CN112782319A - 一种咖啡酸苯乙酯的分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种咖啡酸苯乙酯的分析方法，该分析方法包括对化学合成的药用咖啡酸苯乙酯的待测试物进行HPLC分析，其中HPLC分析的色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，流动相A为磷酸二氢钠缓冲溶液，流动相B为甲醇。该方法得到的色谱图中咖啡酸苯乙酯的峰形清晰、重现性好，且该方法具有分离度好、简单快速、专属性强、灵敏度高等特点。
Description
技术领域
本发明涉及咖啡酸苯乙酯的检测技术领域，具体而言，涉及一种化学合成的药用咖啡酸苯乙酯的分析方法。
背景技术
蜂胶的化学成分非常复杂，长期以来，由于不能确定蜂胶的功能性成分，影响了蜂胶在现代医药上的应用。咖啡酸苯乙酯已经被鉴定为蜂胶中的主要组分之一，而且具有的药理活性非常广泛。咖啡酸苯乙酯的分子式为C17H16O4，化学结构式如下：
其结构中含有多酚羟基基团，具有清除自由基的潜在功能。有文献报道，邻二酚羟基结构具有体内抗氧化作用。研究表明，含有咖啡酸苯乙酯的蜂胶乙醇提取液可以抑制角叉菜胶诱导的佐剂性关节炎、胸膜炎和大鼠足肿胀，而不含咖啡酸苯乙酯的提取液不具有这一活性，说明咖啡酸苯乙酯是发挥抗炎作用的主要组分。由于咖啡酸苯乙酯具有极强的抗炎和抗氧化活性，从而可以起到抗肿瘤的作用，所以在医学上具有广阔的应用前景。
中国专利申请201711457604.9公开了一种软胶囊标志性成分的检测方法，它是通过HPLC测定人参蜂胶软胶囊中7种标志性成分的方法，其中的一种成分为咖啡酸苯乙酯。该方法主要针对的是人参蜂胶软胶囊中咖啡酸苯乙酯含量的检测方法，所存在的问题是，流动相A为0.15％磷酸溶液，其缓冲能力较差，获得的咖啡酸苯乙酯和杂质的峰形不佳；流动相B为乙腈，其洗脱能力较强，难以将咖啡酸苯乙酯与杂质有效地进行分离。总体来说，该发明对于杂质分析专属性较差，峰形不佳。因此，本领域迫切需要一种针对化学合成的药用咖啡酸苯乙酯有关物质进行检测的可靠的分析方法，以实现对化学合成的药用咖啡酸苯乙酯质量进行有效的控制。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种咖啡酸苯乙酯的分析方法，以解决现有技术中采用HPLC分析方法难以达到咖啡酸苯乙酯与杂质的有效分离的问题。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种咖啡酸苯乙酯的分析方法，包括对化学合成的药用咖啡酸苯乙酯的待测试物进行HPLC分析，所述HPLC分析的色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，所述HPLC分析的过程包括将所述含咖啡酸苯乙酯的待测试物在色谱柱中进行梯度洗脱，流动相包括流动相A磷酸二氢钠缓冲溶液和流动相B甲醇，所述磷酸二氢钠缓冲溶液的浓度为0.01mol/L～0.03mol/L，用磷酸调pH值为2-4。
梯度洗脱条件为0-70min，35％B→70％B；70-80min，70％B；80.1-95min，35％B，所述梯度洗脱见表1。
表1
所述磷酸二氢钠缓冲溶液和甲醇流动相的起始比例体积比为30:70:～40:60，优选体积比为35:65。
所述十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱的填料粒度为3μm、5μm，优选为5μm。
所述十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱的柱长为250mm，所述十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱的柱内径为4.6mm。
所述HPLC分析的检测波长为210～220nm，优选为215nm。
所述十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱的进样量为10～30μL，优选为20μL。色谱柱都有一定的承载量，进样量小于特定色谱仪的灵敏度会导致无法准确定量，进样量太大会导致过载，不仅损害色谱柱，还导致峰型拖尾，因此，为更精确地适应本申请的上述十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱对咖啡酸苯乙酯的有效分析，优选上述范围内的进样量。
所述十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱的柱温为20～40℃，优选为30℃。柱温影响分离效能和分析速度，提高柱温可缩短分析时间，降低柱温，使色谱柱的选择性增大，有利于组分的分离并提高色谱柱的稳定性，为平衡这两种作用，达到更好的分析效果，优选上述的柱温。
所述流动相的流速为0.8～1.2mL/min，优选为1.0mL/min。因为流速决定了出峰时间，而出峰时间是用来定性物质成分的，进样速度太慢导致色谱峰型较宽，保留时间延长，灵敏度降低；进样速度太快易导致色谱峰型较窄，柱压增大，保留时间提前，分离效果变差；为平衡上述两个作用，尽可能达到充分分离的且易于表征的色谱峰，优选上述流速。
所述磷酸二氢钠缓冲溶液的浓度优选为0.02mol/L。
所述磷酸二氢钠缓冲溶液的pH值为2-4，优选为3.0。
所述含咖啡酸苯乙酯的待测试物是化学合成的药用咖啡酸苯乙酯，包括杂质A：2-苯乙醇，杂质B：3,4-二羟基苯甲醛，杂质C：丙二酸单苯乙酯，杂质D：咖啡酸，杂质E：咖啡酸苯乙酯的顺反异构体，杂质F：胺降解产物，杂质G：丙二酸二苯乙醇酯，杂质H：乙酸苯乙酯，杂质I：(E)-3-(3,4-二羟基苯基)-2-(苯乙氧羰基)丙烯酸和杂质J：香兰素。
本发明的优点在于，采用甲醇和磷酸二氢钠缓冲溶液作为流动相，并配合不同pH值的缓冲溶液来共同调节咖啡酸苯乙酯与色谱柱、杂质与色谱柱之间的相互作用，从而使得到的色谱图中咖啡酸苯乙酯的峰形清晰、重现性好、且该方法具有分离度好、简单快速、专属性强、灵敏度高等特点，适用于咖啡酸苯乙酯和起始原料的检测与分离分析，可用于咖啡酸苯乙酯的定性和定量分析，或进一步地用于控制咖啡酸苯乙酯合成反应工艺、合成产品及其制剂的质量。本发明流动相A为磷酸二氢钠缓冲溶液，具有更好的缓冲能力，对咖啡酸苯乙酯和杂质的峰形有较好的改善；流动相B为甲醇，降低了洗脱能力，能够达到更优的分离效果。本发明因流动相B为甲醇，比乙腈的洗脱能力弱，为兼顾极性小的杂质，梯度洗脱程序上会采用较高浓度甲醇将小极性杂质洗脱出来；本发明对柱温进行了优化控制，以保证检测结果有良好的重现性；检测波长的选择上，为了兼顾咖啡酸苯乙酯和10种杂质的紫外吸收强弱，因此优选选择了215nm为检测波长。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，在附图中：
图1示出了根据本发明的实施例1提供的一种含咖啡酸苯乙酯的待测试物的HPLC色谱图；
图2示出了根据本发明的实施例2提供的一种含咖啡酸苯乙酯的待测试物的HPLC色谱图；
图3示出了根据本发明的实施例3提供的一种含咖啡酸苯乙酯的待测试物的HPLC色谱图；
图4示出了根据本发明的实施例4提供的一种含咖啡酸苯乙酯的待测试物的HPLC色谱图；
图5示出了根据本发明的实施例5提供的一种含咖啡酸苯乙酯的待测试物的HPLC色谱图；
图6示出了根据本发明的实施例6提供的一种含咖啡酸苯乙酯的待测试物的HPLC色谱图；
图7示出了根据本发明的实施例7提供的一种含咖啡酸苯乙酯的待测试物的HPLC色谱图；
图8示出了根据本发明的实施例8提供的一种含咖啡酸苯乙酯的待测试物的HPLC色谱图；
图9示出了根据本发明的实施例9提供的一种含咖啡酸苯乙酯的待测试物的HPLC色谱图；
图10示出了根据本发明的实施例10提供的一种含咖啡酸苯乙酯的待测试物的HPLC色谱图；
图11示出了根据本发明的实施例11提供的一种含咖啡酸苯乙酯的待测试物的HPLC色谱图；
图12示出了根据本发明的实施例12提供的一种含咖啡酸苯乙酯的待测试物的HPLC色谱图；
图13示出了根据本发明的实施例13提供的一种咖啡酸苯乙酯的待测试物的HPLC分析的灵敏度试验色谱图；
具体实施方式
本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
实验材料与仪器条件：
咖啡酸苯乙酯，自制，纯度为99.9％；
咖啡酸苯乙酯杂质A为2-苯乙醇，购自上海顺诚香料化工有限公司，纯度为99.6％；
咖啡酸苯乙酯杂质B为3,4-二羟基苯甲醛，中检院，纯度为99.9％；
咖啡酸苯乙酯杂质C为丙二酸单苯乙酯，自制，纯度为97.6％；
咖啡酸苯乙酯杂质D为咖啡酸，购自TCI，纯度为99.4％；
咖啡酸苯乙酯杂质E为咖啡酸苯乙酯的顺反异构体，自制，纯度为98.4％；
咖啡酸苯乙酯杂质F为胺解产物，自制，纯度为99.2％；
咖啡酸苯乙酯杂质G为丙二酸二苯乙醇酯，自制，纯度为97.6％；
咖啡酸苯乙酯杂质H为乙酸苯乙酯，购自RHAWN，纯度为99.6％；
咖啡酸苯乙酯杂质I为(E)-3-(3,4-二羟基苯基)-2-(苯乙氧羰基)丙烯酸，自制，纯度为96.0％；
咖啡酸苯乙酯杂质J为香兰素，购自TCI，纯度为99.9％；
实验仪器：Agilent 1260HPLC，VWD检测器；
工作站：Chromeleon 7。
实施例1
取各杂质约20mg，精密称定，置10ml量瓶中，先加0.5ml甲醇溶解，再加甲醇-水(体积比为1:1)稀释至刻度，摇匀，制成每1ml包含各杂质约2mg的各杂质贮备液。取咖啡酸苯乙酯约20mg，精密称定，置10ml量瓶中，先加0.5ml甲醇溶解，再分别精密量取各杂质贮备液0.5ml于同一量瓶中，加甲醇-水(体积比为1:1)稀释至刻度，摇匀，制成每1ml包含咖啡酸苯乙酯2mg，各杂质0.1mg的待测试溶液。采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱Agilent TC C18(250mm×4.6mm×5μm)对含咖啡酸苯乙酯的待测试物溶液进行HPLC分析，HPLC分析的检测波长为215nm，柱温为30℃，含咖啡酸苯乙酯的待测试物的进样量为20μL(仪器自动进样)，流动相与含咖啡酸苯乙酯的待测试物的流速均为1.0mL/min，流动相A为0.01mol/L的磷酸二氢钠水溶液(用磷酸调节pH值至3.0)，流动相B为甲醇，梯度洗脱条件为0-70min，35％B→70％B；70-80min，70％B；80.1-95min，35％B，其最终得到的HPLC色谱图如图1所示。从图1可以看出，咖啡酸苯乙酯，杂质A(2-苯乙醇)，杂质B(3,4-二羟基苯甲醛)，杂质C(丙二酸单苯乙酯)，杂质D(咖啡酸)，杂质E(咖啡酸苯乙酯的顺反异构体)，杂质F(胺降解产物)，杂质G(丙二酸二苯乙醇酯)，杂质H(乙酸苯乙酯)，杂质I((E)-3-(3,4-二羟基苯基)-2-(苯乙氧羰基)丙烯酸)，杂质J(香兰素)，各自的峰型清晰，彼此之间得到很好的分离。其中，45.777min为咖啡酸苯乙酯的保留时间，11.015min为杂质A(2-苯乙醇)的保留时间，5.033为杂质B(3,4-二羟基苯甲醛)的保留时间，16.185min为杂质C(丙二酸单苯乙酯)的保留时间，5.623min为杂质D(咖啡酸)的保留时间，42.895min为杂质E(咖啡酸苯乙酯的顺反异构体)的保留时间，14.293min为杂质F(胺降解产物)的保留时间，63.140min为杂质G(丙二酸二苯乙醇酯)的保留时间，27.162min为杂质H(乙酸苯乙酯)的保留时间，22.593min为杂质I((E)-3-(3,4-二羟基苯基)-2-(苯乙氧羰基)丙烯酸)的保留时间，6.937min为杂质J(香兰素)的保留时间。
实施例2
取各杂质约20mg，精密称定，置10ml量瓶中，先加0.5ml甲醇溶解，再加甲醇-水(体积比为1:1)稀释至刻度，摇匀，制成每1ml包含各杂质约2mg的各杂质贮备液。取咖啡酸苯乙酯约20mg，精密称定，置10ml量瓶中，先加0.5ml甲醇溶解，再分别精密量取各杂质贮备液0.5ml于同一量瓶中，加甲醇-水(体积比为1:1)稀释至刻度，摇匀，制成每1ml包含咖啡酸苯乙酯2mg，各杂质0.1mg的待测试溶液。采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱Agilent TC C18(250mm×4.6mm×5μm)对含咖啡酸苯乙酯的待测试物溶液进行HPLC分析，HPLC分析的检测波长为215nm，柱温为25℃，含咖啡酸苯乙酯的待测试物的进样量为10μL(仪器自动进样)，流动相与含咖啡酸苯乙酯的待测试物的流速均为1.0mL/min，流动相A为0.02mol/L的磷酸二氢钠水溶液(用磷酸调节pH值至2.8)，流动相B为甲醇，梯度洗脱条件为0-70min，35％B→70％B；70-80min，70％B；80.1-95min，35％B，其最终得到的HPLC色谱图如图2所示。从图2可以看出，咖啡酸苯乙酯，杂质A(2-苯乙醇)，杂质B(3,4-二羟基苯甲醛)，杂质C(丙二酸单苯乙酯)，杂质D(咖啡酸)，杂质E(咖啡酸苯乙酯的顺反异构体)，杂质F(胺降解产物)，杂质G(丙二酸二苯乙醇酯)，杂质H(乙酸苯乙酯)，杂质I((E)-3-(3,4-二羟基苯基)-2-(苯乙氧羰基)丙烯酸)，杂质J(香兰素)，各自的峰型清晰，彼此之间得到很好的分离。其中，43.450min为咖啡酸苯乙酯的保留时间，10.328min为杂质A(2-苯乙醇)的保留时间，4.778min为杂质B(3,4-二羟基苯甲醛)的保留时间，15.695min为杂质C(丙二酸单苯乙酯)的保留时间，5.315min为杂质D(咖啡酸)的保留时间，40.568min为杂质E(咖啡酸苯乙酯的顺反异构体)的保留时间，13.235min为杂质F(胺降解产物)的保留时间，60.850min为杂质G(丙二酸二苯乙醇酯)的保留时间，25.438min为杂质H(乙酸苯乙酯)的保留时间，22.213min为杂质I((E)-3-(3,4-二羟基苯基)-2-(苯乙氧羰基)丙烯酸)的保留时间，6.520min为杂质J(香兰素)的保留时间。
实施例3
取各杂质约20mg，精密称定，置10ml量瓶中，先加0.5ml甲醇溶解，再加甲醇-水(体积比为1:1)稀释至刻度，摇匀，制成每1ml包含各杂质约2mg的各杂质贮备液。取咖啡酸苯乙酯约20mg，精密称定，置10ml量瓶中，先加0.5ml甲醇溶解，再分别精密量取各杂质贮备液0.5ml于同一量瓶中，加甲醇-水(体积比为1:1)稀释至刻度，摇匀，制成每1ml包含咖啡酸苯乙酯2mg，各杂质0.1mg的待测试溶液。采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱Agilent TC C18(250mm×4.6mm×5μm)对含咖啡酸苯乙酯的待测试物溶液进行HPLC分析，HPLC分析的检测波长为215nm，柱温为40℃，含咖啡酸苯乙酯的待测试物的进样量为30μL(仪器自动进样)，流动相与含咖啡酸苯乙酯的待测试物的流速均为1.0mL/min，流动相A为0.02mol/L的磷酸二氢钠水溶液(用磷酸调节pH值至3.2)，流动相B为甲醇，梯度洗脱条件为0-70min，35％B→70％B；70-80min，70％B；80.1-95min，35％B，其最终得到的HPLC色谱图如图3所示。从图3可以看出，咖啡酸苯乙酯，杂质A(2-苯乙醇)，杂质B(3,4-二羟基苯甲醛)，杂质C(丙二酸单苯乙酯)，杂质D(咖啡酸)，杂质E(咖啡酸苯乙酯的顺反异构体)，杂质F(胺降解产物)，杂质G(丙二酸二苯乙醇酯)，杂质H(乙酸苯乙酯)，杂质I((E)-3-(3,4-二羟基苯基)-2-(苯乙氧羰基)丙烯酸)，杂质J(香兰素)，各自的峰型清晰，彼此之间得到很好的分离。其中，45.018min为咖啡酸苯乙酯的保留时间，10.700min为杂质A(2-苯乙醇)的保留时间，4.880min为杂质B(3,4-二羟基苯甲醛)的保留时间，15.093min为杂质C(丙二酸单苯乙酯)的保留时间，5.430min为杂质D(咖啡酸)的保留时间，42.117min为杂质E(咖啡酸苯乙酯的顺反异构体)的保留时间，13.940min为杂质F(胺降解产物)的保留时间，62.490min为杂质G(丙二酸二苯乙醇酯)的保留时间，26.525min为杂质H(乙酸苯乙酯)的保留时间，20.928min为杂质I((E)-3-(3,4-二羟基苯基)-2-(苯乙氧羰基)丙烯酸)的保留时间，6.730min为杂质J(香兰素)的保留时间。
实施例4
取各杂质约20mg，精密称定，置10ml量瓶中，先加0.5ml甲醇溶解，再加甲醇-水(体积比为1:1)稀释至刻度，摇匀，制成每1ml包含各杂质约2mg的各杂质贮备液。取咖啡酸苯乙酯约20mg，精密称定，置10ml量瓶中，先加0.5ml甲醇溶解，再分别精密量取各杂质贮备液0.5ml于同一量瓶中，加甲醇-水(体积比为1:1)稀释至刻度，摇匀，制成每1ml包含咖啡酸苯乙酯2mg，各杂质0.1mg的待测试溶液。采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱Agilent TC C18(250mm×4.6mm×5μm)对含咖啡酸苯乙酯的待测试物溶液进行HPLC分析，HPLC分析的检测波长为215nm，柱温为35℃，含咖啡酸苯乙酯的待测试物的进样量为30μL(仪器自动进样)，流动相与含咖啡酸苯乙酯的待测试物的流速均为1.0mL/min，流动相A为0.03mol/L的磷酸二氢钠水溶液(用磷酸调节pH值至3.0)，流动相B为甲醇，梯度洗脱条件为0-70min，35％B→70％B；70-80min，70％B；80.1-95min，35％B，其最终得到的HPLC色谱图如图4所示。从图4可以看出，咖啡酸苯乙酯，杂质A(2-苯乙醇)，杂质B(3,4-二羟基苯甲醛)，杂质C(丙二酸单苯乙酯)，杂质D(咖啡酸)，杂质E(咖啡酸苯乙酯的顺反异构体)，杂质F(胺降解产物)，杂质G(丙二酸二苯乙醇酯)，杂质H(乙酸苯乙酯)，杂质I((E)-3-(3,4-二羟基苯基)-2-(苯乙氧羰基)丙烯酸)，杂质J(香兰素)，各自的峰型清晰，彼此之间得到很好的分离。其中，43.283min为咖啡酸苯乙酯的保留时间，10.318min为杂质A(2-苯乙醇)的保留时间，4.767为杂质B(3,4-二羟基苯甲醛)的保留时间，14.907min为杂质C(丙二酸单苯乙酯)的保留时间，5.238min为杂质D(咖啡酸)的保留时间，40.430min为杂质E(咖啡酸苯乙酯的顺反异构体)的保留时间，13.290min为杂质F(胺降解产物)的保留时间，61.168min为杂质G(丙二酸二苯乙醇酯)的保留时间，25.518min为杂质H(乙酸苯乙酯)的保留时间，20.698min为杂质I((E)-3-(3,4-二羟基苯基)-2-(苯乙氧羰基)丙烯酸)的保留时间，6.510min为杂质J(香兰素)的保留时间。
实施例5
取各杂质约20mg，精密称定，置10ml量瓶中，先加0.5ml甲醇溶解，再加甲醇-水(体积比为1:1)稀释至刻度，摇匀，制成每1ml包含各杂质约2mg的各杂质贮备液。取咖啡酸苯乙酯约20mg，精密称定，置10ml量瓶中，先加0.5ml甲醇溶解，再分别精密量取各杂质贮备液0.5ml于同一量瓶中，加甲醇-水(体积比为1:1)稀释至刻度，摇匀，制成每1ml包含咖啡酸苯乙酯2mg，各杂质0.1mg的待测试溶液。采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱Agilent TC C18(250mm×4.6mm×5μm)对含咖啡酸苯乙酯的待测试物溶液进行HPLC分析，HPLC分析的检测波长为215nm，柱温为20℃，含咖啡酸苯乙酯的待测试物的进样量为20μL(仪器自动进样)，流动相与含咖啡酸苯乙酯的待测试物的流速均为1.0mL/min，流动相A为0.01mol/L的磷酸二氢钠水溶液(用磷酸调节pH值至4.0)，流动相B为甲醇，梯度洗脱条件为0-70min，30％B→70％B；70-80min，70％B；80.1-95min，30％B，其最终得到的HPLC色谱图如图5所示。从图5可以看出，咖啡酸苯乙酯，杂质A(2-苯乙醇)，杂质B(3,4-二羟基苯甲醛)，杂质C(丙二酸单苯乙酯)，杂质D(咖啡酸)，杂质E(咖啡酸苯乙酯的顺反异构体)，杂质F(胺降解产物)，杂质G(丙二酸二苯乙醇酯)，杂质H(乙酸苯乙酯)，杂质I((E)-3-(3,4-二羟基苯基)-2-(苯乙氧羰基)丙烯酸)，杂质J(香兰素)，各自的峰型清晰，彼此之间得到很好的分离。其中，50.882min为咖啡酸苯乙酯的保留时间，13.013min为杂质A(2-苯乙醇)的保留时间，5.570为杂质B(3,4-二羟基苯甲醛)的保留时间，20.155min为杂质C(丙二酸单苯乙酯)的保留时间，6.510min为杂质D(咖啡酸)的保留时间，48.192min为杂质E(咖啡酸苯乙酯的顺反异构体)的保留时间，18.108min为杂质F(胺降解产物)的保留时间，66.482min为杂质G(丙二酸二苯乙醇酯)的保留时间，32.120min为杂质H(乙酸苯乙酯)的保留时间，28.295min为杂质I((E)-3-(3,4-二羟基苯基)-2-(苯乙氧羰基)丙烯酸)的保留时间，8.102min为杂质J(香兰素)的保留时间。
实施例6
取各杂质约20mg，精密称定，置10ml量瓶中，先加0.5ml甲醇溶解，再加甲醇-水(体积比为1:1)稀释至刻度，摇匀，制成每1ml包含各杂质约2mg的各杂质贮备液。取咖啡酸苯乙酯约20mg，精密称定，置10ml量瓶中，先加0.5ml甲醇溶解，再分别精密量取各杂质贮备液0.5ml于同一量瓶中，加甲醇-水(体积比为1:1)稀释至刻度，摇匀，制成每1ml包含咖啡酸苯乙酯2mg，各杂质0.1mg的待测试溶液。采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱Agilent TC C18(250mm×4.6mm×5μm)对含咖啡酸苯乙酯的待测试物溶液进行HPLC分析，HPLC分析的检测波长为215nm，柱温为30℃，含咖啡酸苯乙酯的待测试物的进样量为20μL(仪器自动进样)，流动相与含咖啡酸苯乙酯的待测试物的流速均为1.0mL/min，流动相A为0.01mol/L的磷酸二氢钠水溶液(用磷酸调节pH值至2.0)，流动相B为甲醇，梯度洗脱条件为0-70min，40％B→70％B；70-80min，70％B；80.1-95min，40％B，其最终得到的HPLC色谱图如图6所示。从图6可以看出，咖啡酸苯乙酯，杂质A(2-苯乙醇)，杂质B(3,4-二羟基苯甲醛)，杂质C(丙二酸单苯乙酯)，杂质D(咖啡酸)，杂质E(咖啡酸苯乙酯的顺反异构体)，杂质F(胺降解产物)，杂质G(丙二酸二苯乙醇酯)，杂质H(乙酸苯乙酯)，杂质I((E)-3-(3,4-二羟基苯基)-2-(苯乙氧羰基)丙烯酸)，杂质J(香兰素)，各自的峰型清晰，彼此之间得到很好的分离。其中，39.108min为咖啡酸苯乙酯的保留时间，9.057min为杂质A(2-苯乙醇)的保留时间，4.463为杂质B(3,4-二羟基苯甲醛)的保留时间，12.496min为杂质C(丙二酸单苯乙酯)的保留时间，4.807min为杂质D(咖啡酸)的保留时间，36.098min为杂质E(咖啡酸苯乙酯的顺反异构体)的保留时间，10.897min为杂质F(胺降解产物)的保留时间，58.190min为杂质G(丙二酸二苯乙醇酯)的保留时间，21.807min为杂质H(乙酸苯乙酯)的保留时间，16.907min为杂质I((E)-3-(3,4-二羟基苯基)-2-(苯乙氧羰基)丙烯酸)的保留时间，5.848min为杂质J(香兰素)的保留时间。
实施例7
取各杂质约20mg，精密称定，置10ml量瓶中，先加0.5ml甲醇溶解，再加甲醇-水(体积比为1:1)稀释至刻度，摇匀，制成每1ml包含各杂质约2mg的各杂质贮备液。取咖啡酸苯乙酯约20mg，精密称定，置10ml量瓶中，先加0.5ml甲醇溶解，再分别精密量取各杂质贮备液0.5ml于同一量瓶中，加甲醇-水(体积比为1:1)稀释至刻度，摇匀，制成每1ml包含咖啡酸苯乙酯2mg，各杂质0.1mg的待测试溶液。采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱Agilent TC C18(250mm×4.6mm×5μm)对含咖啡酸苯乙酯的待测试物溶液进行HPLC分析，HPLC分析的检测波长为215nm，柱温为30℃，含咖啡酸苯乙酯的待测试物的进样量为20μL(仪器自动进样)，流动相与含咖啡酸苯乙酯的待测试物的流速均为0.8mL/min，流动相A为0.01mol/L的磷酸二氢钠水溶液(用磷酸调节pH值至3.0)，流动相B为甲醇，梯度洗脱条件为0-70min，35％B→70％B；70-80min，70％B；80.1-95min，35％B，其最终得到的HPLC色谱图如图7所示。从图7可以看出，咖啡酸苯乙酯，杂质A(2-苯乙醇)，杂质B(3,4-二羟基苯甲醛)，杂质C(丙二酸单苯乙酯)，杂质D(咖啡酸)，杂质E(咖啡酸苯乙酯的顺反异构体)，杂质F(胺降解产物)，杂质G(丙二酸二苯乙醇酯)，杂质H(乙酸苯乙酯)，杂质I((E)-3-(3,4-二羟基苯基)-2-(苯乙氧羰基)丙烯酸)，杂质J(香兰素)，各自的峰型清晰，彼此之间得到很好的分离。其中，49.830min为咖啡酸苯乙酯的保留时间，13.190min为杂质A(2-苯乙醇)的保留时间，6.082为杂质B(3,4-二羟基苯甲醛)的保留时间，19.025min为杂质C(丙二酸单苯乙酯)的保留时间，6.783min为杂质D(咖啡酸)的保留时间，46.945min为杂质E(咖啡酸苯乙酯的顺反异构体)的保留时间，16.842min为杂质F(胺降解产物)的保留时间，67.402min为杂质G(丙二酸二苯乙醇酯)的保留时间，31.108min为杂质H(乙酸苯乙酯)的保留时间，25.807min为杂质I((E)-3-(3,4-二羟基苯基)-2-(苯乙氧羰基)丙烯酸)的保留时间，8.362min为杂质J(香兰素)的保留时间。
实施例8
取各杂质约20mg，精密称定，置10ml量瓶中，先加0.5ml甲醇溶解，再加甲醇-水(体积比为1:1)稀释至刻度，摇匀，制成每1ml包含各杂质约2mg的各杂质贮备液。取咖啡酸苯乙酯约20mg，精密称定，置10ml量瓶中，先加0.5ml甲醇溶解，再分别精密量取各杂质贮备液0.5ml于同一量瓶中，加甲醇-水(体积比为1:1)稀释至刻度，摇匀，制成每1ml包含咖啡酸苯乙酯2mg，各杂质0.1mg的待测试溶液。采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱Agilent TC C18(250mm×4.6mm×5μm)对含咖啡酸苯乙酯的待测试物溶液进行HPLC分析，HPLC分析的检测波长为215nm，柱温为30℃，含咖啡酸苯乙酯的待测试物的进样量为20μL(仪器自动进样)，流动相与含咖啡酸苯乙酯的待测试物的流速均为1.2mL/min，流动相A为0.01mol/L的磷酸二氢钠水溶液(用磷酸调节pH值至3.0)，流动相B为甲醇，梯度洗脱条件为0-70min，35％B→70％B；70-80min，70％B；80.1-95min，35％B，其最终得到的HPLC色谱图如图8所示。从图8可以看出，咖啡酸苯乙酯，杂质A(2-苯乙醇)，杂质B(3,4-二羟基苯甲醛)，杂质C(丙二酸单苯乙酯)，杂质D(咖啡酸)，杂质E(咖啡酸苯乙酯的顺反异构体)，杂质F(胺降解产物)，杂质G(丙二酸二苯乙醇酯)，杂质H(乙酸苯乙酯)，杂质I((E)-3-(3,4-二羟基苯基)-2-(苯乙氧羰基)丙烯酸)，杂质J(香兰素)，各自的峰型清晰，彼此之间得到很好的分离。其中，42.005min为咖啡酸苯乙酯的保留时间，9.098min为杂质A(2-苯乙醇)的保留时间，4.113为杂质B(3,4-二羟基苯甲醛)的保留时间，13.682min为杂质C(丙二酸单苯乙酯)的保留时间，4.620min为杂质D(咖啡酸)的保留时间，39.073min为杂质E(咖啡酸苯乙酯的顺反异构体)的保留时间，12.052min为杂质F(胺降解产物)的保留时间，59.145min为杂质G(丙二酸二苯乙醇酯)的保留时间，23.472min为杂质H(乙酸苯乙酯)的保留时间，19.768min为杂质I((E)-3-(3,4-二羟基苯基)-2-(苯乙氧羰基)丙烯酸)的保留时间，5.695min为杂质J(香兰素)的保留时间。
实施例9
取各杂质约20mg，精密称定，置10ml量瓶中，先加0.5ml甲醇溶解，再加甲醇-水(体积比为1:1)稀释至刻度，摇匀，制成每1ml包含各杂质约2mg的各杂质贮备液。取咖啡酸苯乙酯约20mg，精密称定，置10ml量瓶中，先加0.5ml甲醇溶解，再分别精密量取各杂质贮备液0.5ml于同一量瓶中，加甲醇-水(体积比为1:1)稀释至刻度，摇匀，制成每1ml包含咖啡酸苯乙酯2mg，各杂质0.1mg的待测试溶液。采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱Waters XTerra-C18(250mm×4.6mm×5μm)对含咖啡酸苯乙酯的待测试物溶液进行HPLC分析，HPLC分析的检测波长为215nm，柱温为30℃，含咖啡酸苯乙酯的待测试物的进样量为20μL(仪器自动进样)，流动相与含咖啡酸苯乙酯的待测试物的流速均为1.0mL/min，流动相A为0.01mol/L的磷酸二氢钠水溶液(用磷酸调节pH值至3.0)，流动相B为甲醇，梯度洗脱条件为0-70min，35％B→70％B；70-80min，70％B；80.1-95min，35％B，其最终得到的HPLC色谱图如图9所示。从图9可以看出，咖啡酸苯乙酯，杂质A(2-苯乙醇)，杂质B(3,4-二羟基苯甲醛)，杂质C(丙二酸单苯乙酯)，杂质D(咖啡酸)，杂质E(咖啡酸苯乙酯的顺反异构体)，杂质F(胺降解产物)，杂质G(丙二酸二苯乙醇酯)，杂质H(乙酸苯乙酯)，杂质I((E)-3-(3,4-二羟基苯基)-2-(苯乙氧羰基)丙烯酸)，杂质J(香兰素)，各自的峰型清晰，彼此之间得到很好的分离。其中，37.988min为咖啡酸苯乙酯的保留时间，8.000min为杂质A(2-苯乙醇)的保留时间，3.805为杂质B(3,4-二羟基苯甲醛)的保留时间，11.638min为杂质C(丙二酸单苯乙酯)的保留时间，4.143min为杂质D(咖啡酸)的保留时间，34.770min为杂质E(咖啡酸苯乙酯的顺反异构体)的保留时间，10.020min为杂质F(胺降解产物)的保留时间，55.803min为杂质G(丙二酸二苯乙醇酯)的保留时间，21.417min为杂质H(乙酸苯乙酯)的保留时间，16.640min为杂质I((E)-3-(3,4-二羟基苯基)-2-(苯乙氧羰基)丙烯酸)的保留时间，5.073min为杂质J(香兰素)的保留时间。
实施例10
取各杂质约20mg，精密称定，置10ml量瓶中，先加0.5ml甲醇溶解，再加甲醇-水(体积比为1:1)稀释至刻度，摇匀，制成每1ml包含各杂质约2mg的各杂质贮备液。取咖啡酸苯乙酯约20mg，精密称定，置10ml量瓶中，先加0.5ml甲醇溶解，再分别精密量取各杂质贮备液0.5ml于同一量瓶中，加甲醇-水(体积比为1:1)稀释至刻度，摇匀，制成每1ml包含咖啡酸苯乙酯2mg，各杂质0.1mg的待测试溶液。采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱Waters Symmetry-C18(250mm×4.6mm×5μm)对含咖啡酸苯乙酯的待测试物溶液进行HPLC分析，HPLC分析的检测波长为215nm，柱温为30℃，含咖啡酸苯乙酯的待测试物的进样量为20μL(仪器自动进样)，流动相与含咖啡酸苯乙酯的待测试物的流速均为1.0mL/min，流动相A为0.01mol/L的磷酸二氢钠水溶液(用磷酸调节pH值至3.0)，流动相B为甲醇，梯度洗脱条件为0-70min，35％B→70％B；70-80min，70％B；80.1-95min，35％B，其最终得到的HPLC色谱图如图10所示。从图10可以看出，咖啡酸苯乙酯，杂质A(2-苯乙醇)，杂质B(3,4-二羟基苯甲醛)，杂质C(丙二酸单苯乙酯)，杂质D(咖啡酸)，杂质E(咖啡酸苯乙酯的顺反异构体)，杂质F(胺降解产物)，杂质G(丙二酸二苯乙醇酯)，杂质H(乙酸苯乙酯)，杂质I((E)-3-(3,4-二羟基苯基)-2-(苯乙氧羰基)丙烯酸)，杂质J(香兰素)，各自的峰型清晰，彼此之间得到很好的分离。其中，45.848min为咖啡酸苯乙酯的保留时间，10.667min为杂质A(2-苯乙醇)的保留时间，3.990为杂质B(3,4-二羟基苯甲醛)的保留时间，16.730min为杂质C(丙二酸单苯乙酯)的保留时间，4.242min为杂质D(咖啡酸)的保留时间，43.693min为杂质E(咖啡酸苯乙酯的顺反异构体)的保留时间，12.077min为杂质F(胺降解产物)的保留时间，65.415min为杂质G(丙二酸二苯乙醇酯)的保留时间，28.772min为杂质H(乙酸苯乙酯)的保留时间，22.167min为杂质I((E)-3-(3,4-二羟基苯基)-2-(苯乙氧羰基)丙烯酸)的保留时间，5.658min为杂质J(香兰素)的保留时间。
实施例11
取各杂质约20mg，精密称定，置10ml量瓶中，先加0.5ml甲醇溶解，再加甲醇-水(体积比为1:1)稀释至刻度，摇匀，制成每1ml包含各杂质约2mg的各杂质贮备液。取咖啡酸苯乙酯约20mg，精密称定，置10ml量瓶中，先加0.5ml甲醇溶解，再分别精密量取各杂质贮备液0.5ml于同一量瓶中，加甲醇-水(体积比为1:1)稀释至刻度，摇匀，制成每1ml包含咖啡酸苯乙酯2mg，各杂质0.1mg的待测试溶液。采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱Agilent SB-C18(250mm×4.6mm×5μm)对含咖啡酸苯乙酯的待测试物溶液进行HPLC分析，HPLC分析的检测波长为215nm，柱温为30℃，含咖啡酸苯乙酯的待测试物的进样量为20μL(仪器自动进样)，流动相与含咖啡酸苯乙酯的待测试物的流速均为1.0mL/min，流动相A为0.01mol/L的磷酸二氢钠水溶液(用磷酸调节pH值至3.0)，流动相B为甲醇，梯度洗脱条件为0-70min，35％B→70％B；70-80min，70％B；80.1-95min，35％B，其最终得到的HPLC色谱图如图11所示。从图11可以看出，咖啡酸苯乙酯，杂质A(2-苯乙醇)，杂质B(3,4-二羟基苯甲醛)，杂质C(丙二酸单苯乙酯)，杂质D(咖啡酸)，杂质E(咖啡酸苯乙酯的顺反异构体)，杂质F(胺降解产物)，杂质G(丙二酸二苯乙醇酯)，杂质H(乙酸苯乙酯)，杂质I((E)-3-(3,4-二羟基苯基)-2-(苯乙氧羰基)丙烯酸)，杂质J(香兰素)，各自的峰型清晰，彼此之间得到很好的分离。其中，43.737min为咖啡酸苯乙酯的保留时间，9.755min为杂质A(2-苯乙醇)的保留时间，3.887为杂质B(3,4-二羟基苯甲醛)的保留时间，15.140min为杂质C(丙二酸单苯乙酯)的保留时间，4.172min为杂质D(咖啡酸)的保留时间，41.765min为杂质E(咖啡酸苯乙酯的顺反异构体)的保留时间，12.555min为杂质F(胺降解产物)的保留时间，64.657min为杂质G(丙二酸二苯乙醇酯)的保留时间，27.513min为杂质H(乙酸苯乙酯)的保留时间，20.057min为杂质I((E)-3-(3,4-二羟基苯基)-2-(苯乙氧羰基)丙烯酸)的保留时间，5.666min为杂质J(香兰素)的保留时间。
实施例12
取各杂质约20mg，精密称定，置10ml量瓶中，先加0.5ml甲醇溶解，再加甲醇-水(体积比为1:1)稀释至刻度，摇匀，制成每1ml包含各杂质约2mg的各杂质贮备液。取咖啡酸苯乙酯约20mg，精密称定，置10ml量瓶中，先加0.5ml甲醇溶解，再分别精密量取各杂质贮备液0.5ml于同一量瓶中，加甲醇-水(体积比为1:1)稀释至刻度，摇匀，制成每1ml包含咖啡酸苯乙酯2mg，各杂质0.1mg的待测试溶液。采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱Thermo C18(250mm×4.6mm×5μm)对含咖啡酸苯乙酯的待测试物溶液进行HPLC分析，HPLC分析的检测波长为215nm，柱温为30℃，含咖啡酸苯乙酯的待测试物的进样量为20μL(仪器自动进样)，流动相与含咖啡酸苯乙酯的待测试物的流速均为1.0mL/min，流动相A为0.01mol/L的磷酸二氢钠水溶液(用磷酸调节pH值至3.0)，流动相B为甲醇，梯度洗脱条件为0-70min，35％B→70％B；70-80min，70％B；80.1-95min，35％B，其最终得到的HPLC色谱图如图12所示。从图12可以看出，咖啡酸苯乙酯，杂质A(2-苯乙醇)，杂质B(3,4-二羟基苯甲醛)，杂质C(丙二酸单苯乙酯)，杂质D(咖啡酸)，杂质E(咖啡酸苯乙酯的顺反异构体)，杂质F(胺降解产物)，杂质G(丙二酸二苯乙醇酯)，杂质H(乙酸苯乙酯)，杂质I((E)-3-(3,4-二羟基苯基)-2-(苯乙氧羰基)丙烯酸)，杂质J(香兰素)，各自的峰型清晰，彼此之间得到很好的分离。其中，49.915min为咖啡酸苯乙酯的保留时间，12.007min为杂质A(2-苯乙醇)的保留时间，4.588为杂质B(3,4-二羟基苯甲醛)的保留时间，17.913min为杂质C(丙二酸单苯乙酯)的保留时间，4.997min为杂质D(咖啡酸)的保留时间，47.558min为杂质E(咖啡酸苯乙酯的顺反异构体)的保留时间，14.555min为杂质F(胺降解产物)的保留时间，69.488min为杂质G(丙二酸二苯乙醇酯)的保留时间，31.813min为杂质H(乙酸苯乙酯)的保留时间，24.087min为杂质I((E)-3-(3,4-二羟基苯基)-2-(苯乙氧羰基)丙烯酸)的保留时间，6.597min为杂质J(香兰素)的保留时间。
实施例13含咖啡酸苯乙酯的待测试物的HPLC分析的灵敏度试验
取咖啡酸苯乙酯约20mg，精密称定，置100ml量瓶中，先加0.5ml甲醇溶解，加甲醇-水(体积比为1:1)稀释至刻度，摇匀；精密量取1ml置100ml量瓶中，加甲醇-水(体积比1:1)稀释至刻度，摇匀；再精密量取2ml置50ml量瓶中，加甲醇-水(体积比1:1)稀释至刻度，摇匀，作为灵敏度测试溶液。采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱Agilent TC C18(250mm×4.6mm×5μm)对待测试物液进行HPLC分析，HPLC分析的检测波长为215nm，柱温为30℃，进样量为20μL(仪器自动进样)，流速为1.0mL/min，流动相A为0.01mol/L的磷酸二氢钠水溶液(用磷酸调节pH值至3.0)，流动相B为甲醇，梯度洗脱条件为0-70min，35％B→70％B；70-80min，70％B；80.1-95min，35％B，其最终得到的HPLC色谱图如图13所示。从图13可以看出在该样品浓度和进样量下，咖啡酸苯乙酯峰的信噪比大于10，满足检测灵敏度要求。
将实施例1至13中咖啡酸苯乙酯及难分组分3,4-二羟基苯甲醛和咖啡酸的分离度列于表2。
表2
以上结果表明，本发明的分析方法实现了如下技术效果：采用甲醇和磷酸二氢钠缓冲溶液作为流动相，并配合不同pH值的缓冲溶液来共同调节咖啡酸苯乙酯与色谱柱、杂质与色谱柱之间的相互作用，从而实现了咖啡酸苯乙酯与各杂质的有效分离。该方法分离度好，峰形清晰、重现性好，且咖啡酸苯乙酯峰浓度为80ng/ml(为供试品浓度的0.004％)时，信噪比大于10，且不大于报告限度(0.05％)，灵敏度较好，满足检测要求。本发明的分析方法适用于咖啡酸苯乙酯和起始原料的检测与分离分析，可用于咖啡酸苯乙酯的定性和定量分析，或进一步地用于控制咖啡酸苯乙酯合成反应工艺、合成产品及其制剂的质量。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种咖啡酸苯乙酯的分析方法，其特征在于，包括对含咖啡酸苯乙酯的待测试物进行HPLC分析，所述HPLC分析的色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，所述HPLC分析的过程包括将所述含咖啡酸苯乙酯的待测试物在色谱柱中进行梯度洗脱，流动相包括流动相A磷酸二氢钠缓冲溶液和流动相B甲醇，所述磷酸二氢钠缓冲溶液的浓度为0.01mol/L～0.03mol/L。
2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述梯度洗脱条件为0-70min，35％B→70％B；70-80min，70％B；80.1-95min，35％B。
3.根据权利要求2所述的分析方法，其特征在于，所述磷酸二氢钠缓冲溶液和甲醇流动相的起始比例体积比为30:70:～40:60，优选体积比为35:65。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的分析方法，其特征在于，所述十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱的填料粒度为3μm、5μm，优选为5μm；所述十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱的柱长为250mm，所述十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱的柱内径为4.6mm；所述HPLC分析的检测波长为210～220nm，优选为215nm。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的分析方法，其特征在于，所述十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱的进样量为10～30μL，优选20μL。
6.根据权利要求1至3中任一项所述的分析方法，其特征在于，所述流动相的流速为0.8～1.2mL/min，优选为1.0mL/min。
7.根据权利要求1至3中任一项所述的分析方法，其特征在于，所述十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱的柱温为20～40℃，优选为30℃。
8.根据权利要求1至3中任一项所述的分析方法，其特征在于，所述磷酸二氢钠缓冲溶液的浓度为0.02mol/L。
9.根据权利要求1至3中任一项所述的分析方法，其特征在于，所述磷酸二氢钠缓冲溶液的pH值为2-4，优选为3.0。
10.根据权利要求1至3中任一项所述的分析方法，其特征在于，所述含咖啡酸苯乙酯的待测试物是化学合成的药用咖啡酸苯乙酯，包括杂质A，杂质B，杂质C，杂质D，杂质E，杂质F，杂质G，杂质H，杂质I和杂质J。
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