CN112724278A - 一种透明质酸接枝共聚物及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种透明质酸接枝共聚物及其制备方法。本发明的透明质酸接枝共聚物粉末具有优良的水溶性，其在缓解眼干的同时，还可以润洗、清理隐形眼镜表面的污渍，从而使得透明质酸更易浸润于镜片中，提高保湿效果。并且此种透明质酸衍生物无毒性，具有比透明质酸更佳的细胞增殖效果，可降低炎症反应，进一步提高了隐形眼镜配戴的舒适度。此产品制备工艺简单，环保，适合工业化生产，该产品在日化领域有良好的应用前景。

Description

一种透明质酸接枝共聚物及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种透明质酸接枝共聚物及其制备方法和用途。
背景技术
透明质酸具有良好的保湿作用，被誉为理想的天然保湿因子。透明质酸应用于日化领域中有以下作用：(1)保湿作用。(2)营养作用。(3)皮肤损伤的修复和预防作用。(4)润滑性和成膜性。(5)增稠性。
透明质酸强效的锁水保湿效果给隐形眼镜相关研发带来无穷遐想。由于现代人们使用电子屏幕非常普及，眼干人群越来越多，越来越严重，加重了配戴隐形眼镜的不适。将透明质酸添加到隐形眼镜护理液中，通过长时间浸泡，隐形眼镜吸收了大量透明质酸，其佩戴后可缓慢释放，锁住泪液中的水份，减缓蒸发，从而达到锁水保湿的作用。比如高含水次抛镜片，由于镜片含水量高，水份蒸发快，非常不适合眼干的人佩戴，通过在护理液中添加透明质酸，即可使得配戴日抛镜片的人眼干症状得到缓解。
但是，当隐形眼镜被佩带在眼睛上时，会在隐形眼镜上形成诸如蛋白，脂类和钙的沉积物。蛋白等沉积物在隐形眼镜表面上积累，会导致刺激和不舒服，并且还会阻碍透明质酸等物质的浸润。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明提供一种透明质酸接枝共聚物及其制备方法和用途。
具体来说，本发明涉及如下方面：
1、一种透明质酸接枝共聚物，其特征在于，所述共聚物的通式如式(I)所示：
Figure BDA0002856929310000021
其中，式(I)中R为
Figure BDA0002856929310000022
n为1至7443的整数。
2、根据项1所述的共聚物，其特征在于，n＝n1+n2，所述基团为
Figure BDA0002856929310000023
n1个，
Figure BDA0002856929310000024
为n2个，其中n1为正整数，n2为正整数。
3、根据项2所述的共聚物，其特征在于，n1与n的比值为0.01％-10％，优选为0.04％-2％。
4、根据项1所述的共聚物，其特征在于，m为1至12的整数。
5、一种透明质酸接枝共聚物的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
将透明质酸或其盐用N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐进行羧基活化；
将活化后的透明质酸或其盐与接枝物进行反应；
反应结束后，对反应产物进行分离纯化、干燥得到透明质酸接枝共聚物。
6、根据项5所述的方法，其特征在于，所述接枝物选自2-氨基乙醇、氨基-二聚乙二醇、氨基-三聚乙二醇、氨基-四聚乙二醇、氨基-五聚乙二醇、氨基-六聚乙二醇、氨基-七聚乙二醇、氨基-八聚乙二醇、氨基-九聚乙二醇、氨基-十聚乙二醇、氨基-十一聚乙二醇、氨基-十二聚乙二醇中的一种或两种以上。
7、根据项5所述的方法，其特征在于，所述羧基活化步骤包括：
将透明质酸或其盐溶解在水中，加入N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，并调节所形成溶液的pH为4-6，反应10-120分钟；
其中，所述透明质酸或其盐在所述溶液中的浓度为0.001-0.012g/ml，优选为0.005-0.010g/ml。
8、根据项5所述的方法，其特征在于，所述透明质酸或其盐的分子量为1×106-3×106Da。
9、根据项5所述的方法，其特征在于，所述透明质酸或其盐的双糖单元与所述接枝物的摩尔比为1:0.05-0.3，优选为1：0.10-0.25。
10、项1-4任一项所述的共聚物或项5-9任一项所述的方法制备得到的共聚物，在保湿和抗炎中的用途。
11.一种保湿和抗炎用组合物，其包含项1-4中任一项所述的共聚物或项5-9任一项所述的方法制备得到的共聚物。
12.一种隐形眼镜护理液，其包含项1-4中任一项所述的共聚物或项5-9任一项所述的方法制备得到的共聚物。
13.一种眼药水，其包含项1-4中任一项所述的共聚物或项5-9任一项所述的方法制备得到的共聚物。
本发明的透明质酸接枝共聚物粉末具有优良的水溶性，其在缓解眼干的同时，还可以润洗、清理隐形眼镜表面的污渍，从而使得透明质酸更易浸润于镜片中，提高保湿效果。并且此种透明质酸衍生物无毒性，具有比透明质酸更佳的细胞增殖效果，可降低炎症反应，进一步提高了隐形眼镜配戴的舒适度。此产品制备工艺简单，环保，适合工业化生产，该产品在日化领域有良好的应用前景。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明，应当理解，实施例仅用于进一步说明和阐释本发明，并非用于限制本发明。
除非另外定义，本说明书中有关技术的和科学的术语与本领域内的技术人员所通常理解的意思相同。虽然在实验或实际应用中可以应用与此间所述相似或相同的方法和材料，本文还是在下文中对材料和方法做了描述。在相冲突的情况下，以本说明书包括其中定义为准，另外，材料、方法和例子仅供说明，而不具限制性。以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但不用来限制本发明的范围。
本发明提供一种透明质酸接枝共聚物，所述共聚物的通式如式(I)所示：
Figure BDA0002856929310000041
其中，式(I)中R为
Figure BDA0002856929310000042
n为1至7444的整数，例如可以为1、2、3、4、10、100、200、500、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、7200、7400、7443。
接枝，是指大分子链上通过化学键结合适当的支链或功能性侧基的反应，所形成的产物称作接枝共聚物。接枝共聚物的性能决定于主链和支链的组成，结构，长度以及支链数。长支链的接枝物类似共混物，支链短而多，大接枝物则类似无规则共聚物。通过共聚，可将两种性质不同的聚合物接枝在一起，形成性能特殊的接枝物。因此，聚合物的接枝改性，已成为扩大聚合物应用领域，改善高分子材料性能的一种简单又行之有效的方法。
进一步地，n＝n1+n2，
Figure BDA0002856929310000043
为n1个，
Figure BDA0002856929310000044
为n2个，其中n1为正整数，n2为正整数。n1为正整数则n1不等于0，这表示透明质酸接枝共聚物中必须含有
Figure BDA0002856929310000045
由于R为n1与n的比值，即为透明质酸接枝共聚物的接枝基团
Figure BDA0002856929310000046
的取代度，其大小表示透明质酸接枝共聚物中接枝基团所占比例的大小。
取代度可以通过以下方式测量：
(1)溶液处理
酶解缓冲液：称取磷酸二氢钠2.74g和磷酸氢二钠0.88g于100ml容量瓶中溶解并定容。取一定量该溶液稀释40倍得5mmol/L酶解缓冲液。
10mmol/L乙酸铵溶液：称取0.7708g乙酸铵于烧杯中，加入1000ml超纯水溶解混匀，过0.22μm滤膜，超声排气泡后备用。
供试品溶液：称取供试品10mg(透明质酸接枝共聚物粉末)于10ml容量瓶中加入酶解缓冲液5ml，加入透明质酸酶1.0ml于42摄氏度水浴酶解2h，沸水浴中灭活3min，放至室温，酶解缓冲液定容，备用。
(2)将供试品溶液使用分子排阻色谱法进行检测
其中，色谱条件如下：
色谱柱：SuperdexTM 75
进样量：20μl
流速：0.5ml/min
柱温：35℃
流动相：10mmol/L
波长：232nm
(3)使用以下的公式计算取代度。
Figure BDA0002856929310000051
在一个具体的实施方式中，n1与n的比值为0.01％-10％，例如可以为0.01％、0.1％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％，优选为0.04％-2％。
在一个具体的实施方式中，m为1至12的整数，例如m可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12。
本发明还提供一种透明质酸接枝共聚物的制备方法，所述方法包括以下步骤：
将透明质酸或其盐用N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐进行羧基活化；
将活化后的透明质酸或其盐与接枝物进行反应；
反应结束后，对反应产物进行分离纯化、干燥得到透明质酸接枝共聚物。
其中，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)也称为N-羟基琥珀酰亚胺，是白色至类白色结晶，用于合成氨基酸保护剂、半合成卡那霉素及医药中间体。羟基丁二酰亚胺，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)的中文别名：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基-碳二亚胺盐酸盐；1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐；1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐；1-(3-二甲胺丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；1-乙基-3-(3-二甲基铵丙基)碳铵；1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺，通常作为半抗原的偶联剂。
其中，所述羧基活化步骤包括：
将透明质酸或其盐溶解在水中，加入N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，并调节所形成溶液的pH为4-6，例如可以使用1mol/L盐酸调节溶液pH值，反应10-120分钟；
其中，所述透明质酸或其盐在所述溶液中的浓度为0.001-0.012g/ml，例如可以为0.001g/ml、0.002g/ml、0.003g/ml、0.004g/ml、0.005g/ml、0.006g/ml、0.007g/ml、0.008g/ml、0.009g/ml、0.01g/ml、0.011g/ml、0.012g/ml，优选为0.005-0.010g/ml。
在一个具体的实施方式中，所述的透明质酸或其盐的双糖单元与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)的摩尔比为1:0.10-0.25，透明质酸或其盐的双糖单元与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的摩尔比为1:0.10-0.25。
其中，对反应产物进行分离纯化、干燥的步骤可以采用现有技术中任何已知的技术。在一个具体实施方式中，向反应液中加入反应液体积1.4倍体积的有机溶剂沉淀，脱水，抽滤，得湿粉末，进一步将湿粉末30-40℃真空干燥箱干燥，得到透明质酸接枝共聚物。有机溶剂可以为乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇和乙醚中的一种或几种。
在一个具体的实施方式中，所述接枝物选自2-氨基乙醇、氨基-二聚乙二醇、氨基-三聚乙二醇、氨基-四聚乙二醇、氨基-五聚乙二醇、氨基-六聚乙二醇、氨基-七聚乙二醇、氨基-八聚乙二醇、氨基-九聚乙二醇、氨基-十聚乙二醇、氨基-十一聚乙二醇、氨基-十二聚乙二醇中的一种或两种以上。
其中，氨基聚乙二醇是在聚乙二醇的一端连接有氨基。聚乙二醇是一种化合物，化学式是HO(CH2CH2O)nH，其系列产品无刺激性，味微苦，具有良好的水溶性，并与许多有机物组份有良好的相溶性。它们具有优良的润滑性、保湿性、分散性、粘接剂、抗静电剂及柔软剂等，在化妆品、制药、化纤、橡胶、塑料、造纸、油漆、电镀、农药、金属加工及食品加工等行业中均有着极为广泛的应用。
在一个具体的实施方式中，所述透明质酸或其盐的分子量为1×106-3×106Da，例如可以为1×106Da、1.5×106Da、2×106Da、2.5×106Da、3×106Da。
在一个具体的实施方式中，所述透明质酸或其盐的双糖单元与所述接枝物的摩尔比为1:0.05-0.3，例如可以为1:0.05、1:0.1、1:0.15、1:0.2、1:0.25、1:0.3优选为1：0.10-0.25。
本发明还提供上述制备方法制备得到的透明质酸接枝共聚物。
本发明的透明质酸接枝共聚物除了保持透明质酸本身的保湿等性能，相比透明质酸由于降低了表面张力，使得其具有更好的清洁效果，通过细胞毒性测试，表明这种物质具有更佳的细胞增殖效果，从而降低炎症反应。具体的，使用本发明的透明质酸接枝共聚物后对HCEC细胞干燥损伤具有良好的修复作用，与对应的透明质酸钠的效果相当。而细胞相对增殖率的结果则显示本发明的透明质酸接枝共聚物，对小鼠成纤维细胞L929无明显细胞毒性，而且其细胞增殖率明显高于单一的透明质酸，因此，可以看出本申请的酰胺化透明质酸衍生物具有更好的抗炎效果。
利用该透明质酸接枝共聚物的上述性质，可以在隐形眼镜护理液或者眼药水中进行应用。
本发明还提供一种保湿和抗炎用组合物，其包含上述的共聚物或上述的方法制备得到的共聚物。
本发明还提供一种隐形眼镜护理液，其包含上述的共聚物或上述的方法制备得到的共聚物。
本发明还提供一种眼药水，其包含上述的共聚物或上述的方法制备得到的共聚物。
实施例
实施例1
15℃条件下，准确量取100ml纯化水，加入100.00mg透明质酸钠(分子量1×106Da)，透明质酸充分溶解后，用1mol/L盐酸调节溶液pH值为4.50，加入2.80mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)搅拌至溶解，加入4.75mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)，活化10min，加入1.30mg氨基-二聚乙二醇，20个小时后结束反应。加入140ml乙醇沉淀，静置，倒掉上清液后，乙醇脱水两次，抽滤，将湿粉末放入真空干燥箱中30℃干燥过夜，得透明质酸接枝共聚物粉末。测定得到上述粉末取代度为0.01％。
实施例2
25℃条件下，准确量取100ml纯化水，加入1.20g透明质酸钠(分子量3×106Da)，透明质酸充分溶解后，用1mol/L盐酸调节溶液pH值为5.50，加入0.08g N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)搅拌至溶解，加入0.14g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)，活化120min，加入0.09g氨基-二聚乙二醇，20个小时后结束反应。加入140ml乙醇沉淀，静置，倒掉上清液后，乙醇脱水两次，抽滤，将湿粉末放入真空干燥箱中40℃干燥过夜，得透明质酸接枝共聚物粉末。测定得到上述粉末取代度为10.00％。
实施例3
23℃条件下，准确量取100ml纯化水，加入100.00mg透明质酸钠(分子量2×106Da)，透明质酸充分溶解后，用1mol/L盐酸调节溶液pH值为4.70，加入5.70mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)搅拌至溶解，加入9.03mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)，活化60min，加入5.20mg氨基-二聚乙二醇，20个小时后结束反应。加入140ml乙醇沉淀，静置，倒掉上清液后，乙醇脱水两次，抽滤，将湿粉末放入真空干燥箱中40℃干燥过夜，得透明质酸接枝共聚物粉末。测定得到上述粉末取代度为7.26％。
实施例4
23℃条件下，准确量取100ml纯化水，加入100.00mg透明质酸钠(分子量2×106Da)，透明质酸充分溶解后，用1mol/L盐酸调节溶液pH值为4.70，加入5.70mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)搅拌至溶解，加入9.03mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)，活化60min，加入3.02mg 2-氨基乙醇，20个小时后结束反应。加入140ml乙醇沉淀，静置，倒掉上清液后，乙醇脱水两次，抽滤，将湿粉末放入真空干燥箱中40℃干燥过夜，得透明质酸接枝共聚物粉末。测定得到上述粉末取代度为8.58％。
实施例5
23℃条件下，准确量取100ml纯化水，加入100.00mg透明质酸钠(分子量2×106Da)，透明质酸充分溶解后，用1mol/L盐酸调节溶液pH值为4.70，加入5.70mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)搅拌至溶解，加入9.03mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)，活化60min，加入7.38mg氨基-三聚乙二醇，20个小时后结束反应。加入140ml乙醇沉淀，静置，倒掉上清液后，乙醇脱水两次，抽滤，将湿粉末放入真空干燥箱中40℃干燥过夜，得透明质酸接枝共聚物粉末。测定得到上述粉末取代度为5.14％。
实施例6
23℃条件下，准确量取100ml纯化水，加入100.00mg透明质酸钠(分子量2×106Da)，透明质酸充分溶解后，用1mol/L盐酸调节溶液pH值为4.70，加入5.70mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)搅拌至溶解，加入9.03mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)，活化60min，加入9.55mg氨基-四聚乙二醇，20个小时后结束反应。加入140ml乙醇沉淀，静置，倒掉上清液后，乙醇脱水两次，抽滤，将湿粉末放入真空干燥箱中40℃干燥过夜，得透明质酸接枝共聚物粉末。测定得到上述粉末取代度为3.97％。
实施例7
23℃条件下，准确量取100ml纯化水，加入100.00mg透明质酸钠(分子量2×106Da)，透明质酸充分溶解后，用1mol/L盐酸调节溶液pH值为4.70，加入5.70mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)搅拌至溶解，加入9.03mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)，活化60min，加入11.73mg氨基-五聚乙二醇，20个小时后结束反应。加入140ml乙醇沉淀，静置，倒掉上清液后，乙醇脱水两次，抽滤，将湿粉末放入真空干燥箱中40℃干燥过夜，得透明质酸接枝共聚物粉末。测定得到上述粉末取代度为1.85％。
实施例8
23℃条件下，准确量取100ml纯化水，加入100.00mg透明质酸钠(分子量2×106Da)，透明质酸充分溶解后，用1mol/L盐酸调节溶液pH值为4.70，加入5.70mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)搅拌至溶解，加入9.03mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)，活化60min，加入13.91mg氨基-六聚乙二醇，20个小时后结束反应。加入140ml乙醇沉淀，静置，倒掉上清液后，乙醇脱水两次，抽滤，将湿粉末放入真空干燥箱中40℃干燥过夜，得透明质酸接枝共聚物粉末。测定得到上述粉末取代度为1.18％。
实施例9
23℃条件下，准确量取100ml纯化水，加入100.00mg透明质酸钠(分子量2×106Da)，透明质酸充分溶解后，用1mol/L盐酸调节溶液pH值为4.70，加入5.70mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)搅拌至溶解，加入9.03mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)，活化60min，加入16.09mg氨基-七聚乙二醇，20个小时后结束反应。加入140ml乙醇沉淀，静置，倒掉上清液后，乙醇脱水两次，抽滤，将湿粉末放入真空干燥箱中40℃干燥过夜，得透明质酸接枝共聚物粉末。测定得到上述粉末取代度为0.86％。
实施例10
23℃条件下，准确量取100ml纯化水，加入100.00mg透明质酸钠(分子量2×106Da)，透明质酸充分溶解后，用1mol/L盐酸调节溶液pH值为4.70，加入5.70mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)搅拌至溶解，加入9.03mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)，活化60min，加入18.27mg氨基-八聚乙二醇，20个小时后结束反应。加入140ml乙醇沉淀，静置，倒掉上清液后，乙醇脱水两次，抽滤，将湿粉末放入真空干燥箱中40℃干燥过夜，得透明质酸接枝共聚物粉末。测定得到上述粉末取代度为0.54％。
实施例11
23℃条件下，准确量取100ml纯化水，加入100.00mg透明质酸钠(分子量2×106Da)，透明质酸充分溶解后，用1mol/L盐酸调节溶液pH值为4.70，加入5.70mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)搅拌至溶解，加入9.03mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)，活化60min，加入20.44mg氨基-九聚乙二醇，20个小时后结束反应。加入140ml乙醇沉淀，静置，倒掉上清液后，乙醇脱水两次，抽滤，将湿粉末放入真空干燥箱中40℃干燥过夜，得透明质酸接枝共聚物粉末。测定得到上述粉末取代度为0.31％。
实施例12
23℃条件下，准确量取100ml纯化水，加入100.00mg透明质酸钠(分子量2×106Da)，透明质酸充分溶解后，用1mol/L盐酸调节溶液pH值为4.70，加入5.70mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)搅拌至溶解，加入9.03mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)，活化60min，加入22.62mg氨基-十聚乙二醇，20个小时后结束反应。加入140ml乙醇沉淀，静置，倒掉上清液后，乙醇脱水两次，抽滤，将湿粉末放入真空干燥箱中40℃干燥过夜，得透明质酸接枝共聚物粉末。测定得到上述粉末取代度为0.09％。
实施例13
23℃条件下，准确量取100ml纯化水，加入100.00mg透明质酸钠(分子量2×106Da)，透明质酸充分溶解后，用1mol/L盐酸调节溶液pH值为4.70，加入5.70mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)搅拌至溶解，加入9.03mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)，活化60min，加入24.80mg氨基-十一聚乙二醇，20个小时后结束反应。加入140ml乙醇沉淀，静置，倒掉上清液后，乙醇脱水两次，抽滤，将湿粉末放入真空干燥箱中40℃干燥过夜，得透明质酸接枝共聚物粉末。测定得到上述粉末取代度为0.05％。
实施例14
23℃条件下，准确量取100ml纯化水，加入100.00mg透明质酸钠(分子量2×106Da)，透明质酸充分溶解后，用1mol/L盐酸调节溶液pH值为4.70，加入5.70mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)搅拌至溶解，加入9.03mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)，活化60min，加入26.98mg氨基-十二聚乙二醇，20个小时后结束反应。加入140ml乙醇沉淀，静置，倒掉上清液后，乙醇脱水两次，抽滤，将湿粉末放入真空干燥箱中40℃干燥过夜，得透明质酸接枝共聚物粉末。测定得到上述粉末取代度为0.02％。
实施例15
23℃条件下，准确量取100ml纯化水，加入100.00mg透明质酸钠(分子量2×106Da)，透明质酸充分溶解后，用1mol/L盐酸调节溶液pH值为4.70，加入5.70mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)搅拌至溶解，加入9.03mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)，活化60min，加入13.49mg氨基-十二聚乙二醇和1.51mg 2-氨基乙醇，20个小时后结束反应。加入140ml乙醇沉淀，静置，倒掉上清液后，乙醇脱水两次，抽滤，将湿粉末放入真空干燥箱中40℃干燥过夜，得透明质酸接枝共聚物粉末。测定得到上述粉末取代度为2.45％。
具体上述各实施例的反应物加入量及条件如表1所示，其中取代度的测量使用上述的分子排阻色谱法。
表1
Figure BDA0002856929310000111
Figure BDA0002856929310000121
应用例1透明质酸接枝共聚物对角膜上皮细胞干燥损伤的修复作用
1)铺板：取对数生长期的HCEC，以5×104个/mL密度接种于96孔板，每孔100uL，培养体系是DMEM高糖培养液，添加10％胎牛血清，接种的细胞置二氧化碳培养箱37℃、5％CO2常规培养24h。
2)样品溶液配制：用无血清DMEM培养液配制成一定浓度的储备液，并0.22μm滤膜过滤除菌，临用时稀释至所需的终浓度。
3)干燥：对照组用封口膜封住，干燥模型组及加药组弃去培养液，放入干燥器中(温度24.6℃，相对湿度10％)干燥30分钟。
3)加药：加药组换成100μL的实施例2、实施例15和透明质酸钠(2×106Da)的样品，样品的质量浓度分别为0.05％，0.10％,，干燥模型组加入等量无血清培养液，正常对照组加入等量无血清培养液，每个水平6个平行孔。
4)检测：继续培养24小时后每孔加入10μL WST-1，放入细胞培养箱中继续孵育2h。于450nm波长处用酶标仪测定光吸收值，计算细胞相对增殖率。
表2
样品对HCEC细胞干燥损伤的修复作用
Figure BDA0002856929310000122
Figure BDA0002856929310000131
从上述实验可以看出，实施例2、实施例15和透明质酸钠在0.05-0.1％浓度范围内，对HCEC细胞干燥损伤都具有修复作用，而且实施例2、实施例15和透明质酸钠对HCEC细胞干燥损伤的修复作用效果基本相同。
应用例2细胞毒性评价
(1)体外细胞毒性试验(ISO 19003-5:2009,IDT)参照GB/TA 16886.5-2017医疗器械生物学评价第5部分。
(2)选择实施例3、实施例7制备的得到的透明质酸接枝共聚物和分子量为2×106Da的透明质酸钠作样品进行实验。
(3)铺板：取对数生长期小鼠成纤维细胞L929，以5×104个/ml密度接种于96孔板，每孔100μl，培养体系为1640培养液，添加10％胎牛血清，接种的细胞置于二氧化碳培养箱37℃、5％CO2常规培养24h。
(4)样品溶液配制：样品以无血清培养配制，0.22μm滤膜过滤除菌，并用无血清培养液稀释至0.1％、0.05％的使用浓度。
(5)加药：常规培养24h后，弃培养基，实验组换成100μl样品，正常对照组加入等量无血清培养液，每个药物浓度设置6个平行孔。
(6)检测：继续培养24h后，采用WST-1法检测细胞相对增殖率。弃培养液，每孔加入100μl用PBS稀释10倍的WST-1，放入细胞培养箱中继续孵育3h，于450nm波长处用酶标仪测定吸光度。相对增殖率(RGR)为实验组吸光度与正常对照组吸光度的比值。按照GB/TA16886.5-2017的要求，RGR低于70％时，认为样品具有细胞毒性。
表3细胞相对增殖率(％)
Figure BDA0002856929310000132
Figure BDA0002856929310000141
从上述实验可以看出，实施例3和实施例7在0.05-0.1％质量浓度范围内，对小鼠成纤维细胞L929无明显细胞毒性，而且其细胞增殖率明显高于单一的透明质酸，因此，可以看出本申请的酰胺化透明质酸衍生物具有更好的抗炎效果。

Claims (10)

1.一种透明质酸接枝共聚物，其特征在于，所述共聚物的通式如式(I)所示：
Figure FDA0002856929300000011
其中，式(I)中R为
Figure FDA0002856929300000012
n为1至7444的整数。
2.根据权利要求1所述的共聚物，其特征在于，n＝n1+n2，
Figure FDA0002856929300000013
为n1个，
Figure FDA0002856929300000014
为n2个，其中n1为正整数，n2为正整数。
3.根据权利要求2所述的共聚物，其特征在于，n1与n的比值为0.01％-10％，优选为0.04％-2％。
4.根据权利要求1所述的共聚物，其特征在于，m为1至12的整数。
5.一种透明质酸接枝共聚物的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
将透明质酸或其盐用N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐进行羧基活化；
将活化后的透明质酸或其盐与接枝物进行反应；
反应结束后，对反应产物进行分离纯化、干燥得到透明质酸接枝共聚物。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述接枝物选自2-氨基乙醇、氨基-二聚乙二醇、氨基-三聚乙二醇、氨基-四聚乙二醇、氨基-五聚乙二醇、氨基-六聚乙二醇、氨基-七聚乙二醇、氨基-八聚乙二醇、氨基-九聚乙二醇、氨基-十聚乙二醇、氨基-十一聚乙二醇、氨基-十二聚乙二醇中的一种或两种以上。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述羧基活化步骤包括：
将透明质酸或其盐溶解在水中，加入N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，并调节所形成溶液的pH为4-6，反应10-120分钟；
其中，所述透明质酸或其盐在所述溶液中的浓度为0.001-0.012g/ml，优选为0.005-0.010g/ml。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述透明质酸或其盐的分子量为1×106-3×106Da。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述透明质酸或其盐的双糖单元与所述接枝物的摩尔比为1:0.05-0.3，优选为1：0.10-0.25。
10.权利要求1-4任一项所述的共聚物或权利要求5-9任一项所述的方法制备得到的共聚物，在保湿和抗炎中的用途。
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