CN112798720A - 组氨酸缓冲液在减少蛋白聚体中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于药物蛋白检测技术领域，具体涉及组氨酸缓冲液在减少蛋白聚体中的应用。所述的组氨酸缓冲液包含重量比为15/192‑116/53的L‑组氨酸和组氨酸盐。所述的组氨酸缓冲液不仅能使氨基酸序列的C端连接有纳米抗体的蛋白质变得稳定，在涡旋的过程中不会额外产生聚体，保证了样品检测结果的客观性和准确性；还可作为稀释液代替流动相来稀释样品，不会干扰样品的出峰；同时减少了不同人之间由于操作差异可能导致的实验误差，使SEC检测方法的操作步骤简单化，适用于氨基酸序列的C端连接有纳米抗体的蛋白质的SEC检测。

Description

组氨酸缓冲液在减少蛋白聚体中的应用
技术领域
本发明涉及药物蛋白检测技术领域，具体涉及组氨酸缓冲液在减少蛋白聚体中的应用。
背景技术
由于抗体药物蛋白质大多数由CHO细胞表达，糖基化程度高，在细胞培养和纯化生产工艺流程中会聚集产生多聚体，多聚体具备免疫原性。因此在治疗性蛋白药物中，聚体通常被认为影响药效甚至引起免疫原性，而被作为产品相关杂质，需在下游纯化工艺中被去除。体积排阻色谱法（size exclusion chromatography, SEC）作为一种监测聚体含量的不可或缺的方法，被广泛运用于治疗性蛋白药物的聚体含量测定中。在治疗性蛋白药物的研发、生产及储存过程中，SEC检测方法的检测结果直接关系了下游工艺的开发，产品的放行以及产品的稳定性等。
在SEC的日常检测中，当样品浓度过高或为了防止吐温80积累造成的干扰，待测样品往往需要被流动相稀释后再进样分析。但在实际的检测过程中发现以下问题：通常在蛋白氨基酸序列C端带有纳米抗体（Nanobody）的双特异性抗体在用流动相稀释时，其对涡旋的耐受性较差，涡旋后的双特异性抗体（C端带Nanobody）聚体明显增多，并且随着涡旋时间的延长，聚体含量逐渐增高。这种人为产生的聚体严重干扰了SEC检测结果的客观性和准确性，为避免这种现象的发生，通常的样品稀释方法是控制涡旋时间，包括如下步骤：取400µg样品，用流动相稀释至2mg/mL；将稀释后的样品置于涡旋仪上涡旋3秒；将涡旋后的样品微离心。上述样品稀释方法存在以下缺点：1.仍然有少量的人为聚体在涡旋中产生；2.较短的涡旋时间无法保证样品与流动相充分混匀，即无法保证样品的均一性；3.为严格控制涡旋时间，需用计时器读秒，而这种方式增加了方法的繁琐性；4.涡旋的时间较短，难以控制，不同人操作的误差大，导致SEC检测结果的误差也大；5.只控制了涡旋时间，但涡旋的振荡频率和幅度难以控制。
因此，需要研发一种稳定、准确的SEC检测方法，减少双特异性抗体（C端带Nanobody）在涡旋过程中产生的聚体，这对于治疗性蛋白药物的检测显得尤为重要。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明要解决的技术问题是提供一种组氨酸缓冲液，能使氨基酸序列的C端连接有纳米抗体的蛋白质变得稳定，在涡旋的过程中不会额外产生聚体，保证了样品检测结果的客观性和准确性，且不会干扰样品的出峰，简化SEC检测的操作步骤，适用于氨基酸序列的C端连接有纳米抗体的蛋白质的SEC检测。
为解决上述技术问题，本发明提供以下技术方案：
本发明发现：组氨酸缓冲液（包含组氨酸和组氨酸盐）能起到抗氧化的作用，防止蛋白质被氧化形成聚体或碎片；还能与蛋白的疏水区域结合，促进蛋白的溶解性，从而防止蛋白聚集形成聚体。
因此，首先，本发明提供了组氨酸缓冲液在保护蛋白质方面的应用。
具体地，所述的应用指组氨酸缓冲液与蛋白质混合后，而减少蛋白质聚集体。
更具体地，所述的应用指组氨酸缓冲液与蛋白质混合后，进行物理性、化学性、生物性操作时，减少蛋白质聚集体。
更具体地，所述的物理性操作指震荡、摇匀、涡旋、离心、加热、加压、脱水、冷冻、超声波和/或紫外线照射。
更具体地，所述的化学性操作指强酸、强碱、尿素、乙醇、丙酮、无机盐、有机盐、重金属盐和/或SDS处理。
更具体地，所述的生物性操作指酶解，包括水解反应、转蛋白反应和/或交联反应。
等同地，本发明提供了组氨酸缓冲液在减少蛋白聚体中的应用。
再等同地，本发明提供了组氨酸缓冲液在制备蛋白质保护剂中的应用。
优选地，所述的蛋白质保护剂为涡旋用蛋白质保护剂。
更优选地，所述的蛋白质保护剂为涡旋用重组蛋白保护剂。
更进一步优选地，所述的蛋白质保护剂为涡旋用抗体保护剂。
更进一步优选地，所述的蛋白质保护剂为涡旋用酶保护剂。
具体地，所述的组氨酸缓冲液包含组氨酸和组氨酸盐。
另一方面，基于或等同于上述应用，本发明提供了一种蛋白质保护剂，包含组氨酸缓冲液，所述的组氨酸缓冲液包含组氨酸和组氨酸盐。
具体地，所述的组氨酸为L-组氨酸和/或D-组氨酸；优选为L-组氨酸。
具体地，所述的组氨酸盐为组氨酸强酸盐和/或组氨酸弱酸盐；
具体地，所述的组氨酸强酸盐包括但不限于组氨酸盐酸盐、组氨酸硝酸盐、组氨酸硫酸盐、组氨酸对甲苯磺酸盐、组氨酸氟硼酸盐中的任意一种或多种；优选为组氨酸盐酸盐和/或组氨酸硝酸盐；更优选为组氨酸盐酸盐。
具体地，所述的组氨酸弱酸盐包括但不限于组氨酸醋酸盐、组氨酸碳酸盐、组氨酸次氯酸盐、组氨酸氢氟酸盐中的任意一种或多种；优选为组氨酸醋酸盐和/或组氨酸碳酸盐；更优选为组氨酸醋酸盐。
具体地，所述的组氨酸缓冲液中组氨酸和组氨酸盐的重量比为15/192-116/53；优选为15/192-76/108；进一步优选为41/155。
在一些具体的声称解决该技术问题的实施例中，所述的蛋白质保护剂包含0.15-1.16g/L的L-组氨酸和0.53-1.92g/L的组氨酸盐；优选为0.15-0.76g/L的L-组氨酸和1.08-1.92g/L的组氨酸盐。
作为一个优选的实施例，所述蛋白质保护剂包含0.41g/L的L-组氨酸和1.55g/L的组氨酸盐酸盐。
作为另一个优选的实施例，所述蛋白质保护剂包含0.41g/L的L-组氨酸和1.55g/L的组氨酸硝酸盐。
作为另一个优选的实施例，所述蛋白质保护剂包含0.41g/L的L-组氨酸和1.55g/L的组氨酸硫酸盐。
作为另一个优选的实施例，所述蛋白质保护剂包含0.41g/L的L-组氨酸和1.55g/L的组氨酸对甲苯磺酸盐。
作为另一个优选的实施例，所述蛋白质保护剂包含0.41g/L的L-组氨酸和1.55g/L的组氨酸氟硼酸盐。
作为另一个优选的实施例，所述蛋白质保护剂包含0.41g/L的L-组氨酸和1.55g/L的组氨酸醋酸盐。
作为另一个优选的实施例，所述蛋白质保护剂包含0.41g/L的L-组氨酸和1.55g/L的组氨酸碳酸盐。
作为另一个优选的实施例，所述蛋白质保护剂包含0.41g/L的L-组氨酸和1.55g/L的组氨酸次氯酸盐。
作为另一个优选的实施例，所述蛋白质保护剂包含0.41g/L的L-组氨酸和1.55g/L的组氨酸氢氟酸盐。
具体地，所述的蛋白质保护剂所保护的蛋白质为具有一定氨基酸序列结构的化学物质，可以是天然存在的蛋白质，也可以是人工合成的蛋白质；人工合成的蛋白质可以是直接化学合成，也可以是重组表达蛋白。
更具体地，所述的蛋白质为酶和/或抗体。
更具体地，所述的蛋白质为单体、多聚体和/或缀合物。
在一些具体的实施例中，所述的蛋白质为氨基酸序列的C端连接有纳米抗体的双特异性抗体。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
（1）氨基酸序列的C端连接有纳米抗体的蛋白质在加入本发明的组氨酸缓冲液后变得稳定，在涡旋的过程中不会额外产生聚体，保证了样品检测结果的客观性和准确性。
（2）本发明所提供的组氨酸缓冲液在UV280 nm波长下无吸收，可作为稀释液代替流动相来稀释样品，不会干扰样品的出峰。
（3）无需严格控制涡旋频率和时间，无需使用计时器计时，减少了不同人之间由于操作差异可能导致的实验误差，使SEC检测方法的操作步骤简单化，适用于氨基酸序列的C端连接有纳米抗体的蛋白质的SEC检测。
附图说明
图1为分别采用本发明组氨酸缓冲液、流动相对样品进行稀释，进样后的色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
组氨酸（Histidine，His）：分子式为C6H9N3O2，组氨酸在组成蛋白质的20种氨基酸中是属于碱性氨基酸或属于其R基带正电荷的极性氨基酸。组氨酸含有一个咪唑基，pK值在7附近，因此在缓冲液体系中既能接受质子又能释放质子，起到质子传递（电荷转接）体系的作用；还能与蛋白质分子中的其它一些基团形成氢键；同时还能在蛋白质溶液中发挥重要的缓冲作用。因此，组氨酸在蛋白质结构功能和稳定性方面发挥着重要作用。
实施例1
本实施例提供了一种组氨酸缓冲液，作为双特异性抗体（C端带纳米抗体）的防涡旋保护剂，用于替代流动相来稀释SEC待测样品。
其配方如下：称取0.41gL-组氨酸，1.55g组氨酸盐酸盐，加超纯水溶解并定容至1L。
并简单修改了SEC检测方法中的稀释方法：
1、取400 µg样品，用组氨酸缓冲液将样品稀释至2 mg/mL；
2、将稀释后的样品置于涡旋仪上充分混匀；
3、将混匀后的样品微离心。
上述步骤中用组氨酸缓冲液代替了流动相作为稀释液，并删除了之前方法中的读秒计时，既保证了检测结果的客观和准确性，又简化了方法的操作。
本实施例对上述组氨酸缓冲液经过了实验测试，证明可行，结果如下表1和图1所示。
表1 聚体及单体含量
Figure 976940DEST_PATH_IMAGE001
由上述表1结果可知：
（1）样品在不稀释直接进样的情况下单体含量为98.47%，聚体含量为1.53%，这种进样方式的结果最能反映样品的真实情况，但这种进样方式会导致样品中的PS80逐渐在色谱柱上积累，积累到一定程度后会干扰检测结果。
（2）用流动相稀释样品，然后涡旋10秒，样品单体含量下降到96.35%，聚体升高到3.65%。
（3）用组氨酸缓冲液稀释样品后涡旋10秒，单体含量为98.17%，明显高于用流动相稀释后涡旋的结果，与直接进样的结果相当；聚体含量为1.83%，也是明显低于用流动相稀释后涡旋的结果，与直接进样的结果相当。
以上结果表明组氨酸缓冲液能起到防止样品因涡旋而聚集的作用。
此外，由图1可知，“无稀释直接进样”的聚体峰形和“用组氨酸缓冲液稀释，涡旋10秒“的聚体峰形相似，而“用流动相稀释，涡旋10秒”的聚体峰明显多出一个。以上结果表明，组氨酸缓冲液可以防止样品在涡旋过程中额外产生聚体峰。
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (2)

1.组氨酸缓冲液在制备涡旋用蛋白质保护剂中的应用，其特征在于，所述的组氨酸缓冲液包含0.41g/L L-组氨酸和1.55g/L组氨酸盐酸盐；所述的蛋白质为氨基酸序列的C端连接有纳米抗体的双特异性抗体。
2.一种涡旋用蛋白质保护剂，其特征在于，所述的涡旋用蛋白质保护剂包含组氨酸缓冲液，所述的组氨酸缓冲液包含0.41g/L L-组氨酸和1.55g/L组氨酸盐酸盐；所述的蛋白质为氨基酸序列的C端连接有纳米抗体的双特异性抗体。
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