CN112759588B

CN112759588B - 苯并五元杂环胺类衍生物及其用途

Info

Publication number: CN112759588B
Application number: CN202011125020.3A
Authority: CN
Inventors: 王永辉; 陈纪安; 田金龙; 谢琼; 黄瑾; 刘泽慧
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2019-10-21
Filing date: 2020-10-20
Publication date: 2023-01-31
Anticipated expiration: 2040-10-20
Also published as: CN112759588A

Abstract

本发明涉及一种苯并五元杂环胺类衍生物及其用途。所述化合物具有如下式I的结构，这些化合物具有RORγt调节活性和/或DHODH调节活性，尤其是抑制活性，有望用于制备预防或治疗与RORγt和/或DHODH有关的疾病的药物。

Description

苯并五元杂环胺类衍生物及其用途

技术领域

本发明属于化学医药技术领域，涉及一种苯并五元杂环胺类化合物及其衍生物，及其制备方法和用途。这些化合物具有RORγt调节活性和/或DHODH调节活性，尤其是抑制活性，有望用于制备预防或治疗与RORγt和/或DHODH有关的疾病的药物。

背景技术

视黄酸受体相关孤儿受体(retinoic acid receptor-related orphanreceptor，ROR)，作为核受体超家族的一员，可分为三种亚型：RORα(NR1F1)、RORβ(NR1F2)和RORγ(NR1F3)。这三种亚型在不同种属之间具有显著的序列同源性和保守性，同时每一种ROR又可细分为多种亚型，这些亚型之间仅在受体的氨基末端区域有所不同。每种ROR具有独自的组织分布，并调节各种生理过程。其中，RORα广泛分布于脂肪组织、肝脏、皮肤、肾脏、骨骼肌、肺、胸腺和脑中；RORβ分布则比较局限，主要在中枢神经系统中表达；RORγ具有两种亚型：RORγ1和RORγ2(也称为RORγt)，RORγ1主要在肝脏、骨骼肌、脂肪组织和肾脏中表达，而RORγt仅在免疫组织中高表达，如胸腺中。

Littman等最早报道RORγt对于初始CD4+T细胞分化成辅助T细胞17(T helper 17cells，Th17)细胞是必需的。在抗原刺激的Thp细胞向Th17细胞分化过程中，在白介素-6(interleukin-6,IL-6)、白介素-21(interleukin-21,IL-21)和转录生长因子-β(transforming growth factor-beta,TGF-β)等细胞因子作用下诱导表达RORγt。从RORγt缺陷小鼠中分离出来的Thp细胞显示出向Th17细胞株分化的能力显著降低。这些结果表明，RORγt是Th17细胞分化和炎症细胞因子白介素-17(interleukin-17,IL-17)的关键调节因子，而Th17细胞和其分泌的IL-17在银屑病等疾病的发生和发展中起着关键作用。

Th17细胞是辅助性T细胞的一种，会产生IL-17及其他促炎性细胞因子。Th17细胞在许多小鼠自身免疫性疾病模型中均发挥了关键的作用，如实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)和胶原诱导性关节炎(CIA)动物模型。此外，在一些人类自身免疫性疾病包括类风湿性关节炎(RA)、多发性硬化(MS)、银屑病(Psoriasis)和炎症性肠病(IBD)中，均能检测到IL-17水平的提高。自身免疫性疾病病人的组织和外周血液样本中所发现的Th17细胞数量均增多。因此，Th17细胞或其产生的细胞因子IL-17与炎症及自身免疫性疾病的发病机制有紧密联系。

二氢乳清酸脱氢酶(Dihydroorotate dehydrogenase，DHODH)是嘧啶从头合成途径的关键限速酶，抑制DHODH会导致细胞中嘧啶核苷酸从头合成途径受阻，从而影响免疫细胞和癌细胞的过度增殖。众所周知，DHODH抑制剂具有免疫调节活性，在T细胞上最明显，而T辅助(Th)1和Th17细胞是自身免疫性疾病发生发展过程中的重要促成因素。因此，DHODH被认为是自身免疫性疾病和癌症等的理想治疗靶点。对于大多数生物来说，嘧啶碱基可以通过从头合成与补救合成两种途径得到。对于人体内静息的淋巴细胞，补救合成途径获得的嘧啶足以满足其代谢需求，但免疫激活的淋巴细胞和癌细胞对于嘧啶碱基的需求通过补救合成通路不足以满足，必须启动从头合成途径来满足其生理需求。在免疫激活的淋巴细胞中DHODH抑制导致的代谢应激，进一步导致促炎性细胞因子释放减少，包括IL-17(IL-17A和IL-17F)和干扰素(IFN)-γ，并导致淋巴细胞凋亡增加。因此，DHODH抑制剂可以抑制免疫激活的淋巴细胞和肿瘤细胞的DNA或RNA合成，从而有效减少它们的数量，用来抗肿瘤以及治疗自身免疫性疾病；DHODH对于促炎性细胞因子释放的抑制作用也可以用于治疗自身免疫性疾病。

2015年1月，由诺华公司开发的通过特异性阻断IL-17治疗银屑病的单克隆抗体Cosentyx(Secukinumab/AIN457)，已获FDA批准上市，这是治疗银屑病类药物市场中首个作用于IL-17的药物。这也强调了IL-17信号通路在炎性疾病中的重要性，并且展示了通过RORγt抑制剂影响IL-17信号通路而治疗炎性疾病的潜在可能性。因此，RORγt可作为治疗自身免疫性疾病药物的新靶点，寻找RORγt小分子调节剂并将其用于RORγt介导的炎症和自身免疫性疾病的治疗将具有重要意义。CN107257791A、CN108026039A、CN108026050A、CN108064224A、CN108863850A等公开了RORγt小分子调节剂。

一般而言，DHODH的抑制剂显示出有益的免疫抑制和抗增殖活性，对T细胞最显著。布喹那(Brequinar)和来氟米特(Leflunomide)是已经在临床上研究的DHODH小分子抑制剂的两个实例。后者用于治疗难以用甲氨蝶呤治疗的类风湿性关节炎。已经公开了各种DHODH抑制剂用于治疗或预防自身免疫性疾病、免疫和炎症性疾病、破坏性骨病、恶性肿瘤疾病、血管生成相关疾病、病毒性疾病和感染性疾病。例如W02009137081、W02009133379、W02009021696、W02009082691、W02009029473、W02009153043、US2009209557、US2009062318、US2009082374、W02008097180、W02008077639、US2008027079、US2007299114、US2007027193、US2007224672、W02007149211、JP2007015952、W02006044741、W02006001961、W02006051937、W02006038606、W02006022442、US2006199856、W02005075410、US7074831、W02004056797。

RORγt是Th17细胞的关键调节因子，抑制RORγt，减少Th17细胞分化，减少促炎性细胞因子IL-17的生成；DHODH是嘧啶从头合成限速酶，抑制DHODH，可减少嘧啶核苷酸存量，引发代谢抑制，减少IL-17的生成。因此寻找RORγt/DHDOH双靶点小分子调节剂并将其用于预防或治疗自身免疫性疾病、免疫和炎症性疾病、破坏性骨病、血液性癌症、恶性肿瘤疾病、血管生成相关疾病、病毒性疾病和感染性疾病具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种结构新颖的RORγt/DHDOH双靶点小分子调节剂，用于制备预防或治疗与RORγt和/或DHODH有关的疾病的药物。

本发明一方面提供如下式I的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物

其中：

连接基团A为

X₁、X₂、X₃、X₄独立地选自C-R₁、C-R₂、C-R₃、C-R₄、和N；Y为O、S或者N R₁₁；

U为C-R₁₂或者N；

W为(C R₁₃R₁₄)_n或者NR₁₅，n为1或2；

当连接基团A以单键形式连接至Z，Z为CR₁₆或N；当连接基团A以双键形式连接至Z，Z为C且R₉为空；

R₁、R₂、R₃、R₄、R₁₆独立地选自H、卤素、氰基、C_l-C₈烷基和C_l-C₈烷氧基；

R₅、R₆、R₇、R₈、R₉独立地选自H、卤素、和C_l-C₈烷基；

R₁₀为C_l-C₈烷基、C₃-C₈环烷基、或者C₃-C₈杂环烷基；

R₁₂为H、卤素、氰基或者C_l-C₈烷基；

R₁₁、R₁₃、R₁₄、R₁₅独立地选自H和C_l-C₈烷基；

R₁₇、R₁₈独立地选自H、C₁-C₈烷基、C₃-C₈环烷基，或者R₁₇和R₁₈桥接并和酰胺中的氮原子一起形成三元至七元含氮杂环。

优选地，Y为O或者S。

本发明中所述连接基团A可以是

在一个较佳的实施方式中，连接基团A为

R₆为H、卤素、-CH₃或者-CF₃，R₇、R₈为H。更优选地，R₁₂为F、Cl、Br，尤其优选Cl。

在上述较佳的实施方式中，优选提供下述化合物：

在又一个较佳地实施方式中，连接基团A可为

R₆为-CH₃或者-CF₃，R₁₅为-CH₃。

在上述较佳的实施方式中，优选提供下述化合物：

另一方面，本发明提供一种药物组合物，包括上述化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，以及药学上可接受的载体。

再一方面，本发明提供一种上述化合物在制备预防或治疗与RORγt和/或DHODH有关的疾病的药物中的用途，所述疾病例如选自自身免疫性疾病、免疫和炎症性疾病、破坏性骨病、血液性癌症、恶性肿瘤疾病、血管生成相关疾病、病毒性疾病和感染性疾病。

所述自身免疫性疾病例如选自多发性硬化、类风湿关节炎、银屑病和炎症性肠病，所述免疫和炎症性疾病例如选自脑脊髓炎、克隆疾病和哮喘，所述血液性癌症选自骨髓瘤、淋巴瘤、白血病(急性髓性白血病、急性淋巴母细胞性白血病、慢性骨髓白血病、慢性淋巴球性白血病)、慢性骨髓增生性疾病、意义未明单克隆免疫球蛋白血症、骨髓发育不良症候群、血浆交换淀粉样变性和浆细胞瘤，所述恶性肿瘤疾病选自前列腺癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌、直肠癌、胰腺癌、卵巢癌、宫颈癌、睾丸癌、膀胱癌、胃癌、皮肤癌、甲状腺癌、肾癌、食道癌、肝癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌和腺癌等。

具体实施方式

本发明提供一种结构新颖的RORγt小分子调节剂，其具有如下结构通式I：

其中：

连接基团A为

例如可为

X₁、X₂、X₃、X₄独立地选自C-R₁、C-R₂、C-R₃、C-R₄、和N；Y可为O、S或者N R₁₁；

U可为C-R₁₂或者N；

W可为(C R₁₃R₁₄)_n或者NR₁₅，n为1或2；

R₁、R₂、R₃、R₄、R₁₆可独立地选自H、卤素、氰基、C_l-C₈烷基和C_l-C₈烷氧基；

R₅、R₆、R₇、R₈、R₉可独立地选自H、卤素、和C_l-C₈烷基；

R₁₀为C_l-C₈烷基、C₃-C₈环烷基、或者C₃-C₈杂环烷基；

R₁₂可为H、卤素、氰基或者C_l-C₈烷基；

R₁₁、R₁₃、R₁₄、R₁₅可独立地选自H和C_l-C₈烷基；

本发明提供的化合物可以通过下述合成方案1合成：

反应条件：a)氯乙酰氯、N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)、CH₂Cl₂、室温；b)KOH、DMF、室温。

1)式1-1所示胺类化合物与氯乙酰氯反应得到式1-2所示化合物；

2)式1-2所示化合物与杂环巯基类化合物1-3，在氢氧化钾和DMF体系中反应得到目标化合物1-4。

又，在一个较佳的实施方式中，连接基团A为

Z为N。R₆可为H、卤素、-CH₃或者-CF₃，R₅、R₇可为H、-CH₃、F或者Cl，R₈可为H，R₁₂可为H、F、Cl、Br，尤其优选Cl。对于这些化合物可参考下述合成方案2进行合成。

合成方案2：

反应条件：a)三乙酰氧基硼氢化钠(NaBH(OAc)₃)、CH₂Cl₂、0℃–室温；b)HCl/二氧六环、CH₂Cl₂、室温；R₁₀COCl、N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)、CH₂Cl₂、室温；c)Fe、HOAc、室温；d)氯乙酰氯、N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)、CH₂Cl₂、室温；e)KOH、DMF、室温。

1)式2-1所示醛类化合物在三乙酰氧基硼氢化钠作用下与胺发生还原胺化反应，得到式2-2所示Boc-保护的哌嗪类化合物；

2)式2-2所示化合物在盐酸二氧六环体系下脱去保护基，然后在碱性环境中与酰氯反应得到式2-3所示硝基化合物；

3)式2-3所示硝基化合物在铁粉/醋酸体系下发生硝基还原反应，得到式2-4所示胺类化合物；

4)式2-4所示胺类化合物与氯乙酰氯反应得到式2-5所示化合物；

5)式2-5所示化合物与杂环巯基类化合物2-6，在氢氧化钾和DMF体系中反应得到目标化合物2-7。

在又一个较佳地实施方式中，连接基团A可为

Z为CH。R₅可为H，R₆可为-CH₃或者-CF₃，R₁₅可为-CH₃。对于这些化合物可参考下述合成方案3进行合成。

合成方案3：

反应条件：a)K₂CO₃、Pd(PPh₃)₄、二甲基乙酰胺(DME)、EtOH；b)HCl/二氧六环、CH₂Cl₂；R₁₀COCl、N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)、CH₂Cl₂、室温；c)Fe、NH₄Cl、CH₃OH；H₂、Pd/C、CH₃OH、50℃；d)氯乙酰氯、三乙胺(TEA)、CH₂Cl₂；e)KOH、DMF、室温。

1)式3-1所示化合物在四三苯基膦钯作用下与Boc-哌啶类化合物反应得到式3-2所示化合物；

2)式3-2所示化合物在盐酸二氧六环条件下脱去Boc保护基，然后在碱性条件下与酰氯反应得到式3-3所示硝基化合物；

3)式3-3所示硝基化合物在铁粉和氯化铵体系下发生硝基还原反应，接着在钯碳氢气条件下发生双键还原反应得到式3-4所示胺类化合物；

4)式3-4所示胺类化合物与氯乙酰氯反应得到式3-5所示化合物；

5)式3-5所示化合物与杂环巯基类化合物3-6，在氢氧化钾和DMF体系中反应得到目标化合物3-7。

除非另有说明，上述合成方案中所述基团、术语的含义与通式I化合物中的含义相同。

上述合成方案只是列举了本发明中部分化合物的制备方法，参考本领域常用技术手段及参考现有技术，本领域技术人员在上述合成方案的基础上，可采用类似的方法合成本发明的化合物。

本发明所述的“化合物”，包括所有立体异构体、几何异构体、互变异构体和同位素。

本发明所述的“化合物”，可以是不对称的，例如，具有一个或多个立体异构体。除非另有说明，所有立体异构体都包括，如对映异构体和非对映异构体。本发明中含有不对称碳原子的化合物，可以光学活性纯的形式或外消旋形式被分离出来；光学活性纯的形式可以从外消旋混合物拆分，或通过使用手性原料或手性试剂合成。

本发明所述的“化合物”，还包括互变异构体形式；互变异构体形式来源于一个单键与相邻的双键交换并一起伴随一个质子的迁移。

本发明还包括所有同位素的原子，无论是在中间体或最后的化合物；同位素的原子包括具有相同的原子数、但不同质量数的，例如，氢的同位素包括氘和氚。又，如果需要的话，例如为了特别的治疗或者诊断治疗，本发明的化合物可以引入现有技术已知的同位素或放射性同位素、例如³H、¹⁵O、¹³C或¹³N同位素。

“药学上可接受的盐”是指药学上可接受的盐，保持其母体化合物的药理活性的同时改善理化性质或者代谢性质等。这类盐包括由药学上可接受的酸或碱(包括有机酸、无机酸、有机碱、无机碱)制备的酸加成盐和碱加成盐，或者两者混合物。在本发明中，合适的无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸，或类似的酸；合适的有机酸例如，乙酸、丙酸、己酸、环戊基丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、扁桃酸，甲磺酸，三氟甲磺酸，乙磺酸、1,2-乙二磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、水杨酸、硬脂酸、粘康酸，或其类似物。

根据本发明的化合物还可以以其溶剂化物形式存在。例如水合物(半水合物、一水合物、二水合物、三水合物等)。

本发明中，除特殊说明外，所用的术语具有如下含义。

术语“卤素”是指氟、氯、溴或碘，优选氟或氯。

术语“羟基”，指-OH。

术语“烷基”，指由碳原子和氢原子组成的直链或支链的饱和烃基团，如C₁-C₂₀烷基，优选为C₁-C₆烷基，例如甲基、乙基、丙基(包括正丙基和异丙基)、丁基(包括正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基)、戊基(包括正戊基、异戊基、新戊基)、正己基、2-甲基己基等；所述烷基可以是非取代的、或是被一个或多个取代基所取代，取代基包括但不限于烷基、烷氧基、氰基、羟基、羰基、羧基、芳基、杂芳基、氨基、卤素、磺酰基、亚磺酰基、磷酰基，例如C₁-C₆烷基包括-CF₃。

术语“环烷基”，指全部为碳的单环、稠合、螺环或桥环的环，如环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、螺[3.4]辛烷基、二环[3.1.1]己烷基。

术语“杂环烷基”，指含1个或多个N、O或S的杂原子的单环或稠合的环。典型地为含1个或多个N、O或S的杂原子的5-6元杂环基，例如哌嗪子基、吗啉代基、哌啶子基、吡咯烷基及其衍生物。

术语“芳基”，指具有完全共轭的π电子体系的全碳单环或稠合环，通常具有6-14个碳原子，优选具有6-12个碳原子，最优选具有6个碳原子。芳基可以是非取代的、或被一个或多个取代基所取代，取代基包括但不限于烷基、烷氧基、氰基、羟基、羰基、羧基、芳基、芳烷基、氨基、卤素、磺酰基、亚磺酰基、磷酰基。非取代的芳基的实例包括但不限于苯基、萘基和蒽基。

术语“杂芳基”是指5-12个环原子的单环或稠合环，其中含有1-4个选自N、O、S的环原子，其余环原子为C，且具有完全共轭的π-电子体系，包括但不限于吡咯基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、噁唑基、异噁唑基、吡唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、喹啉基、异喹啉基、三唑基、四氢吡咯基。杂芳基可以是非取代的或取代的，所述的取代基包括但不限于烷基、烷氧基、芳基、芳烷基、氨基、卤素、羟基、氰基、硝基、羰基和杂脂环基。

给药以及药物组合物

一般来说，本发明的化合物可以在有效量下，通过任何可接受的用于其他类似用途的给药方式进行给药。举例来说，本发明的化合物可以口服、非肠道给药、透皮给药、局部给药、直肠给药或鼻内给药。

当用作药物时，本发明的化合物通常以药物组合物的形式给药。这些组合物可用制药学领域熟知的方法进行制备，这些组合物包含至少一种活性化合物。在配制本发明提供的组合物时，有效成分通常与赋形剂混合，被赋形剂稀释或被以胶囊，小袋，纸或其他形式的容器包裹。当所述赋形剂作为稀释剂时，可以是固体，半固体，或液体物质，可作为有效成分的运载体、载体或媒介。由此，所述组合物可以是药片、药丸、粉末、锭剂、小袋、胶囊、酏剂、混悬剂、乳剂、溶液、糖浆、喷雾(作为固体或在液体介质里)，软膏，软和硬的明胶胶囊，栓剂，无菌注射溶液，和无菌包装粉末的形式。

一些典型的赋形剂包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、海藻酸盐、黄芪胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、无菌水、糖浆和甲基纤维素。另外还可以包括润滑剂(如滑石粉、硬脂酸镁和矿物油)、浸润剂、乳化和悬浊剂、防腐剂(如对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯)、甜味剂和增味剂。本发明的药物组合物可以通过具体赋形方式在对病人进行给药之后达到药物活性成分的快速、持续或延时释放，这也是本领域中广泛应用的方法。

活性成分，即本发明中的化合物，在药物构成和单位剂型中的数量可根据具体应用情况、特定化合物的活性和预期浓度进行改变或有较大调整。

“治疗”意味着对哺乳动物体内疾病的任何治疗，包括：(1)防止疾病，即造成临床疾病的症状不发展；(2)抑制疾病，即阻止临床症状的发展；(3)减轻疾病，即造成临床症状的消退。

实施例

以下结合具体实施例，对本发明的技术方案做进一步的描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。本发明提供的目标化合物制备方法中，柱层析色谱采用乳山太阳干燥剂有限公司生产的硅胶(200-300目)；薄层色谱采用GF254；核磁共振色谱(NMR)使用Varian-400核磁共振仪测定；液质连用(LC/MS)使用Agilent TechnologiESI 6120液质联用仪。此外，凡涉及易氧化或易水解的原料的所有操作都在氮气保护下进行。除非另有说明，本发明使用的原料都是市售原料，无需进一步纯化可以直接使用。

实施例一：化合物I-1至I-16、I-20至I-36合成通法(上述合成方案2)

步骤1：

取代苯甲醛2-1(1当量)，1-叔丁氧羰基哌嗪(1.1当量)，乙酸(1.1当量)溶于二氯甲烷中，室温搅拌反应1小时。然后加入三乙酰氧基硼氢化钠(3当量)，室温下过夜反应。TLC检测反应完全后，加入饱和NaHCO₃溶液淬灭反应，有机相用水和饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩得粗品2-2。

步骤2：

粗品2-2溶于二氯甲烷中，加入盐酸二氧六环溶液，室温反应过夜。弃去反应液上清液，残余物减压浓缩。浓缩所得残余物溶解在二氯甲烷和三乙胺(3当量)中，缓慢滴加环戊基甲酰氯(1.2当量)，室温反应过夜小时。TLC检测反应完全后，加入饱和NaHCO₃溶液淬灭反应，有机相用水和饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩得粗品2-3。

步骤3：

粗品2-3溶于甲醇中，加入二氧化铂(0.1当量)，氢气氛下反应过夜，TLC检测反应完全后，过滤，滤液减压浓缩得粗品2-4。

步骤4：

粗品2-4，三乙胺(3当量)溶于二氯甲烷中，缓慢滴加氯乙酰氯(1.5当量)，室温反应12小时。TLC检测反应完全后，加入甲醇淬灭反应，反应液减压浓缩，残余物过硅胶垫得粗品2-5。

步骤5：

粗品2-5，巯基苯并五元杂环类化合物(1.5当量)，氢氧化钾(4当量)加入DMF中，室温下搅拌反应过夜。TLC检测反应完全后，以乙酸乙酯稀释反应液，有机相用水和饱和氯化钠溶液洗涤，无水Na₂SO₄干燥，过滤，滤液减压浓缩，残余物经硅胶柱层析和反相中压制备系统纯化得到化合物I-1至I-16、I-20至I-36。

实施例二:

化合物I-1(S)-(4-(3-(苯并[d]噁唑-2-基氨基)-5-氯-2-甲基苄基)-2-甲基哌嗪-1-基)(环戊基)甲酮的制备

步骤1：(S)-4-(5-氯-2-甲基-3-硝基苄基)-2-甲基哌嗪-1-羧酸叔丁酯的制备

5-氯-2-甲基-3-硝基苯甲醛(1.86g,9.35mmol)，(S)-2-甲基哌嗪-1-羧酸叔丁酯(2.25g,11.22mmol)，乙酸(1.12g,18.7mmol)溶于二氯甲烷(40mL)中，室温搅拌反应1小时。然后加入三乙酰氧基硼氢化钠(2.97g,14.03mmol)，室温下过夜反应。加入饱和NaHCO₃溶液(10mL)淬灭反应，CH₂Cl₂层用水和饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，残余物经硅胶柱层析和反相中压制备系统纯化得到产物(2.9g)，产率80.8％。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ7.84(s,1H),7.60(s,1H),4.01(s,1H),3.60(d,J＝12.9Hz,1H),3.44(s,2H),2.87(t,J＝11.5Hz,1H),2.61(d,J＝11.0Hz,1H),2.49(d,J＝11.2Hz,1H),2.27(s,3H),2.07(m,1H),1.94–1.84(m,1H),1.31(s,9H),1.05(d,J＝6.7Hz,3H).MS(ESI)m/z:384.2[M+H]⁺。

步骤2：(S)-4-(5-氯-2-甲基-3-硝基苄基)-2-甲基哌嗪-1-基)(环戊基)甲酮的制备

(S)-4-(5-氯-2-甲基-3-硝基苄基)-2-甲基哌嗪-1-羧酸叔丁酯(2.9g,7.55mmol)溶于二氯甲烷(30mL)中，加入盐酸二氧六环溶液(4M,10mL)，室温反应4小时。弃去反应液上清液，残余物减压浓缩得粗品，直接投入下一步反应。MS(ESI)m/z:284.2[M+H]⁺。

将上一步得到的粗品中间体溶解在二氯甲烷(30mL)和三乙胺(3mL,22.65mmol)中，缓慢滴加环戊基甲酰氯(1.1mL，9.0mmol)，室温反应2小时。加入甲醇(1mL)淬灭反应，反应液减压浓缩，残余物经硅胶柱层析和反相中压制备系统纯化得到产物(2.68g，白色固体)，产率93.7％。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ7.92(d,J＝2.0Hz,1H),7.68(s,1H),4.54(s,0.5H),4.19(d,J＝10.5Hz,1H),3.75(d,J＝12.9Hz,0.5H),3.52(s,2H),3.19(t,J＝11.2Hz,1H),2.98–2.85(m,1H),2.71(d,J＝11.1Hz,1H),2.64–2.57(m,1H),2.35(s,3H),2.19–1.85(m,2H),1.76–1.45(m,8H),1.23-1.09(m,3H).MS(ESI)m/z:380.2[M+H]⁺。

步骤3：(S)-(4-(3-氨基-5-氯-2-甲基苄基)-2-甲基哌嗪-1-基)(环戊基)甲酮的制备

(S)-4-(5-氯-2-甲基-3-硝基苄基)-2-甲基哌嗪-1-基)(环戊基)甲酮(2.68g,7.07mmol)，铁粉(3.9g,70.7mmol)加入乙酸(40mL)中，室温搅拌过夜反应。过滤除去固体，滤液减压浓缩，残余物溶于二氯甲烷(50mL)中，用饱和碳酸氢钠溶液、水和饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩得到产物(2.1g)，产率85％。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ6.59(s,1H),6.46(s,1H),5.13(s,2H),4.52(s,1H),4.17(d,J＝10.4Hz,1H),3.72(d,J＝12.2Hz,1H),3.28(s,1H),3.14(t,J＝11.6Hz,1H),2.89(m,1H),2.79–2.64(m,1H),2.58(m,1H),1.98(m,3H),1.90–1.48(m,10H),1.14(m,3H).MS(ESI)m/z:350.2[M+H]⁺。

步骤4：(S)-2-氯-N-(5-氯-3-((4-(环戊烷羰基)-3-甲基哌嗪-1-基)甲基)-2-甲基苯基)乙酰胺的制备

(S)-(4-(3-氨基-5-氯-2-甲基苄基)-2-甲基哌嗪-1-基)(环戊基)甲酮(2.1g,6.02mmol)，三乙胺(2.5mL,18.06mmol)溶于二氯甲烷(20mL)中，缓慢滴加氯乙酰氯(718μL,9.02mmol)，室温反应2小时。加入甲醇(1mL)淬灭反应，反应液减压浓缩，残余物经硅胶柱层析纯化得到产物(2.3g，黄色固体)，产率89.8％。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.83(s,1H),7.39(s,1H),7.21(s,1H),4.53(m,1H),4.31(s,2H),4.19(m,1H),3.75(m,1H),3.23–3.11(m,1H),2.96–2.86(m,1H),2.73(m,1H),2.60(m,1H),2.18(s,3H),2.12–1.77(m,3H),1.75–1.42(m,8H),1.27–1.03(m,3H).MS(ESI)m/z:426.2[M+H]⁺。

步骤5：(S)-(4-(3-(苯并[d]噁唑-2-基氨基)-5-氯-2-甲基苄基)-2-甲基哌嗪-1-基)(环戊基)甲酮的制备

(S)-2-氯-N-(5-氯-3-((4-(环戊烷羰基)-3-甲基哌嗪-1-基)甲基)-2-甲基苯基)乙酰胺(150mg,0.35mmol)，2-巯基苯并噁唑(80.1mg,0.53mmol)，氢氧化钾(78.4mg,1.4mmol)加入DMF(5mL)中，室温下搅拌反应过夜。加入水(5mL)淬灭反应，用乙酸乙酯(10mL×3)萃取，有机相用水和饱和氯化钠溶液洗涤，无水Na₂SO₄干燥，过滤，滤液减压浓缩，残余物经硅胶柱层析和反相中压制备系统纯化得到目标化合物I-1(65mg)，产率39.9％。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.87(s,1H),7.94(s,1H),7.53–7.39(m,2H),7.27–7.02(m,3H),4.56(m,0.5H),4.22(m,1H),3.77(m,0.5H),3.45(s,2H),3.25–3.13(m,0.5H),2.92(m,1H),2.78(m,1.5H),2.64(m,1H),2.29(s,3H),2.16–1.94(m,2H),1.91–1.45(m,8H),1.17(m,3H).MS(ESI)m/z:467.2[M+H]⁺。

实施例三：

化合物I-2(S)-(4-(5-氯-2-甲基-3-((5-甲基苯并[d]噁唑-2-基)氨基)苄基)-2-甲基哌嗪-1-基)(环戊基)甲酮的制备

参照实施例二化合物I-1的合成路线。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.81(s,1H),7.93(s,1H),7.34(d,J＝7.5Hz,1H),7.22(s,1H),7.16(s,1H),6.92(d,J＝8.0Hz,1H),4.55(s,0.5H),4.22(m,1H),3.76(m,0.5H),3.44(s,2H),3.19(m,0.5H),2.92(m,1H),2.76(m,1.5H),2.64(m,1H),2.36(s,3H),2.28(s,3H),2.04(m,2H),1.75(m,8H),1.18(m,3H).MS(ESI)m/z:481.2[M+H]⁺。

实施例四：

化合物I-3(S)-(4-(5-氯-3-((5-甲氧基苯并[d]噁唑-2-基)氨基)-2-甲基苄基)-2-甲基哌嗪-1-基)(环戊基)甲酮的制备

参照实施例二化合物I-1的合成路线。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.82(s,1H),7.94(s,1H),7.35(d,J＝5.2Hz,1H),7.15(s,1H),7.03(s,1H),6.67(s,1H),4.55(m,0.5H),4.20(m,1H),3.75(m,3.5H),3.44(s,2H),3.25–3.09(m,0.5H),2.92(m,1H),2.75(m,1.5H),2.63(m,1H),2.28(s,3H),2.17–1.92(m,2H),1.89–1.46(m,8H),1.17(m,3H).MS(ESI)m/z:497.2[M+H]⁺。

实施例五：

化合物I-4(S)-(4-(5-氯-3-((5-氟苯并[d]噁唑-2-基)氨基)-2-甲基苄基)-2-甲基哌嗪-1-基)(环戊基)甲酮的制备

参照实施例二化合物I-1的合成路线。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.01(s,1H),7.85(s,1H),7.48(d,J＝4.2Hz,1H),7.27(d,J＝9.2Hz,1H),7.18(s,1H),6.91(t,J＝9.3Hz,1H),4.55(m,0.5H),4.21(m,1H),3.75(m,0.5H),3.43(s,2H),3.18(m,1H),2.91(m,1H),2.76(m,1H),2.62(m,1H),2.27(s,3H),2.16–1.91(m,1H),1.89–1.77(m,1H),1.63(m,8H),1.17(m,3H).MS(ESI)m/z:485.2[M+H]⁺。

实施例六：

化合物I-5(S)-(4-(5-氯-3-((5-氯苯并[d]噁唑-2-基)氨基)-2-甲基苄基)-2-甲基哌嗪-1-基)(环戊基)甲酮的制备

参照实施例二化合物I-1的合成路线。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.06(s,1H),7.82(s,1H),7.48(d,J＝8.8Hz,2H),7.18(s,1H),7.12(m,1H),4.54(m,0.5H),4.20(m,1H),3.75(m,0.5H),3.43(s,2H),3.18(m,0.5H),2.89(m,1H),2.76(m,1.5H),2.62(m,1H),2.26(s,3H),2.17–1.92(m,2H),1.91–1.43(m,8H),1.16(m,3H).MS(ESI)m/z:501.2[M+H]⁺。

实施例七：

化合物I-6(S)-2-((5-氯-3-((4-(环戊烷羰基)-3-甲基哌嗪-1-基)甲基)-2-甲基苯基)氨基)苯并[d]噁唑-5-甲腈的制备

参照实施例二化合物I-1的合成路线。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.27(s,1H),7.90(s,1H),7.83(s,1H),7.70(d,J＝8.2Hz,1H),7.60(d,J＝8.1Hz,1H),7.23(s,1H),4.56(m,0.5H),4.22(d,J＝10.4Hz,1H),3.77(d,J＝12.3Hz,0.5H),3.46(s,2H),3.20(t,J＝11.5Hz,0.5H),2.93(m,1H),2.76(m,1.5H),2.64(m,1H),2.29(s,3H),2.19–1.93(m,2H),1.93–1.46(m,8H),1.29–1.06(m,3H).MS(ESI)m/z:492.2[M+H]⁺。

实施例八：

化合物I-7(S)-(4-(5-氯-2-甲基-3-((5-(三氟甲基)苯并[d]噁唑-2-基)氨基)苄基)-2-甲基哌嗪-1-基)(环戊基)甲酮的制备

参照实施例二化合物I-1的合成路线。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.18(s,1H),7.85(s,1H),7.76(s,1H),7.69(d,J＝8.0Hz,1H),7.48(d,J＝7.9Hz,1H),7.22(s,1H),4.56(m,0.5H),4.21(m,1H),3.77(m,0.5H),3.46(s,2H),3.27–3.11(m,0.5H),2.93(m,1H),2.75(m,1.5H),2.63(m,1H),2.29(s,3H),2.17–1.92(m,2H),1.94–1.43(m,8H),1.32–1.05(m,3H).MS(ESI)m/z:535.2[M+H]⁺。

实施例九：

化合物I-8(S)-(4-(5-氯-3-((6-氟苯并[d]噁唑-2-基)氨基)-2-甲基苄基)-2-甲基哌嗪-1-基)(环戊基)甲酮的制备

参照实施例二化合物I-1的合成路线。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.91(s,1H),7.91(s,1H),7.52(d,J＝8.0Hz,1H),7.40(m,1H),7.17(s,1H),7.07(t,J＝9.3Hz,1H),4.56(m,0.5H),4.21(m,1H),3.77(m,0.5H),3.44(s,2H),3.19(m,0.5H),2.92(m,1H),2.75(m,1.5H),2.63(m,1H),2.28(s,3H),2.16–1.93(m,2H),1.92–1.42(m,8H),1.17(m,3H).MS(ESI)m/z:485.2[M+H]⁺。

实施例十：

化合物I-9(S)-(4-(5-氯-3-((6-氯苯并[d]噁唑-2-基)氨基)-2-甲基苄基)-2-甲基哌嗪-1-基)(环戊基)甲酮的制备

参照实施例二化合物I-1的合成路线。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.00(s,1H),7.86(s,1H),7.66(s,1H),7.38(d,J＝8.5Hz,1H),7.23(m,1H),7.16(s,1H),4.53(m,0.5H),4.20(m,1H),3.74(m,0.5H),3.42(s,2H),3.17(m,0.5H),2.90(d,J＝7.2Hz,1H),2.80–2.68(m,1.5H),2.63–2.55(m,1H),2.26(s,3H),2.13–1.89(m,2H),1.89–1.42(m,8H),1.16(m,3H).MS(ESI)m/z:501.2[M+H]⁺。

实施例十一：

化合物I-10(S)-(4-(5-氯-3-((4-氟苯并[d]噁唑-2-基)氨基)-2-甲基苄基)-2-甲基哌嗪-1-基)(环戊基)甲酮的制备

参照实施例二化合物I-1的合成路线。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.07(s,1H),7.84(s,1H),7.35(s,1H),7.21(s,1H),7.10(d,J＝7.5Hz,2H),4.54(s,0.5H),4.21(m,1H),3.75(m,0.5H),3.45(s,2H),3.21(m,0.5H),2.92(m,1H),2.77(m,1.5H),2.62(m,1H),2.28(s,3H),2.18–1.94(m,2H),1.75(m,8H),1.17(m,3H).MS(ESI)m/z:485.2[M+H]⁺。

实施例十二：

化合物I-11(S)-(4-(5-氯-2-甲基-3-(噁唑并[4,5-b]吡啶-2-基氨基)苄基)-2-甲基哌嗪-1-基)(环戊基)甲酮的制备

参照实施例二化合物I-1的合成路线。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.30(s,1H),8.20(d,J＝4.7Hz,1H),7.84(s,2H),7.24(s,1H),7.14–7.01(m,1H),4.56(m,0.5H),4.21(m,1H),3.77(m,0.5H),3.46(s,2H),3.20(m,0.5H),2.97–2.88(m,1H),2.76(m,1.5H),2.64(m,1H),2.29(s,3H),2.18–1.93(m,2H),1.92–1.45(m,8H),1.11(m,3H).MS(ESI)m/z:468.2[M+H]⁺。

实施例十三：

化合物I-12(S)-(4-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-氯-2-甲基苄基)-2-甲基哌嗪-1-基)(环戊基)甲酮的制备

参照实施例二化合物I-1的合成路线。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.80(s,1H),8.00(s,1H),7.79(d,J＝7.5Hz,1H),7.53(d,J＝6.9Hz,1H),7.31(t,J＝7.7Hz,1H),7.19–7.05(m,2H),4.57(m,0.5H),4.22(m,1H),3.77(m,0.5H),3.46(s,2H),3.21(m,1H),2.91(m,1H),2.77(m,1H),2.64(m,1H),2.29(s,3H),2.16–1.93(m,1H),1.92–1.43(m,9H),1.26(m,3H).MS(ESI)m/z:483.2[M+H]⁺。

实施例十四：

化合物I-13(S)-(4-(5-氯-3-((5-氟苯并[d]噻唑-2-基)氨基)-2-甲基苄基)-2-甲基哌嗪-1-基)(环戊基)甲酮的制备

参照实施例二化合物I-1的合成路线。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.92(s,1H),7.90(s,1H),7.79(s,1H),7.35(s,1H),7.19(s,1H),6.99(s,1H),4.56(m,0.5H),4.20(m,1H),3.76(m,0.5H),3.45(s,2H),3.25–3.14(m,0.5H),2.95(m,1H),2.76(m,1.5H),2.61(m,1H),2.27(s,3H),2.16–1.94(m,2H),1.91–1.43(m,8H),1.17(m,3H).MS(ESI)m/z:501.2[M+H]⁺。

实施例十五：

化合物I-14(S)-(4-(5-氯-3-((5-氯苯并[d]噻唑-2-基)氨基)-2-甲基苄基)-2-甲基哌嗪-1-基)(环戊基)甲酮的制备

参照实施例二化合物I-1的合成路线。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.97(s,1H),7.90(s,1H),7.81(d,J＝8.2Hz,1H),7.56(s,1H),7.18(m,2H),4.56(m,0.5H),4.21(m,1H),3.76(m,0.5H),3.45(s,2H),3.20(m,0.5H),2.96–2.89(m,1H),2.76(m,1.5H),2.62(m,1H),2.27(s,3H),2.15–1.93(m,2H),1.93–1.47(m,8H),1.28–1.06(m,3H).MS(ESI)m/z:517.2[M+H]⁺。

实施例十六：

化合物I-15(S)-2-((5-氯-3-((4-(环戊烷羰基)-3-甲基哌嗪-1-基)甲基)-2-甲基苯基)氨基)苯并[d]噻唑-5-甲腈的制备

参照实施例二化合物I-1的合成路线。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.11(s,1H),8.02(d,J＝7.9Hz,1H),7.96(s,1H),7.91(s,1H),7.54(d,J＝8.0Hz,1H),7.22(s,1H),4.56(m,0.5H),4.21(m,1H),3.77(m,0.5H),3.46(s,2H),3.20(m,0.5H),2.92(m,1H),2.76(m,1.5H),2.63(m,1H),2.28(s,3H),2.17–1.91(m,2H),1.90–1.44(m,8H),1.18(m,3H).MS(ESI)m/z:508.2[M+H]⁺。

实施例十七：

化合物I-16(3-(5-氯-3-((4-氟苯并[d]噁唑-2-基)氨基)-2-甲基苄基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛-8-基)(环戊基)甲酮的制备

参照实施例二化合物I-1的合成路线。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.07(s,1H),7.83(s,1H),7.37(m,1H),7.18(s,1H),7.11(m,2H),4.44(m,1H),4.31(m,1H),3.56–3.42(m,2H),2.87(m,1H),2.60(m,2H),2.29(s,3H),2.15(m,2H),1.85–1.45(m,12H).MS(ESI)m/z:497.2[M+H]⁺。

实施例十八：

化合物I-20(4-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-2-甲基苄基)哌嗪-1-基)(环戊基)甲酮的制备

参照实施例二化合物I-1的合成路线。¹H NMR(400MHz,dmso)δ9.65(s,1H),7.72(d,J＝7.6Hz,1H),7.63(d,J＝7.7Hz,1H),7.44(d,J＝7.8Hz,1H),7.26(t,J＝7.1Hz,1H),7.20(t,J＝7.7Hz,1H),7.16–7.04(m,2H),3.47(brd,6H),3.01–2.89(m,1H),2.35(brd,4H),2.28(s,3H),1.80–1.44(m,8H).MS(ESI)m/z:435.2[M+H]⁺。

实施例十九：

化合物I-21(4-(5-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-2-甲基苄基)哌嗪-1-基)(环戊基)甲酮的制备

参照实施例二化合物I-1的合成路线。¹H NMR(400MHz,dmso)δ10.34(s,1H),7.78(d,J＝7.0Hz,1H),7.68(s,1H),7.63–7.52(m,2H),7.31(t,J＝7.0Hz,1H),7.13(t,J＝7.2Hz,2H),3.47(d,J＝22.7Hz,6H),2.96(s,1H),2.40(d,J＝10.8Hz,4H),2.27(s,3H),1.80–1.47(m,8H).MS(ESI)m/z:435.2[M+H]⁺。

实施例二十：

化合物I-22(4-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-4-甲基苄基)哌嗪-1-基)(环戊基)甲酮的制备

参照实施例二化合物I-1的合成路线。¹H NMR(400MHz,dmso)δ9.64(s,1H),7.73(s,2H),7.45(d,J＝7.4Hz,1H),7.27(s,1H),7.21(d,J＝7.2Hz,1H),7.10(d,J＝7.1Hz,1H),7.04(s,1H),3.48(s,6H),2.94(s,1H),2.35(d,J＝17.1Hz,4H),2.26(s,3H),1.71(s,2H),1.57(dd,6H).MS(ESI)m/z:435.2[M+H]⁺。

实施例二十一：

化合物I-23(4-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-甲基苄基)哌嗪-1-基)(环戊基)甲酮的制备

参照实施例二化合物I-1的合成路线。¹H NMR(400MHz,dmso)δ10.37(s,1H),7.79(d,J＝7.6Hz,1H),7.62–7.52(m,2H),7.49(s,1H),7.31(t,J＝7.5Hz,1H),7.14(t,J＝7.4Hz,1H),6.78(s,1H),3.46(d,J＝14.8Hz,6H),2.99–2.85(m,1H),2.31(brs,7H),1.78–1.42(m,8H).MS(ESI)m/z:435.2[M+H]⁺。

实施例二十二：

化合物I-24(4-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)苄基)哌嗪-1-基)(环戊基)甲酮的制备

参照实施例二化合物I-1的合成路线。¹H NMR(400MHz,dmso)δ10.45(s,1H),7.80(d,J＝7.5Hz,2H),7.65(s,1H),7.59(d,J＝7.7Hz,1H),7.32(t,J＝5.9Hz,2H),7.16(d,J＝6.8Hz,1H),6.96(d,J＝7.1Hz,1H),3.49(brs,6H),3.00–2.87(m,1H),2.36(brd,4H),1.61(ddd,8H).MS(ESI)m/z:421.2[M+H]⁺。

实施例二十三：

化合物I-25(4-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-6-氯-2-甲基苄基)哌嗪-1-基)(环戊基)甲酮的制备

参照实施例二化合物I-1的合成路线。¹H NMR(400MHz,dmso)δ9.73(s,1H),7.76(s,2H),7.46(s,1H),7.31(brd,2H),7.11(s,1H),3.67(s,2H),3.42(m,4H),2.94(m,1H),2.38(m,6H),1.77–1.43(m,8H).MS(ESI)m/z:469.2[M+H]⁺。

实施例二十四：

化合物I-26(4-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-氟-2-甲基苄基)哌嗪-1-基)(环戊基)甲酮的制备

参照实施例二化合物I-1的合成路线。¹H NMR(400MHz,dmso)δ9.77(s,1H),7.93–7.71(m,2H),7.52(s,1H),7.30(s,1H),7.13(s,1H),6.95(d,J＝7.8Hz,1H),3.48(m,6H),2.94(s,1H),2.36(d,J＝12.3Hz,4H),2.24(s,3H),1.79–1.42(m,8H).MS(ESI)m/z:453.2[M+H]⁺。

实施例二十五：

化合物I-27(4-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-2-氯苄基)哌嗪-1-基)(环戊基)甲酮的制备

参照实施例二化合物I-1的合成路线。¹H NMR(400MHz,dmso)δ9.97(s,1H),8.17(s,1H),7.79(d,J＝6.8Hz,1H),7.53(d,J＝7.0Hz,1H),7.37(t,J＝7.5Hz,1H),7.29(s,2H),7.15(d,J＝7.1Hz,1H),3.61(s,2H),3.49(s,4H),2.94(s,1H),2.41(d,J＝16.6Hz,4H),1.79–1.44(m,8H).MS(ESI)m/z:455.2[M+H]⁺。

实施例二十六：

化合物I-28(4-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-5-氯-2-甲基苄基)哌嗪-1-基)(环戊基)甲酮的制备

参照实施例二化合物I-1的合成路线。¹H NMR(400MHz,DMSO)δ9.75(s,1H),7.96(s,1H),7.78(d,J＝7.8Hz,1H),7.51(d,J＝7.8Hz,1H),7.30(t,J＝7.7Hz,1H),7.19–7.09(m,2H),3.49(m,6H),3.01–2.87(m,1H),2.36(d,J＝15.7Hz,4H),2.26(s,3H),1.80–1.47(m,8H).MS(ESI)m/z:469.2[M+H]⁺。

实施例二十七：

化合物I-29(4-(3-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-2,6-二甲基苄基)哌嗪-1-基)(环戊基)甲酮的制备

参照实施例二化合物I-1的合成路线。¹H NMR(400MHz,DMSO)δ9.60(s,1H),7.69(d,J＝7.7Hz,1H),7.42(dd,J＝7.8,3.8Hz,2H),7.25(t,J＝7.6Hz,1H),7.06(t,J＝8.1Hz,2H),3.52(s,2H),3.42(s,4H),2.94(dd,J＝15.3,7.6Hz,1H),2.38(m,7H),2.30(s,3H),1.78–1.45(m,8H).MS(ESI)m/z:449.2[M+H]⁺。

实施例二十八：

化合物I-30(4-(3-(((1H-苯并[d]咪唑-2-基]氨基]-2-甲基苄基]哌嗪-1-基)(环戊基)甲酮的制备

参照实施例二化合物I-1的合成路线。¹H NMR(400MHz,DMSO)δ10.83(s,1H),8.38(s,1H),8.02(d,J＝8.0Hz,1H),7.26(s,2H),7.15(t,J＝7.8Hz,1H),6.96(d,J＝7.0Hz,3H),3.47(brs,6H),2.94(dd,J＝15.1,7.5Hz,1H),2.35(brd,4H),2.29(s,3H),1.80–1.45(m,8H).MS(ESI)m/z:418.3[M+H]⁺。

实施例二十九：

化合物I-31(4-(3-(苯并[d]噁唑-2-基氨基)-2-甲基苄基)哌嗪-1-基)(环戊基)甲酮的制备

参照实施例二化合物I-1的合成路线。¹H NMR(400MHz,DMSO)δ9.65(s,1H),7.63(d,J＝7.7Hz,1H),7.43(d,J＝7.9Hz,1H),7.32(d,J＝7.7Hz,1H),7.22–7.03(m,4H),3.48(brs,6H),2.99–2.91(m,1H),2.35(brd,4H),2.29(s,3H),1.77–1.44(m,8H).MS(ESI)m/z:419.2[M+H]⁺。

实施例三十：

化合物I-32环戊基(4-(2-甲基-3-(噻唑并[5,4-b]吡啶-2-基氨基)苄基)哌嗪-1-基)甲酮的制备

参照实施例二化合物I-1的合成路线。¹H NMR(400MHz,DMSO)δ9.94(s,1H),8.17(d,J＝4.7Hz,1H),7.74(d,J＝8.0Hz,1H),7.58(d,J＝7.6Hz,1H),7.30(dd,J＝7.6,5.2Hz,1H),7.25–7.14(m,2H),3.49(s,2H),3.46(s,4H),3.00–2.90(m,1H),2.36(brd,4H),2.29(s,3H),1.77–1.48(m,8H).MS(ESI)m/z:436.2[M+H]⁺。

实施例三十一：

化合物I-33环戊基(4-(2-甲基-3-(噻唑并[5,4-c]吡啶-2-基氨基)苄基)哌嗪-1-基)甲酮的制备

参照实施例二化合物I-1的合成路线。¹H NMR(400MHz,DMSO)δ10.23(s,1H),8.84(s,1H),8.33(d,J＝5.5Hz,1H),7.55(d,J＝7.5Hz,1H),7.37(d,J＝5.4Hz,1H),7.27–7.18(m,2H),3.50(brs,2H),3.48(brs,4H),2.98–2.92(m,1H),2.36(brd,4H),2.28(s,3H),1.76–1.49(m,8H).MS(ESI)m/z:436.2[M+H]⁺。

实施例三十二：

化合物I-34环戊基(4-(2-甲基-3-(噻唑并[4,5-c]吡啶-2-基氨基)苄基)哌嗪-1-基)甲酮的制备

参照实施例二化合物I-1的合成路线。¹H NMR(400MHz,DMSO)δ9.95(s,1H),8.67(s,1H),8.20(d,J＝5.1Hz,1H),7.82(d,J＝5.1Hz,1H),7.64(d,J＝7.7Hz,1H),7.23(t,J＝7.6Hz,1H),7.17(d,J＝7.3Hz,1H),3.49(brd,6H),3.01–2.88(m,1H),2.36(brd,4H),2.29(s,3H),1.78–1.43(m,8H).MS(ESI)m/z:436.2[M+H]⁺。

实施例三十三：

化合物I-35环戊基(4-(2-甲基-3-(噻唑并[4,5-b]吡啶-2-基氨基)苄基)哌嗪-1-基)甲酮的制备

参照实施例二化合物I-1的合成路线。¹H NMR(400MHz,DMSO)δ10.07(s,1H),8.34–8.24(m,1H),8.13(d,J＝7.6Hz,1H),7.58(d,J＝6.7Hz,1H),7.28–7.16(m,2H),7.05(dd,J＝7.6,4.9Hz,1H),3.49(brd,6H),3.01–2.90(m,1H),2.36(brd,4H),2.29(s,3H),1.79–1.45(m,8H).MS(ESI)m/z:436.2[M+H]⁺。

实施例三十四：

化合物I-36环戊基(4-(2-甲基-3-(噻唑并[4,5-b]吡嗪-2-基氨基)苄基)哌嗪-1-基)甲酮的制备

参照实施例二化合物I-1的合成路线。¹H NMR(400MHz,DMSO)δ10.54(s,1H),8.32(d,J＝3.2Hz,1H),8.13(d,J＝2.5Hz,1H),7.53(d,J＝5.4Hz,1H),7.25(d,J＝6.1Hz,2H),3.51(brs,2H),3.47(brs,4H),3.00–2.90(m,1H),2.36(brd,4H),2.29(s,3H),1.81–1.46(m,8H).MS(ESI)m/z:437.2[M+H]⁺。

实施例三十五：

化合物I-17 1-(4-(5-(苯并[d]噁唑-2-基氨基)-1,4-二甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基)哌啶-1-基)-2-甲基丙基-1-酮的制备

步骤1：4-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶的制备

室温下，甲基溴化镁溶液(3M，53.4mL，160.2mmol)缓慢滴加到含有4-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶(4.89g，32.04mmol)和Pd(dppf)Cl₂(469mg，0.64mmol)的甲苯溶液中，85℃加热反应7小时。降至室温，将反应液缓慢倒入冰水中淬灭反应。然后加入饱和氯化铵溶液，用乙酸乙酯萃取三次，有机相用水和饱和氯化钠溶液洗涤，无水Na₂SO₄干燥，过滤，滤液减压浓缩，残余物用石油醚打浆，过滤得到产物(3.5g)，产率：82.7。MS(ESI)m/z:133.1[M+H]⁺。

步骤2：4-甲基-1-甲苯磺酰基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶的制备

室温下，将对甲苯磺酰氯(5.56g，29.17mmol)缓慢加至含有4-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶(3.5g，26.52mmol)和NaH(60％，1.17g，29.17mmol)的无水DMF溶液中，继续搅拌反应2小时。将反应液缓慢滴加至冰水中，用乙酸乙酯萃取三次。合并有机相，用水和饱和氯化钠溶液洗涤，无水Na₂SO₄干燥。过滤，滤液减压浓缩，残余物经硅胶柱层析纯化得到产物(3.14g)，产率：41.4％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.24(d,J＝4.7Hz,1H),8.00(d,J＝8.0Hz,2H),7.62(d,J＝3.8Hz,1H),7.19–7.11(m,2H),6.91(d,J＝4.7Hz,1H),6.55(d,J＝3.9Hz,1H),2.41(s,3H),2.29(s,3H).MS(ESI)m/z:287.1[M+H]⁺。

步骤3：4-甲基-5-硝基-1-甲苯磺酰基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶的制备

0℃下，将四甲基硝酸铵(800mg，5.88mmol)缓慢加至4-甲基-1-甲苯磺酰基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶(1.12g，3.92mmol)的二氯甲烷(20mL)溶液中，然后加入三氟乙酸酐(820μL，5.88mmol)，然后升至室温反应过夜。加入水(1mL)淬灭反应，然后加入无水Na₂SO₄干燥，过滤，滤液减压浓缩，残余物经甲基叔丁基醚打浆，过滤得到产物(1.1g)，产率：84.6％。¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ9.05(s,1H),8.07(d,J＝6.5Hz,2H),7.86(s,1H),7.30(d,J＝7.4Hz,2H),6.78(s,1H),2.77(s,3H),2.39(s,3H).MS(ESI)m/z:332.1[M+H]⁺。

步骤4：4-甲基-5-硝基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶的制备

4-甲基-5-硝基-1-甲苯磺酰基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶(1.1g，3.32mmol)、碳酸钾(916mg，6.64mmol)加至甲醇(50mL)中，然后加入吗啡啉(2.89g，33.2mmol)，70℃加热反应1小时。降至室温，反应液减压浓缩，残余物经硅胶柱层析纯化得到产物(588mg)，产率：100％。MS(ESI)m/z:178.1[M+H]⁺。

步骤5：1,4-二甲基-5-硝基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶的制备

将碘甲烷(2.69g，18.92mmol)缓慢加入含有4-甲基-5-硝基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶(588mg，3.32mmol)和碳酸钾(1.37g，9.96mmol)的DMF溶液中，室温反应2小时。将反应液倒入水中，用乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，用水和饱和氯化钠溶液洗涤，无水Na₂SO₄干燥，过滤，滤液减压浓缩，残余物经硅胶柱层析纯化得到产物(388mg)，产率：61.2％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ9.06(s,1H),7.30(d,J＝3.6Hz,1H),6.68(d,J＝3.3Hz,1H),3.94(s,3H),2.86(s,3H).MS(ESI)m/z:192.1[M+H]⁺。

步骤6：3-碘-1,4-二甲基-5-硝基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶的制备

将NIS(549mg，2.44mmol)加入1,4-二甲基-5-硝基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶(388mg，2.03mmol)的DMF溶液中，室温反应2小时。将反应液倒入水中，用乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，用水和饱和氯化钠溶液洗涤，无水Na₂SO₄干燥，过滤，滤液减压浓缩，残余物经硅胶柱层析纯化得到产物(500mg)，产率：77.7％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.90(s,1H),7.44(s,1H),3.89(s,3H),3.07(s,3H).MS(ESI)m/z:318.1[M+H]⁺。

步骤7：4-(1,4-二甲基-5-硝基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基)-5,6-二氢吡啶-1(2H)-羧酸叔丁酯的制备

在3-碘-1,4-二甲基-5-硝基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶(500mg,1.58mmol)的DME(8mL)和乙醇(2mL)溶液中，依次加入4-(4,4,5,5-叔丁基)四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-3,6-二氢吡啶-1(2H)-羧酸酯(732.8mg，2.37mmol)，碳酸钾(872.2mg，6.32mmol)和水(1mL)，在氮气保护下室温搅拌5分钟，然后加入Pd(PPh₃)₄(91mg，0.08mmol)，升温至80℃反应10小时。将反应液加入至水和二氯甲烷的混合体系中，分液，有机相用水和饱和氯化钠溶液洗涤，无水Na₂SO₄干燥，过滤，滤液减压浓缩，残余物经硅胶柱层析纯化得到产物(510mg)，产率：86.7％。MS(ESI)m/z:373.2[M+H]⁺。

步骤8：1,4-二甲基-5-硝基-3-(1,2,3,6-四氢吡啶-4-基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶的制备

向4-(1,4-二甲基-5-硝基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基)-5,6-二氢吡啶-1(2H)-羧酸叔丁酯(510mg，1.37mmol)的二氯甲烷(5mL)溶液中，加入盐酸二氧六环溶液(4N，2mL)，室温搅拌反应4小时。反应液减压浓缩得到粗产物，直接用于下一步反应。MS(ESI)m/z:273.2[M+H]⁺。

步骤9：1-(4-(1,4-二甲基-5-硝基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基)-5,6-二氢吡啶-1(2H)-基)-2-甲基丙-1-酮的制备

室温下，将异丁酰氯(215μL，2.06mmol)缓慢滴加至含有上述粗品的二异丙基乙胺(707μL，4.11mmol)和二氯甲烷(10mL)溶液中，室温反应1小时。加入甲醇淬灭反应，将反应液减压浓缩，残余物经硅胶柱层析纯化得到产物(500mg)，产率：100％。MS(ESI)m/z:343.1[M+H]⁺。

步骤10：1-(4-(5-氨基-1,4-二甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基)哌啶-1-基)-2-甲基丙-1-酮的制备

向含有1-(4-(1,4-二甲基-5-硝基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基)-5,6-二氢吡啶-1(2H)-基)-2-甲基丙-1-酮(500mg，1.46mmol)，氯化铵(390mg，7.3mmol)的甲醇溶液中，加入铁粉(409mg，7.3mmol)，升至80℃反应6小时。反应液降至室温，过滤，滤液减压浓缩，残余物经硅胶柱层析纯化得到中间体。将中间体溶于甲醇中，加入钯碳(5％，100mg)，在氢气氛下室温反应过夜。反应液过滤，滤液减压浓缩得到产物(200mg)，产率：43.7％。MS(ESI)m/z:315.2[M+H]⁺。

步骤11：2-氯-N-(3-(1-异丁酰基哌啶-4-基)-1,4-二甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)乙酰胺的制备

将氯乙酰氯(113mg，1mmol)滴加至含有1-(4-(5-氨基-1,4-二甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基)哌啶-1-基)-2-甲基丙-1-酮(160mg，0.5mmol)和二异丙基乙胺(0.5mL，3mmol)的二氯甲烷溶液中，室温反应2小时。加入甲醇淬灭反应，反应液减压浓缩，残余物经硅胶柱层析纯化得到产物(200mg)，产率：100％。MS(ESI)m/z:391.2[M+H]⁺。

步骤12：1-(4-(5-(苯并[d]噁唑-2-基氨基)-1,4-二甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基)哌啶-1-基)-2-甲基丙基-1-酮的制备

(2-氯-N-(3-(1-异丁酰基哌啶-4-基)-1,4-二甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)乙酰胺(195mg,0.5mmol)，苯并[d]噁唑-2-硫醇(151mg,1.0mmol)和氢氧化钾(112mg,2.0mmol)加入DMF(8mL)中，室温搅拌反应过夜。加入水(5mL)淬灭反应，用乙酸乙酯(10mL×3)萃取，合并有机相，用水和饱和氯化钠溶液洗涤，无水Na₂SO₄干燥，过滤，滤液减压浓缩，残余物经硅胶柱层析和反相中压制备系统纯化得到目标化合物I-17(70mg)，产率32.6％。¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.74(s,1H),8.23(s,1H),7.47–7.34(m,2H),7.23(d,J＝7.3Hz,1H),7.14(t,J＝7.4Hz,1H),7.03(t,J＝7.6Hz,1H),4.57(d,J＝12.0Hz,1H),4.06(d,J＝12.5Hz,1H),3.76(s,3H),3.30–3.09(m,2H),2.90(d,J＝5.9Hz,1H),2.64(d,J＝12.7Hz,1H),2.57(s,3H),2.08–1.85(m,2H),1.59–1.32(m,2H),1.02(m,6H).MS(ESI)m/z:432.2[M+H]⁺。

实施例三十六：

化合物I-18 1-(4-(1,4-二甲基-5-(噁唑并[4,5-b]吡啶-2-基氨基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基)哌啶-1-基)-2-甲基丙基-1-酮的制备

参照实施例三十五化合物I-17的合成路线。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.29(s,1H),7.22(m,2H),7.10(m,1H),7.00(m,1H),6.90(m,1H),4.78(m,1H),4.01(m,1H),3.77(s,3H),3.24–3.02(m,2H),2.78(m,1H),2.61(m,4H),2.01(m,2H),1.50(m,2H),1.09(m,6H).MS(ESI)m/z:433.2[M+H]⁺。

实施例三十七：

化合物I-19 1-(4-(5-(苯并[d]噻唑-2-基氨基)-1,4-二甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基)哌啶-1-基)-2-甲基丙基-1-酮的制备

参照实施例三十五化合物I-17的合成路线。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.33(s,1H),7.43(d,J＝6.8Hz,1H),7.20(m,1H),7.16(m,1H),6.97(m,2H),4.77(d,J＝10.7Hz,1H),4.00(d,J＝11.0Hz,1H),3.81(s,3H),3.24–3.02(m,2H),2.79(m,1H),2.65(s,3H),2.59(m,1H),2.02(m,2H),1.52(m,2H),1.09(m,6H).MS(ESI)m/z:448.2[M+H]⁺。

实施例三十八：体外测定化合物对RORγ受体的抑制活性试验对本发明的化合物I-1～I-19采用荧光共振能量转移(FRET)实验来测定化合物对RORγ蛋白受体的抑制活性。该抑制活性采用半数抑制浓度(IC₅₀)和最大抑制的百分率(Max Inh％)这两个指标来表示。

实验方法：

1、RORγ基础缓冲液的配制

准备100mL基础缓冲液，加入10mL DTT，混合均匀备用；

2、化合物溶液的配制

化合物均为30μM起3倍稀释10个浓度；

3、蛋白溶液混合物的配制

a.配制40nM的B-RORγLBD和20nM的SA-APC溶液，混合均匀，室温孵育15分钟，然后加入400nM生物素，混合均匀，室温孵育10分钟；

b.配制40nM的Bioin-SRC1和10nM的SA-eu溶液，混合均匀，室温孵育15分钟，然后加入200nM生物素，混合均匀，室温孵育10分钟；

c.将上述两个混合溶液1：1混合，室温孵育5分钟；

d.在384孔板中每孔加入0.1μM替代激动剂N-(2-氯-6-氟苯基)-N-((20-甲氧基-[1,10-联苯基]-4-取代)甲基)苯磺酰胺，25μLB-RORγLBD/SA-APC和Bioin-SRC1/SA-eu混合液及受试化合物，1000rpm离心1分钟，室温下孵育1小时。在Envision微孔板检测仪上读取数据，计算IC₅₀值。测定结果显示，本发明的化合物对RORγ蛋白受体有较好的抑制活性(如表1所示)。

表1.实施例化合物的RORγFRET抑制活性结果

·IC₅₀值为至少两次独立试验的平均值

·IC₅₀值：*＊＊*表示IC₅₀<80nM；*＊*表示80nM≤IC₅₀<160nM；**表示IC₅₀≥160nM。

·Max Inh％：*＊＊*表示Max Inh％>130％；*＊*表示130％≥Max Inh％>100％；**表示Max Inh％≤100％。

实施例三十九：细胞水平测定化合物对RORγt的抑制活性试验对本发明的化合物I-1～I-36采用双荧光素酶报告基因系统来测定化合物在细胞水平对RORγt的抑制活性。该抑制活性采用化合物浓度在10μM和1μM的抑制率来表示。

荧光素酶报告基因系统是利用荧光素作为底物去检测荧光素酶活性的一种报告系统。原理是把荧光素报告基因的编码序列和基因表达调控序列融合形成一个嵌合的基因，从而在调控序列的控制下转录表达，然后利用表达的荧光素酶分解底物的状况来标定目的基因的表达状况。

实验方法：

①准备细胞：293T细胞传代于6cm板，培养条件为DMEM+10％FBS。

②质粒转染：pFN11A(BIND)-GAL4-ROR(97-516)和pGL4.31[luc2P/GAL4UAS/Hygro]分别为2μg，转染试剂为10μL,分别用50μL DMEM稀释后混匀孵育30min后，均匀滴入6cm板。

③细胞铺板:4.5h后细胞计数，铺于96孔板，每孔5万个细胞，100μL培养基。

④细胞加药：20h后，用DMEM+10％FBS稀释待测化合物，每孔加入100μL相应稀释后的化合物。

⑤荧光检测：24h后检测荧光素酶报告基因。稀释裂解液：每孔50μL，按照96个孔计算共需要裂解液96×50＝4.8mL～5mL购买的Passive lysis buffer为5×溶液，所以需要母液1mL，用4mL的超纯水稀释，混液槽内轻晃均匀。细胞房取出细胞，弃去培养液，用预冷的PBS漂洗1遍，吸尽PBS，每孔加50μL的裂解液晃匀，置于冰上裂解20分钟。准备试剂盒，20分钟后在冰上拿出细胞置于微量振荡器上振荡，充分悬浮细胞，在96孔白板中，加入50μL裂解液，每孔避光加入萤火虫发光剂Dual-Glo孵育10min后用酶标仪(Synergy2)的化学发光系统检测萤火虫荧光素酶的活性。每孔再避光加10μL的Dual-Glo stop&Glo试剂，(使用前需现配现用RLA：RLAbuffer＝1：100)孵育10min后读数。

⑥数据处理：

荧光素酶活性计算是各样品中的荧光素酶活性除以海肾荧光素酶活性的值，海肾荧光素酶用以校正在转染效率的差异。相对荧光素酶的活性为样品荧光素酶的活性比上DMSO空白值，抑制率用以下公式计算：

％Luciferase Inihibition＝100*(FLA/RLA_control-FLA/RLA_compound)/FLA/RLA_control

为了验证该系统的转染效果，我们使用阳性化合物T0901317进行检测，T0901317在该系统的抑制IC₅₀为0.81μM。而在有的参考文献中全长的RORγt荧光素酶报告基因实验中IC₅₀为1.7μM。测定结果显示，本发明的化合物对RORγ蛋白受体有较好的抑制活性(如表2所示)。

表2.实施例化合物的GAL4细胞活性测试结果

·抑制率为至少两次独立试验的平均值

·抑制率值：*＊＊*表示100％≥抑制率>70％；*＊*表示70％≥抑制率>40％；**表示40％≥抑制率>0％

·“-”表示未测定

实施例四十：体外测定化合物对DHODH的抑制活性试验

对本发明的化合物I-1～I-36采用DCIP法来测定化合物对DHODH的抑制活性。该抑制活性采用半数抑制浓度(IC₅₀)来表示。

实验方法：DCIP法

DCIP，即2,6-二氯靛酚钠，在600nm处有特定的吸收值，当底物二氢乳清酸(DHO)被hDHODH催化脱氢后，CoQ₀被还原的同时，DCIP代替呼吸链作为最终电子受体被氧化，反应体系中原来的DCIP量会减少，从而在600nm处的吸收值也会降低。因此，吸收值变化速率可以反映出酶活性大小及化合物抑制活性的强弱。变化速率越大，说明氧化还原反应越剧烈，酶活性越强，相对的化合物抑制活性越弱。

将纯化后的HsDHODH蛋白用活性测试溶液稀释至10nM，活性测试溶液为50mMHEPES pH 8.0，150mM KCl，0.1％Triton X-100。加入CoQ₀及DCIP，使其终浓度分别为100μM和120μM。混匀后排枪加入96孔板，室温孵育5min后，加入底物DHO启动反应，DHO终浓度为500μM。使用BioTek酶标仪检测600nm的吸光值，每30s读取一次，持续6min。计算酶促反应初速度V0，抑制剂的活性测试则在上述反应体系中加入不同浓度的抑制剂，计算酶促反应初速度Vi，化合物的抑制率则由公式(1-Vi/V0)×100％计算。在化合物IC50的计算中，至少测试8个浓度下的抑制率，IC50值使用Origin 8.0计算。实验过程中采用A77 1726为阳性对照，每次实验至少设三个平行。测定结果显示，本发明的化合物对DHODH有较好的抑制活性(如表3所示)。

表3.实施例化合物的DHODH抑制活性测试结果

·IC₅₀值为至少两次独立试验的平均值

·IC₅₀值：*＊*表示IC₅₀<1μM；**表示1μM≤IC₅₀<10μM；*表示IC₅₀≥10μM。

·“-”表示未测定

RORγFRET受体试验和GAL4细胞试验结果显示，本发明的苯并五元杂环胺类衍生物能有效抑制RORγt活性。DHODH的抑制活性实验结果显示，本发明的苯并五元杂环胺类衍生物能有效抑制DHODH活性。本发明的苯并五元杂环胺类衍生物能有效抑制RORγt活性并能有效抑制DHODH活性，从而抑制淋巴细胞的增殖，Th17细胞的分化，抑制IL-17的产生，可进一步作为预防或治疗与RORγt和/或DHODH有关的自身免疫性疾病、免疫和炎症性疾病、破坏性骨病、血液性癌症、恶性肿瘤疾病、血管生成相关疾病、病毒性疾病和感染性疾病等疾病的药物。