CN112760301A

CN112760301A - 一种催化活性提高的糖基转移酶突变体及其应用

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Publication number: CN112760301A
Application number: CN201911061051.4A
Authority: CN
Inventors: 朱玥明; 李娇; 戴住波; 张学礼; 宋云飞; 谢永富; 孙媛霞
Original assignee: Guilin Layn Natural Ingredients Corp; Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Guilin Layn Natural Ingredients Corp; Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2019-11-01
Filing date: 2019-11-01
Publication date: 2021-05-07
Anticipated expiration: 2039-11-01
Also published as: CN112760301B

Abstract

本发明公开了一种催化活性提高的糖基转移酶突变体及其应用。本发明在野生型糖基转移酶的基础上通过特定位点的突变，得到了多个糖基转移酶突变体，糖基化反应催化相比于野生型明显提高，且底物范围广。

Description

一种催化活性提高的糖基转移酶突变体及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种催化活性提高的糖基转移酶突变体及其应用。

背景技术

罗汉果甜苷是从罗汉果中分离得到的四环三萜类化合物，是其主要的甜味物质，具有零热量、高甜度的特点(P.Rahul S,K.Alexander J,R.Jeanne I,Analytical andBioanalytical Chemistry 2013,405,4397-4407.)。其中，罗汉果甜苷V是主要的活性物质，其甜度是蔗糖的300倍。对罗汉果甜苷的不断深入研究发现，罗汉果甜苷除具有镇咳、治疗干咳等作用外，还被证实具有抗癌、抗肿瘤、抑菌的生物活性(Liu C,Dai L,Liu Y,DouD,Sun Y,Ma L,Future Med Chem,2018,10(8):845-850；Liu C,Dai L,Liu Y,Rong L,DouD,Sun Y,Ma L,Nutrients,2016,8(6))。由于罗汉果甜苷结构复杂且在自然界中含量低，同时罗汉果种植对环境要求苛刻，故传统的罗汉果种植方法使得罗汉果甜苷的进一步应用受到限制。

由糖基转移酶催化的糖基化反应是罗汉果甜苷合成的最后一步也是至关重要的步骤，对甜苷的甜味，水溶性以及药理活性等具有重要的影响。目前，在糖酶数据库中(CAZY；carbohydrate-active enzyme database；http://www.cazy.org/)共收录了16799条糖基转移酶序列，但其中只有400条糖基转移酶基因得以表征。同时，极少数的糖基转移酶能够对罗汉果醇进行糖基化，且催化活性较低(M.Itkin,R.Davidovich-Rikanati,S.Cohen,V.Portnoy,A.Doron-Faigenboim,E.Oren,S.Freilich,G.Tzuri,N.Baranes,S.Shen,Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Statesof America 2016,113,E7619)，限制了罗汉果甜苷的生物法合成。因此，发掘糖基转移酶的关键活性位点，提高糖基转移酶对罗汉果醇的催化活性对于罗汉果甜苷的合成途径的开发与应用具有重要的意义。

我们实验验证了罗汉果来源的糖基转移酶UGT74AC1具有催化罗汉果醇生成罗汉果甜苷IE的功能，首次报道了该酶在罗汉果甜苷合成途径中的作用(L.Dai,C.Liu,Y.Zhu,J.Zhang,Y.Men,Y.Zeng,Y.Sun,Plant&Cell Physiology 2015,56,1172-1182；L.Dai,L.Jiao,P.Yao,Y.Zhu,M.Yan,Z.Yan,J.Yang,Y.Sun,Journal of Biotechnology 2017,248,69-76)。同时还发现该酶不仅能够对罗汉果醇进行糖基化反应生成甜苷IE，还能对多种黄酮类、四环三萜类及五环三萜类化合物(如原人参二醇、原人参三醇、罗汉果醇、灵芝酸I、灵芝酸C2、灵芝酸G、赤芝酸LM1、赤芝酸C、泻根甜苷元、松苓新酸等四环三萜类化合物；甘草次酸等五环三萜类化合物；白杨素，芹菜素，山奈酚，橙皮素，柚皮素，水飞蓟宾，芒柄花素，染料木素，鹰嘴豆芽素等黄酮类化合物)进行糖基化。这些化合物通过糖基化反应，水溶性明显增强，且表现出特殊的生理活性功能，因此该酶具有较强的应用价值。例如，合成具有抗肿瘤、抗炎活性的人参二醇糖基化产物人参皂苷Rh2，具有抗炎活性物质泻根苷元3-O-Glc(cabenoside D)以及具有抗肿瘤细胞生长活性的甘草次酸糖苷。但是现有的糖基转移酶对这些化合物的催化活性普遍偏低，如何实现高效可控的通过酶催化反应制备罗汉果苷仍是一大难题。

发明内容

本发明提供一种催化活性提高的糖基转移酶突变体，可以有效催化罗汉果醇以及多种黄酮类、四环三萜类及五环三萜类化合物糖基化反应，相比于野生型糖基转移酶其酶催化活性大幅提高。

本发明提供如下技术方案：

本发明提供一种糖基转移酶突变体，其氨基酸序列是以SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列为参考序列，在对应于SEQ ID NO:1的S15、R28、H47、L48、M76、T79、L109、或F203位中至少一个位置处的氨基酸残基发生突变；或者所述糖基转移酶突变体的氨基酸序列具有所述发生突变的氨基酸序列中的所述突变位点，且与所述发生突变的氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列，优选具有90％以上、95％以上或98％以上的同源性。

在本发明的一个实施方案中，所述糖基转移酶突变体在上述位点的氨基酸残基被小位阻氨基酸或疏水性氨基酸中的一种取代，例如被丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、苏氨酸、亮氨酸或异亮氨酸中的至少一种取代。

在一个实施方案中，所述糖基转移酶突变体至少包括如下突变位点之一：对应于SEQ ID NO:1的第15位的丝氨酸S15突变为赖氨酸K、丙氨酸A、酪氨酸Y、缬氨酸V或者组氨酸H中的任一种，第28位的精氨酸R28突变为脯氨酸P、赖氨酸K、组氨酸H或丙氨酸A中的任一种，第47位的组氨酸H47突变为酪氨酸Y、精氨酸R、赖氨酸K或苯丙氨酸F中的任一种，第48位的亮氨酸L48突变为异亮氨酸I、甲硫氨酸M、缬氨酸V、丙氨酸A或苏氨酸T中的任一种，第76位的甲硫氨酸M76突变为异亮氨酸I、亮氨酸L、丙氨酸A或丝氨酸S中的任一种，第79位的苏氨酸T79突变为苯丙氨酸F、酪氨酸Y、色氨酸W或半胱氨酸C中的任一种，第109位的亮氨酸L109突变为异亮氨酸I、甘氨酸G、缬氨酸V、丙氨酸A或苏氨酸T中的任一种，第203位的苯丙氨酸F203突变为异亮氨酸I、亮氨酸L、酪氨酸Y或丙氨酸A中的任一种。具体地，所述突变体包括对应于SEQ ID NO:1，发生至少一个如下位点的取代或者是如下二种以上不同位点的组合：S15K、S15A、S15Y、S15V、S15H、R28P、R28K、R28H、R28A、H47Y、H47R、H47K、H47F、L48I、L48M、L48V、L48A、L48T、M76I、M76L、M76A、M76S、T79F、T79Y、T79W、T79C、L109I、L109G、L109V、L109A、L109T、F203 I、F203L、F203Y、F203A。

在一个实施方案中，所述糖基转移酶突变体包括在对应于SEQ ID NO:1的L109位点的突变；例如L109突变为异亮氨酸I、甘氨酸G、缬氨酸V、丙氨酸A或苏氨酸T中的任一种。进一步，所述糖基转移酶突变体还可以包括至少其他七个位点的突变，例如所述其他七个位点可以是对应于SEQ ID NO:1的任意七个位点，包括但不限于S15、R28、H47、L48、M76、T79和F203中的任一个或多个位点。作为一个示例性方案，所述糖基转移酶突变体包括对应于SEQ ID NO:1的L109I的突变，并且包括对应于SEQ ID NO:1的至少其他七个位点的突变，所述其他七个位点包括但不限于对应于SEQ ID NO:1的S15、R28、H47、L48、M76、T79和F203中的任一个或多个位点；具体地，所述其他七个位点的突变包括但不限于如下突变或者其不同位点的组合：S15K、S15A、S15Y、S15V、S15H、R28P、R28K、R28H、R28A、H47Y、H47R、H47K、H47F、L48I、L48M、L48V、L48A、L48T、M76I、M76L、M76A、M76S、T79F、T79Y、T79W、T79C、F203 I、F203L、F203Y、F203A。

在一个实施方案中，所述糖基转移酶突变体包括在对应于SEQ ID NO:1的F203位点的突变；例如F203突变为异亮氨酸I、亮氨酸L、酪氨酸Y或丙氨酸A中的任一种。进一步，所述糖基转移酶突变体还可以包括至少其他七个位点的突变，例如所述其他七个位点可以是对应于SEQ ID NO:1的任意七个位点，包括但不限于S15、R28、H47、L48、M76、T79和L109中的任一个或多个位点。作为一个示例性方案，所述糖基转移酶突变体包括对应于SEQ ID NO:1的F203I的突变，并且包括对应于SEQ ID NO:1的至少其他七个位点的突变，所述其他七个位点包括但不限于对应于SEQ ID NO:1的S15、R28、H47、L48、M76、T79和L109中的任一个或多个位点；具体地，所述其他七个位点的突变包括但不限于如下突变或者其不同位点的组合：S15K、S15A、S15Y、S15V、S15H、R28P、R28K、R28H、R28A、H47Y、H47R、H47K、H47F、L48I、L48M、L48V、L48A、L48T、M76I、M76L、M76A、M76S、T79F、T79Y、T79W、T79C、L109I、L109G、L109V、L109A、L109T。

在一个实施方案中，所述糖基转移酶突变体至少同时包括对应于SEQ ID NO:1的第109位亮氨酸和第203位苯丙氨酸的突变，例如位于第109位的亮氨酸L突变为异亮氨酸I、甘氨酸G、缬氨酸V、丙氨酸A或苏氨酸T中的任一种，同时第203位氨基酸突变为异亮氨酸I、亮氨酸L、酪氨酸Y或丙氨酸A中的任一种；优选地，所述糖基转移酶突变体包括第109位和第203位同时突变为异亮氨酸I。进一步地，所述糖基转移酶突变体还进一步包括第15、28、47、48、76、79位中的至少一个位点的突变，所述第15、28、47、48、76、79位氨基酸可以发生如前所述的任一突变。

在一个实施方案中，所述糖基转移酶突变体包括对应于SEQ ID NO:1的第109位亮氨酸L和第203位苯丙氨酸F同时突变为异亮氨酸I，并且在对应于SEQ ID NO:1的S15、R28、H47、L48、M76、T79位点同时发生突变；优选，所述糖基转移酶突变体包括如下位点的突变：S15K、R28H、H47Y、L48V、M76I、T79F、L109I、F203I。

本发明还提供编码所述糖基转移酶突变体的核酸序列，所述核酸序列可以是根据所述糖基转移酶突变体的氨基酸序列得到。

本发明还涉及包含所述核酸序列的表达盒、包含所述核酸或者表达盒的表达载体。进一步地，本发明还提供包含所述核酸序列、表达盒或者所述载体的宿主细胞，例如用所述核酸序列、表达盒或者载体转化或转染原始宿主细胞，形成转化体。本发明所述的表达盒，还可以任选地包括增强子或其他必须元件。在一个具体实施方案中，所述表达盒包含表达所述变体的所有元件，包括在宿主细胞中转录和翻译过程中所必须的元件，例如，所述表达盒包括启动子和终止子，所述启动子和终止子没有特别的限定，可以是本领域已知的能够实现所述变体表达的启动子和终止子。

本发明还提供了所述糖基转移酶突变体的应用，所述突变体用于催化糖基受体，例如萜类化合物、黄酮类化合物的糖基化反应。

在一个实施方案中，所述突变体可催化四环三萜类化合物、五环三萜类化合物的糖基化反应，例如所述萜类化合物为原人参二醇、原人参三醇、罗汉果醇、灵芝酸I、灵芝酸C2、灵芝酸G、赤芝酸LM1、赤芝酸C、泻根甜苷元、松苓新酸中的任一种。

在一个实施方案中，所述突变体催化将来自糖基供体的糖基转移到四环三萜类化合物的C3和/或C24位的羟基，催化C3和/或C24位羟基糖基化；优选地，所述突变体可以先催化C3位羟基糖基化，再催化C24位羟基糖基化。在一个实施方案中，当所述四环三萜类化合物的糖基受体C2位有羟基时，所述突变体催化C2位羟基进行糖基化。

在一个实施方案中，所述突变体催化将来自糖基供体的糖基转移到五环三萜类化合物的C3和/或C30位的羟基。在一个实施方案中，所述突变体催化将来自糖基供体的糖基转移到黄酮类化合物的羟基，黄酮类化合物种类不同则糖基化位点不同，例如，所述突变体催化山奈酚C7位糖基化。

在一个实施方案中，所述突变体用于催化罗汉果醇制备罗汉果甜苷，或用于催化原人参二醇制备Rh₂。

在一个实施方案中，所述突变体可催化山奈酚、白杨素、芹菜素、橙皮素、柚皮素、水飞蓟宾、芒柄花素、染料木素、鹰嘴豆芽素等黄酮类化合物的糖基化反应。

本发明还提供一种糖基化反应方法，通过利用本发明所述糖基化转移酶突变体、转化体或其培养物催化糖基供体的糖基转化至糖基受体，发生糖基化反应。

在一个实施方案中，所述方法包括：在糖基化反应体系中加入所述的糖基转移酶突变体，所述糖基转移酶突变体与所述糖基化反应体系中的糖基受体、糖基供体接触，使其进行糖基化反应；或者在糖基化反应体系中加入所述转化体，进行培养，使所述转化体产生所述糖基转移酶突变体，与所述糖基化反应体系中的糖基受体、糖基供体接触，使其进行糖基化反应。

所述糖基受体、糖基供体具有如上文所述的含义。

在一个实施方案中，将上述转化体根据已知的培养微生物的方法通过培养转化体而获得所述转化体的培养物。

有益效果：

本发明提供一系列糖基化反应催化活性显著提高的突变体，对罗汉果醇、原人参二醇和原人参三醇等四环三萜类化合物的催化活性、对甘草次酸等五环三萜类化合物的催化活性、对山奈酚等黄酮类化合物的催化活性相比野生型糖基转移酶都有大幅提高。应用该突变体能够以罗汉果醇、原人参二醇和原人参三醇为底物制备罗汉果甜苷、人参皂苷Rh2等具有重要药理活性化合物。同时，这些突变体对多种黄酮类、其它四环三萜类及五环三萜类化合物的活性也有明显提高，扩展了该酶的底物谱，提升了该酶在制备重要珍稀化合物中的实际应用潜力。

附图说明

图1是实施例5突变体M170以罗汉果醇为底物,以UDP-葡萄糖为糖基供体转化生产罗汉果甜苷LC-MS图。

图2是突变体MT催化原人参二醇(PPD)产生人参皂苷Rh₂ LC-MS图。

图3是MT催化原人参三醇(PPT)产生PPT 3-O-Glc LC-MS图。

图4是突变体M48催化甘草次酸LC-MS图。

图5是突变体M48催化山奈酚LC-MS图。

图6是利用突变体M170以罗汉果醇为底物,以UDP-半乳糖为糖基供体转化生产罗汉果甜苷LC-MS图。

图7为利用突变体M170以罗汉果醇为底物,以UDP-氮乙酰葡萄糖为糖基供体转化生产罗汉果甜苷LC-MS图。

具体实施方式

定义与说明

本发明中氨基酸由单字母或三字母代码表示，具有如下含义：A：Ala(丙氨酸)；R：Arg(精氨酸)；N：Asn(天冬酰胺)；D：Asp(天冬氨酸)；C：Cys(半胱氨酸)；Q：Gln(谷氨酰胺)；E：Glu(谷氨酸)；G：Gly(甘氨酸)；H：His(组氨酸)；I：Ile(异亮氨酸)；L：Leu(亮氨酸)；K：Lys(赖氨酸)；M：Met(甲硫氨酸)；F：Phe(苯丙氨酸)；P：Pro(脯氨酸)；S：Ser(丝氨酸)；T：Thr(苏氨酸)；W：Trp(色氨酸)；Y：Tyr(酪氨酸)；V：Val(缬氨酸)。

本发明中，“糖基转移酶”催化糖基部分从UDP-糖转移到宽范围的底物的酶。所述糖基转移酶是催化糖基团从活化的糖基供体转移至糖基受体分子的酶，并且具体地，它指利用UDP-糖作为糖基供体的酶。本文所述“糖基受体”、“底物”可互换使用，包括但不限于萜类化合物、黄酮类化合物，例如四环三萜类化合物、五环三萜类化合物的糖基化反应，例如所述萜类化合物为原人参二醇、原人参三醇、罗汉果醇、灵芝酸I、灵芝酸C2、灵芝酸G、赤芝酸LM1、赤芝酸C、泻根甜苷元、松苓新酸中的任一种；所述黄酮类化合物可以选自山奈酚、白杨素、芹菜素、橙皮素、柚皮素、水飞蓟宾、芒柄花素、染料木素、鹰嘴豆芽素中的任一种。术语“萜”是指在类异戊二烯结构骨架上构建或通过组合异戊二烯单元产生的有机化合物。本发明中术语“黄酮类化合物”一般视为是具有两个苯环和杂环的15碳结构，因此，可视为是萜的重叠。

本文所述“糖基供体”是提供糖基的化合物，包括核苷二磷酸糖。例如，所述的糖基供体选自下组：UDP-葡萄糖，ADP-葡萄糖，TDP-葡萄糖，CDP-葡萄糖，GDP-葡萄糖，UDP-半乳糖醛酸，ADP-半乳糖醛酸，TDP-半乳糖醛酸，CDP-半乳糖醛酸，GDP-半乳糖醛酸，UDP-半乳糖，ADP-半乳糖，TDP-半乳糖，CDP-半乳糖，GDP-半乳糖，UDP-阿拉伯糖，ADP-阿拉伯糖，TDP-阿拉伯糖，CDP-阿拉伯糖，GDP-阿拉伯糖，UDP-鼠李糖，ADP-鼠李糖，TDP-鼠李糖，CDP-鼠李糖，GDP-鼠李糖，UDP-氮乙酰葡萄糖，ADP-氮乙酰葡萄糖，TDP-氮乙酰葡萄糖，CDP-氮乙酰葡萄糖，或其他核苷二磷酸己糖或核苷二磷酸戊糖，或其组合。

本发明中，“同源性”具有本领域常规的含义，是指两个核酸或氨基酸序列之间的“同一性”，其百分比表示在最佳比对(best alignment)后获得的待比较的两个序列之间的相同核苷酸或氨基酸残基的统计学意义的百分比，两个序列之间的差异随机地分布在其整个长度上。

本发明当中，所述变体根据它们在特定残基上的突变来描述，其位置通过与野生型酶序列SEQ ID NO:1比对或参考酶序列SEQ ID NO:1来确定。在本发明的上下文中，还涉及在功能等同的残基上携带这些相同突变的任何变体。

在本发明中，术语“引物”和“引物链”可以互换使用，是指初始的核酸片段，通常是与由目标核酸分子全部或部分的引物结合位点互补的RNA寡核苷酸、DNA寡核苷酸或嵌合序列。引物链可包含天然的、合成的或修饰的核苷酸。引物长度的下限为在核酸扩增反应条件下可以形成稳定双链体所需的最小长度。

在本发明中，术语“突变体”和“变体”可以互换使用，“取代”或“突变”可以互换使用，这些表达是指相对于野生型蛋白的氨基酸，例如野生型的序列SEQ ID NO:1的UGT74AC1多肽，或来源于此类多肽的基础上，包含在一个或更多个位置处的改变，即取代、插入和/或缺失，并仍然保留其活性。变体可以通过本领域已知的各种技术获得，例如可以是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主中产生。特别地，用于重组技术的修饰编码野生型蛋白的DNA序列的示例性技术包括但不限于，定向诱变、随机诱变和合成寡核苷酸的构建。

关于氨基酸位置或残基的术语“取代”是指在特定位置处的氨基酸已被其他的氨基酸代替。取代可以是保守的或非保守的。

本文采用“XaY”的形式表示氨基酸的突变或取代，其中a表示SEQ ID NO:1中氨基酸的位置，X表示SEQ ID NO:1中a位置野生型的氨基酸种类，Y表示SEQ ID NO:1中a位置突变后的氨基酸种类。例如，“S15K”表示与SEQ ID NO:1比对，在对应于SEQ ID NO:1第15位置的丝氨酸S被赖氨酸K取代。

术语“启动子”是一段位于结构基因5'端上游区的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地相结合并具有转录起始的特异性，本发明的可以是本领域任何已知的启动子序列，可以是原核的或真核的，可选自例如Lacl、LacZ、pLacT、ptac、T3或T7噬菌体RNA聚合酶启动子、CMV启动子、HSV胸苷激酶启动子、SV40启动子、小鼠金属硫蛋白–L启动子等。

本发明所述宿主细胞可以是原核生物，例如大肠杆菌，或真核生物。真核生物可以是低等真核生物，诸如酵母(例如，巴斯德毕赤酵母或乳酸克鲁维酵母)或真菌(例如属曲霉属(Aspergillus))或高等真核生物诸如昆虫细胞(例如Sf9或Sf21)、哺乳动物细胞或植物细胞。细胞可以是哺乳动物细胞，例如COS(绿猴细胞系)、CHO(中国仓鼠卵巢细胞系)、小鼠细胞和人类细胞等。

本发明所述载体可以是质粒、噬菌体、噬菌粒、粘粒、病毒、YAC、BAC、土壤杆菌属(Agrobacterium)pTi质粒等。载体可以优选地包含选自以下的一个或更多个元件：复制起点、多克隆位点和可选择的基因。优选地，载体是质粒。原核载体的一些非详尽实例如下：pQE70、pQE60、pQE–9(Qiagen)、pbs、pD10、phagescript、psiX174、pbluescript SK、pbsks、pNH8A、pNH16A、pNH18A、pNH46A；ptrc99a、pKK223–3、pKK233–3、pDR540、pBR322、pRIT5、pET-32a、pET-28a。优选地，所述载体是表达载体，优选为pET-28a。

本文中，术语“转化”指将DNA导入宿主细胞以便DNA可作为染色体外元件或通过染色体整合被复制。即，转化指通过将外源DNA导入细胞引起的基因的合成改变。术语“转化体的培养物”指根据已知的培养微生物的方法通过培养转化体而获得的产物。

本文中，术语“疏水性氨基酸”或“小位阻氨基酸”指的是根据Eisenberg，1984，J.Mol.Biol.179：125-142(1984)的标准化共有疏水性级别(normalizedconsensushydrophobicity scale)表现出的疏水性高于零的氨基酸。示例性的疏水性氨基酸包括但不限于：Ala、Val、Ile、Leu、Phe、Tyr、Trp、Pro、Met、Gly，以及以上氨基酸的衍生物。在一些实施方式中，疏水性氨基酸为芳香族氨基酸。本文所使用的术语“芳香族氨基酸”指的是其侧链具有至少一个芳环或杂芳环的疏水性氨基酸。所述芳环或杂芳环可含有一个或多个取代基，如-OH、-SH、-CN、-F、-Cl、-Br、-I、-NO₂、-NO、-NH₂、-NHR、-NRR、-C(O)R、-C(O)OH、-C(O)OR、-C(O)NH₂、-C(O)NHR、-C(O)NRR等，其中R独立地为(C1-C6)烷基、取代的(C2-C6)烷基、(C2-C6)烯基、取代的(C2-C6)烯基、(C2-C6)炔基、取代的(C2-C6)炔基、(C5-C20)芳基、取代的(C5-C20)芳基、(C6-C26)烷芳基、取代的(C6-C26)烷芳基、5-20元杂芳基、取代的5-20元杂芳基、6-26元烷杂芳基或者取代的6-26元烷杂芳基。示例性的芳香族氨基酸包括但不限于Phe、Tyr和Trp。在一些实施方式中，疏水性氨基酸为脂肪族氨基酸。本文所使用的术语“脂肪族氨基酸”是指具有脂肪族烃侧链的疏水性氨基酸。示例性的脂肪族氨基酸包括但不限于Ala、Val、Leu和Ile。在一些实施方式中，疏水性氨基酸为非极性氨基酸，例如带有的侧链在生理pH下不带电的疏水性氨基酸，该氨基酸具有的键中由两个原子共用的电子对通常由两个原子中的每一者均等控制(即所述侧链是非极性的)。示例性的非极性氨基酸包括但不限于Leu、Val、Ile、Met、Gly和Ala。本领域技术人员应当理解的是，本文所述的氨基酸的分类并不是互斥的。因此，具有的侧链表现出两种以上物理化学性质的氨基酸可归于多个类别中。例如，具有被极性取代基进一步取代的芳香部分的氨基酸侧链，如Tyr，可同时表现出芳香族疏水性和极性或亲水性，因此可包含在芳香族和极性两个类别中。特别是在本文提供的详细公开内容的基础之上，对任何氨基酸的适当分类对于本领域技术人员而言将是显而易见的。

在下面的实施例中进一步说明本发明，但并不限制本发明的范围。部分分子克隆方法细节依据试剂、酶或试剂盒提供商家不同而有所差别，应当按照产品说明进行操作，在实施例中不再详细描述。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1.糖基转移酶的表达及活性评价

糖基转移酶UGT74AC1野生型及突变体基因连接于pET32a载体中，转化至大肠杆菌表达菌BL21(DE3)中，以LB培养基进行异源蛋白的诱导表达。离心收集菌株，用Tris盐酸缓冲液对菌体进行悬浮，然后进行超声破碎，离心获得破碎上清，采用Ni柱亲和层析的方法进行纯化，并进一步用30kDa的超滤管进行超滤，得到浓缩纯化的野生型及突变体蛋白。

糖基转移酶酶活测定体系如下：Tris·HCl(pH＝8.0)，0.2mM的罗汉果醇或PPD或PPT，3mM的UDP-glucose，10mM MgCl₂，5μL粗酶液，40℃反应30分钟。糖基化反应结束后，加入等体积甲醇终止反应，利用液相与质谱进行测定。高效液相色谱分析按如下条件进行：仪器为安捷伦高效液相色谱仪1200，色谱柱为C18色谱柱，流动相：水+0.1％甲酸，乙腈+0.1％甲酸，流速：1mL/min，上样量为20μL。

实施例2突变位点的设计

首先，将罗汉果来源的糖基转移酶UGT74AC1与Genbank数据库中已报道的糖基转移酶氨基酸序列进行同源性比对分析，然后对糖基转移酶UGT74AC1进行结构预测，利用Swiss-Model、Phyre2、Discovery Studio等软件对UGT74AC1野生型蛋白进行同源建模，并利用罗汉果醇、原人参二醇和原人参三醇等底物进行分子对接，从而预测野生型酶的催化位点及底物结合位点，并分析这些位点附近氨基酸残基的作用，设计突变体的氨基酸序列。

实施例3预测位点的定点饱和突变

选取SEQ ID NO：1中第15、28、47、48、76、79、109、203位共8个与活性密切相关的位点为示例，进行单点饱和突变，具体操作如下：以重组质粒pET32-UGT74AC1为模板，以带有突变位点的一对引物，用高保真酶进行全质粒PCR扩增，获得指定突变位点的重组质粒。扩增产物用DpnI酶在37℃条件下消化2h，降解初始模板。消化产物转化至E.coli BL21，涂布到含有100μg/mL氨苄霉素LB琼脂平板上，37℃过夜培养，每个位点筛选200个阳性克隆。

建立突变体通量筛选方法，分析测定酶的催化活性，将催化活性提高的糖基转移酶突变体进行测序分析相应位置氨基酸突变为何种氨基酸。活性提高的突变体的突变位点及相对活性如表1所示，相对活性是指定义野生型UGT74AC1的相对活性为1时，突变体在同等条件下催化相同底物的催化活性相对于野生型的倍数。

表1

实施例4组合突变

在上述定点突变的基础上，203位和109位氨基酸残基的突变对酶活性显著提高，因此选取两个位点进行组合，构建双突变体203I/109I、203I/109G、203I/109V、203I/109A、203I/109T、203L/109I、203L/109G、203L/109V、203L/109A、203L/109T、203Y/109I、203Y/109G、203Y/109V、203Y/109A、203Y/109T、203A/109I、203A/109G、203A/109V、203A/109A、203A/109T。对这些双突变体的活性进行测定，发现203I/109I的活性相比于单突变体的活性显著提高，其相对活性是单突变体203I的5倍，是单突变体109I的9倍，该相对活性是野生型的97倍。其他双突变体相对野生型的活性也有提升(3-5倍)，因此，在双突变体203I/109I的基础上进行下一轮的组合突变。

然后，将上述相对活性显著提高的双突变体与其他在单点饱和突变中提升活性的位点进行逐轮组合突变，并测定相对酶活。表2-6中列举出相对活性提高显著的组合突变体的相对活性及突变情况，野生型相对活性为1。

表2

表3

表4

表5

表6

实施例5利用糖基转移酶突变体以罗汉果醇为底物，以UDP-葡萄糖为糖基供体转化合成罗汉果甜苷

经过组合突变，获得具有8个位点突变的糖基转移酶UGT74AC1突变体，其活性较野生型显著提升。挑选相对活性较高的突变体M170，以罗汉果醇为底物进行转化实验，糖基化反应的体系如下：Tris·HCl(pH＝8.0)，0.2mM的罗汉果醇，1mM的UDP-葡萄糖，10mM MgCl₂，10uL粗酶液，40℃反应30分钟。糖基化反应结束后，加入等体积甲醇终止反应，利用液相与质谱进行测定。色谱柱为月旭C18色谱柱，对于罗汉果醇检测条件为：梯度洗脱条件为0-30min，25％-80％乙腈(0.1％甲酸)流速1mL/min，紫外检测波长为210nm。质谱条件为正离子模式，ESI离子源。图1所示，以罗汉果醇为底物，UGT74AC1突变体能够催化罗汉果醇产生罗汉果甜苷IE(罗汉果醇-3-O-Glc)，并在此基础上生成C3和C24位的糖基化的产物(罗汉果醇-3,24-O-2Glc)，而野生型只能将C3进行糖基化。该糖基化反应转化效率基本达到100％，即全部底物均被糖基化。通过液质联用对生成产物进行进一步的鉴定，可见两产物分子量分别为639.4442和801.4999[M+H]⁺，分别与罗汉果甜苷IE和罗汉果醇-3,24-O-2Glc的分子量一致。

实施例6利用糖基转移酶突变体对其他四环三萜类化合物的糖基化反应

挑选相对活性提高显著的糖基转移酶UGT74AC1单突变体M1和组合突变体M170，分别以原人参二醇、原人参三醇、灵芝酸C2、灵芝酸G、灵芝酸I、赤芝酸LM、赤芝酸C、泄根苷元、16α羟基松苓新酸为底物进行糖基化反应。糖基化反应的体系：Tris·HCl(pH＝8.0)，0.2mM的四环三萜类化合物，3mM的UDP-葡萄糖，10mM MgCl₂，5μL粗酶液，40℃反应30分钟。糖基化反应结束后，加入等体积甲醇终止反应，利用液相测定突变体对不同底物的催化活性。结果发现，突变体对这九种四环三萜类化合物的活性均有比较明显的提升。对原人参二醇活性提高4-356倍，对原人参三醇活性提高4-850倍，对灵芝酸C2活性提高6-350倍，对灵芝酸G活性提高4-500倍，对灵芝酸I活性提高5-350倍，对赤芝酸LM活性提高8-700倍，对赤芝酸C活性提高10-770倍，对泄根苷元活性提高6-2100倍，对16α羟基松苓新酸活性提高4-12600倍。

进一步以液质联用方法对原人参二醇(PPD)、原人参三醇(PPT)的转化产物进行鉴定。色谱柱为月旭C18色谱柱，对于PPD检测条件为：梯度洗脱条件为0-30min，50％-100％乙腈(0.1％甲酸)，流速1mL/min，紫外检测波长为203nm。质谱条件为正离子模式，ESI离子源。如图2所示，以原人参二醇为底物，UGT74AC1突变体M170对原人参二醇进行催化产生人参皂苷Rh₂(PPD-3-O-Glc)，其分子量为623.4498[M+H]⁺，符合预期。其他突变体反应产物液相检测其出峰时间和质谱检测其分子量与M170一致。

对于PPT检测条件为：梯度洗脱条件为0-25min，25％-85％乙腈(0.1％甲酸),25-45min，85％乙腈(0.1％甲酸)，流速1mL/min，紫外检测波长为203nm。质谱条件为正离子模式，ESI离子源。如图3所示，以原人参三醇为底物，UGT74AC1突变体M170对原人参三醇(PPT)进行催化产生原人参三醇单糖基化产物(PPT-3-O-Glc)的分子量639.4457[M+H]⁺，符合预期。其他突变体反应产物液相检测其出峰时间和质谱检测其分子量与M170一致。

实施例7糖基转移酶突变体对五环三萜类化合物(甘草次酸)的糖基化反应

糖基化反应的体系：Tris·HCl(pH＝8.0)，0.2mM的甘草次酸，1mM的UDP-葡萄糖，10mM MgCl₂，5μL粗酶液，40℃反应30分钟。糖基化反应结束后，加入等体积甲醇终止反应，利用液相与质谱进行测定。色谱柱为月旭C18色谱柱，对于甘草次酸检测条件为：梯度洗脱条件为0-25min，25％-85％乙腈(0.1％甲酸),25-40min，85％乙腈(0.1％甲酸)，流速1mL/min，紫外检测波长为250nm。质谱条件为正离子模式，ESI离子源。如图4所示，以甘草次酸为底物，选择活性较高的UGT74AC1突变体M48对甘草次酸进行催化产生甘草次酸单糖基化产物(甘草次酸-3-O-Glc，分子量633.4020[M+H]⁺；甘草次酸-30-O-Glc，分子量633.402008[M+H]⁺)以及双糖基化产物(甘草次酸-3，30-O-2Glc)，分子量795.4531[M+H]⁺。以甘草次酸为底物，选择活性较高的UGT74AC1突变体M48和M170对甘草次酸进行催化产生甘草次酸单糖基化产物以及双糖基化产物，结果显示，相较于野生型，突变体对甘草次酸的活性是野生型的300-850倍左右。

实施例8利用糖基转移酶突变体对黄酮类化合物(山奈酚)的糖基化反应糖基化反应的体系：Tris·HCl(pH＝8.0)，0.2mM的山奈酚，1mM的UDP-葡萄糖，10mM MgCl₂，5μL粗酶液，40℃反应30分钟。糖基化反应结束后，加入等体积甲醇终止反应，利用液相与质谱进行测定。色谱柱为月旭C18色谱柱，对于山奈酚检测条件为：梯度洗脱条件为0-25min，25％-85％乙腈(0.1％甲酸)，流速1mL/min，紫外检测波长为254nm。质谱条件为正离子模式，ESI离子源。如图5所示，以山奈酚为底物，选择活性较高的UGT74AC1突变体M48对山奈酚进行催化产生山奈酚单糖基化产物(山奈酚-7-O-Glc)的分子量449.1075[M+H]⁺。以山奈酚为底物，选择活性较高的UGT74AC1突变体M48和M170对山奈酚进行催化产生山奈酚单糖基化产物，结果显示，相较于野生型，突变体对山奈酚的活性是野生型的16-63倍左右。

实施例9利用糖基转移酶突变体以罗汉果醇为底物,以UDP-半乳糖为糖基供体转化合成罗汉果甜苷

经过组合突变，获得具有8个位点突变的糖基转移酶UGT74AC1突变体，其活性较野生型显著提升。挑选相对活性较高的突变体M170，以罗汉果醇为底物进行转化实验，糖基化反应的体系如下：Tris·HCl(pH＝8.0)，0.2mM的罗汉果醇，1mM的UDP-半乳糖，10mM MgCl₂，10uL粗酶液，40℃反应30分钟。糖基化反应结束后，加入等体积甲醇终止反应，利用液相与质谱进行测定。色谱柱为月旭C18色谱柱，对于罗汉果醇检测条件为：梯度洗脱条件为0-30min，25％-80％乙腈(0.1％甲酸)流速1mL/min，紫外检测波长为210nm。质谱条件为正离子模式，ESI离子源。如图6所示，以罗汉果醇为底物，UGT74AC1突变体能够催化罗汉果醇产生罗汉果醇-3-O-Gal，转化效率基本达到27.5％。通过液质联用对生成产物进行进一步的鉴定，可见该产物分子量为639.4467[M+H]⁺，与罗汉果-3-O-Gal的分子量一致。

实施例10利用糖基转移酶突变体以罗汉果醇为底物，以UDP-氮乙酰葡萄糖为糖基供体转化合成罗汉果甜苷

经过组合突变，获得具有8个位点突变的糖基转移酶UGT74AC1突变体，其活性较野生型显著提升。挑选相对活性较高的突变体M170，以罗汉果醇为底物进行转化实验，糖基化反应的体系如下：Tris·HCl(pH＝8.0)，0.2mM的罗汉果醇，1mM的UDP-氮乙酰葡萄糖(UDP-GlcNAc)，10mM MgCl₂，10uL粗酶液，40℃反应30分钟。糖基化反应结束后，加入等体积甲醇终止反应，利用液相与质谱进行测定。色谱柱为月旭C18色谱柱，对于罗汉果醇检测条件为：梯度洗脱条件为0-30min，25％-80％乙腈(0.1％甲酸)流速1mL/min，紫外检测波长为210nm。质谱条件为正离子模式，ESI离子源。如图7所示，以罗汉果醇为底物，UGT74AC1突变体能够催化罗汉果醇产生罗汉果醇-3-O-GlcNAc和罗汉果醇-3，24-O-2GlcNAc，转化效率基本达到100％。通过液质联用对生成产物进行进一步的鉴定，可见产物罗汉果醇-3，24-O-2GlcNAc分子量为883.5499[M+H]⁺，罗汉果醇-3-O-GlcNAc分子量为680.4735[M+H]⁺，分别与罗汉果醇-3，24-O-2GlcNAc和罗汉果-3-O-GlcNAc的分子量一致。

以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

桂林莱茵生物科技股份有限公司

<120> 一种催化活性提高的糖基转移酶突变体及其应用

<130> CPCN19110995

<141> 2019-10-28

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 454

<212> PRT

<213> 罗汉果

<400> 1

Met Glu Lys Gly Asp Thr His Ile Leu Val Phe Pro Phe Pro Ser Gln

1 5 10 15

Gly His Ile Asn Pro Leu Leu Gln Leu Ser Lys Arg Leu Ile Ala Lys

20 25 30

Gly Ile Lys Val Ser Leu Val Thr Thr Leu His Val Ser Asn His Leu

35 40 45

Gln Leu Gln Gly Ala Tyr Ser Asn Ser Val Lys Ile Glu Val Ile Ser

50 55 60

Asp Gly Ser Glu Asp Arg Leu Glu Thr Asp Thr Met Arg Gln Thr Leu

65 70 75 80

Asp Arg Phe Arg Gln Lys Met Thr Lys Asn Leu Glu Asp Phe Leu Gln

85 90 95

Lys Ala Met Val Ser Ser Asn Pro Pro Lys Phe Ile Leu Tyr Asp Ser

100 105 110

Thr Met Pro Trp Val Leu Glu Val Ala Lys Glu Phe Gly Leu Asp Arg

115 120 125

Ala Pro Phe Tyr Thr Gln Ser Cys Ala Leu Asn Ser Ile Asn Tyr His

130 135 140

Val Leu His Gly Gln Leu Lys Leu Pro Pro Glu Thr Pro Thr Ile Ser

145 150 155 160

Leu Pro Ser Met Pro Leu Leu Arg Pro Ser Asp Leu Pro Ala Tyr Asp

165 170 175

Phe Asp Pro Ala Ser Thr Asp Thr Ile Ile Asp Leu Leu Thr Ser Gln

180 185 190

Tyr Ser Asn Ile Gln Asp Ala Asn Leu Leu Phe Cys Asn Thr Phe Asp

195 200 205

Lys Leu Glu Gly Glu Ile Ile Gln Trp Met Glu Thr Leu Gly Arg Pro

210 215 220

Val Lys Thr Val Gly Pro Thr Val Pro Ser Ala Tyr Leu Asp Lys Arg

225 230 235 240

Val Glu Asn Asp Lys His Tyr Gly Leu Ser Leu Phe Lys Pro Asn Glu

245 250 255

Asp Val Cys Leu Lys Trp Leu Asp Ser Lys Pro Ser Gly Ser Val Leu

260 265 270

Tyr Val Ser Tyr Gly Ser Leu Val Glu Met Gly Glu Glu Gln Leu Lys

275 280 285

Glu Leu Ala Leu Gly Ile Lys Glu Thr Gly Lys Phe Phe Leu Trp Val

290 295 300

Val Arg Asp Thr Glu Ala Glu Lys Leu Pro Pro Asn Phe Val Glu Ser

305 310 315 320

Val Ala Glu Lys Gly Leu Val Val Ser Trp Cys Ser Gln Leu Glu Val

325 330 335

Leu Ala His Pro Ser Val Gly Cys Phe Phe Thr His Cys Gly Trp Asn

340 345 350

Ser Thr Leu Glu Ala Leu Cys Leu Gly Val Pro Val Val Ala Phe Pro

355 360 365

Gln Trp Ala Asp Gln Val Thr Asn Ala Lys Phe Leu Glu Asp Val Trp

370 375 380

Lys Val Gly Lys Arg Val Lys Arg Asn Glu Gln Arg Leu Ala Ser Lys

385 390 395 400

Glu Glu Val Arg Ser Cys Ile Trp Glu Val Met Glu Gly Glu Arg Ala

405 410 415

Ser Glu Phe Lys Ser Asn Ser Met Glu Trp Lys Lys Trp Ala Lys Glu

420 425 430

Ala Val Asp Glu Gly Gly Ser Ser Asp Lys Asn Ile Glu Glu Phe Val

435 440 445

Ala Met Leu Lys Gln Thr

450

Claims

1.一种糖基转移酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列是以SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列为参考序列，在对应于SEQ ID NO:1的S15、R28、H47、L48、M76、T79、L109、或F203位中的至少一个位置的氨基酸残基发生突变；或者所述糖基转移酶突变体的氨基酸序列具有所述发生突变的氨基酸序列中的所述突变位点，且与所述发生突变的氨基酸序列具有80％以上同源性、具有糖基转移酶活性的功能性片段，优选具有90％以上、95％以上或98％以上的同源性。

2.根据权利要求1所述的糖基转移酶突变体，所述突变是指在所述位点的氨基酸残基被小位阻氨基酸或疏水性氨基酸中的一种取代，例如被丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、苏氨酸、亮氨酸或异亮氨酸中的至少一种取代。

3.根据权利要求1或2所述的糖基转移酶突变体，所述糖基转移酶突变体包括对应于SEQ ID NO:1，发生如下位点的取代：S15K、S15A、S15Y、S15V、S15H、R28P、R28K、R28H、R28A、H47Y、H47R、H47K、H47F、L48I、L48M、L48V、L48A、L48T、M76I、M76L、M76A、M76S、T79F、T79Y、T79W、T79C、L109I、L109G、L109V、L109A、L109T、F203 I、F203L、F203Y、F203A中的任一种或二种以上的组合。

4.根据权利要求3所述的糖基转移酶突变体，所述糖基转移酶突变体包括在对应于SEQID NO:1的L109位点的突变；例如L109突变为异亮氨酸I、甘氨酸G、缬氨酸V、丙氨酸A或苏氨酸T中的任一种。

5.根据权利要求4所述的糖基转移酶突变体，所述糖基转移酶突变体还包括至少其他七个位点的突变，所述其他七个位点是对应于SEQ ID NO:1的任意其他七个位点。

6.根据权利要求4或5所述的糖基转移酶突变体，所述其他七个位点包括S15、R28、H47、L48、M76、T79和F203中的任一个或多个位点；优选，所述其他七个位点的突变选自如下突变或者其多个不同位点的组合：对应于SEQ ID NO:1的S15K、S15A、S15Y、S15V、S15H、R28P、R28K、R28H、R28A、H47Y、H47R、H47K、H47F、L48I、L48M、L48V、L48A、L48T、M76I、M76L、M76A、M76S、T79F、T79Y、T79W、T79C、F203 I、F203L、F203Y、F203A。

7.根据权利要求3所述的糖基转移酶突变体，所述糖基转移酶突变体包括在对应于SEQID NO:1的F203位点的突变；例如F203突变为异亮氨酸I、亮氨酸L、酪氨酸Y或丙氨酸A中的任一种。

8.根据权利要求7所述的糖基转移酶突变体，所述糖基转移酶突变体还可以包括至少其他七个位点的突变，所述其他七个位点是对应于SEQ ID NO:1的任意其他七个位点。

9.根据权利要求7或8所述的糖基转移酶突变体，所述其他七个位点包括S15、R28、H47、L48、M76、T79和L109中的任一个或多个位点，优选，所述其他七个位点的突变选自如下突变或者其多个不同位点的组合：对应于SEQ ID NO:1的：S15K、S15A、S15Y、S15V、S15H、R28P、R28K、R28H、R28A、H47Y、H47R、H47K、H47F、L48I、L48M、L48V、L48A、L48T、M76I、M76L、M76A、M76S、T79F、T79Y、T79W、T79C、L109I、L109G、L109V、L109A、L109T。

10.根据权利要求1-9任一项所述的糖基转移酶突变体，所述糖基转移酶突变体至少同时包括对应于SEQ ID NO:1的第109位亮氨酸和第203位苯丙氨酸的突变，例如位于第109位的氨基亮氨酸L突变为异亮氨酸I、甘氨酸G、缬氨酸V、丙氨酸A或苏氨酸T中的任一种，同时第203位氨基酸突变为异亮氨酸I、亮氨酸L、酪氨酸Y或丙氨酸A中的任一种；优选地，所述糖基转移酶突变体包括第109位和第203位同时突变为异亮氨酸I；优选地，所述糖基转移酶突变体还进一步包括第15、28、47、48、76、79位中的至少一个位点的突变。

11.根据权利要求10所述的糖基转移酶突变体，所述糖基转移酶突变体包括对应于SEQID NO:1的第109位亮氨酸L和第203位苯丙氨酸F同时突变为异亮氨酸I，并且在对应于SEQID NO:1的S15、R28、H47、L48、M76、T79位点同时发生突变；优选，所述糖基转移酶突变体包括如下位点的突变：对应于SEQ ID NO:1的S15K、R28H、H47Y、L48V、M76I、T79F、L109I、F203I。

12.编码权利要求1-11任一项所述糖基转移酶突变体的核酸序列，所述核酸序列可以根据所述糖基转移酶突变体的氨基酸序列得到。

13.包含权利要求12所述核酸序列的表达盒或表达载体。

14.包含权利要求13所述的表达盒或表达载体的转化体。

15.权利要求1-11任一项所述糖基转移酶突变体或权利要求14所述的转化体的应用，用于催化来自糖基供体的糖基转移至糖基受体发生糖基化反应；优选，所述糖基受体包括萜类化合物、黄酮类化合物。

16.根据权利要求15所述的用途，所述糖基受体选自四环三萜类化合物、五环三萜类化合物、黄酮类化合物；

优选地，所述突变体催化如下任一种或多种糖基化反应：

(1)催化四环三萜类化合物的C3和/或C24位羟基糖基化反应；

(2)催化四环三萜类化合物的C2羟基糖基化反应；

(3)催化五环三萜类化合物的C3和/或C30位的羟基糖基化反应；

(4)催化酮类化合物的羟基糖基化反应，黄酮类化合物种类不同糖基化位点不同，例如，催化山奈酚C7位糖基化。

17.根据权利要求15或16所述的用途，所述糖基受体选自原人参二醇、原人参三醇、罗汉果醇、灵芝酸I、灵芝酸C2、灵芝酸G、赤芝酸LM1、赤芝酸C、泻根甜苷元、松苓新酸、山奈酚、白杨素、芹菜素、橙皮素、柚皮素、水飞蓟宾、芒柄花素、染料木素、鹰嘴豆芽素中的任一种；优选地，所述糖基供体选自UDP-葡萄糖，ADP-葡萄糖，TDP-葡萄糖，CDP-葡萄糖，GDP-葡萄糖，UDP-半乳糖醛酸，ADP-半乳糖醛酸，TDP-半乳糖醛酸，CDP-半乳糖醛酸，GDP-半乳糖醛酸，UDP-半乳糖，ADP-半乳糖，TDP-半乳糖，CDP-半乳糖，GDP-半乳糖，UDP-阿拉伯糖，ADP-阿拉伯糖，TDP-阿拉伯糖，CDP-阿拉伯糖，GDP-阿拉伯糖，UDP-鼠李糖，ADP-鼠李糖，TDP-鼠李糖，CDP-鼠李糖，GDP-鼠李糖，UDP-氮乙酰葡萄糖，ADP-氮乙酰葡萄糖，TDP-氮乙酰葡萄糖，CDP-氮乙酰葡萄糖，或其他核苷二磷酸己糖或核苷二磷酸戊糖中的任一种或多种；优选地，所述突变体用于催化罗汉果醇制备罗汉果甜苷，或用于催化原人参二醇制备Rh2。

18.根据权利要求15-17任一项所述的应用，包括：在糖基化反应体系中加入所述的糖基转移酶突变体，所述糖基转移酶突变体与所述糖基化反应体系中的糖基受体、糖基供体接触，使其进行糖基化反应；或者在糖基化反应体系中加入所述转化体，进行培养，使所述转化体产生所述糖基转移酶突变体，与所述糖基化反应体系中的糖基受体、糖基供体接触，使其进行糖基化反应。