CN112710833A - 基于微管流控芯片的细胞捕获方法 - Google Patents

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Abstract

一种基于微管流控芯片的细胞捕获方法，通过化学修饰方法在微米直径高分子聚合物微管内壁修饰G蛋白，然后嫁接带有Ig‑G的抗体，使管壁吸附抗体；将样本流入微管流控芯片，再利用免疫荧光技术对捕获到的目标有核细胞进行鉴定。本发明利用有核细胞在血流中的趋壁边集效应以及细胞抗原抗体特异性粘附特点分离全血中的有核细胞，无需提前裂红或离心去除成熟红细胞，解决了传统分离方法操作复杂，耗时等问题，具有简单，便捷，快速且准确可靠的特性。

Description

基于微管流控芯片的细胞捕获方法
技术领域
本发明涉及的是一种医学检测领域的技术，具体是一种从全血中基于微管流控芯片的细胞捕获方法。
背景技术
稀有细胞指在人体中含量极低的细胞，包括孕妇外周血中的胎儿有核红细胞，癌症病人外周血中的循环肿瘤细胞，每毫升血液仅有个位至十位数，其含量相当于白细胞的十万分之一，成熟红细胞的亿分之一。稀有细胞在外周血中含量很低，不易获得，但却具有重要的临床意义。传统的稀有有核细胞富集技术主要分为亲和性富集与物理富集法。
其中物理富集主要依赖于目标细胞特殊的大小，密度与变形性进行分离，较为常见的有密度梯度离心法(DGC)，基于细胞大小的过滤法等。传统的物理富集方法需先通过密度梯度离心或红细胞裂解去除成熟红细胞的干扰，然而这一过程会造成细胞活性受损以及细胞丢失，且分离的准确性与特异性不高。
亲和性富集利用细胞表面抗原与对应抗体的特异性结合特点捕获目标细胞，典型的亲和性富集方法有荧光激活细胞分离(FACS)与磁珠分选法(MACS)等。其中FACS方法分离通量大，纯度高，但是检测平台的搭建非常繁琐并且价格昂贵，且对技术人员的操作要求较高。并且通过免疫荧光分选稀有细胞的结果可能会受到一些其他干扰，比如非特异标记，数据阈值的选取等。MACS方法通过在磁珠表面涂敷与靶细胞特定位点结合的特异性抗体捕获目标细胞，分离纯度较高，但容易造成样本污染以及由于剪切力造成的细胞破坏。
微流控技术的发展为传统分离方法操作繁琐，成本高的问题提供了解决思路。例如利用确定性径向位移技术(DLD)设计微管流控芯片捕获稀有细胞等。然而该芯片结构与生理结构差异较大，主要原理是通过狭缝碰撞捕获目标细胞，而狭缝容易激活血小板，造成血液凝聚，管道堵塞等问题。
发明内容
本发明针对现有分离技术步骤繁琐，试剂昂贵，同时稀有细胞容易丢失的缺陷，提出一种基于微管流控芯片的细胞捕获方法，利用有核细胞在血流中的趋壁边集效应以及细胞抗原抗体特异性粘附特点分离全血中的有核细胞，无需提前裂红或离心去除成熟红细胞，解决了传统分离方法操作复杂，耗时等问题，具有简单，便捷，快速且准确可靠的特性。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明通过化学修饰方法在微米直径高分子聚合物微管内壁修饰G蛋白，然后嫁接带有Ig-G的抗体，使管壁吸附抗体；将样本流入微管流控芯片，再利用免疫荧光技术对捕获到的目标有核细胞进行鉴定。
所述的样品包括但不限于含有目标有核细胞的全血血液，例如脐血(含胎儿细胞)、孕妇外周血(含胎儿细胞)、癌症病人外周血(含循环肿瘤细胞)。
所述的微米直径高分子聚合物微管，通过将聚二甲基硅氧烷(PDMS)基质与固化剂的混合液浇注于金属丝上，经固化后取出金属丝得到。
所述的金属丝优选选用不同直径不同材质的金属丝，优选根据所需微管内径选用不同直径的金属丝，金属丝直径即为在微管内所形成通道的直径。可选择机械强度不同的金属丝，如铜丝、钨丝、铁丝等。
所述的金属丝截面形状除圆形外可选有其他不同形状，金属丝是单根或多根，不同形状截面以及单根或多根的各自功能效果具体为：使用不同形状截面的金属丝优选得到不同形状的内部通道；使用多根金属丝优选在一根高聚物管内获得多个通道。
所述的修饰是指：向预处理后的微米直径高分子聚合物微管内注入多聚赖氨酸溶液并孵育后再注入G蛋白溶液并孵育。
所述的预处理是指：采用丙酮超声波清洗微管，室温烘干后进行真空等离子表面处理。
所述的孵育，优选在室温下湿盒内孵育2h后通过缓冲液冲洗。
所述的嫁接是指：向微米直径高分子聚合物微管内注入荧光偶联的Ig-G抗体原液并孵育。
所述的孵育，优选在4℃下湿盒内孵育过夜后随用PBS冲洗微管，去除未牢固结合的抗体。
所述的带有Ig-G的抗体包括但不限于：用于捕获FNRBC的捕获试剂是与FNRBC表面抗原特异性结合的抗体，如转铁蛋白(CD71)抗体，细胞表面糖蛋白CD147抗体，血型糖蛋白A(GPA)；用于捕获CTC的捕获试剂是与CTC表面抗原特异性结合的抗体，如CD44抗体；用于捕获CEC的捕获试剂是与CEC表面抗原特异性结合的抗体，如上皮细胞粘附分子(EpCAM)。
所述的聚合物为可在光学显微镜下观察到聚合物微管内壁捕获细胞的分布情况的透明聚合物，包括但不限于聚二甲基硅氧烷(PDMS)、MyPloymer。
所述的微管流控芯片中包含至少一个内壁修饰G蛋白的微米直径高分子聚合物微管，且多重通道可连接，使样品在通道之间流动，可提高通量，并提高样本处理效率。
所述的将样本流入微管流控芯片的具体流速温度等设置为：血流流速为0.02mL/h～0.3mL/h，温度为室温。
所述的利用免疫荧光技术对捕获到的目标有核细胞进行鉴定的具体技术手段为：用三种荧光标记物Hoechst、HBF、CD71识别FNRBC(三种荧光下均为阳性)；用Hoechst、CD45、EpCAM识别CTC(CD45阴性，Hoechst、EpCAM阳性)。
优选地，所述的鉴定直接在管道内表面进行，无需消化收集目标细胞。
技术效果
本发明整体解决了现有技术需提前去除成熟红细胞、操作繁琐、成本高、耗时的不足；与现有技术相比，本发明利用复杂的生物力学机理设置简单的实验装置实现全血分离稀有细胞，可实现细胞的全血捕获，无需提前裂红或离心去除成熟红细胞，对细胞损害较小；芯片结构简单、操作简便、成本较低、可实现细胞高通量捕获。
附图说明
图1为实施例1中微管流控芯片设计图；
图2为实施例1中微管流控芯片实物图；
图3为实施例2中微管流控芯片的工作原理示意图；
图4为实施例2中微管流控芯片的设备流程图；
图5为实施例1中G蛋白捕获效果图；
图6为实施例3中利用特异性荧光蛋白对胎儿有核红细胞进行鉴定的结果图；
图7为实施例2中微管流控芯片对脐血中胎儿有核红细胞捕获的明场/荧光照片；
图8为实施例中从脐血捕获和鉴定胎儿有核红细胞的数目与流速的关系图。
具体实施方式
实施例1
本实施例涉及微管流控芯片的制备操作，包括：
1)聚二甲基硅氧烷(PDMS)基质与固化剂均匀混合。
2)取硅板，放置100μm直径铜丝，使铜丝与硅板保持0.34mm情况下拉紧并固定铜丝。
3)浇注PDMS使其完全包裹铜丝，放置60℃烤箱固化两小时。
4)取出固化后的PDMS，抽出铜丝后得到100μm内径PDMS微槽道流控芯片。
如图1、图2所示，本实施例涉及上述方法制备得到的微槽道流控芯片，即包括单个或多个圆形槽道的PDMS平板。
本实施例涉及基于上述微管的内部抗体修饰及确认操作，包括：
1)丙酮超声波清洗微管，室温烘干后进行真空等离子表面处理。
2)在微管内表面孵育多聚赖氨酸溶液一段时间后用PBS(phosphate buffersaline)去除未粘附在微管表面的多聚赖氨酸。
3)注入G蛋白溶液充满微管，室温下湿盒内孵育2h后，用PBS冲洗微管去除未牢固吸附的G蛋白。
4)注射荧光偶联的Ig-G抗体原液充满微管，4℃下湿盒内孵育过夜后随用PBS冲洗微管，去除未牢固结合的抗体。
5)在荧光显微镜下观察，如图5所示，左图为经过处理的微管芯片，右图为空白对照，通过荧光强度可确认Ig-G抗体吸附。
实施例2
本实施例涉及针对有核红细胞的微管芯片制作，具体步骤为：
1)取实施例1制备得到的微管芯片，注射Ig-G偶联的CD147抗体原液充满微管，4℃下湿盒内孵育过夜后随用PBS冲洗微管，去除未牢固结合的抗体。
2)为避免非目标细胞的非特异性吸附，注射2％胎牛血清蛋白(BSA)充满微管，室温下湿盒内孵育半小时，随用PBS冲洗微管；微管表面处理完成，放入4℃冰箱备用以捕获有核红细胞。
本实施例涉及上述微管芯片的样本处理及细胞捕获操作，具体步骤为：
1)将20微升脐血血液通入抗体修饰的微管流控芯片，血液中的背景干扰细胞从出口端回收，而胎儿有核红细胞通过抗原抗体的特异性结合作用留在微管流控芯片内部，实现捕获。
2)使用PBS冲洗微管，去除未粘附的背景细胞。
如图7所示，胎儿有核红细胞粘附在微管流控芯片的内壁上。
实施例3
本实施例涉及脐血胎儿有核红细胞的微管内原位鉴定方法，具体步骤为：
1)孵育0.05％戊二醛固定细胞，室温静置10分钟后用PBS清洗微管内壁。
2)孵育0.01％Triton对细胞进行破膜打孔，室温静置6分钟后用PBS清洗微管内壁。
3)为避免抗体非特异性染色，孵育2％BSA，室温静置6分钟后用PBS清洗微管内壁。
4)孵育HBF(hemoglobin F)+CD71(PE)荧光抗体混合液，4℃过夜染色后用PBS清洗微管内壁，去除管内多余抗体。
实施例4
本实施例探究不同流速对细胞捕获效率的影响，具体步骤为：以100微米内径微管流控芯片为例，改变血流捕获速率，设置血流流速分别为0.02mL/h,0.06mL/h、0.1mL/h、0.2mL/h、0.3mL/h、0.4mL/h、0.6mL/h，对应的血流剪切率分别为7.07s-1、21.2s-1、35.4s-1、70.7s-1、106s-1、141.5s-1、212.1s-1。实验结果如图8所示，血流流速为0.3mL/h与0.02mL/h左右时，细胞捕获效率最高，对应的血流剪切率分别为21.2s-1与106s-1。
经过具体实际实验，采用全血血样，在管径为100μm直管中，流速在0.3mL/h左右时，可以有效地捕获到胎儿有核红细胞。可见本方法采用圆形直微管通道捕获细胞，可以实现全血中细胞捕获，无需提前裂红或离心去除成熟红细胞，对细胞的损害较小。
与现有技术相比，本方法利用全血流动时目标细胞在直管中滚动粘附的生理现象，高效便捷地捕获细胞，能够避免芯片结构复杂带来的细胞额外受力以及血小板力学激活导致血管凝固堵塞。利用多聚赖氨酸良好的生物相容性与粘附特性加强G蛋白与抗体捕获。可实现细胞全血捕获，无需提前裂红去除成熟红细胞，对细胞损害较小；芯片结构简单，制作成本低，可直接在芯片表面进行后续临床分析；可实现高通量捕获，节约细胞捕获时间：可采用多根管道并联同时捕获细胞，成倍提高实验效率。
上述具体实施可由本领域技术人员在不背离本发明原理和宗旨的前提下以不同的方式对其进行局部调整，本发明的保护范围以权利要求书为准且不由上述具体实施所限，在其范围内的各个实现方案均受本发明之约束。

Claims (10)

1.一种基于微管流控芯片的细胞捕获方法，其特征在于，通过化学修饰方法在微米直径高分子聚合物微管内壁修饰G蛋白，然后嫁接带有Ig-G的抗体，使管壁吸附抗体；将样本以0.02mL/h～0.3mL/h速度流入微管流控芯片，再利用免疫荧光技术直接在管道内表面对捕获到的目标有核细胞进行鉴定，无需消化收集目标细胞。
2.根据权利要求1所述的基于微管流控芯片的细胞捕获方法，其特征是，所述的微米直径高分子聚合物微管，通过将聚二甲基硅氧烷基质与固化剂的混合液浇注于截面为圆形的金属丝上，经固化后取出金属丝得到。
3.根据权利要求1所述的基于微管流控芯片的细胞捕获方法，其特征是，所述的修饰是指：向预处理后的微米直径高分子聚合物微管内注入多聚赖氨酸溶液并孵育后再注入G蛋白溶液并孵育。
4.根据权利要求1所述的基于微管流控芯片的细胞捕获方法，其特征是，所述的预处理是指：采用丙酮超声波清洗微管，室温烘干后进行真空等离子表面处理。
5.根据权利要求1所述的基于微管流控芯片的细胞捕获方法，其特征是，所述的孵育，在室温下湿盒内孵育2h后通过缓冲液冲洗。
6.根据权利要求1所述的基于微管流控芯片的细胞捕获方法，其特征是，所述的嫁接是指：向微米直径高分子聚合物微管内注入荧光偶联的Ig-G抗体原液并孵育；
所述的带有Ig-G的抗体包括：用于捕获FNRBC的捕获试剂是与FNRBC表面抗原特异性结合的抗体、用于捕获CTC的捕获试剂是与CTC表面抗原特异性结合的抗体、用于捕获CEC的捕获试剂是与CEC表面抗原特异性结合的抗体。
7.根据权利要求1所述的基于微管流控芯片的细胞捕获方法，其特征是，所述的孵育，在4℃下湿盒内孵育过夜后随用PBS冲洗微管，去除未牢固结合的抗体。
8.根据权利要求1或6所述的基于微管流控芯片的细胞捕获方法，其特征是，所述的带有Ig-G的抗体包括：转铁蛋白(CD71)抗体、细胞表面糖蛋白CD147抗体、血型糖蛋白A(GPA)、CD44抗体、上皮细胞粘附分子(EpCAM)。
9.根据权利要求1所述的基于微管流控芯片的细胞捕获方法，其特征是，所述的微管流控芯片中包含至少一个内壁修饰G蛋白的微米直径高分子聚合物微管，且多重通道可连接，使样品在通道之间流动，可提高通量，并提高样本处理效率。
10.根据权利要求1所述的基于微管流控芯片的细胞捕获方法，其特征是，所述的利用免疫荧光技术对捕获到的目标有核细胞进行鉴定是指：用三种荧光标记物Hoechst、HBF、CD71识别FNRBC；用Hoechst、CD45、EpCAM识别CTC。
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