CN112741828A - 药物联用物及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种药物联用物，包括如下物质作为活性成分：3‑溴丙酮酸或其药学上可接受的盐以及CPI‑613或其药学上可接受的盐；将所述活性成分共同配制或分开配制，用于配伍使用、同时使用或分开使用。本发明还提供一种该药物联用物的复合纳米颗粒剂，本发明还提供该药物联用物的复合纳米颗粒剂的制备方法。两药联合使用具有协同效应，联用时，其抗肿瘤活性可达到1+1＞2的技术效果；该药物联用物用使用复合纳米颗粒剂剂型，药物相容性好，抗肿瘤活性高；该复合纳米颗粒的制备方法制备过程简单，周期短，稳定性好，所得复合纳米颗粒剂的两个活性药物成分均匀地包载于PLGA纳米粒中。

Description

药物联用物及其制备方法和用途
技术领域
本发明专利涉及纳米药物技术领域，具体是指一种药物组合物及其制备方法和用途。
背景技术
肿瘤细胞由于生长旺盛，细胞分裂加速，所以肿瘤细胞须消耗大量的葡萄糖来产生这些物质；诺贝尔奖获得者德国生物化学家Otto Warburg就发现了肿瘤细胞葡萄糖代谢特点――高水平的糖酵解，Warburg认为，肿瘤发生的最初原因是线粒体呼吸功能障碍，为了维持细胞生存和满足大分子合成的需要，细胞选择激活另一种能量代谢方式：有氧糖酵解。肿瘤细胞用有氧糖酵解替代正常组织细胞的氧化磷酸化。即使在有氧条件下，葡萄糖在肿瘤细胞胞质中经糖酵解途径生成乳酸，并且肿瘤细胞摄取葡萄的能力是同类正常组织细胞的几十倍，这种现象被称为“Warburg effect”(沃伯格效应)。
ATP是合成生物大分子、生物膜、维持离子浓度和合成DNA所必需的。肿瘤生长需要大量的ATP，它们不仅是肿瘤细胞转移和增殖所必需，还是维持肿瘤细胞生存所必需；目前针对肿瘤能量代谢的治疗是一种全新的治疗策略，阻断了肿瘤细胞ATP的来源必将导致许多肿瘤细胞生存相关的生物事件无法进行；最新的研究认为肿瘤细胞能量代谢产物ATP主要由以下几条途径产生：①葡萄糖在肿瘤细胞胞质中经葡萄糖酵解产生ATP，大部分肿瘤细胞由此途径产生ATP，这已在临床被PET-CT证实，这部分ATP约占肿瘤细胞内能量的80％；②谷氨酰胺回补途径，谷氨酰胺回补进入三羧酸循环，代谢产生ATP,这部分约占肿瘤细胞内能量的10％-20％；③部分肿瘤细胞也可能有脂肪参与供能产生ATP，如前列腺癌。
目前阻断肿瘤能量代谢的治疗研究已成为美欧和日本等国的研究热点，研究较广泛的药物有葡萄糖代谢阻断剂3-溴丙酮酸和线粒体三羧酸循环代谢阻断剂CPI-613。3-溴丙酮酸已在人体试验性治疗上显示了极好的疗效和治疗前景；其体内全身给药受首过效应影响较大，且于体内含水环境中半衰期较短(大约3小时)，为此3-溴丙酮酸更加适合于经动脉给药的介入治疗途径。3-溴丙酮酸的药理机制简述如下：3-溴丙酮酸是一种小分子量烷化剂，经肿瘤细胞膜表面单羧酸转运蛋白(MCTs)进入细胞内，主要作用的靶蛋白有GADPH和HK-Ⅱ(己糖激酶(HK)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GADPH)是糖酵解的关键酶)；3-溴丙酮酸对GADPH和HK-Ⅱ具有极强的亲和力，极低浓度条件下即可完全阻断GADPH和HK-Ⅱ活性。体外细胞水平研究已证实，3-溴丙酮酸作用于VX2肿瘤细胞半小时后可致肿瘤细胞ATP耗竭；体内动物水平研究通过应用PET-CT相关技术证实3-溴丙酮酸作用于VX2肿瘤细胞2小时后肿瘤糖代谢停止；国外研究同时证实：3-溴丙酮酸对肿瘤干细胞也有杀伤作用，且能逆转肿瘤细胞对某些药物的多耐药性。而肿瘤细胞线粒体三羧酸循环代谢阻断剂CPI-613经过三年的研究后于2013年已进入临床，并且在II期临床实验尚未完成时被美国FDA特批为孤儿药，为广谱性抗肿瘤药，其适应症包括实体瘤和血液系统肿瘤，期药理机制为：CPI-613结构与维生素B1类似，进入细胞线粒体后磷酸化丙酮酸脱氢酶(PDH)E1α，磷酸化后的PDH失活并阻断丙酮酸或脂肪代谢起源的乙酰辅酶A代谢，阻断其能量产生，CPI-613同时也能抑制酮戊二酸脱氢酶复合物(KGDH)，阻断谷氨酰胺回补途径――即既阻断谷氨酰胺进入肿瘤细胞代谢产能。
然而，迄今为止，尚未见3-溴丙酮酸与CPI-613联用的研究。
因此，有必要对3-溴丙酮酸与CPI-613联用进行研究。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题之一，发明人研究了3-溴丙酮酸联合CPI-613特异性阻断肝癌细胞三条主要能量产生途经的治疗方法，并且两药联合治疗具有协同效应。为此，本发明提供一种药物联用物，包括如下物质作为活性成分：
3-溴丙酮酸或其药学上可接受的盐以及
CPI-613或其药学上可接受的盐；
将所述活性成分共同配制或分开配制，用于配伍使用、同时使用或分开使用。
在本发明的技术方案中，所述药物联用物为单剂量单位形式，包括4～16mg的3-溴丙酮酸或其药学上可接受的盐以及
4～16mg的CPI-613或其药学上可接受的盐。
在本发明的技术方案中，所述药物联用物的剂型选自颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂。
但实验中我们也发现3-溴丙酮酸液体状态时不稳定，易分解，每次使用都必须新鲜配制，易溶于水，呈酸性，首过效应大；而CPI-613呈脂溶性，易溶于有机溶剂，难溶于水，因此有必要改变3-溴丙酮酸和CPI-613的剂型和使用方式。
纳米作为药物载体具有保护药物，降低药物系统毒性，提高细胞的药物摄取率以及缓释和靶向递药作用，常用的纳米药物递送系统包括纳米脂质体、聚合物胶束和纳米乳等,堪为目前理想的肿瘤靶向给药系统。实验已证明：采用肝动脉途径输送纳米药物的介入治疗方法具有靶向性强，提高肿瘤和肿瘤新生血管局部药物浓度和达到缓释效果等优越性及可行性。3-溴丙酮酸的水溶性和CPI-613脂溶性特别适合纳米药物的制备。
在本发明的技术方案中，所述药物联用物的剂型为纳米颗粒剂。具体地，所述药物联用物的剂型为两种活性成分均匀分布的复合纳米颗粒剂。
本发明还提供上述药物联用物在制备抗肿瘤药物中的用途。
本发明还提供上述药物联用物(复合纳米颗粒剂)的制备方法，包括如下步骤：
步骤1)：将脂溶性的药物CPI-613和PLGA共溶于二氯甲烷中，配置成油相溶液；
步骤2)：将水溶性药物3-溴丙酮酸溶解在水中，配置成水相溶液；
步骤3)：将步骤2)中水相溶液在涡旋条件下逐滴加入到步骤1)中的油相溶液中，冰浴条件下进行超声，得到第一乳浊液；
步骤4)：涡旋条件下，将步骤3)中超声后的第一乳浊液逐滴加入聚乙烯醇(PVA)水溶液中，然后冰浴超声，得到第二乳浊液；
步骤5)：将步骤4)中得到的第二乳浊液迅速倒入聚乙烯醇(PVA)水溶液中，15～35℃条件下，加速搅拌使第二乳浊液中有机溶剂二氯甲烷蒸发；
步骤6)：高速离心收集制备得到的纳米粒子，并用去离子水洗涤三次；
步骤7)：将步骤6)得到的纳米粒子分散在海藻糖的水溶液中，-50～-80℃冻干，储存于-20℃冰箱中备用。
在本发明的技术方案中，所述步骤1)中，CPI-613与PLGA的质量比为(1～8):100。
在本发明的技术方案中，所述步骤2)中，3-BPA的浓度为(1～100)×10-3mg/μL，优选地，3-BPA的浓度为(25～30)×10-3mg/μL。
在本发明的技术方案中，所述步骤4)中，所述第一乳浊液在所述聚乙烯醇(PVA)水溶液中的终浓度为1～5(v/v)％。
在本发明的技术方案中，所述步骤4)中，超声的参数为超声振幅20～50％，每次5～20s，间隔1～10s，超声总时长为0.5～3min。
在本发明的技术方案中，所述步骤5)中，所述第二乳浊液在所述聚乙烯醇(PVA)水溶液中浓度为0.1～0.5(v/v)％。
在本发明的技术方案中，所述步骤6)中，离心速率为6000～15000g，离心时间为8～30min。
本发明所述的CPI-613为6，8-双(苄基硫代)辛酸；3-BPA为3-溴丙酮酸；CPI-613+3-BPA游离药物为CPI-613和3-BPA混合作为药物活性成分，CPI-613+3-BPA复合纳米颗粒为CPI-613和3-BPA同时作为药物活性成分共负载的复合纳米颗粒。3-BPA单药纳米颗粒为仅负载3-BPA作为活性成分的PLGA纳米颗粒。CPI-613单药纳米颗粒为仅负载CPI-613作为活性成分的PLGA纳米颗粒。
本发明还提供一种CPI-613单药纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：
步骤1)：将PLGA和CPI-613共同溶于二氯甲烷中，得到油相溶液；
步骤2)：准备二次水溶液，得到水相溶液；
步骤3)：将步骤2)得到的水相溶液在涡旋条件下逐滴加入到步骤①得到的油相溶液中，冰浴条件下进行超声，得到第一乳浊液；
步骤4)：涡旋条件下，将步骤3)得到的超声后的第一乳浊液逐滴加入聚乙烯醇水溶液中，立即放入冰浴中进行超声，得到第二乳浊液；
步骤5)：超声完毕后，将步骤4)得到的第二乳浊液迅速倒入聚乙烯醇水溶液中；15～35℃条件下，加速搅拌使第二乳浊液中有机溶剂二氯甲烷蒸发；
步骤6)：12000rpm离心20min收集制备得到的纳米粒子，并用去离子水洗涤三次；
步骤7)：最后将步骤6)得到的纳米粒子重新分散在海藻糖的水溶液中；-80～-50℃真空条件下将纳米粒子冻干后，存于-20℃冰箱中备用。
本发明还提供一种3-BPA单药纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤:
步骤1)：准确称量100mg PLGA溶于2mL二氯甲烷中，得到油相溶液；
步骤2)：准确称量8mg 3-溴丙酮酸加入150μL二次水溶液中，得到水相溶液；(载体/药物比例是100：8)
步骤3)：将步骤2)得到的水相溶液在涡旋条件下逐滴加入到步骤①得到的油相溶液中，冰浴条件下进行超声，得到第一乳浊液；
步骤4)：涡旋条件下，将步骤3)得到的超声后的第一乳浊液逐滴加入4mL 5(w/v)％(5g聚乙烯醇/100mL水)聚乙烯醇水溶液中，立即放入冰浴中进行超声，得到第二乳浊液；
步骤5)：超声完毕后，将步骤4)得到的第二乳浊液迅速倒入0.05(w/v)％聚乙烯醇(PVA)水溶液中；15～35℃条件下，加速搅拌使第二乳浊液中有机溶剂二氯甲烷蒸发；
步骤6)：12000rpm离心20min收集制备得到的纳米粒子，并用去离子水洗涤三次；
步骤7)：最后将步骤6)得到的纳米粒子重新分散在1mL海藻糖(0.1g/mL；冻干保护剂)的水溶液中；-80～-50℃真空条件下将纳米粒子冻干后，存于-20℃冰箱中备用。
本发明的有益效果在于：
1、本发明首次提出3-溴丙酮酸联合CPI-613特异性阻断肝癌细胞三条主要能量产生途径的肿瘤治疗方法，并提供了一种药物联用物，包含活性成分CPI-613和3-溴丙酮酸，两药联合治疗具有协同效应，联用时，其抗肿瘤活性可达到1+1＞2的技术效果；
2、本发明提供一种该药物联用物的复合纳米颗粒剂，该药物联用物使用复合纳米颗粒剂剂型，药物相容性好，抗肿瘤活性高；
3、本发明提供一种药物联用物的复合纳米颗粒剂的制备方法，采用乳化-溶剂挥发法制备复合纳米颗粒，并且选用PLGA为药物载体，制备过程简单，周期短，稳定性好，所得复合纳米颗粒剂的两个活性药物成分均匀地包载于PLGA纳米粒中。
附图说明
图1为CPI-613+3-BPA复合纳米颗粒的透射电镜图和DLS测量结果图；
图2为游离CPI-613、游离3-BPA、不同摩尔比的CPI-613与3-BPA制备得到的CPI-613+3-BPA复合纳米颗粒在培养24h、48h对Hepa1-6细胞的杀伤力测试结果图；
图3a为不同总药浓度、摩尔比为1:1的CPI-613与3-BPA制备得到的CPI-613+3-BPA复合纳米颗粒在培养24h、48h对Hepa1-6细胞的杀伤力测试结果图；
图3b为用CalcuSyn软件测量摩尔比为1:1的CPI-613与3-BPA制备得到的CPI-613+3-BPA复合纳米颗粒CI值的测试结果图；
图4为CPI-613+3-BPA复合纳米颗粒的生物安全性评价试验结果图；
图5为游离3-BPA、游离CPI-613、3-BPA单药纳米颗粒、CPI-613单药纳米颗粒、CPI-613+3-BPA复合纳米颗粒对细胞代谢情况的影响的试验结果图；
其中，图5a为空白对照、游离3-BPA、游离CPI-613、3-BPA单药纳米颗粒、CPI-613单药纳米颗粒、3-BPA+CPI-613复合纳米颗粒对ATP含量的影响结果示意图；图5b为空白对照、游离3-BPA、游离CPI-613、3-BPA单药纳米颗粒、CPI-613单药纳米颗粒、3-BPA+CPI-613复合纳米颗粒对乳酸含量的影响结果示意图；图5c为空白对照、游离3-BPA、游离CPI-613、3-BPA单药纳米颗粒、CPI-613单药纳米颗粒、3-BPA+CPI-613复合纳米颗粒对葡萄糖含量的影响结果示意图；
附图中，Free 3-BPA为游离3-BPA；Free CPI-613为游离CPI-613；Free drugs和Free 3-BPA+Free CPI-613为CPI-613+3-BPA游离药物；CPI NPs为CPI-613单药纳米颗粒；BPA NPs为3-BPA单药纳米颗粒；BCP NPs为CPI-613+3-BPA复合纳米颗粒；Blank PLGA NPs为空白PLGA纳米颗粒；saline为生理盐水组。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。Free 3-BPA为游离3-BPA；Free CPI-613为游离CPI-613；Free drugs和Free 3-BPA+Free CPI-613为CPI-613+3-BPA游离药物；CPI NPs为CPI-613单药纳米颗粒；BPA NPs为3-BPA单药纳米颗粒；BCPNPs为CPI-613+3-BPA复合纳米颗粒；Blank PLGA NPs为空白PLGA纳米颗粒；saline为生理盐水组。
实施例1：不同纳米颗粒的制备
(1)CPI-613和3-BPA共负载的复合PLGA纳米颗粒(CPI-613+3-BPA复合纳米颗粒)的制备方法，包括以下步骤：
①准确称量100mg PLGA和4mg CPI-613共同溶于2mL二氯甲烷中，得到油相溶液；
②准确称量4mg 3-溴丙酮酸加入150μL二次水溶液中，得到水相溶液；(载体/药物总比例是100：8，然后两种药物有不同比例)
③将步骤②得到的水相溶液在涡旋条件下逐滴加入到步骤①得到的油相溶液中，冰浴条件下进行超声，得到第一乳浊液；
④涡旋条件下，将步骤③得到的超声后的第一乳浊液逐滴加入4mL 5(w/v)％的(5g聚乙烯醇/100mL水)聚乙烯醇水溶液中，立即放入冰浴中进行超声，得到第二乳浊液；
⑤超声完毕后，将步骤④得到的第二乳浊液迅速倒入0.05(w/v)％聚乙烯醇(PVA)水溶液中；15～35℃条件下，加速搅拌使第二乳浊液中有机溶剂二氯甲烷蒸发；
⑥12000rpm离心20min收集制备得到的纳米粒子，并用去离子水洗涤三次；
⑦最后将步骤⑥得到的纳米粒子重新分散在1mL海藻糖(0.1g/mL；冻干保护剂)的水溶液中；-50～-80℃真空条件下将纳米粒子冻干后，存于-20℃冰箱中备用。
(2)负载CPI-613的PLGA纳米颗粒(CPI-613单药纳米颗粒)的制备方法，包括以下步骤:
①准确称量100mg PLGA和8mg CPI-613共同溶于2mL二氯甲烷中，得到油相溶液；
②准备150μL二次水溶液，得到水相溶液；(载体/药物比例是100：8)
③将步骤②得到的水相溶液在涡旋条件下逐滴加入到步骤①得到的油相溶液中，冰浴条件下进行超声，得到第一乳浊液；
④涡旋条件下，将步骤③得到的超声后的第一乳浊液逐滴加入4mL 5(w/v)％(5g聚乙烯醇/100mL水)聚乙烯醇水溶液中，立即放入冰浴中进行超声，得到第二乳浊液；
⑤超声完毕后，将步骤④得到的第二乳浊液迅速倒入0.05(w/v)％聚乙烯醇(PVA)水溶液中；15～35℃条件下，加速搅拌使第二乳浊液中有机溶剂二氯甲烷蒸发；
⑥12000rpm离心20min收集制备得到的纳米粒子，并用去离子水洗涤三次；
⑦最后将步骤⑥得到的纳米粒子重新分散在1mL海藻糖(0.1g/mL；冻干保护剂)的水溶液中；-50～-80℃真空条件下将纳米粒子冻干后，存于-20℃冰箱中备用。
(3)负载3-BPA的PLGA纳米颗粒(3-BPA单药纳米颗粒)的制备方法，包括以下步骤:
①准确称量100mg PLGA溶于2mL二氯甲烷中，得到油相溶液；
②准确称量8mg 3-溴丙酮酸加入150μL二次水溶液中，得到水相溶液；(载体/药物比例是100：8)；
③将步骤②得到的水相溶液在涡旋条件下逐滴加入到步骤①得到的油相溶液中，冰浴条件下进行超声，得到第一乳浊液；
④涡旋条件下，将步骤③得到的超声后的第一乳浊液逐滴加入4mL 5(w/v)％(5g聚乙烯醇/100mL水)聚乙烯醇水溶液中，立即放入冰浴中进行超声，得到第二乳浊液；
⑤超声完毕后，将步骤④得到的第二乳浊液迅速倒入0.05(w/v)％聚乙烯醇(PVA)水溶液中；15～35℃条件下，加速搅拌使第二乳浊液中有机溶剂二氯甲烷蒸发；
⑥12000rpm离心20min收集制备得到的纳米粒子，并用去离子水洗涤三次；
⑦最后将步骤⑥得到的纳米粒子重新分散在1mL海藻糖(0.1g/mL；冻干保护剂)的水溶液中；-50～-80℃真空条件下将纳米粒子冻干后，存于-20℃冰箱中备用。
(4)PLGA空载体纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
①准确称量100mg PLGA溶于2mL二氯甲烷中，得到油相溶液；
②准备150μL二次水溶液，得到水相溶液；
③将步骤②得到的水相溶液在涡旋条件下逐滴加入到步骤①得到的油相溶液中，冰浴条件下进行超声，得到第一乳浊液；
④涡旋条件下，将步骤③得到的超声后的第一乳浊液逐滴加入4mL 5％((w/v).5g聚乙烯醇/100mL水聚乙烯醇水溶液中，立即放入冰浴中进行超声，得到第二乳浊液；
⑤超声完毕后，将步骤④得到的第二乳浊液迅速倒入0.05(w/v)％聚乙烯醇(PVA)水溶液中；15～35℃条件下，加速搅拌使第二乳浊液中有机溶剂二氯甲烷蒸发；
⑥12000rpm离心20min收集制备得到的纳米粒子，并用去离子水洗涤三次；
⑦最后将步骤⑥得到的纳米粒子重新分散在1mL海藻糖(0.1g/mL；冻干保护剂)的水溶液中；-50～-80℃真空条件下将纳米粒子冻干后，存于-20℃冰箱中备用。
将上述(1)中合成得到的CPI-613+3-BPA复合纳米颗粒的形貌通过透射电子显微镜和动态光散射仪(dynamic light scattering，DLS)进行观察。在分析之前，CPI-613+3-BPA复合纳米颗粒经过真空喷铂处理。CPI-613+3-BPA复合纳米颗粒的透射电镜图和DLS测量结果如图1所示。从图1可以看出该复合纳米颗粒形貌均一，大小约为100纳米。同时，DLS测量结果为243.9nm±1.686，比透射电镜观察的结果大，这现有技术相关研究结果相符，因为水合粒径要比干燥后的颗粒粒径大。
实施例2：不同摩尔比的CPI-613与3-BPA制备得到的CPI-613+3-BPA复合PLGA纳米颗粒对Hepa1-6细胞的杀伤力实验
不同摩尔比的CPI-613与3-BPA制备得到的CPI-613+3-BPA复合纳米颗粒对Hepa1-6细胞的杀伤力实验，包括如下步骤：
步骤1)：将1×105个/mL的Hepa1-6细胞接种于96孔板中，每孔加入100μL，培养过夜。
步骤2)：吸出培养液，用PBS溶液洗三次。
步骤3)：培养到设定时间点后，分别向孔板中加入以不同摩尔比(CPI-613与3-BPA的摩尔比分别为1∶5、1∶2、1∶1、2∶1、5∶1)的CPI-613与3-BPA分别按实施例1中(1)CPI-613+3-BPA复合PLGA纳米颗粒的制备方法制备得到的CPI-613+3-BPA复合纳米颗粒(所有组中两种药物的总量控制为60μM)；
步骤4)：继续培养24h和48h后，去除含药培养基，并用PBS溶液洗涤细胞三次。每孔加入100μL MTT溶液(0.5mg/ml)。
步骤5)：继续培养4h后，去除培养基，每孔加入200μL DMSO溶液。将孔板放置于震荡箱中，150rpm低速震荡15min，使生成的紫色结晶完全溶解。
步骤6)：用多功能酶标仪测定各孔光学密度(OD)值。未经处理的细胞作为阴性对照，1％Triton X-100溶液(v/v)处理的细胞作为阳性对照，每组均设置5个生物学平行。
CPI-613与3-BPA不同药物摩尔比和治疗时间下CPI-613+3-BPA复合纳米颗粒的MTT测试结果如图2所示，横坐标为CPI-613与3-BPA的摩尔比，从图中可以看出，CPI-613与3-BPA的摩尔比为1:1时，CPI-613+3-BPA复合PLGA纳米颗粒对Hepa1-6细胞的杀伤力最强。
实施例3：不同浓度CPI-613+3-BPA复合纳米颗粒对Hepa1-6细胞的杀伤力实验
不同浓度CPI-613+3-BPA复合PLGA纳米颗粒对Hepa1-6细胞的杀伤力实验，包括如下步骤：
步骤1)：将1×105个/mL的Hepa1-6细胞接种于96孔板中，每孔加入100μL，培养过夜。
步骤2)：吸出培养液，用PBS溶液洗三次。
步骤3)：培养到设定时间点后，向孔板中分别加入不同浓度3-BPA+CPI-613复合纳米颗粒(合成时两种药物的摩尔比例为：3-BPA：CPI-613＝1：1，CPI-613的浓度分别为20μM，40μM，60μM，80μM，160μM；按实施例1中(1)复合纳米颗粒制备方法制备复合纳米颗粒时，使用等摩尔量的CPI-613和3-溴丙酮酸)。
步骤4)：继续培养24h和48h后，去除含药培养基，并用PBS溶液洗涤细胞三次。每孔加入100μL MTT溶液(0.5mg/ml)。
步骤5)：继续培养4h后，去除培养基，每孔加入200μL DMSO溶液。将孔板放置于震荡箱中，150rpm低速震荡15min，使生成的紫色结晶完全溶解。
步骤6)：用多功能酶标仪测定各孔光学密度(OD)值。未经处理的细胞作为阴性对照，1％Triton X-100溶液(v/v)处理的细胞作为阳性对照，每组均设置5个生物学平行。
不同总药物浓度和治疗时间下CPI-613+3-BPA复合PLGA纳米颗粒的效果MTT测试结果如图3a所示，从图中可以看出，CPI-613+3-BPA复合PLGA纳米颗粒对Hepa1-6细胞具有明显的杀伤力，并且其杀伤力呈浓度依赖性，即CPI-613+3-BPA复合PLGA纳米颗粒对Hepa1-6细胞具有明显的杀伤力随着总药物浓度的增大而增大。
进一步地，我们利用CalcuSyn软件(英国剑桥的Biosoft公司)计算了在CPI-613与3-BPA摩尔比为1:1时的CI值，结果如图3b所示，当CPI-613与3-BPA摩尔比为1:1时，其CI值小于1，表明在两种药物的合成摩尔比为1:1的时候，其具有明显的协同作用(CI值>1:拮抗作用；CI值＝1:联合作用；CI值<1:协同作用)。
实施例4：CPI-613+3-BPA复合纳米颗粒的生物安全性评价
CPI-613+3-BPA复合纳米颗粒的生物安全性评价，包括如下步骤：
步骤1)：小鼠眼窝处取1mL新鲜血液。
步骤2)：3000rpm离心5min后，收集小鼠血液中的红细胞。
步骤3)：用PBS溶液洗涤三次后再次将RBC重悬在PBS中(2％，v/v)备用。
步骤4)：随后，将实施例1中(1)制备得到的CPI-613+3-BPA复合纳米颗粒分散于PBS中，稀释成药物总浓度为0.1～100μM的悬液，浓度分别为0.1、1、5、10、25、50和100μM。
步骤5)：将500μL红细胞悬液分别与500μL PLGA-NPs纳米粒子悬液。
步骤6)：在37℃下进一步孵育6h。
步骤7)：12000rpm离心15min。
步骤8)：取200μL上清液，加到对应的透明底的96孔板中，在570nm处测定上清液中血红蛋白的吸收强度(OD值)。
步骤9)：根据各组OD值计算对应的溶血率，用二次水处理的RBC悬浮液(1％，w/v)用作阴性对照，PBS处理组作为阳性对照。
结果如图4所示，红细胞和不同浓度的复合纳米药物共孵育一段时间之后，其溶血率均低于5％，说明并没有发现溶血现象，表明该复合纳米具有很好的生物安全性。
实施例5：CPI-613+3-BPA复合纳米颗粒对细胞代谢情况的影响
CPI-613+3-BPA复合纳米颗粒对细胞代谢情况的影响，包括以下步骤：
步骤1)：分别将1×105个/mL的Hepa1-6细胞接种于96孔板中，每孔加入100μL，培养过夜。
步骤2)：吸出培养液，用PBS溶液洗三次。
步骤3)：培养到设定时间点后，向孔板中加入游离3-BPA，游离CPI-613，3-BPA单药纳米颗粒，CPI-613单药纳米颗粒，3-BPA+CPI-613复合纳米颗粒(单药中含有等量的单药CPI-613：60μM，等量的单药3-BPA：60μM；复合纳米药物中的总的药物量为60μM)
步骤4)继续培养一定时间后，去除含药培养基，并用PBS溶液洗涤细胞三次。然后分别按照ATP含量测定试剂盒，乳酸含量测定试剂盒及葡萄糖含量测定试剂盒的说明书处理样品，测定其各自的ATP，乳酸，葡萄糖的含量。
结果如图5所示，其中，图5a为空白对照、游离3-BPA、游离CPI-613、3-BPA单药纳米颗粒、CPI-613单药纳米颗粒、3-BPA+CPI-613复合纳米颗粒对ATP含量的影响结果示意图；图5b为空白对照、游离3-BPA、游离CPI-613、3-BPA单药纳米颗粒、CPI-613单药纳米颗粒、3-BPA+CPI-613复合纳米颗粒对乳酸含量的影响结果示意图；图5c为空白对照、游离3-BPA、游离CPI-613、3-BPA单药纳米颗粒、CPI-613单药纳米颗粒、3-BPA+CPI-613复合纳米颗粒对葡萄糖含量的影响结果示意图。从图中可以看出，给药处理后，与未加药物的对照组相比，ATP和乳酸的含量均降低，并且3-BPA+CPI-613复合纳米颗粒处理组比单药处理组降低很多，同样，葡萄糖的含量则呈相反趋势。其原因可能为，给药后，阻断了细胞的ATP和乳酸的产生，导致其含量下降。同时由于细胞呼吸减弱，导致其葡萄糖消耗减少，所以其含量呈增多的趋势。并且不同药物处理组对比发现，3-BPA+CPI-613复合纳米颗粒药物对细胞呼吸的抑制能力强于单药组尤其是游离单药组。
实施例6：CPI-613+3-BPA复合纳米颗粒的体内抗肿瘤效果评价，包括以下步骤：
步骤1)：选用6～8周的雌性C57小鼠(18～20g)，在其左侧腹皮下植入Hepa1-6细胞建立皮下肿瘤的肝癌模型；
步骤2)：待肿瘤大小为100mm3时，将小鼠随机分为6组；
步骤3)：分别给予不同的治疗：①生理盐水；②Blank PLGA NPs；③Free Drugs(Free3-BPA+Free CPI，总药物量为5mg/kg)；④3-BPA NPs(5mg/kg)；⑤CPI NPs(5mg/kg)；⑥BCP NPs(总药物量为5mg/kg)；
步骤4)：在给药期间，每两天记录一次肿瘤体积和体重，每3天注射一次药物，根据式I监测和计算肿瘤体积。
肿瘤体积＝(肿瘤长度)×肿瘤宽度×肿瘤宽度×0.5(式I)
结果如表格1和表格2所示，其中，表1为生理盐水、空白纳米粒、游离药物、3-BPA单药纳米颗粒、CPI单药纳米颗粒、3-BPA+CPI-613复合纳米颗粒处理对治疗期间小鼠体重的影响结果；表2为生理盐水、空白纳米粒、游离药物、3-BPA单药纳米颗粒、CPI单药纳米颗粒、3-BPA+CPI-613复合纳米颗粒处理对治疗期间小鼠肿瘤体积的影响结果(表2的数据为每两天记录的各实验组的肿瘤体积除以0天时肿瘤体积得到的比值)。
表1不同处理组处理对治疗期间小鼠体重的影响结果
Figure BDA0002888582240000121
表2不同处理组处理对治疗期间小鼠肿瘤体积的影响结果
Saline PLGA NPs Free drugs BPA NPs CPI NPs BCP NPs
0d 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0 1.00±0.00
2d 1.48±0.40 1.12±0.27 1.36±0.06 1.04±0.03 1.06±0.10 1.18±0.17
4d 1.64±0.36 1.27±0.25 1.12±0.17 0.89±0.02 1.07±0.06 1.03±0.30
6d 1.76±0.27 1.24±0.14 0.83±0.13 1.54±0.72 1.24±0.24 0.89±0.11
8d 2.36±0.03 1.59±0.14 0.84±0.13 1.26±0.53 1.16±0.16 0.80±0.13
10d 2.65±0.25 1.75±0.04 1.21±0.29 1.35±0.81 1.14±0.12 0.74±0.09
12d 3.07±0.04 1.97±0.33 1.51±0.49 1.56±0.77 1.14±0.03 0.74±0.05
14d 3.16±0.48 3.25±0.25 1.35±0.38 1.39±0.36 1.15±0.21 0.71±0.06
16d 3.73±1.01 3.71±0.15 1.49±0.69 1.02±0.33 1.17±0.04 0.65±0.05
18d 3.89±1.08 4.26±0.54 1.05±0.37 0.98±0.24 1.06±0.01 0.54±0.05
从表中可以看出，在治疗期间小鼠体重没有发生明显的变化，说明该游离药物及纳米颗粒药物对小鼠均没有明显的毒副作用，不会造成其体重的上升或者下降。然而，从小鼠治疗期间的肿瘤体积变化情况可以看出，与生理盐水对照组相比，给药组的肿瘤体积显著较小，给药组中，BCP NPs(CPI-613+3-BPA复合纳米颗粒)组的抗肿瘤效果最为明显，不仅发生了肿瘤生长的抑制，并且肿瘤体积还在减小。以上结果说明，制备的3-BPA和CPI-613两种药物共负载的PLGA纳米颗粒(C PI-613+3-BPA复合纳米颗粒)不仅在体外表现出协同性抗肿瘤效果，而且体内抗抑瘤效果也很显著。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种药物联用物，其特征在于，包括如下物质作为活性成分：
3-溴丙酮酸或其药学上可接受的盐以及
CPI-613或其药学上可接受的盐；
将所述活性成分共同配制或分开配制，用于配伍使用、同时使用或分开使用。
2.根据权利要求1所述的药物联用物，其特征在于，所述药物联用物为单剂量单位形式，包括4～16mg的3-溴丙酮酸或其药学上可接受的盐以及
4～16mg的CPI-613或其药学上可接受的盐。
3.根据权利要求1所述的药物联用物，其特征在于，所述药物联用物的剂型选自颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂中的一种。
4.根据权利要求1所述的药物联用物，其特征在于，所述药物联用物为纳米颗粒剂。
5.一种权利要求1～4任一项所述的药物联用物在制备抗肿瘤药物中的用途。
6.一种权利要求4所述的药物联用物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1)：将脂溶性的药物CPI-613和PLGA共同溶于二氯甲烷中，配置成油相溶液；
步骤2)：将水溶性药物3-溴丙酮酸溶解在水中，配置成水相溶液；
步骤3)：将步骤2)中水相溶液在涡旋条件下逐滴加入到步骤1)中的油相溶液中，冰浴条件下进行超声，得到第一乳浊液；
步骤4)：涡旋条件下，将步骤3)中超声后的第一乳浊液逐滴加入聚乙烯醇(PVA)水溶液中，然后冰浴超声，得到第二乳浊液；
步骤5)：将步骤4)中得到的第二乳浊液迅速倒入聚乙烯醇(PVA)水溶液中，15～35℃条件下，加速搅拌使第二乳浊液中有机溶剂二氯甲烷蒸发；
步骤6)：高速离心收集制备得到的纳米粒子，并用去离子水洗涤三次；
步骤7)：将步骤6)得到的纳米粒子分散在海藻糖的水溶液中，-50～-80℃冻干，储存于-20℃冰箱中备用。
7.根据权利要求6所述的药物联用物的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中，CPI-613与PLGA的质量比为(1～8):100。
8.根据权利要求6所述的药物联用物的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中，3-BPA的浓度为(1～100)×10-3mg/μL。
9.根据权利要求6所述的药物联用物的制备方法，其特征在于，所述步骤4)中，所述第一乳浊液在所述聚乙烯醇(PVA)水溶液中的终浓度为1～5(v/v)％。
10.根据权利要求6所述的药物联用物的制备方法，其特征在于，所述步骤5)中，所述第二乳浊液在所述聚乙烯醇(PVA)水溶液中浓度为0.1～0.5(v/v)％。
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