献1：村瀬(Murase)及其他6人，“Data-dependent acquisition systemfor N-linked glycopeptides using MALDI-DIT-TOF MS”，International MassSpectrometry Conference，2012年，Poster session PWe-058
非专利文献2：K.Maass及其他4人，“‘Glyco-peakfinder’de novo compositionanalysis of glycoconjugates”，Proteomics，2007年，Vol.7，No.24，pp.4435-4444
发明内容
发明要解决的问题
在使用反相柱来分离糖肽的情况下，肽结构相同的糖型在比较接近的时间洗脱的情况多。因此，在通过数据依赖性解析进行MS/MS分析的情况下，由于质谱分析装置的通量的制约，只能对于被离子化的一部分糖型获取到MS/MS谱的情况并不少。若是这样，则无法进行MS/MS分析的其余糖型的糖链结构无法进行解析，对糖型的全面性的解析带来障碍。因此，需要如下方法：即使在对于一部分糖型无法进行MS/MS分析的情况下，也能够基于收集到的数据来全面性地解析源自于单一糖蛋白质的糖型。
假定为以下情况来进行糖链的结构估计在锁定妥当的结构候选上是有效的：在无法进行MS/MS分析的MS谱中检测到的离子峰是源自于这样的糖型的峰，该糖型具有与基于在比较接近的洗脱时间测定出的MS/MS谱而得到了估计结构信息(例如，肽质量)的糖肽相同的氨基酸序列。然而，糖型的洗脱时间并非仅取决于肽，还取决于糖链的化学特性、结构而发生变动。另外，如还在专利文献2、3中记载的那样，有时在糖链解析时对糖链导入各种化学修饰，也有时取决于其化学修饰的种类而糖型的洗脱时间发生变动。并且，这样的洗脱时间的变动幅度也根据每种肽而不同。
因此，即使在以相同LC条件对源自于单一糖蛋白质的糖型进行分离的情况下，也需要针对每种肽预先估计糖型的洗脱时间范围，进行基于在该洗脱时间范围内得到的MS/MS谱而得到了结构信息的糖型所对应的糖链解析。每种肽的糖型的洗脱时间范围的估计很麻烦，并且难以高精度地估计该洗脱时间范围。
本发明是鉴于上述问题而完成的，其主要目的在于提供一种能够高精度且简便地估计源自于单一糖蛋白质的每种肽的糖型的洗脱时间范围、由此能够提高糖型中的糖链解析的全面性的糖肽解析装置。
用于解决问题的方案
为了解决上述问题而完成的本发明的第一方式的糖肽解析装置使用将液相色谱仪与能够进行MS/MS分析的质谱分析装置组合而成的分析装置，来进行与糖蛋白质的糖型有关的结构解析，该糖肽解析装置具备：
谱制作部，其基于由所述分析装置对包含源自于作为目标的糖蛋白质的糖肽的试样进行分析而得到的数据，来制作每个洗脱时间的MS/MS谱；
肽质量计算部，其从由所述谱制作部制作出的洗脱时间不同的多个MS/MS谱中选定被估计为源自于糖肽的糖肽关联谱，基于该糖肽关联谱来计算该糖肽中的肽的质量；
谱相似性判定部，其判定所述糖肽关联谱与除其以外的所有MS/MS谱之间的相似性、或者所述糖肽关联谱与对应于特定时间范围的MS/MS谱之间的相似性；
糖型关联谱筛选部，其筛选出被判定为与所述糖肽关联谱的相似性高的MS/MS谱来作为该糖肽的糖型关联谱；
糖型洗脱时间范围估计部，其求出与所筛选出的所述糖型关联谱有关的在时间轴上的出现频度的分布，基于该分布来估计糖型洗脱时间范围；以及
糖链组成估计部，其在所估计出的所述糖型洗脱时间范围内收集到的MS谱上检测到的离子峰之中选出与由所述肽质量计算部计算出的肽质量以上的质量对应的离子峰，基于该离子峰来估计糖链组成。
关于这里所说的“将液相色谱仪与能够进行MS/MS分析的质谱分析装置组合而成的分析装置”，除了将从液相色谱仪的柱出口洗脱的洗脱液的至少一部分导入到质谱分析装置的离子化部的液相色谱质谱联用仪(LC-MS)以外，也可以是每隔规定的时间就对来自液相色谱仪的柱出口的洗脱液进行分级并调制样本，用具有基质辅助激光解吸离子源等离子源的质谱分析装置对该样本进行质谱分析的液相色谱质谱分析系统。
另外，关于“能够进行MS/MS分析的质谱分析装置”，一般地说，使用了离子阱与飞行时间型质谱分析器(TOFMS)的组合的装置、TOF/TOF型的质谱分析装置、四极杆-飞行时间型(Q-TOF型)质谱分析装置、三重四极杆型质谱分析装置等是有用的。
发明的效果
肽结构相同的一组糖型只是糖链修饰的位置不同或者糖链结构稍有不同，因此，一般地说，从这些糖型得到的MS/MS谱的图案的相似性高。因此，在本发明的上述方式所涉及的糖肽结构解析装置中，谱相似性判定部和糖型关联谱筛选部例如按照规定的算法来计算被估计为源自于糖肽的MS/MS谱(糖肽关联谱)与除其以外的所有MS/MS谱或对应于特定时间范围的MS/MS谱之间的相似度，并将该相似度与预先决定的阈值进行比较，由此提取被估计为源自于一个糖肽的糖型的MS/MS谱(糖型关联谱)。
如上所述，虽然与某个糖肽的肽结构共通的多种多样的糖型的洗脱时间并不完全相同，但是有在比较接近的时间洗脱的倾向。因此，当制作与被筛选出的大量的糖型关联谱有关的在时间轴上的出现频度的分布、即柱状图时，在该柱状图中出现峰。认为与该峰对应的洗脱时间范围是作为目标的一组、即肽结构相同的糖型洗脱的概率高的洗脱时间范围。因此，糖型洗脱时间范围估计部例如基于上述柱状图中的峰的大概的宽度来估计糖型洗脱时间范围。
在该糖型洗脱时间范围中，由于质谱分析装置的通量的制约等，虽然得到了MS谱，但是存在洗脱出未获取到MS/MS谱的糖型的可能性。因此，糖链组成估计部不利用MS/MS谱、而是利用在该糖型洗脱时间范围内收集到的MS谱上检测的离子峰，来估计糖链组成。
根据本发明的上述方式所涉及的糖肽解析装置，能够基于谱的相似度这样的客观的指标来简便且准确地估计按每种肽而不同的糖型的洗脱时间范围。由此，能够根据从糖肽和肽混合物的试样中收集的庞大的量的数据，不漏掉糖型地估计其糖链组成。反之，能够将包含与糖肽关联的糖型的可能性低的MS谱从糖链组成的估计对象中排除，因此能够缩短估计糖链组成所需的时间，能够提高估计精度。另外，还能够减轻用于验证该糖链组成的估计结果的时间、工作量。
附图说明
图1是作为本发明的一个实施方式的糖肽解析装置的主要部分的模块结构图。
图2是表示本实施方式的糖肽解析装置中的解析处理过程的流程图。
图3是本实施方式的糖肽解析装置中的糖型洗脱时间范围估计的过程的说明图。
图4是表示本实施方式的糖肽解析装置中的糖型洗脱时间范围估计的实例的图。
图5是本实施方式的糖肽解析装置中的用于对作为解析对象的糖肽进行分类的糖肽筛选分类部的主要部分的模块结构图。
图6是表示图5示出的糖肽筛选分类部中的糖肽分类处理的过程的流程图。
图7是表示在糖肽筛选分类部中基于层次聚类解析的分类结果的一例的图。
附图标记说明
1：分析部；11：液相色谱仪部；12：质谱分析部；2：数据解析部；21：谱数据保存部；22：糖链结构解析部；23：肽质量计算部；24：谱相似度计算部；25：糖型关联谱筛选部；26：糖型洗脱时间范围计算部；27：糖链组成估计部；28：解析结果显示处理部；3：输入部；4：显示部；200：糖肽筛选分类部；201：糖链碎片峰检测部；202：糖肽候选谱筛选部；203：糖链碎片峰去除部；204：谱相似度计算部；205：糖肽候选谱分类部。
具体实施方式
下面，参照附图来说明作为本发明的一个实施方式的糖肽解析装置。图1是本实施方式的糖肽解析装置的主要部分的模块结构图。
该糖肽解析装置具备对试样执行规定的分析来收集数据的分析部1、对收集到的数据进行解析处理的数据解析部2、输入部3以及显示部4。分析部1包含使用了反相柱的液相色谱仪部(LC部)11、以及能够进行MS/MS分析的质谱分析部(MS/MS部)12。
作为功能模块，数据解析部2包括谱数据保存部21和糖链结构解析部22，糖链结构解析部22包括肽质量计算部23、谱相似度计算部24、糖型关联谱筛选部25、糖型洗脱时间计算部26、糖链组成估计部27、解析结果显示处理部28等。
在分析部1中，质谱分析部12例如是搭载有电喷雾离子化(ESI)离子源的离子阱飞行时间型质谱分析装置，能够设为将从液相色谱仪部11的柱洗脱出的洗脱液的全部量或者一部分量直接导入到离子源，反复进行质谱分析。分析部1也可以不是液相色谱仪部11与质谱分析部12直接连接而成的结构，而是对由液相色谱仪部11进行了成分分离的洗脱液进行分级、分离来调制多个样本并将该多个样本分别在质谱分析部12中进行质谱分析的结构。在该情况下，关于质谱分析部12，能够采用使用了基质辅助激光解吸离子化(MALDI)离子源的MALDI-IT-TOFMS等。
在本装置中，数据解析部2的实体是通用的个人计算机或者性能更高的工作站，能够设为，通过使这样的计算机中安装的专用的数据处理用程序在该计算机中运行来实现如图1示出的各功能模块的功能。但是，在实施后述那样的数据库检索的情况下，既可以是该数据库本身包含于数据解析部2，也可以是访问不包含于数据解析部2的数据库来从该数据库仅提取所需的数据的结构。
接着，参照图1及图2、图3来说明使用了本实施方式的糖肽解析装置的解析动作的一例。图2是表示本实施方式的糖肽解析装置中的解析处理过程的流程图，图3是本实施方式的糖肽解析装置中的糖型洗脱时间范围估计的过程的说明图。
作为分析部1的分析对象的试样是由用户通过与以往方法同样的过程来准备的。即，首先精制作为目标的糖蛋白质之后，通过酵素消化来将该糖蛋白质分解为糖肽从而得到肽混合物。然后，从该肽混合物中选择性地提取糖肽并进行浓缩。
此外，在分析接受了包含唾液酸或者其它酸性糖的糖链修饰的糖肽的情况下，能够对该酸性糖的连接方式实施基于特异性的化学修饰的预处理，将完成该处理的试样提供给LC/MS分析。即，测定对象的肽混合物也可以包含接受了化学修饰的糖肽。
分析部1如上述那样对所准备的糖肽试样执行LC/MS分析。即，在液相色谱仪部11中，将试样中的各种糖肽在时间方向上分离，质谱分析部12对从液相色谱仪部11的柱洗脱出的洗脱液反复实施规定的质谱分析。质谱分析部12进行基于数据依赖性解析的MS/MS分析。具体地说，质谱分析部12首先执行遍及规定的质荷比范围的MS分析来获取质谱(MS谱)。然后，在该质谱中选择适合规定的选择条件的1个或者多个峰，继MS分析之后执行以该峰的质荷比为前体离子的MS/MS分析。以该1次MS分析与1次或者多次MS/MS分析为1个周期来反复执行该周期。
随着时间经过，通过反复执行MS分析和MS/MS分析而得到的数据从分析部1被发送到数据解析部2并被保存到谱数据保存部21。因而，在谱数据保存部21中，按每个保持时间(洗脱时间)，保存构成MS谱的数据以及构成与该MS谱关联的MS/MS谱的数据。
通常，糖肽的分子关联离子峰的信号强度高，因此通过适当地设定上述选择条件，能够高效地选择糖肽的分子关联离子峰来进行MS/MS分析。但是，在同一周期中能够继MS分析之后执行的MS/MS分析的次数存在时间上的制约，因此源自于具有相同的肽结构而糖链结构等不同的糖型的离子的量很多，当在质谱上进行观测时，对于一部分糖型无法进行MS/MS分析。因此，经常存在以下情况：即使在MS谱中观测到某个糖肽的分子关联离子峰，也无法获取与该糖肽对应的MS/MS谱。
基于如上述那样收集到的数据，糖链结构解析部22执行如下解析处理。
肽质量计算部23首先从所有MS/MS谱中选出是源自于糖肽的MS/MS谱的可能性高的MS/MS谱、即能够以某种程度的高准确度判断为源自于糖肽的MS/MS谱，来作为糖肽关联谱(参照图3的(a))。然后，针对所选出的每个MS/MS谱(糖肽关联谱)分别根据在该MS/MS谱中观测到的离子峰的信息来推算肽质量、即糖肽中的仅肽部分的质量(步骤S1)。关于糖肽关联谱的选出，例如能够以如下方法中的任一个方法来进行。
<糖肽关联谱的第一选出方法>
肽质量计算部23根据处理对象的MS/MS谱，收集去除了噪声峰等的有意义的峰的信息来制作峰列表。然后，通过基于该峰列表和预先设定的检索条件进行数据库检索，来尝试糖肽的鉴定。然后，将鉴定出糖肽的MS/MS谱判断为糖肽关联谱。
在上述的数据库检索时的检索条件中，例如优选包含基于存在特定糖的修饰或者糖的裂解片段的修饰之类的先验信息而估计出的糖链(翻译后修饰)信息等。另外，关于数据库检索，能够采用美国Matrix Science公司提供的Mascot中所包含的MS/MS离子检索等、蛋白质组解析用的现存的蛋白质数据库检索引擎。如果鉴定出糖肽则可知肽的氨基酸序列，因此能够根据该氨基酸序列推算出肽质量。此外，在对MS/MS谱进行使用了蛋白质数据库检索的糖肽解析时，优选的是事先对源自于糖肽的MS/MS谱与除其以外的MS/MS谱进行分类，而关于此分类后面叙述。
<糖肽关联谱的第二选出方法>
当对源自于糖肽的离子进行伴有碰撞诱导裂解(CID)的MS/MS分析时，存在以下情况：糖链部分优先于肽部分裂解，产生源自于糖残基按顺序脱离所得到的肽的离子、即由于糖链的碎片化而产生的糖链碎片离子(氧鎓离子(oxonium ion))。因此肽质量计算部23判定在处理对象的MS/MS谱中是否检测到这样的氧鎓离子，将检测到氧鎓离子的MS/MS谱判断为糖肽关联谱。然后，在作为解析对象的糖肽是N-连接型糖肽、且质谱分析部12是搭载有ESI离子源的质谱分析装置的情况下，假定MS/MS谱中信号强度最大的峰是1个N-乙酰己糖胺(HexNAc)连接了肽而成的N-连接型糖肽碎片离子，根据该峰的质荷比推算出肽质量。
此外，也有时在MS/MS谱中氧鎓离子峰本身是信号强度最大的峰，因此在寻找信号强度最大的峰时，也可以事先从峰列表中去掉氧鎓离子峰。
<糖肽关联谱的第三选出方法>
已知在作为解析对象的糖肽是N-连接型糖肽、使用搭载有MALDI离子源的质谱分析装置的情况下，在MS/MS谱中会观测到特征性的三重峰(以质荷比间隔从低质荷比侧起为83Da和120Da地排列的3个峰)。因此肽质量计算部23判定在对象的MS/MS谱中是否检测到上述的三重峰，将检测到三重峰的MS/MS谱判断为糖肽关联谱。然后，将在该三重峰中质荷比最小的峰假定为仅糖链脱离的肽离子，根据该峰的质荷比来推算肽质量。
若在上述步骤S1中选出了糖肽关联谱，则谱相似度计算部24针对每个MS/MS谱计算表示1个糖肽关联谱与除其以外的MS/MS谱的谱图案的相似性的指标值、即相似度(步骤S2：参照图3的(b))。
此外，在生成上述的糖链碎片(氧鎓离子)的情况下，它们共同出现在糖肽中，因此当包含这些离子地计算相似度时，即使不是与相同的肽对应的糖型，相似度也在表观上变高。即，在判定是否为源自于相同的肽的MS/MS谱的方面，氧鎓离子可以说成为妨碍。因此，也可以在计算相似度之前进行以下处理：从糖肽关联谱以及与其进行比较的所有MS/MS谱去除源自于已知的氧鎓离子的峰。另外，氧鎓离子经验上是m/z为500或者530以下的低质荷比的离子，反映了糖链的特异性的组成等的离子的质荷比基本上都比它大。因此，也可以从糖肽关联谱以及与其进行比较的所有MS/MS谱去除存在于m/z为500或者530等事先指定的质荷比值以下的低质荷比范围内的所有峰。
糖型关联谱筛选部25将针对每个MS/MS谱求出的相似度的值与规定的阈值进行比较，仅筛选出相似度为阈值以上的MS/MS谱来作为糖型关联谱(步骤S3)。也就是说，从收集到的MS/MS谱中仅筛选出被判定为与糖肽关联谱的相似性高的MS/MS谱来作为糖型关联谱。关于肽相同而糖链结构稍有不同的糖型、或者糖链相同而仅连接方式、连接位置不同的糖型，其MS/MS谱的图案的相似性应该高。因而，通过步骤S3的筛选处理，能够收集相同的肽的多样的糖型的MS/MS谱(参照图3的(c))。
糖型洗脱时间计算部26针对每个得到在步骤S3中筛选出的MS/MS谱的洗脱时间求出该MS/MS谱的数量、即出现频度。在此，只要按规定的时间宽度分割液相色谱仪部11中的整个测定时间，按该分割得到的时间宽度来计算上述出现频度即可。然后，基于该计算结果，制作如图3的(d)所示的与洗脱时间相对的出现频度分布(柱状图)。该柱状图能够表示肽相同的糖型洗脱的可能性的高度。因此糖型洗脱时间计算部26基于柱状图中出现的峰的宽度、或者该峰波形的分散程度等，来估计被视为一组的糖型的洗脱时间范围(步骤S4)。
若在步骤S4中决定了洗脱时间范围，则糖链组成估计部27从谱数据保存部21读出在该洗脱时间范围内得到的所有MS谱。然后，在各MS谱中，提取表示与在步骤S1中求出的肽质量以上的质量对应的质荷比的离子峰，基于该离子峰来进行糖链组成的估计(步骤S5)。关于该糖链组成的估计方法，可以是以往一般进行的方法。例如，能够考虑以下方法：假定MS谱上的离子峰是源自于糖肽的离子峰，从与该峰对应的质量减去肽质量，由此求出糖链(实际上是假定为糖链的成分)的质量，轮循地探索与该糖链质量一致的糖链。在这样的糖链的轮循式的探索中，能够利用非专利文献2中记载的“Glyco-peakfinder”。
在洗脱时间范围内得到的MS谱中，观测到与由于上述那样的时间上的制约而无法进行MS/MS分析的糖型对应的离子峰的可能性高。因而，在本实施方式的糖肽解析装置中，也能够估计在基于MS/MS谱的解析中被看漏的糖型的糖链组成、结构。即，能够对还将至今为止无法解析的糖型包括在内的糖型进行全面性的解析。
解析结果显示处理部28将这样估计出的糖链的组成、结构的解析结果与肽的结构解析结果(氨基酸序列)等显示于显示部4(步骤S6)。
一般地说，在上述说明中的步骤S1中会选定多个糖肽关联谱，因此优选针对每个该糖肽关联谱实施上述步骤S2～S5的处理。
另外，也可以在对上述步骤S4中估计出的洗脱时间范围内得到的所有MS谱进行合并的基础上实施步骤S5和S6的处理。
[实测例]
作为使用了本实施方式的糖肽解析装置的一个实测例，参照图4来说明对α1-酸性糖蛋白的糖型的洗脱时间范围进行估计的例子。
对源自于α1-酸性糖蛋白的试样进行LC/MS分析，从基于通过该分析收集到的数据制作出的MS/MS谱中，通过上述的第二选出方法(检测氧鎓离子的方法)来筛选出了糖肽关联谱。然后，从筛选出的糖肽关联谱及其它MS/MS谱中去除源自于已知的氧鎓离子的峰(参照图4的(a))之后，计算出了谱的相似度。相似度是通过dot product(点积)法求出的。
图4的(b)是示出了针对每个MS/MS谱计算出的相似度的分布的图。在此，将与相似度对应的阈值定为0.8，相似度为0.8以上的MS/MS谱被判断为正在关注的糖肽的糖型关联谱而被选出。由图4的(b)可知，所选出的糖型关联谱的洗脱时间与原来的、即相似度低的MS/MS谱的洗脱时间相比，其偏差相当小。
然后，如图4的(c)所示，制作出关于所选出的糖型关联谱的洗脱时间所对应的柱状图，而几乎所有糖型关联谱都收敛于17分钟～20.5分钟之间。因此，关于正在关注的糖肽，糖型洗脱时间范围被决定为17分钟～20.5分钟。
这样，在本实施方式的糖肽解析装置中，能够利用MS/MS谱来决定对于每种肽都适合的、也就是将糖型几乎网罗那样的洗脱时间范围。
[MS/MS谱的筛选和分类]
如上所述，在上述实施方式的糖肽解析装置中，作为在步骤S1中计算肽质量时的一个方法，列举了对MS/MS谱使用了蛋白质数据库检索的方法。在进行基于MS/MS谱的一般的蛋白质组解析用的蛋白质数据库检索的情况下，虽然也存在能够鉴定糖肽的情况，但是通常能够以高可靠度鉴定糖肽的只不过是一部分MS/MS谱，避免不了发生鉴定遗漏。为了基于这种未鉴定的MS/MS谱进行糖肽解析，需要首先估计肽质量，但是一般经常使用的肽质量估计法以N-连接型糖肽为对象。因此，需要事先将MS/MS谱分类为源自于糖肽的MS/MS谱与非源自于糖肽的MS/MS谱。
即，为了对通过测定未知的糖肽混合物试样所得到的大量MS/MS谱全面性地进行糖肽的结构解析，重要的是，从该大量MS/MS谱中筛选出源自于糖肽的MS/MS谱，并且按肽结构不同的每种糖肽将该筛选出的MS/MS谱分类。这并不一定限于在如图2示出的处理过程中进行糖链结构解析的情况，在基于MS/MS谱的糖蛋白质、糖肽的解析时也是共同的问题。
图5是表示能够追加到图1示出的上述实施方式的糖肽解析装置中的数据解析部20的糖肽筛选分类部200的模块结构的图。作为功能模块，该糖肽筛选分类部200包含糖链碎片峰检测部201、糖肽候选谱筛选部202、糖链碎片峰去除部203、谱相似度计算部204、糖肽候选谱分类部205。
图6是表示糖肽筛选分类部200的处理过程的流程图。
糖链碎片峰检测部201针对处理对象的MS/MS谱分别检测源自于已知的糖链碎片离子(氧鎓离子)的峰(步骤S11)。在对糖链进行了化学修饰的情况下，作为检测的对象，也可以对糖链碎片离子附加被修饰糖链碎片离子。未检测到糖链碎片离子峰的MS/MS谱不是源自于糖肽的MS/MS谱的可能性高，因此在此被排除。
接着，糖肽候选谱筛选部202判定在步骤S11中检测到的糖链碎片离子峰是否满足规定基准，筛选包含满足规定基准的糖链碎片离子峰的MS/MS谱来作为糖肽候选谱(步骤S12)。作为规定基准，只要设为检测到的离子峰的数量为规定个数以上、或者、N-乙酰己糖胺(HexNAc)等特定的糖链碎片离子峰的强度在该一个MS/MS谱中的所有离子峰中为规定的顺位以上等即可。即使在步骤S11中检测到糖链碎片离子峰，也有时偶尔存在与糖链碎片离子相同的或者质量极其相近的其它离子，而这种情况的至少一部分在此被排除。
接着，糖链碎片峰去除部203对筛选出的各糖肽候选谱去除糖链碎片离子峰(步骤S13)。此时，也可以采用如下等的方法：不是仅除掉检测到的糖链碎片离子峰，而是将包含主要的糖链碎片离子的规定的质荷比范围(例如m/z为530以下的范围)的峰全部去除。
谱相似度计算部204按照规定的算法(例如点积法)来计算去除了源自于糖链碎片离子的峰之后的糖肽候选谱之间的相似度(步骤S14)。作为表示相似度的得分，只要采用作为肽、代谢物的库检索方法而被公知的计分方法即可。
糖肽候选谱分类部205使用在步骤S14中得到的糖肽候选谱之间的相似度来进行层次聚类解析，基于其结果对糖肽候选谱进行分类(步骤S15)。将这样筛选及分类后的MS/MS谱(糖肽候选谱)例如输出为糖链解析部22中的如上述那样的解析处理的对象(步骤S16)。作为上述层次聚类解析中的谱间距离的计算法，例如能够使用欧几里得距离。另外，作为聚类间距离的测定法，能够采用离差平方和(Ward)法。
在步骤S14、S15中，也可以将作为相似度计算的对象的大量糖肽候选谱按规定的洗脱时间范围来分开，计算洗脱时间范围内所包含的糖肽候选谱之间的相似度。例如，在洗脱时间整体为60分钟的情况下，也可以将其按5分钟分割来总共设定12个洗脱时间范围，对于各洗脱时间范围内所包含的糖肽候选谱实施层次聚类解析。或者，也可以求出规定的洗脱时间(例如，3分钟)的范围内所包含的糖肽候选谱之间的相似度。当然，也可以在求出了洗脱时间整体的糖肽候选谱之间的相似度之后，将洗脱时间整体适当分割，将不需要的洗脱时间范围的结果删除。另外，关于分割的洗脱时间范围的宽度、作为计算相似度的对象之外的洗脱时间的长度，只要基于已知的糖肽的洗脱时间的分布等来决定即可。
图7是示出针对对α-1酸性糖蛋白的混合物试样进行LC-MS/MS分析所得到的MS/MS谱实施了上述处理的情况下的聚类解析结果的一例的图。在图7的纵轴和横轴上分别以相同的顺序排列用洗脱时间表示的MS/MS谱，在纵横的交点用灰阶来示出了两个MS/MS谱间的相似度的大小。因而，在图7中向右下45°倾斜的线示出了相同的MS/MS谱之间的相似度。另外，隔着该线而上下对称。
如观察图7可知的那样，MS/MS谱被分类为多个不同的糖肽的聚类。其中，以GP1、GP2示出的两个聚类是通过数据库检索以高可靠度鉴定出的糖肽候选谱。另一方面，记载为“未知”的聚类是未鉴定的糖肽候选谱。这样，通过在预先将大量MS/MS谱筛选并分类的基础上，如上述那样由糖链解析部22进行解析处理，能够提高基于数据库检索的糖肽的鉴定效率，并且能够减少可能会误鉴定的解析结果。另外，事先排除了无需鉴定糖肽的MS/MS谱，因此不再需要进行无用的解析处理。
此外，上述实施方式和上述的变形例不过是本发明的一例，在本发明的主旨的范围内即使进行了适当变形、修改、追加等也包含于本申请权利要求书，这是理所当然的。
[各种方式]
本领域技术人员能够理解，上述的例示性的实施方式是以下方式的具体例。
(第1项)本发明的一个方式的糖肽解析装置使用将液相色谱仪与能够进行MS/MS分析的质谱分析装置组合而成的分析装置，来进行与糖蛋白质的糖型有关的结构解析，该糖肽解析装置具备：
谱制作部，其基于由所述分析装置对包含源自于作为目标的糖蛋白质的糖肽的试样进行分析而得到的数据，来制作每个洗脱时间的MS/MS谱；
肽质量计算部，其从由所述谱制作部制作出的洗脱时间不同的多个MS/MS谱中选定被估计为源自于糖肽的糖肽关联谱，基于该糖肽关联谱来计算该糖肽中的肽的质量；
谱相似性判定部，其判定所述糖肽关联谱与除其以外的所有MS/MS谱之间的相似性、或者所述糖肽关联谱与对应于特定时间范围的MS/MS谱之间的相似性；
糖型关联谱筛选部，其筛选出被判定为与所述糖肽关联谱的相似性高的MS/MS谱来作为该糖肽的糖型关联谱；
糖型洗脱时间范围估计部，其求出与所筛选出的所述糖型关联谱有关的在时间轴上的出现频度的分布，基于该分布来估计糖型洗脱时间范围；以及
糖链组成估计部，其在所估计出的所述糖型洗脱时间范围内收集到的MS谱上检测到的离子峰之中选出与由所述肽质量计算部计算出的肽质量以上的质量对应的离子峰，基于该离子峰来估计糖链组成。
根据第1项所记载的糖肽解析装置，能够基于谱的相似度这样的客观的指标来简便且准确地估计按每种肽而不同的糖型的洗脱时间范围。由此，能够根据从糖肽和肽混合物的试样收集的庞大的量的数据，不漏掉糖型地估计其糖链组成。反之，能够将包含与糖肽关联的糖型的可能性低的MS谱从糖链组成的估计对象中排除，因此能够缩短估计糖链组成所需的时间，能够提高估计精度。另外，还能够减轻用于验证该糖链组成的估计结果的时间、工作量。
(第2项)第1项所记载的糖肽解析装置能够设为，所述肽质量计算部通过基于各MS/MS谱的数据库检索法来进行糖肽的鉴定，将能够进行糖肽的鉴定的MS/MS谱选定为糖肽关联谱。
根据第2项所记载的糖肽解析装置，对于包含N-连接型糖链的肽以及包含O-连接型糖链的肽中的任意一种，都能够选定糖肽关联谱。
(第3项)第1项所记载的糖肽解析装置能够设为，所述肽质量计算部将检测到氧鎓离子的MS/MS谱选定为糖肽关联谱，假定该MS/MS谱中信号强度最大的峰是1个N-乙酰己糖胺连接于肽而成的N-连接型糖肽的碎片离子，来计算肽的质量。
根据第3项所记载的糖肽解析装置，特别是在作为解析对象的糖肽是N-连接型糖肽、且由使用了搭载有ESI离子源作为离子源的质谱分析装置的分析装置执行LC/MS分析的情况下，能够良好地选定糖肽关联谱来计算其肽质量。
(第4项)第1项所记载的糖肽解析装置能够设为，所述肽质量计算部将检测到在N-连接型糖肽中具有特征性的三重离子峰的MS/MS谱选定为糖肽关联谱，将该MS/MS谱中的三重峰中质量最小的离子峰假定为仅糖链脱离的肽离子，来计算肽的质量。
根据第4项所记载的糖肽解析装置，特别是在由使用了搭载有MALDI离子源作为离子源的质谱分析装置的分析装置执行LC/MS分析的情况下，能够良好地选定糖肽关联谱，来计算其肽质量。
(第5项)第1项～第4项中的任1项所记载的糖肽解析装置能够设为，所述谱相似性判定部在从糖肽关联谱和除其以外的所有MS/MS谱分别去除源自于氧鎓离子的峰、或者从糖肽关联谱和对应于特定时间范围的MS/MS谱分别去除源自于氧鎓离子的峰之后，判定谱的相似性。
根据第5项所记载的糖肽解析装置，能够提高MS/MS谱的相似度的计算精度，由此还能够提高糖型的洗脱时间范围的准确性。其结果，能够更加减少糖型的漏掉。
(第6项)第1项～第5项中的任1项所记载的糖肽解析装置能够设为，还具备分析控制部，该分析控制部对所述质谱分析装置的动作进行控制，使得在所述质谱分析装置中执行通常的MS分析来获取MS谱，继所述MS分析之后执行将在该MS谱中检测到的峰之中满足规定条件的峰的质荷比设定为前体离子的MS/MS分析。
根据第6项所记载的糖肽解析装置，在来自液相色谱仪的洗脱液中包含有糖肽等成分的情况下，能够自动地获取关于该成分的MS/MS谱。另外，通过适当地设定用于选择前体离子的规定条件，能够避免对洗脱液中所包含的夹杂物等不需要的成分执行MS/MS分析，能够相应地增加对有意义的成分执行MS/MS分析的机会。
(第7项)第1项～第6项中的任1项所记载的糖肽解析装置能够设为，还具备：
糖链碎片检测部，其从由所述谱制作部制作出的多个MS/MS谱中分别检测糖链碎片峰；
糖肽候选谱选出部，其选出检测到的糖链碎片峰满足规定基准的MS/MS谱来作为糖肽候选谱；
糖链碎片去除部，其从所选出的糖肽候选谱中分别删除糖链碎片峰；
谱相似度计算部，其计算已去除糖链碎片峰的糖肽候选谱之间的峰图案的相似度；以及
谱分类部，其进行基于所述相似度的聚类解析，按照规定基准将糖肽候选谱分类为一个或多个组，
其中，由所述谱分类部分组后的糖肽候选谱的全部或一部分被供于所述肽质量计算部所进行的处理。
根据第7项所记载的糖肽解析装置，能够从通过测定未知的糖肽混合物试样而得到的大量MS/MS谱中筛选出源自于糖肽的可能性高的MS/MS谱，并且，按肽结构相同或者类似的每种肽来进行分类之后，进行解析处理。由此，能够基于大量MS/MS，无漏掉地进行糖肽结构解析。另外，能够减少误鉴定而进行高精度的糖肽解析。
另外，上述第7项所记载的糖肽解析装置并不限定于第1项～第6项所记载的肽解析装置，作为进行基于其它方法的糖肽解析时的MS/MS谱的预处理的方法也有效。即，在基于通过测定未知的糖肽混合物试样所得到的MS/MS谱来进行全面性的糖肽结构解析时，出于尽可能没有漏掉地进行糖肽解析并且减少误鉴定来提高其估计精度的目的，能够使用第8项所记载的糖肽解析装置。
(第8项)为了达成上述目的而完成的本发明的第二方式的糖肽解析装置使用将液相色谱仪与能够进行MS/MS分析的质谱分析装置组合而成的分析装置，来进行糖蛋白质的结构解析，该糖肽解析装置具备：
谱制作部，其基于由所述分析装置对包含源自于作为目标的糖蛋白质的糖肽的试样进行分析而得到的数据，来制作每个洗脱时间的MS/MS谱；
糖链碎片检测部，其从由所述谱制作部制作出的多个MS/MS谱中分别检测糖链碎片峰；
糖肽候选谱选出部，其选出检测到的糖链碎片峰满足规定基准的MS/MS谱来作为糖肽候选谱；
糖链碎片去除部，其从所选出的糖肽候选谱中分别删除糖链碎片峰；
谱相似度计算部，其计算已去除糖链碎片峰的糖肽候选谱之间的峰图案的相似度；以及
谱分类部，其进行基于所述相似度的聚类解析，按照规定基准将糖肽候选谱分类为一个或多个组。
根据上述第8项所记载的糖肽解析装置，在基于通过对未知的糖肽混合物试样进行测定所得到的MS/MS谱来进行全面性的糖肽结构解析时，能够尽可能没有漏掉地进行糖肽解析。另外，能够减少误鉴定来提高该解析的估计精度。
(第9项)第8项所记载的糖肽解析装置能够设为，还具备肽质量计算部，该肽质量计算部基于被分类为一个或多个组的糖肽候选谱，来针对每个组或者针对任意一个组计算糖肽中的肽的质量。
(第10项)另外，第9项所记载的糖肽解析装置能够设为，还具备糖链组成估计部，该糖链组成估计部利用洗脱时间与一个糖肽候选谱的洗脱时间相同的MS谱、以及根据该糖肽候选谱求出的肽的质量，来估计该糖肽的糖链组成。
根据上述第9项和第10项所记载的糖肽解析装置，能够基于对糖肽混合物试样进行LC/MS分析而得到的庞大的量的数据，来全面且高精度地求出糖肽的糖链组成。
Claims (10)
1.一种糖肽解析装置，使用将液相色谱仪与能够进行MS/MS分析的质谱分析装置组合而成的分析装置，来进行与糖蛋白质的糖型有关的结构解析，该糖肽解析装置具备：
谱制作部，其基于由所述分析装置对包含源自于作为目标的糖蛋白质的糖肽的试样进行分析而得到的数据，来制作每个洗脱时间的MS/MS谱；
肽质量计算部，其从由所述谱制作部制作出的洗脱时间不同的多个MS/MS谱中选定被估计为源自于糖肽的糖肽关联谱，基于该糖肽关联谱来计算该糖肽中的肽的质量；
谱相似性判定部，其判定所述糖肽关联谱与除其以外的所有MS/MS谱之间的相似性、或者所述糖肽关联谱与对应于特定时间范围的MS/MS谱之间的相似性；
糖型关联谱筛选部，其筛选出被判定为与所述糖肽关联谱的相似性高的MS/MS谱来作为该糖肽的糖型关联谱；
糖型洗脱时间范围估计部，其求出与所筛选出的所述糖型关联谱有关的在时间轴上的出现频度的分布，基于该分布来估计糖型洗脱时间范围；以及
糖链组成估计部，其在所估计出的所述糖型洗脱时间范围内收集到的MS谱上检测到的离子峰之中选出与由所述肽质量计算部计算出的肽质量以上的质量对应的离子峰，基于该离子峰来估计糖链组成。
2.根据权利要求1所述的糖肽解析装置，其特征在于，
所述肽质量计算部通过基于各MS/MS谱的数据库检索法来进行糖肽的鉴定，将能够进行糖肽的鉴定的MS/MS谱选定为糖肽关联谱。
3.根据权利要求1所述的糖肽解析装置，其特征在于，
所述肽质量计算部将检测到氧鎓离子的MS/MS谱选定为糖肽关联谱，假定该MS/MS谱中信号强度最大的峰是1个N-乙酰己糖胺连接于肽而成的N-连接型糖肽的碎片离子，来计算肽的质量。
4.根据权利要求1所述的糖肽解析装置，其特征在于，
所述肽质量计算部将检测到在N-连接型糖肽中具有特征性的三重离子峰的MS/MS谱选定为糖肽关联谱，将该MS/MS谱中的三重峰中质量最小的离子峰假定为仅糖链脱离的肽离子，来计算肽的质量。
5.根据权利要求1所述的糖肽解析装置，其特征在于，
所述谱相似性判定部在从糖肽关联谱和除其以外的所有MS/MS谱分别去除源自于氧鎓离子的峰、或者从糖肽关联谱和对应于特定时间范围的MS/MS谱分别去除源自于氧鎓离子的峰之后，判定谱的相似性。
6.根据权利要求1所述的糖肽解析装置，其特征在于，
还具备分析控制部，该分析控制部对所述质谱分析装置的动作进行控制，使得在所述质谱分析装置中执行通常的MS分析来获取MS谱，继所述MS分析之后执行将在该MS谱中检测到的峰之中满足规定条件的峰的质荷比设定为前体离子的MS/MS分析。
7.根据权利要求1所述的糖肽解析装置，其特征在于，还具备：
糖链碎片检测部，其从由所述谱制作部制作出的多个MS/MS谱中分别检测糖链碎片峰；
糖肽候选谱选出部，其选出检测到的糖链碎片峰满足规定基准的MS/MS谱来作为糖肽候选谱；
糖链碎片去除部，其从所选出的糖肽候选谱中分别删除糖链碎片峰；
谱相似度计算部，其计算已去除糖链碎片峰的糖肽候选谱之间的峰图案的相似度；以及
谱分类部，其进行基于所述相似度的聚类解析，按照规定基准将糖肽候选谱分类为一个或多个组，
其中，由所述谱分类部分组后的糖肽候选谱的全部或一部分被供于所述肽质量计算部所进行的处理。
8.一种糖肽解析装置，使用将液相色谱仪与能够进行MS/MS分析的质谱分析装置组合而成的分析装置，来进行糖蛋白质的结构解析，该糖肽解析装置具备：
谱制作部，其基于由所述分析装置对包含源自于作为目标的糖蛋白质的糖肽的试样进行分析而得到的数据，来制作每个洗脱时间的MS/MS谱；
糖链碎片检测部，其从由所述谱制作部制作出的多个MS/MS谱中分别检测糖链碎片峰；
糖肽候选谱选出部，其选出检测到的糖链碎片峰满足规定基准的MS/MS谱来作为糖肽候选谱；
糖链碎片去除部，其从所选出的糖肽候选谱中分别删除糖链碎片峰；
谱相似度计算部，其计算已去除糖链碎片峰的糖肽候选谱之间的峰图案的相似度；以及
谱分类部，其进行基于所述相似度的聚类解析，按照规定基准将糖肽候选谱分类为一个或多个组。
9.根据权利要求8所述的糖肽解析装置，其特征在于，
还具备肽质量计算部，该肽质量计算部基于被分类为一个或多个组的糖肽候选谱，来针对每个组或者针对任意一个组计算糖肽中的肽的质量。
10.根据权利要求9所述的糖肽解析装置，其特征在于，
还具备糖链组成估计部，该糖链组成估计部利用洗脱时间与一个糖肽候选谱的洗脱时间相同的MS谱、以及根据该糖肽候选谱求出的肽的质量，来估计该糖肽的糖链组成。
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