CN112807323A - 用于抑制病毒增殖的组合物的应用和肠道感染症的发病风险的降低方法 - Google Patents

Abstract

用于抑制病毒增殖的组合物的应用和肠道感染症的发病风险的降低方法。[课题]课题在于提供使用了源自饮食品的有效成分的、能够轻松摄取且具有抗病毒作用的组合物。[解決手段]提供包含乳酸菌的胞外多糖的、用于抑制病毒的增殖的组合物。组合物可以适合用于如诺如病毒那样的肠道感染性的病毒。组合物还用于选自由促进INF‑β的产生、RIG‑I的活化和MDA5的活化组成的组中的任意者。

Description

用于抑制病毒增殖的组合物的应用和肠道感染症的发病风险 的降低方法

技术领域

本发明涉及用于抑制病毒增殖的组合物。

背景技术

感染性肠炎是主要由病毒等病原体引起的肠炎的总称，作为成为原因的病毒，已知诺如病毒、轮状病毒、札幌病毒、腺病毒等。由诺如病毒引起的食物中毒、感染症在全年中会发生，但每年冬季时迎来爆发高峰。诺如病毒借助手指、食品等以经口方式感染，在人的肠道中增殖而引起呕吐、腹泻、腹痛等。有时小孩、老年人等会重症化。

另一方面，已知乳酸菌或其产生的胞外多糖具有几种效果。例如，专利文献1提出了以乳杆菌保加利亚亚种OLL1073R-1(L.bulgaricus OLL1073R-1)和嗜热链球菌OLS3059(S.thermophilus OLS3059)作为起子菌而制造的、具有NK细胞活化作用的发酵乳。在此，记述了如下内容：该发酵乳中包含酸性多糖类、优选磷酸化多糖类，含有酸性多糖类作为有效成分的NK细胞激活剂具有预防流感等感染症、预防癌症、防止加剧等效果。

另外，专利文献2提出了以胞外多糖(EPS)作为有效成分的细胞因子产生调节剂，更具体而言，具有抗病毒性的细胞因子的上升作用、且具有炎症性的细胞因子的降低作用的细胞因子产生调节剂。在此，以100μg/mL的浓度使EPS作用于猪肠上皮细胞48小时后，清洗细胞并去除了多余的EPS。然后假设病毒感染并用作为TLR3的配体的Poly(I：C)刺激该细胞，可观察到作为抗病毒性细胞因子的IFN-α和IFN-β的产生促进作用，且可观察到作为炎症性细胞因子的IL-6的产生抑制作用，因此提出了EPS的细胞因子产生调节用途。

进而，专利文献3提出了含有德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillusdelbrueckii ssp.bulgaricus)OLL1073R-1和/或其培养物的、用于提高血液中的抗体效价的疫苗用佐剂。在此，记述了如下内容：通过使用了包含德氏乳杆菌保加利亚亚种OLL1073R-1(Lactobacillus delbrueckii ssp.bulgaricus OLL1073R-1)的培养物的饮料和安慰剂饮料的随机双盲安慰剂对照试验，可能启示出该培养物的摄取组中通过接种流感疫苗对新型流感疫苗显示出更高的抗体效价上升效果；以及在对经口给予了该培养物的小鼠腹腔内给予蛋清白蛋白时，具有补体活化能力和T细胞、NK细胞、中性粒细胞、巨噬细胞等效应细胞的活化能力的IgG2a和IgG2b的抗体产生上升，通过摄取该培养物而可以期待全面预防感染症、预防重症化。

专利文献4提出了一种胞外多糖(EPS)，其由以保藏编号NITE BP-1519保藏的、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)NTM048株或其具有IgA产生促进作用的突变株产生。在此，记述了如下内容：将NTMO48(株)所产生的EPS调整为250μg/mL的浓度加入小鼠小肠派尔集合淋巴结细胞悬浮液中，高度诱导了IgA产生，因此包含该EPS的组合物可以用作能作为肠道免疫激活剂、抗变态反应剂、抗病毒剂使用的药物、食品等。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2005-194259号公报(日本专利第5177728号)

专利文献2：日本特开2018-177740号公报

专利文献3：国际公开WO2015/029967号公报(日本专利第6449771号)

专利文献4：国际公开WO2015/041299号公报(日本专利第6524468号)

发明内容

发明要解决的问题

病毒感染通常经过病毒吸附至宿主细胞的表面、侵入细胞内、病毒核酸的复制/病毒蛋白的合成、病毒颗粒的形成、释放至宿主细胞外的过程。抗病毒药阻断该过程中的一部分或通过干预人体的抗病毒免疫机制来抑制病毒的增殖，但只开发出了很少数。另外几乎没有报道基于食品原料的抗病毒效果。

本发明的课题在于提供使用了源自饮食品的有效成分的、能够轻松摄取且具有抗病毒作用的组合物。另外，这样的组合物优选对具有肠道感染性的病毒具有增殖抑制效果。特别是诺如病毒没有疫苗，且治疗仅限于输液等对症疗法，因此是强烈希望对治疗感染症有效的病毒之一，组合物更优选对诺如病毒具有增殖抑制效果。

用于解决问题的方案

本发明人等发现：通过在乳酸菌所产生的胞外多糖(EPS)的存在下培养感染了鼠诺如病毒的巨噬细胞，所释放的病毒量显著减少。另外，作为其机理，发现：通过EPS和病毒的刺激而更大量地释放了已知作为抗病毒蛋白的IFN-β。基于这些见解，可认为乳酸菌的EPS通过同样的机理对于人的诺如病毒等具有肠道感染性的所有病毒具有效果，完成了本发明。

本发明提供以下方案。

[1]一种用于抑制病毒的增殖的组合物，其包含乳酸菌的胞外多糖。

[2]根据1所述的组合物，其中，病毒为感染性肠炎的致病病毒。

[3]根据1或2所述的组合物，其中，病毒为诺如病毒。

[4]根据2或3所述的组合物，其用于选自由促进INF-β的产生、RIG-I的活化和MDA5的活化组成的组中的任意者。

[5]一种组合物，其包含乳酸菌的胞外多糖，且用于选自由RIG-I的活化和MDA5的活化组成的组中的任意者。

[6]根据1～5中任一项所述的组合物，其中，乳酸菌是被分类为乳杆菌属的乳酸菌。

[7]根据1～6中任一项所述的组合物，其中，乳酸菌是被分类为德氏乳杆菌保加利亚亚种的乳酸菌。

[8]根据1～7中任一项所述的组合物，其以发酵乳的方式包含胞外多糖。

[9]一种对象中的肠道感染症的发病风险的降低方法，其包括向对象给予乳酸菌的胞外多糖。

[10]一种乳酸菌的胞外多糖在制造用于抑制病毒的增殖的组合物中的应用。

[11]一种乳酸菌的胞外多糖在制造用于选自由RIG-I的活化和MDA5的活化组成的组中的任意者的组合物中的应用。

[12]一种乳酸菌的胞外多糖或包含乳酸菌的胞外多糖的组合物，其在用于抑制病毒的增殖的方法中应用。

[13]一种乳酸菌的胞外多糖或包含乳酸菌的胞外多糖的组合物，其在用于选自由RIG-I的活化和MDA5的活化组成的组中的任意者的方法中应用。

[14]一种抑制对象中的病毒的增殖的方法，其包括向对象给予乳酸菌的胞外多糖或包含乳酸菌的胞外多糖的组合物。

[15]一种用于对象中的选自由RIG-I的活化和MDA5的活化组成的组中的任意者的方法，其包括向对象给予乳酸菌的胞外多糖或包含乳酸菌的胞外多糖的组合物。

本发明还提供以下方案。

[1]一种乳酸菌的胞外多糖在制造用于抑制病毒的增殖的组合物中的应用。

[2]根据1所述的应用，其中，病毒为肠道感染性。

[3]根据1所述的应用，其中，病毒为诺如病毒。

[4]根据2或3所述的应用，其用于选自由促进INF-β的产生、RIG-I的活化和MDA5的活化组成的组中的任意者。

[5]一种乳酸菌的胞外多糖在制造用于选自由RIG-I的活化和MDA5的活化组成的组中的任意者的组合物中的应用。

[6]根据1～5中任一项所述的应用，其中，乳酸菌是被分类为乳杆菌属的乳酸菌。

[7]根据6所述的应用，其中，乳酸菌是被分类为德氏乳杆菌保加利亚亚种的乳酸菌。

[8]根据7所述的应用，其中，乳酸菌为德氏乳杆菌保加利亚亚种FERM BP-10741。

[9]根据1～8中任一项所述的应用，其以发酵乳的方式包含胞外多糖。

[10]一种对象中的肠道感染症的发病风险的降低方法，其包括向对象给予乳酸菌的胞外多糖。

发明的效果

根据本发明，可以适用以食品来源的成分作为有效成分、且具有抗病毒作用的组合物。另外通过该组合物而能够抑制病毒的增殖。

根据本发明，可以治疗由诺如病毒等肠道感染性的病毒引起的食物中毒和感染症。

附图说明

图1培养上清液中的病毒量。*：对照组与EPS组相比具有显著差异(p<0.05)。**：对照组与EPS组相比具有显著差异(p<0.01)。

图2培养上清液中IFN-β。6小时与12小时与18小时的对照组为检测限以下。**：对照组与EPS组相比具有显著差异。

图3RIG-I mRNA转录量。**：对照组与EPS组相比具有显著差异。

图4RIG-I mRNA转录量。**：对照组与EPS组相比具有显著差异。

图5培养上清液中IL-6浓度。*：对照组与EPS组相比具有显著差异(p<0.05)。**：对照组与EPS组相比具有显著差异。

具体实施方式

以下对本发明进行详细地说明。

本发明涉及以乳酸菌所产生的胞外多糖(EPS)作为有效成分的组合物。

[有效成分]

本发明的组合物包含乳酸菌的EPS作为有效成分。乳酸菌具有如下特征：其是同化葡萄糖而产生以相对于糖的收率计为50％以上的乳酸的微生物的总称，作为生理学性质为革兰氏阳性菌的球菌或桿菌，且不具有运动性，大多数情况无孢子形成能力(还有如凝结芽孢杆菌那样具有孢子形成能力的乳酸菌。)，呈过氧化氢酶阴性等。自古以来，乳酸菌就已通过发酵乳等在世界各地被食用，可以说是安全性极高的微生物。乳酸菌被分类为多个属。本发明的组合物中包含的乳酸菌的EPS优选由被分类为乳杆菌(Lactobacillus)属的乳杆菌属乳酸菌产生。

本发明的组合物中使用的EPS只要具有目标效果就没有特别限定。乳酸菌所产生的EPS在结构上分为作为同多醣的EPS和作为杂多糖的EPS(例如，由半乳糖和葡萄糖构成的EPS)，还有时进行了磷酸化、硫氧化等修饰，但任意情况下均可以作为本发明的组合物的有效成分使用。优选的EPS的一个例子是，包含中性多糖体和在中性多糖体上加成了磷酸基的酸性多糖体中的至少一者的EPS。已知这样的EPS由德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)、乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcuslactis subsp.cremoris)等所产生。本发明中使用的EPS可以是1种，还可以是2种以上的组合。

本发明的组合物中使用的特别优选的产生EPS的乳酸菌的例子是乳杆菌属乳酸菌。作为乳杆菌属乳酸菌，例如可列举出保加利亚种、干酪种、嗜酸种、植物种等。这些乳杆菌属乳酸菌当中，本发明中，优选为被分类为保加利亚种的乳酸菌(也称为乳杆菌保加利亚亚种)的乳酸菌。进而，乳杆菌属乳酸菌当中，更优选被分类为德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)的乳酸菌。特别优选的方式中，乳酸菌为德氏乳杆菌保加利亚亚种OLL1073 R-1菌(保藏编号：FERM BP-10741)(有时称为“乳杆菌保加利亚亚种R-1株”。)。即，本发明的组合物中使用的EPS的特别优选的一个例子是乳杆菌保加利亚亚种R-1株所产生的EPS。

乳杆菌保加利亚亚种R-1株在国家高级工业科学技术学院，国际专利生物保藏中心(IPOD，NITE)(日本茨城县筑波市东1丁目1番1中央第6)基于布达佩斯条约进行了国际保藏(保藏者：株式会社明治、保藏日：2006年11月29日、保藏编号：FERM BP-10741)。需要说明的是，2012年4月国家技术评估学会，专利微生物保藏中心(NPMD)(日本千叶县木更津市上总镰足2-5-8 120号室)接管了该保藏机构的业务。

本发明的组合物中包含的乳酸菌的EPS可以作为乳酸菌发酵物而包含。乳酸菌发酵物中除由乳酸菌得到的发酵物本身之外还包含其处理物。乳酸菌发酵物本身包含例如发酵乳(具体而言，酸奶等)。处理物包括例如通过对粗精制物、发酵物进行过滤、离心分离或膜分离再进行除菌而得到的培养滤液、培养上清液，将培养滤液/培养上清液浓缩而得到的浓缩物、浓缩物的干燥物。

乳酸菌的EPS的制备方法可以利用现有技术，在需要更详细的条件时，可以参照本说明书的实施例等。另外，将乳酸菌的EPS制成乳酸菌发酵物时，通过在将产生EPS的乳酸菌作为起子添加至原料乳中使其发酵，在发酵物中产生EPS，从而能够制造包含EPS的发酵乳。发酵时的条件例如原料乳、发酵温度、发酵时间只要所使用的乳酸菌能够产生EPS就没有特别限制，本领域技术人员可以进行适宜设定。

[用途]

包含乳酸菌的EPS的本发明的组合物具有抗病毒作用，可以用于抑制病毒的增殖。另外，包含乳酸菌的EPS的本发明的组合物可以用于治疗病毒感染症。病毒感染症中包括由病毒引起的食物中毒。

治疗包括：抑制、阻碍或降低成为对象的疾病或状态的发病/出现(表现)；降低该发病/出现风险；治疗成为对象的疾病或状态的发病/表现；抑制、阻碍或延迟成为对象的疾病或状态的进行。治疗包括：医生和接受医生指示的护士、助产士等所进行的医疗行为、以及除医生以外者、例如药剂师、营养师(包括管理营养师、运动营养师)、保健师、助产士、护士、临床检验技师、运动教员、药物制造商、药物贩卖商、食品制造商、食品贩卖商等所进行的非治疗性行为。进而，治疗包括：特定食品摄取的推荐、营养指导(针对伤病者的疗养所需的营养指导及用于保持增进健康的营养指导)。

病毒感染通常经过病毒吸附至宿主细胞的表面、侵入细胞内、病毒核酸的复制/病毒蛋白的合成、病毒颗粒的形成、释放至宿主细胞外的过程。关于本发明的组合物，除非特别声明，否则病毒的增殖抑制是指通过阻碍该过程中的一部分或通过干预人体的抗病毒免疫机构来抑制病毒的增殖。

本发明的组合物还可以用于选自由促进INF-β的产生、RIG-I的活化和MDA5的活化组成的组中的任意者。本发明的组合物优选用于RIG-I的活化和MDA5的活化，更优选用于MDA5的活化。

IFN(干扰素)-β被分类为Ⅰ型干扰素，响应病毒的攻击而由各种细胞产生，是一种具有阻止病毒增殖、抑制细胞增殖、调节免疫系统和炎症等作用的细胞因子。IFN-β作为药物、作为病毒性肝炎等的抗病毒药、作为多发性骨髓瘤等的抗癌药而使用。

维甲酸诱导基因I(RIG-I，Retinoic acid-induciblegene-I)和抗黑色素瘤分化相关基因-5(MDA5，Melanoma differentiation associatedgene5)是识别细胞内的病毒RNA的RIG-I样受体(RIG-I-like receptor：RLR)的一种。RLR通过C末端的RNA解旋酶样结构域与病毒RNA结合，由此作为病毒的传感器发挥作用。

RLR蛋白质在N末端侧具有2个与衔接分子相互作用的CARD，激活诱导Ⅰ型干扰素的信号转导路径。在RLR中最早发现的是RIG-I，识别病毒基因组的单链RNA的未经加帽修饰的5’-三磷酸(流感病毒、仙台病毒、新城病病毒、水疱性口炎病毒、日本脑炎病毒等各种RNA病毒)。

MDA5具有与RIG-I相似的结构，但识别双链RNA。但是，单链RNA病毒的小核糖核酸病毒能被MDA5识别等不清楚的部分还很多。有报道称诺如病毒是单链RNA病毒，但MDA5需要控制鼠诺如病毒感染(10Oct 2008:McCartney SA,Thackray LB,Gitlin L,Gilfillan S,Virgin HW,et al.(2008)Correction:MDA-5Recognition of a Murine Norovirus.PLOSPathogens 4(10):10.1371)。

RIG-I的活化可以通过来自编码RIG-I的基因的mRNA的转录量上升、RIG-1的表达量上升等来进行评价。对于MDA5的活化也是同样。

本发明的组合物此外还可以用于促进INF-β的产生、RIG-I的活化和MDA5的活化，以及选自由MAVS的活化、Viperin的活化、IRF7的活化、IRF1的活化、STAT1的活化和ISG15的活化组成的组中的任意者。

[对象病毒]

在病毒中，本发明的组合物可以适宜用于尤其具有肠道感染性、成为感染性胃肠炎的原因的病毒。这样的病毒的具体的例子是诺如病毒、轮状病毒、札幌病毒、腺病毒、星状病毒。优选的例子是诺如病毒、札幌病毒、星状病毒，更优选的例子是诺如病毒和札幌病毒，进一步优选的例子是诺如病毒。

诺如病毒是杯状病毒科的正义单链RNA病毒，病毒颗粒是直径27～32nm的小型球形。可以通过电子显微镜、PCR、ELISA等来检测。诺如病毒的感染力非常强，即使是10～100个病毒也可被感染，因此容易引起大规模的食物中毒、爆发。

另外，诺如病毒的基因组富含突变，因此抗原性具有显著的多样性。诺如病毒根据碱基序列的同源性而分类，目前已知I～V组。人类感染的是GI、GII和GIV这3种。从成为人的感染、食物中毒的原因的食物中检测出的大部分诺如病毒属于GI和GII。诺如病毒中唯一在培养细胞中成功增殖的鼠诺如病毒属于GV。本发明的组合物可以期待对所有这些基因型的诺如病毒是有效的。

札幌病毒与诺如病毒同样是杯状病毒科的正义单链RNA病毒，病毒颗粒是直径27～32nm的小型球形。可以通过电子显微镜、PCR等来检测。

轮状病毒是呼肠孤病毒科的双链RNA病毒，病毒颗粒的直径约为70nm。可以通过胶乳凝聚反应、ELISA、反向间接血凝反应、电子显微镜、PAGE、PCR、培养来检测。

腺病毒是双链线性DNA病毒，病毒颗粒是直径约80nm的正20面体的球形。可以通过胶乳凝聚反应、ELISA、电子显微镜、PCR来检测。

星状病毒是星状病毒科的单链RNA病毒，病毒颗粒是直径27～32nm的小型球形。可以通过电子显微镜、PCR、ELISA、胶乳凝聚反应、培养等来检测。

从其它观点出发，本发明的组合物与诺如病毒同样地可以适宜地用于不具有包膜的病毒。通常，不具有包膜，不易被胃酸、胆汁等消化酶破坏，容易引起肠道感染。另外，由于不具有包膜，因此不易被醇、醚灭活，为了进行防御而需要进行通过具有较强氧化作用的次氯酸钠、二氧化氯等的消毒。

进而从其它的观点出发，本发明的组合物还可以期待对埃波拉病毒、丙型肝炎病毒和在分类学上与这些病毒相同的病毒的效果。有报道称埃波拉病毒和丙型肝炎病毒通过激活RIG-I来抑制增殖(RIG-I activation inhibits ebolavirus replication VirologyVolume 392,2009,pages 11-15、Innate immunity induced by composition-dependentRIG-I recognition of hepatitis C virus RNA Nature volume 454,pages 523–527(2008))。

[与现有技术的差异]

包含乳酸菌的EPS的本发明的组合物具有抗病毒作用，可以用于抑制病毒的增殖。另外包含乳酸菌的EPS的本发明的组合物可以用于治疗病毒感染症。病毒优选为肠道感染性的病毒，更优选为诺如病毒、轮状病毒、札幌病毒、腺病毒或星状病毒，进一步优选为诺如病毒。

相对于此，上述专利文献1记述了如下内容：是含有酸性多糖类作为有效成分的NK细胞激活剂，对于流感等感染症预防也具有效果，但并未证实对病毒有直接效果。此处的作用机制是通过激活NK细胞而破坏感染了病原体的细胞，不能说酸性多糖类可用于抑制病毒的增殖。可以说本发明的组合物的不同之处在于可减少病毒本身的数量。在本发明的优选的一个方式中，不包括NK细胞激活剂或治疗由激活NK细胞所导致的病毒感染症的方法。

另外流感病毒是上呼吸道感染、正粘病毒科的反义单链RNA病毒，具有包膜。另一方面，优选使用本发明的组合物的诺如病毒是肠道感染、杯状病毒科的正义单链RNA病毒，不具有包膜。有报道称MDA5对于控制由诺如病毒引起的感染是很重要的。在本发明的优选的一个方式中，不包括流感的感染预防剂，另外不包括治疗流感感染症的方法。

上述专利文献2记载了EPS的IFN-α和IFN-β的产生促进作用、且作为炎症性细胞因子的IL-6的生成抑制作用，但实际上并未证实能够抑制病毒的增殖。

另外，若感染病毒，则由识别感染的巨噬细胞产生IL-6。即，在病毒感染时IL-6产生反而上升。另外，在病毒感染过程中，IL-6具有促进作为急性期反应的淋巴细胞迁移至炎症组织、促进T细胞增殖、增强体液免疫的作为佐剂的作用等(参考：IL-6的多种作用自身免疫性疾病和炎症性疾病中的IL-6的意义、日药理志(Folia Pharmacol.Jpn.)144，172-177(2014))。因此从消除病毒的方面考虑，期望IL-6不受到抑制。根据本发明人等的研究，本发明的组合物使诺如病毒感染时的IL-6的产生上升。

另外专利文献2基于使称为Poly(I：C)的TLR3的配体发挥作用时的EPS所起的作用的评价，但诺如病毒未被TLR3识别的可能性较高(TLR7 and 9agonists are highlyeffective mucosal adjuvants for norovirus virus-like particle vaccines HumanVaccines&Immunotherapeutics Volume 10,2014、MDA-5Recognition of a MurineNorovirus PLoS Pathog 4(7),2008)。本发明中在经EPS处理的细胞中确认了诺如病毒感染时MDA5和RIG-I的mRNA上升。因此，可认为本发明中的EPS的作用机制如下：通过借助线粒体而并非借助TLR3的系统(病毒的RNA为RIG-I、MDA5)而被识别，通过线粒体膜上的IFN-β启动子刺激物1(IPS-1)来诱导IRF3、IRF7的磷酸化，产生IFN-β(植松等人,病毒,第56卷,第1号，pp.1-8，2006)。在本发明的优选的一个方式中，不包括借助TLR3的病毒感染治疗剂，另外不包括借助TLR3的病毒感染症的治疗方法。

上述专利文献3提出了含有乳酸菌培养物、且用于提高血液中的抗体效价的疫苗用佐剂，但从描述为疫苗用佐剂也可清楚的那样，其主要着眼于提高针对疫苗等抗原的抗体效价的效果，可以说并没有明确在病毒感染时或感染后摄取时抑制病毒增殖的效果。在本发明的优选的一个方式中，不包括用于提高血液中的抗体效价的疫苗用佐剂，另外不包括用于提高血液中的抗体效价的方法。

[组合物]

(食品组合物等)

本发明的组合物可以制成食品组合物或药物组合物。除非特别声明，否则食品和药物不仅包括用于人类的食品和药物，还包括用于除人类以外的动物的食品和药物。除非特别声明，否则食品包括通常食品、功能性食品、营养组合物，另外包括治疗食品(发挥治疗目的的食品。医生开出的膳食处方，营养师等依据其制作的菜单，基于其烹调出的食品。)、饮食疗法食品、配方食品、护理食品、治疗辅助用食品。除非特别声明，否则食品不仅包括固体物，还包括液态的食品例如饮料、饮料剂、流食和汤。功能性食品是指能对生物体赋予规定的功能性的食品，例如包括：特定保健用食品(包括附加条件的特保[特定保健用食品])、功能性标示食品、包括营养功能食品在内的保健功能食品、特殊用途食品、营养辅助食品、健康辅助食品、营养强化剂(例如，片剂、包衣片剂、糖衣片剂、胶囊、液体制剂等各种剂型的食品)、美容食品(例如，减肥食品)等全部健康食品。另外，本发明中“功能性食品”包括适用基于法典(FAO/WHO联合食品标准委员会)的食品标准的健康声明(Health claim)的健康食品。

(对象)

本发明的组合物适于摄取或给予优选治疗由病毒引起的感染的对象。这样的对象包括：婴幼儿、小孩、成人(15岁以上)、中高年人、老年人(65岁以上)、生病期间和病后的人、孕妇、产妇、男性、女性。

(给予途径等)

对于本发明的组合物，可以将其非经口地例如经管(胃造瘘、肠造瘘)给予或经鼻给予，还可以经口给予，但优选经口给予。

本发明的组合物针对病毒感染症还可以在发病前预防性地使用，另外还可以在发病后用于治疗。另外还可以在怀疑感染时期用于抑制发病。本发明人等进行的使用了鼠诺如病毒的实验中，乳酸菌的EPS添加至对象细胞后，在相对较早的阶段显示出效果。详细而言，鼠诺如病毒自吸附至细胞表面约10小时后，释放出在细胞内增殖的病毒。感染的细胞随着时间增加而全部细胞最终被感染，培养上清液中的病毒量达到平稳水平。实验中，自病毒感染9小时后可观察到基于供与乳酸菌的EPS的效果。由此可认为，乳酸菌的EPS可以在病毒感染的初期阶段、例如自潜伏期开始抑制病毒的增殖。

因此，本发明的组合物通过在怀疑发生感染时直接摄取而刺激肠道的细胞，自感染初期开始抑制增殖而抑制发病，因此即使感染、发病，也可期待能减轻症状。

(有效成分的含量/用量)

本发明的组合物中的乳酸菌的EPS的含量为可发挥目标效果的量即可。考虑到其被检体的年龄、体重、症状等各种因素，可以适宜设定组合物的给予量或摄取量，每一天量的乳酸菌的EPS的量例如可以设为0.1mg以上，优选设为0.6mg以上，更优选设为1mg以上，特别优选设为3mg以上。每一天量的EPS的量的上限值在下限值为任意的情况下均可以设为500mg以下，优选设为300mg以下，特别优选设为250mg以下。

每一次给予或每一次食用、即每一次量的乳酸菌的EPS的量例如可以设为0.03mg以上，优选设为0.2mg以上，更优选设为1mg以上。每一次量的EPS的量的上限值在下限值为任意的情况下均可以设为200mg以下，优选设为100mg以下，更优选设为70mg以下，特别优选设为30mg以下。

以发酵乳那样的组合物的方式使用本发明的组合物中的乳酸菌的EPS时，作为组合物的一天量例如可以设为30g以上，优选设为50g以上，更优选设为60g以上，特别优选设为100g以上。作为发酵乳的一天量的上限值在下限值为任意的情况下均可以设为例如1500g以下，优选设为1200g以下，更优选设为900g以下，更优选设为600g以下。

作为组合物的一次量例如可以设为10g以上，优选设为20g以上，更优选设为30g以上。作为组合物的一次量的上限值在下限值为任意的情况下均可以设为例如500g以下，优选设为400g以下，更优选设为200g以下，特别优选设为125g以下。

组合物可以设为一天1次的给予/摄取，还可以设为一天多次、例如每次饮食的3次给予。组合物以饮食经验丰富的乳酸菌的EPS作为有效成分。因此，本发明的组合物的有效成分是饮食经验较久的EPS，因此适于长期摄取。因此可以重复或长期摄取，例如可以持续给予/摄取3天以上，优选1周以上，更优选4周以上，特别优选1个月以上。

(其它成分、添加剂)

本发明的组合物可以包含容许作为食品或药物的其它有效成分、营养成分。这样的成分的例子是氨基酸类(例如，赖氨酸、精氨酸、甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸)、糖质(葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、海藻糖、赤藓糖醇、麦芽糖醇、帕拉金糖、木糖醇、糊精)、电解质(例如，钠、钾、钙、镁)、维生素(例如，维生素A、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12、维生素C、维生素D、维生素E、维生素K、生物素、叶酸、泛酸和烟酸类)、矿物质(例如，铜、锌、铁、钴、锰)、抗生素、食物纤维、蛋白质、脂质等。

另外组合物可以进一步包含容许作为食品或药物的添加物。这样的添加物的例子是非活性载体(固体、液体载体)、赋形剂、表面活性剂、结合剂、崩解剂、润滑剂、助溶剂、悬浮剂、涂布剂、着色剂、保存剂、缓冲剂、pH调节剂、乳化剂、稳定剂、甜味剂、抗氧化剂、香料、酸味剂、天然物。更具体而言，为水、其它水性溶剂、制药上可接受的有机溶剂、胶原、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、羧乙烯基聚合物、藻酸钠、水溶性葡聚糖、水溶性糊精、羧甲基淀粉钠、果胶、黄原胶、阿拉伯胶、酪蛋白、明胶蛋白、琼指、甘油、丙二醇、聚乙二醇、凡士林、石蜡、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白、甘露糖醇、山梨糖醇、乳糖、三氯蔗糖、甜菊糖、阿斯巴甜、安赛蜜钾、柠檬酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、磷酸、醋酸、果汁、蔬菜汁等。

(剂型/形态)

本发明的药物组合物可以制成适于经口给予的、片剂、颗粒剂、散剂、丸剂、胶囊剂等固体制剂、液体制剂、悬浮剂、糖浆剂等液体制剂、凝胶剂、气溶胶剂等任意的剂型。

本发明的食品组合物可以制成固体、液体、混合物、悬浮液、粉末、颗粒、糊剂、啫喱、凝胶、胶囊等任意的形态。另外，本发明的食品组合物可以制成乳制品、营养强化剂、点心、饮料、饮料剂、调味剂、加工食品、配菜、汤等任意的形态。更具体而言，本发明的组合物可以制成乳饮料、清凉饮料、乳酸菌饮料、乳性饮料、发酵乳、酸奶、冰激凌、压片、巧克力、干酪、面包、饼干(biscuits)、咸饼干(cracker)、比萨饼、配方奶粉、液态奶、流食、病人用食品、营养食品、冷冻食品、加工食品等形态，另外可以制成混合于饮料、食品中进行摄取的颗粒、粉末、糊剂、浓厚液体等形态。

(其它)

在本发明的组合物的制造中，可以适宜选择配混乳酸菌的EPS的阶段。只要不显著损害乳酸菌的EPS的特性，配混的阶段就没有特别限制。例如，可以在原材料中混合并配混培养产生EPS的乳酸菌而得到的包含EPS的培养物、其粗精制物、精制物。或者，将本发明的组合物以发酵乳的方式加以实施时，在原材料、发酵后的发酵乳中混合并配混包含EPS的培养物、其粗精制物、精制物，或在原料乳中添加产生EPS的乳酸菌作为起子，使其发酵并产生EPS，由此制造包含EPS的发酵乳。

本发明的组合物中可以标示能够用于抑制病毒的增殖、用于治疗病毒感染症、用于治疗食物中毒、用于预防食物中毒、用于降低肠道感染症的发病风险等内容，另外可以标示向特定的对象推荐摄取的内容。可以直接性或间接性标示，直接性标示的例子是在制品本身、包装、容器、标签、标志等有形物体上的记载，间接性标示的例子包括通过网页、店铺、小册子、展览会、媒体研讨会等研讨会、书籍、报纸、杂志、电视、广播、邮件、电子邮件、语音等场所或手段进行的广告/宣传活动。

以下使用实施例对本发明进行进一步具体地说明。但本发明的保护范围不限定于这些实施例。

[实施例]

[试验物质德氏乳杆菌保加利亚亚种OLL1073R-1在菌体外产生的多糖(EPS)的制备]

将用10质量％脱脂奶粉培养基培养德氏乳杆菌保加利亚亚种OLL1073R-1而得到的培养物中的EPS精制。即，在以37℃培养18小时的培养物中加入三氯乙酸使其最终浓度为10质量％，去除变性蛋白质，加入冷乙醇并在4℃下静置至第二天，得到包含EPS的沉淀物。使用透析膜(截留分子量6000-8000)将其用MilliQ水进行透析，使核酸和蛋白质酶降解后，再次进行乙醇沉淀而得到沉淀物。将其溶解于MilliQ水中，再次进行透析后冷冻干燥，将EPS精制。

[试验材料和方法]

1)使用细胞

RAW264.7(小鼠巨噬细胞来源株)(ATCC、TIB-71^TM、https：//www.atcc.org/ products/all/TIB-71.aspx)

2)组构成

对照：鼠诺如病毒感染+通常培养基

EPS：鼠诺如病毒感染+含有EPS的培养基

3)试验系统的概要

以5×10⁵细胞/ml将小鼠巨噬细胞株RAW264.7接种于12孔板中，24小时后使其感染(MOI≥1.0)鼠诺如病毒(MNV)，然后更换全部培养基，在EPS的存在下(200μg/ml·D-MEM)或在没有EPS的存在下(D-MEM(Wako)https：//labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/ detail/048-29763.html)培养36小时(n＝3)。培养过程中，每3小时回收培养上清液和细胞。

从培养上清液中提取RNA，依据论文(Development and application of abroadly reactive real-time reverse transcription-PCR assay for detection ofmurine noroviruses,Journal of Virological Methods,Volume 169,Issue 2,November2010,Pages 269-273)通过定量PCR(qPCR)测定了释放至上清液中的病毒量。另外，利用ELISA法(R&D Systems,Inc.Mouse IFN-beta Quantikine ELISA kit#MIFNB0)对所产生的IFN-β进行定量。

在感染初期阶段的直至12小时为止的细胞中提取RNA，对于参与IFN-β应答的各种分子(RIG-I、MDA5、MAVS、Viperin、IRF7、IRF1、STAT1、ISG15)，通过qPCR(初期变性95℃30秒、2步PCR循环数40、变性95℃5秒、伸长反应60℃31秒、熔解曲线95℃15秒、60℃1分钟、95℃15秒)测定了mRNA转录量。

4)统计学处理方法

测定值用平均值±标准偏差表示。数据用Excel，通过F检验的方差齐性检验后，通过T检验进行检验。显着性水平为5％。

[结果]

将结果示于图1～4。在EPS存在下，与对照相比显著抑制了病毒的增殖(图1)。需要说明的是，半数组织培养感染量(TCID50，Median tissue culture infectious dose)是确认病毒感染滴度时使用的测定方法之一。是指：将病毒稀释液接种于预先培养细胞并使之附着的试管、孔板上，使50％的细胞感染的浓度。

另外，在EPS的存在下，培养上清液中的IFN-β量与对照相比显著上升(图2)。进而，在EPS的存在下，细胞中的MDA5的mRNA转录量在感染9小时后，与对照相比显著上升(图3)。已知MDA5作为感知病毒侵入的传感器发挥作用，可认为EPS通过激活MDA5而促进IFN-β的产生。此外，在EPS的存在下，细胞中的RIG-1的mRNA转录量在感染9小时后，与对照相比显著上升。已知RIG-1也作为感知病毒侵入的传感器发挥作用，EPS通过激活RIG-1而促进IFN-β的产生。

[参考：对IL-6产生的影响]

测定上述实验中得到的培养上清液中的IL-6的浓度。IL-6的测定使用市售的试剂盒、Bio-Plex Pro Mouse Cytokine 1 10plx EXP(Bio-Rad)，依据试剂盒中附带的协议进行测定。与上述实验同样地进行统计解析。

将结果示于图5。在EPS的存在下，细胞中的IL-6表达量在感染30小时及之后与对照相比显著上升。

Claims (11)

1.一种乳酸菌的胞外多糖在制造用于抑制病毒的增殖的组合物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其中，病毒为肠道感染性。

3.根据权利要求1所述的应用，其中，病毒为诺如病毒。

4.根据权利要求2或3所述的应用，其用于选自由促进INF-β的产生、RIG-I的活化和MDA5的活化组成的组中的任意者。

5.一种乳酸菌的胞外多糖在制造用于选自由RIG-I的活化和MDA5的活化组成的组中的任意者的组合物中的应用。

6.根据权利要求1～3和5中任一项所述的应用，其中，乳酸菌是被分类为乳杆菌属的乳酸菌。

7.根据权利要求6所述的应用，其中，乳酸菌是被分类为德氏乳杆菌保加利亚亚种的乳酸菌。

8.根据权利要求7所述的应用，其中，乳酸菌为德氏乳杆菌保加利亚亚种FERM BP-10741。

9.根据权利要求1～3、5、7和8中任一项所述的应用，其以发酵乳的方式包含胞外多糖。

10.根据权利要求6所述的应用，其以发酵乳的方式包含胞外多糖。

11.一种对象中的肠道感染症的发病风险的降低方法，其包括向对象给予乳酸菌的胞外多糖。

Images