CN112795515B - 一株咪唑乙烟酸降解菌及其应用 - Google Patents

一株咪唑乙烟酸降解菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一株可降解咪唑乙烟酸的菌株，其为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)菌株MZ‑1，于2021年1月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC NO.21659，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本发明还提供咪唑乙烟酸降解菌株的筛选方法、菌剂及其应用和一种降解咪唑乙烟酸或者修复咪唑乙烟酸污染的方法。本发明提供的菌株MZ‑1，对咪唑乙烟酸具有较高降解性能，且降解产物对敏感作物油菜无毒或毒性较低，有利于减轻咪唑乙烟酸对后茬作物产生的药害，还可有效治理咪唑乙烟酸残留污染，降低咪唑乙对环境的生态压力，保护生态环境。

Description

一株咪唑乙烟酸降解菌及其应用
技术领域
本发明属于生物降解技术领域，具体涉及一株咪唑乙烟酸降解菌及其应用。
背景技术
咪唑乙烟酸，化学名称为(RS)-5-乙基-2-(4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)烟酸，分子式C15H19N303，相对分子量为289.3。咪唑乙烟酸是由美国氰胺公司开发的咪唑啉酮类除草剂，属乙酰乳酸合成酶(ALS)或乙酸羟酸合成酶(AHAS)抑制剂。由于其杀草谱宽、活性高、选择性强，广泛用于花生地、大豆田及林地等一年生禾本科马唐、多年生禾本科白草以及阔叶苍耳等杂草的防除，是该类除草剂在我国的主要商品。
但是咪唑乙烟酸在土壤中残效期长，长期大面积使用不仅会对油菜、水稻、玉米等后茬敏感作物产生药害，造成减产，甚至绝产的严重后果，还会影响轮作的正常进行，使大豆产量与质量显著下降。而且，土壤中残留的咪唑乙烟酸还会通过淋溶或挥发作用对大气和地下水造成污染。除此之外，咪唑乙烟酸的大量使用，还有可能导致减少生物多样性、降低土壤质量、减少生物固氮等。目前，对咪唑乙烟酸残留药害的治理方法主要有物理和化学方法，但传统治理方法往往存在治理周期长、清除速度慢、易造成二次污染等问题，不适宜在大豆田中大面积应用。
微生物降解除草剂对环境污染小，安全性较高，所以分离筛选出能高效降解咪唑乙烟酸的微生物是解决其污染问题的有效途径。目前为止，已经有丙酸杆菌属、海球菌属、节细菌属、假单胞杆菌属、产碱菌属、无色杆菌属等细菌被发现有降解作用。本发明所筛选的蜡状芽孢杆菌是首次发现对咪唑乙烟酸具有降解能力，这对咪唑乙烟酸污染土壤的生物修复以及丰富咪唑乙烟酸生物降解微生物资源具有重要意义。
发明内容
本发明旨在针对现有技术的不足，提供一株咪唑乙烟酸降解菌及其应用。
本发明第一个目的在于提供一种从大田土壤和活性污泥的混合土壤中分离并筛选出来的蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)菌株MZ-1，丰富了咪唑乙烟酸降解的菌种资源，为研究开发降解剂奠定基础。
本发明第二个目的在于提供咪唑乙烟酸降解菌株的筛选方法。
本发明第三个目的在于提供咪唑乙烟酸降解菌株在降解咪唑乙烟酸中的应用。
本发明第四个目的在于提供咪唑乙烟酸降解菌株在修复咪唑乙烟酸污染的自然环境中的应用。
本发明第五个目的在于提供一种可降解咪唑乙烟酸的降解菌剂。
本发明第六个目的在于提供咪唑乙烟酸降解菌株在制备咪唑乙烟酸降解菌剂中的应用。
本发明第七个目的在于提供一种降解咪唑乙烟酸或者修复咪唑乙烟酸污染的方法。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一株可降解咪唑乙烟酸的菌株，其为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)菌株MZ-1，于2021年1月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCCNO.21659，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
一种如上所述的菌株的筛选方法，采用逐级加量驯化的方法进行咪唑乙烟酸降解菌株的筛选，包括以下步骤，
(1)把长期施用咪唑乙烟酸的农田土壤和活性污泥质量比1：1混合备用；
(2)取混合土壤5g加入到100mL LB培养基中，30℃，160r/min培养24h；
(3)取上述培养液10mL加入100mL含咪唑乙烟酸100mg/L的选择培养基中，30℃，160r/min培养5d后，取10mL培养液转接至100mL含咪唑乙烟酸200mg/L的选择培养基中培养5d；
(4)以此类推，逐级提高基础盐培养基中药剂的浓度，直至咪唑乙烟酸质量浓度达到500mg/L；
(5)吸取50μL上述培养液涂布于咪唑乙烟酸浓度为500mg/L的固体选择培养基上，30℃培养，待平板上出现肉眼可见的菌落，挑取菌落进一步分离纯化，即得到咪唑乙烟酸降解菌株。
优选的，所述步骤(2)中的LB培养基的配方为：5g酵母膏，10g蛋白胨，10g NaCl，1000mL蒸馏水。
优选的，所述步骤(3)中的固体选择培养基的配方为：1g NH4NO3，1g NaCl，0.5gKH2PO4，1.5g K2HPO4，1g(NH4)2SO4，0.1g MgSO4·7H2O，0.1g蛋白胨，蒸馏水1000mL。
如上所述的菌株在降解咪唑乙烟酸中的应用。
现有技术中并未公开蜡状芽孢杆菌应用于降解咪唑乙烟酸，该蜡状芽孢杆菌菌株MZ-1不同于公开的蜡状芽孢杆菌。该菌株MZ-1的形态特征、生理生化特性及生物学特性为：革兰氏染色阳性，产孢，菌落近圆形，灰白色，粗糙无光泽，中央稍凸起，边缘不整齐，有的呈缺刻状；硝酸盐还原、甲基红、明胶液化、磷酸酯酶、过氧化氢酶、淀粉水解均呈阳性，吲哚反应和V.P.试验为阴性。根据GenBank序列同源性比较，菌株MZ-1与蜡状芽孢杆菌同处于最小的分支，同源性达到99.58％，结合菌株的生理生化特性，将菌株MZ-1初步鉴定为芽孢杆菌属蜡状芽孢杆菌种。
如上所述的应用，通过对菌株MZ-1的降解条件优化研究发现，为了方便实际操作对所获得的最优条件进行了修正，最优降解条件为：降解温度为32℃，pH为6.6，接菌量为3％，降解率预测值为73.12％；在最优条件下，将制备好的OD600值为1.0的菌株MZ-1菌悬液按照3％的比例接种到含200mg/L咪唑乙烟酸的无机盐培养基中，110h后对咪唑乙烟酸的降解率达70％以上。
通过菌株MZ-1对咪唑乙烟酸的去毒效应试验可以看出，菌株MZ-1能将咪唑乙烟酸快速降解为对油菜种子无毒或低毒的物质，对减轻咪唑乙烟酸对后茬作物的毒性有良好的效果。
如上所述的菌株在修复咪唑乙烟酸污染的自然环境中的应用，所述自然环境为水体或土壤。
通过菌株MZ-1对土壤中咪唑乙烟酸的降解效果试验可以看出，接种菌株MZ-1的土壤中，咪唑乙烟酸的降解速率提高了24.6％。由此可见，添加菌株MZ-1能够明显加快土壤中咪唑乙烟酸的降解，对咪唑乙烟酸污染土壤起到良好的修复效果。
一种可降解咪唑乙烟酸的降解菌剂，含有如上所述的菌株MZ-1。
如上所述的菌株在制备咪唑乙烟酸降解菌剂中的应用。
一种降解咪唑乙烟酸或者修复咪唑乙烟酸污染的方法，是将上述的菌株MZ-1直接或者稀释后加入到待处理对象中。
本发明的有益效果是：
本发明提供一株咪唑乙烟酸降解菌菌株MZ-1，该菌株对咪唑乙烟酸降解具有较高降解性能，且降解产物对敏感作物油菜无毒或毒性较低，有利于减轻咪唑乙烟酸对后茬作物产生的药害，使轮作得以正常进行，还可有效治理咪唑乙烟酸残留污染，降低咪唑乙对环境的生态压力，保护生态环境。该菌株的菌剂制备工艺简单，效率高，成本低，对环境耐受性强，无二次污染，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为咪唑乙烟酸色谱图，其中，黑色部分为对照组色谱图，白色部分为降解后色谱图；
图2为基于16S rDNA序列建立的菌株MZ-1系统发育树；
图3为菌株MZ-1的菌落形态图；
图4为响应面曲线及等高线；
图5为菌株MZ-1最优条件下生长及降解曲线图；
图6为不同处理对油菜种子根生长抑制情况；
图7为咪唑乙烟酸在不同处理土壤中的降解。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的内容，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非另有定义，本说明书所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。
本发明中，蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)菌株MZ-1或被简称为菌株MZ-1。
实施例1菌株MZ-1的筛选与鉴定
本发明人采用逐级加量驯化的方法进行高效降解菌的驯化筛选。把长期施用咪唑乙烟酸的农田土壤和活性污泥质量比1：1混合备用。取混合土壤5g加入到100mL LB培养基(LB培养基的配方为：5g酵母膏，10g蛋白胨，10g NaCl，1000mL蒸馏水)中，30℃，160r/min培养24h，取上述培养液10mL加入100mL含咪唑乙烟酸100mg/L的选择培养基(选择培养基的配方为：1g NH4NO3，1g NaCl，0.5g KH2PO4，1.5g K2HPO4，1g(NH4)2SO4，0.1g MgSO4·7H2O，0.1g蛋白胨，蒸馏水1000mL)中，30℃，160r/min培养5d后，取10mL培养液转接至100mL含咪唑乙烟酸200mg/L的选择培养基中培养5d，以此类推，逐级提高基础盐培养基中药剂的浓度，直至咪唑乙烟酸质量浓度达到500mg/L。吸取50μL上述培养液涂布于咪唑乙烟酸浓度为500mg/L的固体选择培养基上，30℃培养，待平板上出现肉眼可见的菌落，挑取菌落进一步分离纯化。采用高效液相色谱法(以下简称“UPLC”)以不接菌为对照，确定纯化后的菌株对咪唑乙烟酸的降解能力。
UPLC测定条件如下：
UPLC型号：Thermo ScientificTM VanquishTM UHPLC系统；
色谱柱：Thermo Hypersll GOLD C18(3μm,2.1×100mm)；
柱温：35℃；
流速:0.3mL/min；
进样量10μL；
流动相：V(乙腈)：V(1％冰乙酸水溶液)＝80:20；
检测波长:254nm。
此条件下，咪唑乙烟酸的保留时间为1.17。色谱图如图1所示。
降解率计算如下：
Figure BDA0002940257070000071
采用上述方法从土壤样品中成功分离获得一株咪唑乙烟酸降解菌，命名为MZ-1，该菌在最优降解条件下，当咪唑乙烟酸初始浓度为200mg/L时，5d后降解率可达70％以上。
观察菌株的形态，菌株菌落近圆形，灰白色，粗糙无光泽，中央稍凸起，边缘不整齐，有的呈缺刻状，如图3所示。
通过生理生化特性测定，显示该菌属于革兰氏阳性菌，硝酸盐还原、甲基红、明胶液化、磷酸酯酶、过氧化氢酶、淀粉水解均呈阳性，吲哚反应和V.P.试验为阴性。
利用细菌16S rDNA鉴定方法进行鉴定，以菌株MZ-1的总DNA为模板，利用细菌16SrDNA通用引物：27F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和1541R(AAGGAGGTGATCCAGCCGCA)，进行PCR扩增，得到约1.5kb的扩增产物，测序由上海生工生物工程股份有限公司完成，其核苷酸序列如序列表1所示，该序列已上传GenBank(MW541635)。
该菌株基因序列与BLAST在线数据中的Bacillus cereus strain JSYM6(GenBank登录号为：JN999893)相似性高达99.58％，相关菌株的16S rDNA系统进化分析如图2所示。
结合菌株的形态学特征、生理生化特性和基因序列比对结果，最终将菌株MZ-1鉴定为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)。将筛选到的蜡状芽孢杆菌菌株MZ-1在2021年1月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.21659。
实施例2菌株MZ-1降解条件的优化
影响菌株降解的重要因素包括温度、pH和接菌量。本实验所采用温度(A)范围：20-40℃；pH(B)：5.0-9.0；接菌量(C)：1-3％(OD 600＝1)。采用Box-Behnken统计学试验设计方法对以上3个影响因素进行试验设计，试验设计及结果如表1所示，试验结果为菌株MZ-1在含有200mg/L咪唑乙烟酸无机盐培养基中生长第5天的降解率(R)。对表1结果进行分析，同时绘制三维响应面图，从而获得最优降解条件的理论值。
二项式如下所示：
咪唑乙烟酸降解率(％)＝71.63+4.85A-9.62B+2.02C+5.5AB-1.47AC+2.26BC-8.84A2-23.56B2-4.46C2
表1 Box-Behnken试验设计及结果
Figure BDA0002940257070000081
Figure BDA0002940257070000091
结果分析显示，三个因素对菌株降解咪唑乙烟酸影响显著，各因素对降解率的影响顺序为B＞A＞C，即pH＞温度＞接菌量；pH和温度及接菌量交互效应显著，温度和接菌量交互效应不显著。分析结果结合响应面曲线及等高线，如图4所示，获得MZ-1降解咪唑乙烟酸的最优条件，菌株MZ-1最优降解条件：温度为32.08℃，pH为6.65，接菌量为3.3％，为了方便操作对所获得的最优条件进行了修正：降解温度为32℃，pH为6.6，接菌量为3％，降解率预测值为73.12％。
本实施例为菌株MZ-1提供了理论最优降解条件，为在实际应用中发挥其最佳性能提供保证。
实施例3最优条件下生长和降解曲线测定
在最优pH、温度、接菌量的件下接种于100mL咪唑乙烟酸初始浓度为200mg/L的基础盐培养基中，测定不同时间菌液的OD600值和咪唑乙烟酸降解率，以时间为横坐标，分别以OD600值和咪唑乙烟酸降解率为纵坐标，根据时间与OD600值和咪唑乙烟酸降解率的对应关系绘制降解菌的生长曲线和降解曲线。
菌株MZ-1的生长和降解曲线如图5所示。菌株MZ-1在咪唑乙烟酸浓度200mg/L的无机盐培养液中，24h内快速生长，24h时OD600值达到最大，为0.98。随着菌株MZ-1的快速生长，咪唑乙烟酸的降解率逐渐升高，在110h后，降解率为74.34％，与预测值偏差为1.64％。
本实施例说明，菌株MZ-1在适宜条件下可快速进行生长繁殖，同时降低咪唑乙烟酸残留浓度。
实施例4菌株MZ-1对咪唑乙烟酸的去毒效应
油菜对咪唑乙烟酸浓度敏感，选用油菜种子作为生物测试的材料，采用培养皿滤纸法，选取大小均匀一致的油菜种子10粒，置于垫两层滤纸的培养皿中，以灭菌基础无机盐培养液处理为对照，将含相同浓度的咪唑乙烟酸培养液分为加菌和不加菌两组处理组，加菌处理中加菌量按3％比例加入MZ-1菌悬液(OD600＝1)。5d后分别稀释10倍、500倍、1000倍后处理种子，30℃恒温黑暗培养3d后测量根长，计算各稀释倍数处理后对油菜种子根生长的抑制率。通过抑制率的大小来评价菌株MZ-1对咪唑乙烟酸的去毒效应。试验结果如图6所示。
Figure BDA0002940257070000101
由图6可知，随着稀释倍数的增加，两组处理的差异变得明显，当稀释倍数为1000倍时，加菌处理组的抑制率为18.91％，仅为不加菌处理抑制率的52.45％，油菜种子根长明显长于不加菌处理组，由此可见，降解菌MZ-1能将咪唑乙烟酸快速降解为对油菜种子无毒或低毒的物质，对减轻咪唑乙烟酸对后茬作物的毒性有良好的效果。
实施例5菌株MZ-1对土壤中咪唑乙烟酸的降解效果
土壤取自青岛农业大学植物园，土壤为棕壤土，理化性质为：总有机碳，18.2g/kg；总氮，1.43g/kg；总磷，1.05g/kg；pH，6.67。本实验共设置二个处理：自然土+咪唑乙烟酸、自然土+咪唑乙烟酸+降解菌MZ-1。每个处理设置3次重复，土壤中咪唑乙烟酸含量为10mg/kg，加菌土壤中加入菌MZ-1的量为107cfu/g土壤。所有土壤均调节土壤含水量至最大持水量的60％左右，置于30℃恒温生化培养箱中黑暗培养，培养过程中损失的水分每天通过称重法进行补充。处理后分别于0、3、7、14、21、28、45、60d取样利用固相萃取-HPLC方法提取检测土壤中咪唑乙烟酸的残留量。
咪唑乙烟酸在不同处理土壤中的降解结果如图7所示。随着时间的延长，咪唑乙烟酸在土壤中降解率逐渐升高，残留浓度逐渐降低。接种菌株MZ-1的土壤中，咪唑乙烟酸的降解速率提高了24.6％。由此可见，添加菌株MZ-1能够明显加快土壤中咪唑乙烟酸的降解，对咪唑乙烟酸污染土壤起到良好的修复效果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 青岛农业大学
<120> 一株咪唑乙烟酸降解菌及其应用
<141> 2021-02-07
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1488
<212> DNA
<213> 蜡状芽孢杆菌MZ-1的16S rDNA基因（ 16S rDNA of Bacillus cereus MZ-1）
<400> 1
tccttggggc gtgcctatac atgcagtcga gcgaatggat taagagcttg ctcttatgaa 60
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gggaaaccgg ggctaatacc ggataatatt ttgaactgca tggttcgaaa ttgaaaggcg 180
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cacaccacga gagtttgtaa cacccgaagt cggtggggta acctttttgg agccagccgc 1440
ctaaggtggg acagatgatt ggggtgaagt cgtaacaaga gcccgtga 1488

Claims (7)

1.一株可降解咪唑乙烟酸的菌株，其特征在于，其为蜡状芽孢杆菌 (Bacillus cereus)菌株MZ-1，于2021年1月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC NO.21659，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.根据权利要求1所述的菌株在降解咪唑乙烟酸中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，降解的条件为：温度为32 ℃，pH为6.6，接菌量为3 %。
4.根据权利要求1所述的菌株在修复咪唑乙烟酸污染的自然环境中的应用，其特征在于，所述自然环境为水体或土壤。
5.一种可降解咪唑乙烟酸的降解菌剂，其特征在于，含有权利要求1所述的菌株MZ-1。
6.根据权利要求1所述的菌株在制备咪唑乙烟酸降解菌剂中的应用。
7.一种降解咪唑乙烟酸或者修复咪唑乙烟酸污染的方法，其特征在于，是将权利要求1中的菌株MZ-1直接或者稀释后加入到待处理对象中。
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