CN112725405A - 一种结核分枝杆菌的药物敏感性检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及药物敏感性检测领域，特别是涉及一种结核分枝杆菌的药物敏感性检测方法。本发明的结核分枝杆菌的药物敏感性检测方法，包括：S1：制备结核分枝杆菌菌液；S2：用含药物的培养基对S1中的结核分枝杆菌菌种进行培养；S3：对S2的培养物进行MPT64抗原检测，获得检测结果；S4：对S3的MPT64抗原检测结果进行分析，得出结核分枝杆菌药物敏感性结论。本发明的检测方法通过监测MPT64的分泌情况，反映出结核分枝杆菌在对应的待评估药物作用下的生长状况，最终实现对结核分枝杆菌的耐药性的评估。本发明的检测方法，可以同时检测结核分枝杆菌对多种药物的敏感性检测，不限于本发明所例举的利福平、异烟肼两种药物。

Description

一种结核分枝杆菌的药物敏感性检测方法
技术领域
本发明涉及药物敏感性检测领域，特别是涉及一种结核分枝杆菌的药物敏感性检测方法。
背景技术
耐多药结核病是对利福平和异烟肼这两种抗结核药物都具有耐药性的结核病，对其确诊需要进行细菌学确认并快速检测耐药性。目前应用于结核药物敏感性检测的技术分为表型法与基因法。其中世界卫生组织推荐广泛使用的绝对浓度法和比例法操作简单、经济等优点，比例法被认为是结核分枝杆菌药物敏感性检测的金标准，但耗时较长，在得到分离菌株后需要4～6周时间才能获得药敏结果。目前基于表型的药物敏感性检测方法中，以BACTECMGIT960和
Figure BDA0002919718140000011
3D为最常用，但是前者价格昂贵，后者检测时间最少为10天。此外，这两种表型检测方法的原理是基于微生物代谢产生的氧气和二氧化碳，并没有结核分枝杆菌特异性，无法排除污染。近年来，各种分子技术比如线性探针测定、DNA测序、Gene Xpert结核分枝杆菌/RIF等被开发成突变基因的快速筛查方法检测耐药结核分枝杆菌，他们比传统的表型药物敏感性检测要快。前者只能检测利福平的药物敏感性，后者虽然可以检测异烟肼药物敏感性，但是其检测异烟肼药物敏感性的灵敏度和特异度分别为84.44％～92.00％和94.93％～100.00％。在所有抗结核分枝杆菌药物中，利福平耐药基因研究的是最清楚的。检测利福平药物敏感性的分子方法主要基于结核分枝杆菌利福平耐药基因RpoB的突变，但是只有95％的结核分枝杆菌利福平耐药与该基因突变有关。
可见，虽然这些分子方法比传统的表型药物敏感性检测要快，但基于分子的检测方法只能检测与表型明确相关的耐药基因突变，无法识别未明确的耐药基因，导致了其较低的准确率，其次，这些分子技术除需要专门的仪器和训练人员，导致其无法全面普及而限制了该方法的应用。
因此，研发建立快速、准确、简便的药物敏感性检测方法是耐药结核病防治的重要之举。发展准确、及时、直接的结核分枝杆菌药敏试验方法，对于发现、正确治疗和控制耐药结核病的传播至关重要。
发明内容
基于此，本发明的目的在于，提供一种结核分枝杆菌的药物敏感性检测方法，能准确、及时、直接的检测出结核分枝杆菌的利福平、异烟肼或其它抗结核药物的药物敏感性情况。
本发明的技术方案如下：
一种结核分枝杆菌的药物敏感性检测方法，包括：
S1：制备结核分枝杆菌菌液；
S2：用含药物的培养基对S1中的结核分枝杆菌菌种进行培养；
S3：对S2的培养物进行MPT64抗原检测，获得检测结果；
S4：对S3的MPT64抗原检测结果进行分析，得出结核分枝杆菌药物敏感性结论。
进一步的，本发明的结核分枝杆菌的药物敏感性检测方法用于检测结核分枝杆菌的利福平和/或异烟肼的药物敏感性。
进一步的，所述S1：制备结核分枝杆菌菌液，包括：
S11：确认待检菌群：确认带检菌群为结核分枝杆菌；
S12：将待检的结核分枝杆菌菌群进行净化，并制成结核分枝杆菌菌液。
优选的，所述S12的净化操作包括：取待检结核分枝杆菌菌群置于生理盐水中，超声匀散为悬液，转移至离心管，10000-14000rpm离心10-15min，使结核分枝杆菌沉淀于管底壁，弃上清；重复此步骤操作2～3次，得到纯净的结核分枝杆菌菌体；再将该纯净的结核分枝杆菌菌体重悬，制成结核分枝杆菌菌液。此操作能充分去掉结核分枝杆菌菌体表面的分泌蛋白，如MPT64蛋白等，避免影响检测结果的准确性。离心操作优选12000rpm离心10min。
优选的，所述结核分枝杆菌菌液的浓度为0.1麦氏。
进一步的，所述S2的结核分枝杆菌菌种培养操作包括：
将S1制得的结核分枝杆菌菌液接种至含待评估药物的培养基上，于37℃培养7～10天。经验证培养7～10天具有最好的检测性能，且判读临界值不变。
优选的，所述结核分枝杆菌在培养基中的终浓度为0.01麦氏/7mL。
进一步的，待评估药物为利福平时，所述培养基中利福平的浓度为1.0μg/mL。
进一步的，待评估药物为异烟肼时，所述培养基中异烟肼的浓度为0.2μg/mL。
结核分枝杆菌接种的初始浓度与药物添加浓度的选择，会影响培养结束后培养物中MPT64抗原蛋白的浓度，从而进一步影响灰度比值，再影响到药物敏感性结论，而本方案中结核分枝杆菌接种的初始浓度与药物添加浓度是最佳的浓度值组合，按照本方案中结核分枝杆菌接种的初始浓度与药物添加浓度添加初始物可以使培养结束后培养物中MPT64抗原蛋白的浓度可控，再经过灰度比值对MPT64抗原蛋白浓度的微小差异性的弱化，最终无限缩小实验误差，使药物敏感性结论更加准确地反应了菌株实际的药物敏感性。
进一步的，所述S3：MPT64抗原检测，包括：采用胶体金免疫层析法对S2的培养物进行MPT64抗原检测，并收集检测结果；
优选的，所述S3还包括：进行MPT64抗原检测前，对步骤S2所得的培养物进行离心处理；离心条件为：10000～14000rpm离心5～10min，使固液分离，上清澄清；然后取上清液样本进行MPT64抗原检测。优选离心条件为：12000rpm离心5min。
进一步的，所述S4包括：
S41：对S3的检测结果进行成像处理，对所成的图像的条带进行灰度分析，得出样本检测条带的灰度值和质控条带的灰度值；
S42：计算灰度比值，并进行结果判读。
优选的，所述成像处理操作包括：采用成像仪的白光模式对检测结果进行成像处理。除此之外，也可以采用扫描仪对检测结果进行扫描成像。
优选的，所述S42中，灰度比值的计算方法为：设质控条带灰度值为“1”，计算样本检测带灰度值和质控带灰度值的灰度比值(样本检测带灰度值/质控带灰度值)。
优选的，所述S42中，判读标准包括：
待评估药物为利福平时，灰度比值大于0.23即可判断待检结核分枝杆菌为利福平耐药结核分枝杆菌；灰度比值低于0.23即可判断为利福平敏感结核分枝杆菌。
优选的，所述S42中，判读标准包括：
待评估药物为异烟肼时，灰度比值大于0.2即可判断待检结核分枝杆菌为异烟肼耐药结核分枝杆菌，灰度比值低于0.2即可判断为异烟肼敏感结核分枝杆菌。
本发明的结核分枝杆菌的药物敏感性检测方法，其应用包括但不限于检测结核分枝杆菌对利福平、异烟肼的药物敏感性，其他药物，如链霉素、乙氨丁醇、吡嗪酰胺等，也适用于本发明的结核分枝杆菌的药物敏感性检测方法，具体的将步骤S2中加入培养基中的利福平、异烟肼替代成待评估的其他抗结核药物即可。
本发明的有益效果：
本发明的检测方法通过监测MPT64的分泌情况，反映出结核分枝杆菌在对应的待评估药物作用下的生长状况，最终实现对结核分枝杆菌的耐药性的评估。本发明的检测方法，可以同时检测结核分枝杆菌对多种药物的敏感性检测，不限于本发明所例举的利福平、异烟肼两种药物。
本技术领域公认的，比例法、绝对浓度法等所需时间约6周，BACTEC MGIT960为10天，基因型法检测异烟肼的的灵敏度、特异度分别为84.44％～92.00％和94.93％～100.00％。相对于现有技术，本发明以检测结核分枝杆菌培养上清中MPT64含量为检测指标，检测结核分枝杆菌的利福平和异烟肼敏感性，其原理基于表型，具有结核分枝杆菌特异性，且大大缩短了检测时间，比比例法和绝对浓度法快速(7天)、高效(操作简单)，比BACTECMGIT960和
Figure BDA0002919718140000051
3D特异性好，价格便宜(成本价约为35元/个反应)，比基因型法特异度高(均为100％)。此外，该方法基于表型检测，亦可用于其它抗结核药物的药物敏感性检测。
本发明的检测方法以病原菌在实际生存环境中的最终表现为判断耐药与否的依据，相较于分子检测的方法只能检测与表型明确相关的耐药基因突变，而无法识别未明确的耐药基因的现状，本发明的检测方法反映出的耐药情况更接近病原菌的实际耐药情况，对临床应有提供了更可靠的依据。
本发明的检测方法，经校对与结核分枝杆菌药物敏感性检测的金标准比例法的检测结果无差异(P<0.05)，且检测性能很好，具有很好的市场价值，可广泛推广适用。
附图
图1为以MPT64指示的利福平和异烟肼耐药性检测的受试者工作特征曲线，其中S：敏感株；MDR：耐药株；*：P＜0.05；RFP：利福平；INH：异烟肼。
具体实施方式
在本说明书中提到或者可能提到的上、下、左、右、前、后、正面、背面、顶部、底部等方位用语是相对于其构造进行定义的，它们是相对的概念。因此，有可能会根据其所处不同位置、不同使用状态而进行相应地变化。所以，也不应当将这些或者其他的方位用语解释为限制性用语。
以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本公开相一致的所有实施方式。相反，它们仅是与如所附权利要求书中所详述的、本公开的一些方面相一致的方法的例子。
在本公开使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本公开。在本公开和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。还应当理解，本文中使用的术语“和/或”是指并包含一个或多个相关联的列出项目的任何或所有可能组合。
本申请实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。本申请实施例中所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购等途径获得的常规产品。
实施例一 结核分枝杆菌的利福平和/或异烟肼的药物敏感性检测
1设备与材料
实验所用的结核分枝杆菌菌株均源于呼吸疾病国家重点实验室结核病研究室的结核分枝杆菌菌株库，均已通过生化和分子方法鉴定为结核分枝杆菌、通过比例法鉴定菌株的药物敏感性。
结核分枝杆菌抗原检测试剂盒(胶体金法)，由杭州创新生物检控技术有限公司提供；
凝胶成像系统仪(BioRad)；
细菌超声分散仪BACspreaderTM 1100为广东体必康生物科技有限公司生产；
Middlebrook 7H10固体培养基和Middlebrook 7H9液体培养基购自美国BD 公司。
2药物敏感性检测试验
具体操作步骤包括：
S1：确认结核分枝杆菌后，取结核分枝杆菌置于生理盐水中，超声匀散为悬液，转移至离心管，12000rpm离心10min，弃上清；重复此步骤2～3次，充分去掉菌体表面的分泌蛋白，尤其是在此之前产生的MPT64抗原蛋白，得到纯净菌体；再用生理盐水重悬纯净菌体并调整菌浓度为0.1麦氏，得到结核分枝杆菌菌液。
此步骤中，在生理盐水洗涤后可用抗原检测试剂盒检验MPT64抗原蛋白是否去除干净。
S2：吸取上述菌液接种于药物培养基，使结核分枝杆菌的终浓度为0.01麦氏/7mL，药物培养基利福平与异烟肼的终浓度分别为1.0μg/mL和0.2μg/mL，于37℃培养7天。
S3：胶体金法检测MPT64抗原：取S2的培养物，12000rpm离心5min，按照产品说明书指示，取100μL上清加入结核分枝杆菌抗原检测试剂盒的检测板的样本孔内，室温放置15min后观察结果。出现质控带表示结果有效，无质控带出现表示试剂失效，需更换试剂重测；其中质控带和测试带都出现表示MPT64检测阳性；只有质控带则表示检测阴性。
S4：将S3中已出有效检测结果的各组检测板用BioRad成像仪白光模式分别成像，然后做条带灰度分析(软件名称：Image labTM 3.0)，得出条带灰度值；设质控条带灰度值为“1”，按照“样本检测带灰度值/质控带灰度值”的方式计算出灰度比值，然后根据灰度比值和判读标准，得出结核分枝杆菌的药物敏感性结论。
判读标准：
当利福平加药培养基上清的MPT64灰度比值大于0.23时判断待检结核分枝杆菌为利福平耐药结核分枝杆菌，低于此值时判断为利福平敏感菌。
当异烟肼加药培养基上清的MPT64灰度比值大于0.2时判断待检结核分枝杆菌为异烟肼耐药结核分枝杆菌，低于此值时判断为异烟肼敏感菌。
实施例二 本发明的核分枝杆菌的药物敏感性检测方法的检测性能评估
本实施例的核分枝杆菌的药物敏感性检测操作同实施例1。
药物作用7天时，基于MPT64抗原的胶体金法可准确鉴定结核分枝杆菌的利福平及异烟肼药物敏感性，根据受试者工作特征曲线(ROC)分析，该方法用于检测利福平耐药和异烟肼耐药的ROC曲线下面积均为1。经卡方检验，该方法与结核分枝杆菌药物敏感性检测的金标准比例法的检测结果无差异(P<0.05)，且检测性能很好，具有很好的市场价值，可广泛推广适用。
本发明的检测方法快速、准确性高，可以同时检测结核分枝杆菌对多种药物的敏感性检测，不限于本发明所例举的利福平、异烟肼两种药物，其他药物，如链霉素、乙氨丁醇、吡嗪酰胺，也适用于本发明的结核分枝杆菌的药物敏感性检测方法，具体的将步骤S2中加入培养基中的利福平、异烟肼替代成待评估的其他抗结核药物即可。
实施例三 药物处理时间的验证
分别进行结核分枝杆菌的利福平和/或异烟肼的药物敏感性检测，每种药物进行3组检测，在步骤S2中的培养时间分别选择3天、7天和10天，其他按照实施例一的操作步骤进行。
分别检测各药物处理3、7、10天时各菌株、各时间点MPT64检测带的灰度比值，依据灰度比值分别绘制以MPT64指示的利福平和异烟肼耐药性检测的受试者工作特征曲线，如图1所示。
结果显示：对于利福平和异烟肼，3天时受试者工作特征曲线线下面积分别为0.84和0.77；而7天和10天时，受试者工作特征曲线线下面积为1，可见药物处理7～10天时，该方法具有最好的检测性能。
实施例四 判读临界值的验证
选取12株结核分枝杆菌敏感株和11株耐多药株，参照实施例一的操作步骤进行实验，分析药物处理3天、7天、10天后MPT64检测带的灰度，通过受试者工作曲线计算该方法对结核分枝杆菌药物敏感性检测的检测性能，结果显示，待评估药物为利福平时，药物处理7天，最优的检测界值为0.23。并在另外的药敏结果(比例法)明确的34株结核分枝杆菌中验证该方法，其检测的灵敏度92.9％、特异度100.0％。基于此，将0.23作为检测结核分枝杆菌对利福平敏感性检测的判读临界值，即灰度比值大于0.23即可判断待检结核分枝杆菌为利福平耐药结核分枝杆菌；灰度比值低于0.23即可判断为利福平敏感结核分枝杆菌。
验证过程同上，待评估药物为异烟肼时，药物处理7天，最优的检测界值为0.2。并在另外的药敏结果(比例法)明确的34株结核分枝杆菌中验证该方法，其检测的灵敏度87.5％、特异度100.0％。基于此，将0.2作为检测结核分枝杆菌对异烟肼敏感性检测的判读临界值，即灰度比值大于0.2即可判断待检结核分枝杆菌为异烟肼耐药结核分枝杆菌，灰度比值低于0.2即可判断为异烟肼敏感结核分枝杆菌。
其他情况分析
MPT64是结核分枝杆菌早、中期生长繁殖过程中大量分泌的一种蛋白，在非结核分枝杆菌和卡介苗株中不存在，是能快速鉴别结核分枝杆菌的重要抗原。MPT64与结核分枝杆菌生长高度相关，理论上，体外液体培养结核分枝杆菌进行药敏试验时，若为敏感株，加入药物处理后，结核分枝杆菌生长抑制，MPT64分泌减少；相反，若为耐药株，加入药物处理后，则MPT64分泌不受影响。这也是本发明的理论基础。
何霞等学者(“应用MPT64为靶标快速检测结核分枝杆菌长的研究”，2010年)探讨了应用MPT64作为快速检测结核分枝杆菌生长指示的可能性，建立一种准确、快速、简便、易于普及开展的结核分枝杆菌生长检测方法(后文称“何的研究”)。结果证实应用MPT64为靶标快速检测结核分枝杆菌生长，结果准确、快速，操作简便。自此，MPT64作为评估结核分枝杆菌生长状况的指标得到了学界普遍认可。
之后，许婉华等学者(“应用MPT64分泌为结核杆菌生长指示的适宜检测时点研究”，实用医学杂志，2012年)探讨了应用免疫胶体金法检测结核分枝杆菌复合群特异分泌蛋白MPT64指示结核杆菌生长的适宜检测时间(后文称“许的研究”)。结果显示，在2、4周末可分别检测到60％与95％以上的MPT64阳性样本，可以分别视为快速检测和培养终点检测的适宜时点，这为创建新型、实用的结核杆菌分离培养方法提供了科学依据。本发明方案中，通过对菌种浓度、药物浓度等参数、参数关系的优化和精确控制，以及实验过程的一些具体辅助处理方式，如菌群净化操作、培养物检测前处理等，已经将检测时间点由在先公开的许的研究的第2周末提前到药物培养的第7-10天。
袁俐等学者(“异烟肼耐药菌株与敏感菌株MTB三个基因及其表达差异的研究”，2014年)通过对新疆地区收集的结核病患者的痰液进行分离培养并检测，比较了结核分枝杆菌异烟肼耐药株与敏感株fbpB，MPT64及psts1三个基因在DNA，mRNA及蛋白水平的差异性，筛选与结核分枝杆菌异烟肼耐药产生相关的蛋白(后文称“袁的研究”)。检测用异烟肼诱导处理后的异烟肼耐药株与敏感株的3个基因mRNA的表达水平，发现MPT64基因在结核分枝杆菌耐药株与敏感株中mRNA水平的差异均无统计学意义(P>0.05)，得出MPT64与结核分枝杆菌产生异烟肼耐药无关的结论。这看似与本发明结果相悖，其实不然。经过分析，认为袁的研究得出的结论是与其所采用的实验设计对应的，之所以与在先的何的研究结论不同，主要原因是袁的研究中异烟肼对菌株的诱导处理时间仅为72小时，而按照之前的研究，比如许的研究，72h时普通结核分枝杆菌菌株MPT64的分泌量较低，还不可被检测到，当然，也就更不可能体现出耐药株和敏感株的差异。为此，本发明也针对药物处理时间做了相应的实验验证，详见实施例三，结果显示按照本发明的优化后的处理方法操作，在严格控制每步骤的操作和参数精准度之后，药物处理3天也仍然不是最佳检测时机。这也在一定程度上与许的研究结论相互应证。
另外，关于药物浓度，袁的研究中用异烟肼对菌株进行处理的目的是诱导其MPT64基因发生变化，然后通过检测其mRNA表达水平获知异烟肼诱导下MPT64基因突变的情况。而本发明在何、许等的研究详细披露的理论基础上，基于作为临床应用的参考的目的，使用药物处理菌株的目的是杀死对药物敏感的菌株。虽然袁的研究中并未披露异烟肼的药物浓度，但诱导处理的药物浓度与杀菌的药物浓度是必然不同的，这是本领域技术人员均能明显得出的结论。
本发明用的是试剂盒对MPT64进行检测，而正如仇艳等学者(“中国结核分枝杆菌MPT64蛋白多态性及对MPT64抗原检测试剂盒的敏感性影响”，2015年)的研究表明的一样，中国结核分枝杆菌的MPT64蛋白存在多态性，63bp缺失会造成MPT64抗原检测试剂盒的假阴性(其中总数180株，8株菌有63bp的缺失，假阴性率约为4.4％)，而某些单位点突变对检测效率无影响。MPT64蛋白作为一项重要检测指标，其后期的研究应用前景之广是可以预期的，在进一步研究之前，MPT64蛋白多态性的一些基本情况则需要弄清楚。基于此，毛欣茹等学者(“结核分枝杆菌MPT64基因突变研究”2016)对MPT64蛋白的多态性做了进一步统计和分析，结果显示结核分枝杆菌MPT64基因突变频率很低(总共45株临床菌株，1株存在63bp的基因缺失突变，突变概率约为2.2％)。中国结核分枝杆菌的MPT64蛋白多态性的低发生率对本发明检测方法的影响可以忽略不计，不影响本发明的结核分枝杆菌的药物敏感性检测方法的普遍适用性。
本发明的检测方法通过监测MPT64的分泌情况，反映出结核分枝杆菌在对应的待评估药物培养基中的生长状况，最终实现对结核分枝杆菌的耐药性的评估。本发明的检测方法，可以同时检测结核分枝杆菌对多种药物的敏感性检测，不限于本发明所例举的利福平、异烟肼两种药物。
相对于现有技术，本发明以检测结核分枝杆菌培养上清中MPT64含量为检测指标，检测结核分枝杆菌的利福平和异烟肼敏感性，其原理基于表型，具有结核分枝杆菌特异性，且大大缩短了检测时间，比比例法和绝对浓度法快速(7天)、高效(操作简单)，比BACTECMGIT960和
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3D特异性好，价格便宜(成本价约为35元/个反应)，比基因型法特异度高(均为100％)。本发明的检测方法集多种现有技术的优点于一身，兼顾了检测准确度、检测效率和检测成本等问题。此外，该方法基于表型检测，亦可用于其它抗结核药物的药物敏感性检测。
本发明的检测方法以病原菌在实际生存环境中的最终表现为判断耐药与否的依据，相较于分子检测的方法只能检测与表型明确相关的耐药基因突变，而无法识别未明确的耐药基因的现状，本发明的检测方法反映出的耐药情况更接近病原菌的实际耐药情况，对临床应有提供了更可靠的依据。
本发明的检测方法，经校对与结核分枝杆菌药物敏感性检测的金标准比例法的检测结果无差异(P<0.05)，且检测性能很好，具有很好的市场价值，可广泛推广适用。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种结核分枝杆菌的药物敏感性检测方法，其特征在于，所述的检测方法包括步骤：
S1：制备结核分枝杆菌菌液；
S2：用含药物的培养基对S1中的结核分枝杆菌菌种进行培养；
S3：对S2的培养物进行MPT64抗原检测，获得检测结果；
S4：对S3的MPT64抗原检测结果进行分析，得出结核分枝杆菌药物敏感性结论。
2.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌的药物敏感性检测方法，其特征在于，所述S2中含药物的培养基中的药物包括利福平或异烟肼。
3.根据权利要求2所述的结核分枝杆菌的药物敏感性检测方法，其特征在于，所述S2中的药物为利福平时，含药物的培养基中利福平的浓度为1.0μg/mL；所述S2中的药物为异烟肼时，含药物的培养基中异烟肼的浓度为0.2μg/mL。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的结核分枝杆菌的药物敏感性检测方法，其特征在于，所述S1：制备结核分枝杆菌菌液，具体操作包括：
S11：确认待检菌为结核分枝杆菌；
S12：将待检的结核分枝杆菌菌群进行净化，并制成结核分枝杆菌菌液。
5.根据权利要求4所述的结核分枝杆菌的药物敏感性检测方法，其特征在于，所述S12的净化操作包括：取待检结核分枝杆菌菌群置于生理盐水中，超声匀散为悬液，转移至离心管，10000～14000rpm离心10～15min，弃上清；重复此操作2～3次，得到纯净的结核分枝杆菌菌体；再将该纯净的结核分枝杆菌菌体重悬，制成浓度为0.1麦氏的结核分枝杆菌菌液。
6.根据权利要求1-3任意一项所述的结核分枝杆菌的药物敏感性检测方法，其特征在于，所述S2的结核分枝杆菌菌种培养操作包括：
将S1制得的结核分枝杆菌菌液接种至含药物的培养基上，所述结核分枝杆菌在培养基中的终浓度为0.01麦氏/7mL，然后于37℃培养7～10天。
7.根据权利要求1-3任意一项所述的结核分枝杆菌的药物敏感性检测方法，其特征在于，所述S3：MPT64抗原检测，包括：对步骤S2所得的培养物进行离心处理；离心条件为：10000～14000rpm离心5～10min；然后取上清液样本，采用胶体金免疫层析法对其进行MPT64抗原检测，并收集检测结果。
8.根据权利要求1-3任意一项所述的结核分枝杆菌的药物敏感性检测方法，其特征在于，所述S4包括：
S41：对S3的检测结果进行成像处理，对所成的图像的条带进行灰度分析，得出样本检测条带的灰度值和质控条带的灰度值；
S42：计算灰度比值，并进行结果判读；
所述灰度比值的计算方法为：设质控条带灰度值为“1”，计算样本检测带灰度值和质控带灰度值的灰度比值。
9.根据权利要求8所述的结核分枝杆菌的药物敏感性检测方法，其特征在于，所述S42中，判读标准包括：
当所述S2中含药物的培养基中的药物为利福平时，灰度比值大于0.23即可判断待检结核分枝杆菌为利福平耐药结核分枝杆菌；灰度比值低于0.23即可判断为利福平敏感结核分枝杆菌；
当所述S2中含药物的培养基中的药物为异烟肼时，灰度比值大于0.2即可判断待检结核分枝杆菌为异烟肼耐药结核分枝杆菌，灰度比值低于0.2即可判断为异烟肼敏感结核分枝杆菌。
10.根据权利要求1-9任意一项所述的的结核分枝杆菌的药物敏感性检测方法，其特征在于，所述检测方法还可适用于检测结核分枝杆菌对链霉素、乙氨丁醇或吡嗪酰胺的药物敏感性检测；具体的操作包括：步骤S2中加入培养基中的待评估药物为链霉素、乙氨丁醇或吡嗪酰胺。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101377495A (zh) * 2008-09-11 2009-03-04 郑州安图绿科生物工程有限公司 一种结核分枝杆菌快速药敏检测试剂盒及其检测方法
US20140256664A1 (en) * 2011-05-13 2014-09-11 University Of Virginia Patent Foundation Compositions and methods for a mycobacterium tuberculosis drug susceptibility test
CN206450598U (zh) * 2017-01-22 2017-08-29 武汉璟泓万方堂医药科技股份有限公司 胶体金荧光定量分析一体机
WO2018082257A1 (zh) * 2016-11-05 2018-05-11 深圳市前海安测信息技术有限公司 基于胶体金试纸条的生物标志物检测系统及方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101377495A (zh) * 2008-09-11 2009-03-04 郑州安图绿科生物工程有限公司 一种结核分枝杆菌快速药敏检测试剂盒及其检测方法
US20140256664A1 (en) * 2011-05-13 2014-09-11 University Of Virginia Patent Foundation Compositions and methods for a mycobacterium tuberculosis drug susceptibility test
WO2018082257A1 (zh) * 2016-11-05 2018-05-11 深圳市前海安测信息技术有限公司 基于胶体金试纸条的生物标志物检测系统及方法
CN206450598U (zh) * 2017-01-22 2017-08-29 武汉璟泓万方堂医药科技股份有限公司 胶体金荧光定量分析一体机

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
尹小毛等: "应用MPT64检测建立结核分枝杆菌药敏新方法的初步探索", 《实验与检验医学》 *
徐礼锋等: "液体分枝杆菌培养管培养联合结核分枝杆菌分泌蛋白64免疫胶体金检测法在快速鉴定结核分枝杆菌中的应用", 《中国卫生检验杂志》 *
王浩等: "Sensititre结核药敏板检测结核分枝杆菌药敏的方法学研究", 《河北医科大学学报》 *
穆成: "结核分枝杆菌药敏试验表型检测法的新进展", 《中国卫生检验杂志》 *
陈俊林等: "结核分枝杆菌胶体金法对分枝杆菌菌型快速鉴别价值探讨", 《医学综述》 *
陈振华等: "结核分枝杆菌固体培养结合不同分子生物学检测的应用分析", 《临床检验杂志》 *

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