CN112767995A - 一种微生物次级代谢产物制备过程中产物产率评估方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种微生物次级代谢产物制备过程产物产率评估方法。本发明根据微生物发酵过程的时间和空间的连续性(离散型)，微生物次级代谢产物合成过程具备马尔科夫性，可认为是马尔可夫过程。对微生物次级代谢产物的合成可建立统一的数学评估方法，通过该数学评估方法揭示建立微生物代谢生物合成过程产物生成概率转移因素，使之可量化。本发明适用于微生物代谢产物多阶段生物合成过程产物产率评估，其优势在于算法简单、适用范围广、预测结果准确。

Description

一种微生物次级代谢产物制备过程中产物产率评估方法

技术领域：

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种基于微生物代谢产物工业化制备四过程，评估代谢产物产率的建模方法，适用于微生物代谢产物多阶段生物合成过程产物产率评估及可信性评估。

背景技术：

据报道，目前有150种来自微生物的次级代谢产物(不到已知生物活性代谢物的1％) 被用于人类和兽医学以及农业，其中100多种用于人类疾病治疗。最近的研究表明，近十年，被批准的小分子药物中有50％以上仍然是天然产物。其中最易获批的来源于自然资源的药物是抗菌剂和抗真菌剂。对于这些有价值的大多数化合物，唯一可行的生产方法是发酵，通过微生物发酵大规模生产药物一直是该行业的基础，但微生物发酵过程是一个极为复杂过程，其过程涉及了物理、化学及生物等各项基础属性的约束和影响。

微生物次级代谢产物制备过程曲线反映在特定环境条件(或特定阶段)下表现出的群体生长规律，这些规律对实际生产制造、科研探索具有重要的科学指导作用。例如在发酵工程领域中，依据微生物不同生长阶段中特性获取缩短代谢产物周期、依据时间特性可知收获的最佳时期等；在肿瘤领域，依据生长特征可以快速诊断肿瘤扩散时间，在材料领域，依据可信性(失效率)可施加应力缩短获取材料周期并提高材料获取可信性。因此，得到模拟精准的微生物产物制备过程模型在微生物制备及科学研究、材料功能、可靠性工程、能源等领域中都具有重要意义。

微生物次级代谢产物生物合成的一般过程为：菌种的活化培育，菌种的扩大培养(种子罐发酵)，大罐发酵过程以及发酵产物分离提纯，其中发酵过程受温度、pH值、溶氧、通气量以及转速和消泡措施等各参数影响。其过程中有不同的动力学模型，包括菌体生长动力学模型、产物生产动力学模型以及底物消耗动力学模型，必须通过建立这三种模型，才能模拟发酵过程中菌体、产物、底物之间的相互关系和动态变化过程。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供了一种微生物次级代谢产物制备过程产物产率评估方法。该方法优势在于算法简单、适用范围广、预测结果准确。

本发明根据微生物发酵过程的时间和空间的连续性(离散型)，微生物次级代谢产物合成过程具备马尔科夫性(图1)，可认为是马尔可夫过程。对微生物次级代谢产物的合成可建立统一的数学评估方法，从而实现了本发明的目的。

本发明的微生物次级代谢产物制备过程产物产率评估方法，包括以下步骤：

建立微生物次级代谢产物制备过程中次级代谢产物产率的数学评估模型及评估模型可信度；

所述的建立微生物次级代谢产物制备过程中次级代谢产物产率的数学评估模型是将马尔可夫链中的相关元素进行定义，使用微生物次级代谢产物制备过程中各阶段前后的菌种浓度、代谢产物浓度、营养物质浓度等参数经验值作为建模工具的输入变量并生成概率及生成初始概率，对概率数据进行分析确定其生成产物转移概率，建立产物产率的数学评估模型；揭示微生物次级代谢产物制备过程产物生成概率转移因素，使之可量化；

所述的评估模型可信度是连续测量微生物生长过程中产生的次级代谢产物产率信息，根据次级代谢产物的积累量与微生物生长速率的耦合关系，评估各阶段的微生物产物产率及可信性。具体是通过定期采集微生物代谢产物制备过程产物产率及生成概率(或制备失效率)数据，包括且不限于：菌种失效率、各阶段前后微生物数量、代谢产物浓度、营养物质量等参数及失效概率，对过程中的失效概率进行分布拟合，采用Kolmogorov-Smirnov 检验法进行拟合优度检验，确保各阶段的一步转移概率误差最小，降低模型误差。

优选，所述的微生物次级代谢产物制备过程包括四个阶段：菌种活化培育、菌种扩大培养(种子罐发酵)、大罐发酵过程、发酵产物分离提纯。

优选，具体包括以下步骤：

一、建立马尔科夫链模型

1)利用马尔可夫工程建立微生物次级代谢产物制备过程中产物产率评估数学模型；

2)采集微生物次级代谢产物制备过程的菌种活化培育、菌种的扩大培养(种子罐)、大罐发酵过程、发酵产物分离提纯四个过程实验前后菌种浓度、产物浓度、营养物质等实验数据；

3)根据采集的数据，计算菌种的活化培育过程的产物及一步转移概率；

4)根据采集的数据，计算菌种的扩大培养过程的产物及一步转移概率；

5)根据采集的数据，计算发酵过程的产物及一步转移概率；

6)根据采集的数据，计算发酵产物分离提纯过程的产物及一步转移概率；

7)根据得到的4个步骤的一步转移概率，评价微生物代谢产物在制备四个过程中的产率概率与参数之间的转化关系，按照马尔可夫工程建立产物产率评估模型；

二、评估模型拟合度

模型拟合度检验采用Kolmogorov-Smirnov检验法。

三、微生物次级代谢产物制备过程中产物产率及可信性模型：

优选，具体步骤为：

(1){X(n),n＝0,1,2,…}是微生物次级代谢产物合成马尔可夫链，状态空间为I，在初始时刻(n＝0)状态{X(0)}的概率分布P{X(0)＝j}＝p_j,j∈I,称为微生物次级代谢产物合成过程马尔可夫链{X(n),n＝0,1,2,…}的初始概率分布，定义为：

(2)在时刻m(n＝m)状态微生物次级代谢产物浓度X(m)的概率分布

P{X(m)＝j}＝P_j(m),j∈I,m＞0,在时刻m的概率分布为：

(3)在时刻m＝0的概率分布就是初始概率分布，

时刻m的概率分布满足条件

(4)如果已知在时刻m的微生物次级代谢产物浓度概率分布p_j(m)(j∈I)及微生物次级代谢产物浓度一步转移概率p_ij(i,j∈I),则知在时刻m+1的微生物次级代谢产物浓度概率分布为

(5)如果已知初始概率分布p_j(m)(j∈I)及m步转移概率p_ij(m)(i,j∈I,m≥1)，则在时刻m的概率分布为

(6)如果微生物次级代谢产物合成齐次马尔可夫链的状态空间为I＝{1,2，…N}，

是一步转移概率矩阵，则式1可以表示为

记

则式1又可以表示为

则最终微生物次级代谢产物式可以表示为：

(7)转移概率分布拟合优度检验

原假设：近似中位秩公式计算得到转移概率函数F_n(t)＝实际转移概率函数F(t)；

近似中位秩公式计算得到转移概率函数和实际转移概率函数之间的最大偏差D_n可由下面公式求得：

给定显著性水平α，查表D_n的极限分布表得到临界值D_n,α(见附录A)。当D_n＜D_n,α时，接受原假设；反之则拒绝。

本发明根据微生物发酵过程的时间和空间的连续性(离散型)，微生物次级代谢产物合成过程具备马尔科夫性，可认为是马尔可夫过程。对微生物次级代谢产物的合成可建立统一的数学评估方法，通过该数学评估方法揭示建立微生物代谢生物合成过程产物生成概率转移因素，使之可量化。本发明适用于微生物代谢产物多阶段生物合成过程产物产率评估，其优势在于算法简单、适用范围广、预测结果准确。

附图说明：

图1是微生物次级代谢产物合成及分解马尔科夫过程；

图2是状态转移概率示意图。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：以某顶头孢霉菌种生产头孢菌素C为例

一种微生物次级代谢产物合成制备过程产物产率及可信性评估方法，包括以下步骤：

1、对第一子过程(菌种活化培育过程)进行菌种占比的马尔科夫链统计分析，在开始阶段，目标菌种、营养物质、目标代谢产物和其他占比数据如下表1。

表1某顶头孢霉菌种培育78h后各成分占比分布表

比值	菌种	营养物质	目标代谢产物	其他
					初始	20.45％	8.86％	0.56％	70.13％
78h	40.04％	0.28％	5.36％	54.32％

经过菌种培育78h后，与培育前相比，本子过程各个菌种浓度概率转移情况如表2所示。

表2某菌种培育78h占比转移表

因整个系统的质量一定，即目标菌种浓度一定，根据马尔科夫链试预测目标菌种培育后占比量U。

令n＝0代表培育前,n＝1代表第一次统计数据,n＝2代表第二次统计,n＝3代表第三次统计,n＝4代表第四次统计，依次递推。同时令{X(n),n＝0,1,2,3,4}表示该菌种自培育前到培育后的各时间段的占比统计次数，显然这是齐次马尔可夫链。它的初始概率分布为

其中p₁,p₂,p₃,p₄,分别代表该培育过程内目标菌种、营养物质、目标代谢产物及其他占比频数。

它的一步转移概率矩阵为:

则该目标菌种比率分布预测值即上述齐次马尔可夫链在时刻4的概率分布，满足下式:

利用MATLAB计算得出:

则该目标菌种培育后的占比量为:

U＝(∑N)p₁(4)＝100％×0.4034＝40.34％

而代谢产物占比量非常少，为：

U＝(∑N)p₁(4)＝100％×0.0529＝5.29％

对比表1中菌种浓度和代谢产物实际占比，其相对误差分别低至：0.75％和1.31％。

(2)对第二子过程(种子罐发酵过程)进行菌种占比的马尔科夫链统计分析，在第二子过程开始阶段，目标菌种占比数据如下表3。

表3某菌种种子罐发酵阶段78h占比分布表

初始	20.02％	9.65％	0.57％	69.76％
					78h	40.36％	0.23％	12.28％	47.13％

经过种子罐发酵过程78h后，与培育前相比，本子过程各个菌种浓度概率转移情况如表4所示。

表4某菌种种子罐发酵过程开始至结束目标菌种占比转移概率表:

因整个系统的质量一定，即目标菌种浓度一定，根据马尔科夫链试预测目标菌种种子罐发酵后占比量U。

令n＝0代表种子罐发酵前,n＝1代表第一次统计数据,n＝2代表第二次统计,n＝3代表第三次统计,n＝4代表第四次统计，依次递推。同时令{X(n),n＝0,1,2,3,4}表示该菌种自种子罐发酵前到种子罐发酵后的各时间段的占比统计次数，显然这是齐次马尔可夫链。它的初始概率分布为

其中p1,p2,p3,p4,分别代表该过程内目标菌种、营养物质、目标代谢产物及其他占比频数。

它的一步转移概率矩阵为:

则该目标菌种比率分布预测值即上述齐次马尔可夫链在时刻4的概率分布，满足下式:

利用MATLAB计算得出:

则该目标菌种种子罐发酵后的占比量为:

则种子罐发酵78h后目标代谢产物占比量为:

对比表3中菌种浓度和代谢产物实际占比，其相对误差分别低至：0.27％和0.49％。

(3)对第三子过程(大罐发酵过程)进行菌种占比的马尔科夫链统计分析，在第二子过程开始阶段，目标菌种占比数据如下表5。

表5某菌种大罐发酵126h占比分布表

经过大罐发酵过程126h后，与培育前相比，本子过程各个菌种浓度概率转移情况如表 6所示。

表6某菌种大罐发酵过程开始至结束目标菌种占比转移概率表:

因整个系统的质量一定，即目标菌种浓度一定，根据马尔科夫链试预测目标菌种大罐发酵后占比量U。

令n＝0代表大罐发酵前,n＝1代表第一次统计数据,n＝2代表第二次统计,n＝3代表第三次统计,n＝4代表第四次统计，依次递推。同时令{X(n),n＝0,1,2,3,4}表示该菌种自大罐发酵前到大罐发酵后的各时间段的占比统计次数，显然这是齐次马尔可夫链。它的初始概率分布为

其中p₁,p₂,p₃,p₄,分别代表该过程内目标菌种、营养物质、目标代谢产物及其他占比频数。

它的一步转移概率矩阵为:

则该目标菌种比率分布预测值即上述齐次马尔可夫链在时刻4的概率分布，满足下式:

利用MATLAB计算得出:

则该目标代谢产物培育后的占比量为:

培育后菌种浓度为：

对比表5中菌种浓度和代谢产物实际占比，其相对误差分别低至：0.18％和0.23％。

(4)转移概率分布拟合优度检验

近似中位秩公式计算得到目标菌种消失函数F_n(t)＝1-实际转移概率函数F(t)。

近似中位秩公式计算得到转移概率函数和实际转移概率函数之间的最大偏差D_n可由下面公式求得：

给定显著性水平α，查表D_n的极限分布表得到临界值D_n,α(见附录A)。当D_n＜D_n,α时，接受原假设；反之则拒绝。

以大罐发酵过程统计的概率数据为例，开展模型的拟合优度检验如下表7。

表7大罐发酵过程转移概率分布拟合优度检验的过程

取显著性水平α＝0.01，查表得D_n,α＝0.356，即

通过拟合优度检验，可认为正态分布拟合结果满足要求。

最终获得微生物次级代谢产物合成制备过程产物产率及可信性模型为：

附录A(规范性附录)

K-S检验临界值表

Claims (4)

1.一种微生物次级代谢产物制备过程中产物产率评估方法，其特征在于，包括以下步骤：

建立微生物次级代谢产物制备过程中次级代谢产物产率的数学评估模型及评估模型可信度；

所述的建立微生物次级代谢产物制备过程中次级代谢产物产率的数学评估模型是将马尔可夫链中的相关元素进行定义，使用微生物次级代谢产物制备过程中各阶段前后的菌种浓度、代谢产物浓度、营养物质浓度等参数经验值作为建模工具的输入变量并生成概率及生成初始概率，对概率数据进行分析确定其生成产物转移概率，建立产物产率的数学评估模型；

所述的评估模型可信度是连续测量微生物生长过程中产生的次级代谢产物产率信息，根据次级代谢产物的积累量与微生物生长速率的耦合关系，评估各阶段的微生物产物产率及可信性。

2.根据权利要求1所述的微生物次级代谢产物制备过程产物产率评估方法，其特征在于，所述的微生物次级代谢产物制备过程包括四个阶段：菌种活化培育、菌种扩大培养、大罐发酵过程、发酵产物分离提纯。

3.根据权利要求2所述的微生物次级代谢产物制备过程产物产率评估方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

一、建立马尔科夫链模型

1)利用马尔可夫工程建立微生物次级代谢产物制备过程中产物产率评估数学模型；

2)采集微生物次级代谢产物制备过程的菌种活化培育、菌种的扩大培养(种子罐)、大罐发酵过程、发酵产物分离提纯四个过程实验前后菌种浓度、产物浓度、营养物质等实验数据；

3)根据采集的数据，计算菌种的活化培育过程的产物及一步转移概率；

4)根据采集的数据，计算菌种的扩大培养过程的产物及一步转移概率；

5)根据采集的数据，计算发酵过程的产物及一步转移概率；

6)根据采集的数据，计算发酵产物分离提纯过程的产物及一步转移概率；

7)根据得到的4个步骤的一步转移概率，评价微生物代谢产物在制备四个过程中的产率概率与参数之间的转化关系，按照马尔可夫工程建立产物产率评估模型；

二、评估模型拟合度

模型拟合度检验采用Kolmogorov-Smirnov检验法。

三、微生物次级代谢产物制备过程中产物产率及可信性模型：

4.根据权利要求1所述的微生物次级代谢产物制备过程产物产率评估方法，其特征在于，具体步骤为：

(1){X(n),n＝0,1,2,…}是微生物次级代谢产物合成马尔可夫链，状态空间为I，在初始时刻(n＝0)状态{X(0)}的概率分布P{X(0)＝j}＝p_j,j∈I,称为微生物次级代谢产物合成过程马尔可夫链{X(n),n＝0,1,2,…}的初始概率分布，定义为：

(2)在时刻m(n＝m)状态微生物次级代谢产物浓度X(m)的概率分布

P{X(m)＝j}＝P_j(m),j∈I,m＞0,在时刻m的概率分布为：

(3)在时刻m＝0的概率分布就是初始概率分布，

时刻m的概率分布满足条件

(4)如果已知在时刻m的微生物次级代谢产物浓度概率分布p_j(m)(j∈I)及微生物次级代谢产物浓度一步转移概率p_ij(i,j∈I),则知在时刻m+1的微生物次级代谢产物浓度概率分布为

(5)如果已知初始概率分布p_j(m)(j∈I)及m步转移概率p_ij(m)(i,j∈I,m≥1)，则在时刻m的概率分布为

(6)如果微生物次级代谢产物合成齐次马尔可夫链的状态空间为I＝{1,2，…N}，

是一步转移概率矩阵，则式1可以表示为

记

则式1又可以表示为

则最终微生物次级代谢产物式可以表示为：

(7)转移概率分布拟合优度检验

原假设：近似中位秩公式计算得到转移概率函数F_n(t)＝实际转移概率函数F(t)；

近似中位秩公式计算得到转移概率函数和实际转移概率函数之间的最大偏差D_n可由下面公式求得：

给定显著性水平α，查表D_n的极限分布表得到临界值D_n,α，当D_n＜D_n,α时，接受原假设；反之则拒绝。

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