CN112710528B - 一种姐妹染色单体互换差别染色辅助装置及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种姐妹染色单体互换差别染色辅助装置及方法。它包括容器、石英玻璃片和紫外线灯；所述容器中装有2×SSC溶液；所述石英玻璃片与所述溶液接触；所述紫外灯线照射的紫外线透过所述石英玻璃片照射在完全浸泡在所述溶液中的待染色的细胞上。该装置能保证样品在液体浸泡下，以设定的温度完成紫外线照射，同时保证紫外线照射的距离、时间、功率和穿透性。
Description
技术领域
本发明涉及一种染色辅助装置及方法，尤其涉及一种姐妹染色单体互换差别染色辅助装置及方法。
背景技术
姐妹染色单体互换(Sister chromatid exchange,SCE)试验是一种检测染色体同源位点上DNA复制产物互换频率的试验方法。SCE是染色体不稳定性和DNA损伤较敏感的指标，可以检测出各种物理化学因素、疾病、药物、病毒、治疗方法是否对染色体造成损伤，进而影响细胞遗传。
在细胞分裂时，每条染色体均有两条染色单体，每条染色单体含一条双链DNA。5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-bromodeoxy-uridine，BrdU)是脱氧胸腺嘧啶核苷的类似物，在DNA链的复制过程中，可替代胸腺嘧啶掺入到复制的DNA中。经两个复制周期后，中期染色体的两个DNA双链产生了差别：一条染色单体的两股DNA的均有BrdU掺入，另一条染色单体的两股DNA中一股含BrdU，一股不含BrdU。利用特殊的差别染色技术对染色体标本进行处理，可使双链均含有BrdU的单体浅染，只有一条含BrdU的单体深染。当姐妹染色体间存在同源片段交换时，可在同一条染色单体上看到深浅不同的颜色。
差别染色是姐妹染色单体互换试验中关键的技术环节，传统的操作方法如图1所示：在平皿9中平行放置两根牙签4(防止载玻片吸在容器底部不易取出)，将载玻片3放在牙签4上，加适量2×SSC溶液5(以不超过标本2为度)。在标本上盖一张比载玻片3稍大的擦镜纸6，使纸边浸入2×SSC溶液5中，并使2×SSC溶液5渗至玻片标本2上，保持标本2湿润。将平皿置55℃水浴面上，用30W紫外灯1垂直照射标本30分钟，照射距离10cm。
姐妹染色单体互换差别染色方法中，紫外线照射的标准化是保证染色质量和效果的关键。在传统操作方法中，通过浸水的擦镜纸保持湿润的效果并不理想，经常会出现玻片中间被烤干的情况；擦镜纸也会影响紫外线的穿透，让照射的质量打折扣；擦镜纸盖在玻片上也存在擦掉玻片上的细胞可能。而将载有细胞的玻片完全浸泡在水中时，虽然避免了擦镜纸的影响，但是载玻片上方液体的高度不容易标准化，不同批次实验间液面高度的差异会影响紫外线照射效果，另外，高温下液体蒸发速度快，容易出现液体蒸干的情况。
发明内容
本发明的目的是提供一种姐妹染色单体互换差别染色辅助装置。该装置能保证样品在液体浸泡下，以设定的温度完成紫外线照射，同时保证紫外线照射的距离、时间、功率和穿透性。
本发明提供的一种姐妹染色单体互换差别染色辅助装置，它包括容器、石英玻璃片和紫外线灯；所述容器中装有2×SSC溶液；所述石英玻璃片与所述溶液接触；所述紫外灯线照射的紫外线透过所述石英玻璃片照射在完全浸泡在所述溶液中的待染色的细胞上。
本发明中，所述2×SSC溶液为本领域中常用试剂，可通过商业途径购买，其组成为0.3mol/L NaCl与0.03mol/L柠檬酸钠混合制成。
上述的装置中，所述石英玻璃片的厚度可为0.5mm～2mm，太薄容易破碎，太厚影响透光；
所述紫外灯距离所述待染色的细胞的垂直距离为10cm～15cm。
上述的装置中，所述装置还包括载玻片；所述紫外灯线照射的紫外线透过所述石英玻璃片照射在位于所述载玻片上的待染色的细胞上；所述载玻片和所述石英玻璃片之间设有间距。
上述的装置中，所述间距可为0.05mm～5.0mm，优选1.0mm、0.05mm～1.0mm、1mm～5.0mm或0.05mm～2.5mm。
上述的装置中，当所述紫外线灯位于所述容器的上方时，所述石英玻璃片位于所述容器底部的支撑物上且所述溶液的液面不超过所述石英玻璃片的上表面，超过上表面的液体无法控制厚度与液体蒸发；所述容器上方的所述紫外线灯照射的紫外线透过所述石英玻璃片和所述溶液照射在位于所述石英玻璃片下方的载玻片上表面的待染色的细胞上。
上述的装置中，所述支撑物具体可为棉签。
上述的装置中，当所述紫外线灯位于所述容器下方时，所述容器的底部开设有透光孔；所述石英玻璃片与所述透光孔密封配合；所述载玻片位于所述石英玻璃片的上方；所述容器下方的所述紫外线灯照射的紫外线透过所述石英玻璃片和所述溶液照射在位于所述载玻片的下表面的样品上。
本发明还提供了利用上述的装置进行辅助染色的方法。
本发明具有如下有益效果：
1、石英玻璃作为紫外线照射透光窗口，石英玻璃对紫外线的穿透率为高，达80％以上，能有效保证紫外线照射的均一性，达到标准化。
2、整个样品浸泡在液体下，能保证紫外线照射的整个过程都有2×SSC液体保护，避免干燥。加热浸泡的液体，使温度控制更加准确。
3、通过石英玻璃片与样品之间支撑物的厚度可确定光线透过水的距离。
附图说明
图1是传统染色装置的示意图。
图2是本发明的整体结构及实施例1示意图。
图3是本发明的整体结构及实施例2示意图。
图4是本发明应用的整体结构示意图。
图5是本发明应用的局部结构示意图。
图6是本发明应用的载玻片架示意图。
图7是本发明装置应用的外观示意图。
图8是本发明应用的SCE结果图片(箭头所指为典型姐妹染色单体互换图片)。
图9是传统方法的SCE结果图片(箭头所指为典型姐妹染色单体互换图片)。
图中，各标记如下：
1紫外灯；2待染色的细胞标本；3载玻片；4棉签a；5 2×SSC溶液；6擦镜纸；7支撑物；8石英玻璃片；9容器；10控温定时装置；11载玻片架；12自来水或蒸馏水；13、空心箱体。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下面结合说明书附图对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于下述实施例。
下述实施例中的外周血淋巴细胞染色体制片通过如下步骤得到：
在无菌条件下，用RPMI1640培养基，常规方法培养外周血淋巴细胞，培养24h后加入BrdU，最终浓度为10μg/mL。避光，置37℃温箱中培养至48小时，加入秋水仙素至终浓度0.4-0.8μg/mL，继续培养4小时。按常规收集细胞，气干法制片，将染色体制片放入70℃-80℃烤箱中烘烤1小时-2小时。
下述实施例中所用的2×SSC溶液通过商业途径购买，其组成为0.3mol/L NaCl与0.03mol/L柠檬酸钠混合制成
实施例1、姐妹染色单体互换差别染色辅助装置
如图2所示，本发明装置包括紫外线灯1、载玻片3、石英玻璃片8和容器9。紫外线灯1位于容器9的下方，用于发射紫外线。容器9底部开设有方形透光孔，透光孔大小与载玻片3大小相同或大于载玻片3直至整个底部。石英玻璃片8与该透光孔密封配合，形成可装液体的容器。容器9中装有2×SSC溶液5。在容器9中，浸没在2×SSC溶液5中的载玻片3位于石英玻璃片8的上方，且载玻片3和石英玻璃片8之间通过一定厚度的支撑物7(如具体可为棉签b)设有0.05mm～5.0mm(优选1.0mm)的间距，使载玻片3的下表面有2×SSC溶液5浸泡。紫外灯1距离石英玻璃片8的垂直距离为10cm～15cm，优选15cm。
使用时，采用载玻片3制备染色体制片，并使待染色的细胞标本2位于载玻片3的下表面(紫外线灯在容器下方，紫外线透过石英玻璃和SSC液体照射在载玻片的细胞面朝下的细胞上)。紫外线灯1的功率为15W～30W，优选30w。容器内或容器外配水温控制装置，可将水温加热至40℃～80℃(优选60℃，照射30分钟)。紫外灯线1照射的紫外线透过石英玻璃片8照射在位于载玻片3的下表面的待染色的细胞上。紫外线照射完成后，流水冲洗玻片表面液体，风干，10％姬姆萨染色液染色2～10分钟。根据染色液的质量和染色时的气温确定条件，具体可为25℃下优选染色5分钟。
实施例2、姐妹染色单体互换差别染色辅助装置
如图3所示，本发明装置包括紫外线灯1、载玻片3、石英玻璃片8和容器9。紫外线灯1位于容器9的上方，用于发射紫外线。容器9中装有2×SSC溶液5。在容器9中，载玻片3位于容器9底部的支撑物(如棉签a 4)上；石英玻璃片8位于载玻片3的上方，且载玻片3和石英玻璃片8之间通过一定厚度的支撑物7(如具体可为棉签b)设有0.05mm～5.0mm的间距(优选1.0mm)，使载玻片3的上表面有液体浸泡；溶液5的液面不超过石英玻璃片8的上表面。紫外灯距离载玻片3的垂直距离为10cm～15cm，优选15c。
使用时，采用载玻片3制备染色体制片，并使待染色的细胞位于载玻片3的上表面(紫外线灯在容器上方，所以载玻片的细胞面朝上)。紫外线灯1的功率为15W～30W，优选30W。容器内或容器外配水温控制装置，可将水温加热至40℃～80℃(优选60℃，照射30分钟)。紫外灯1照射的紫外线透过石英玻璃片8照射在位于载玻片3的上表面的待染色的细胞上。紫外线照射完成后，流水冲洗玻片表面液体，风干，10％姬姆萨染色液染色2-10分钟。根据染色液的质量和染色时的气温确定条件，25℃下优选染色5分钟。
实施例3、
应用本发明实施例2的方法，设计一套姐妹染色单体差别染色装置。其整体结构分布如图4、7所示，紫外灯1位于一空心箱体13的靠上部位，其位置可在空心箱体13上下移动，调整紫外灯1与石英玻璃8的距离，本应用调整的距离为15cm。石英玻璃8面是上述空心箱体13的底面，厚度1mm，并与空心箱体13紧密连接(本应用通过AB胶粘合)，保证液体5不能进入空心箱体13。如图5-6所示，箱体的下方附承载载玻片架11的钩子，能托起载玻片架11，同时起到载玻片3与石英玻璃8之间支撑物4的作用，使载玻片3上表面的待染色细胞标本2与石英玻璃8之间的距离为1mm。本应用的载玻片架11一次可以放置10张载玻片3，载玻片3载有待染色细胞标本2的一面朝上。本应用的容器9为一设有控温定时装置10的双层水箱，上层水箱为2×SSC液，使载玻片架11和载玻片3完全浸泡在2×SSC溶液中。下层水箱装自来水或蒸馏水12，通过控温定时装置10可调水温在40℃-80℃范围内，为细胞提供恒定的温度，控制紫外灯1的照射时间，本应用控制温度为60℃，紫外照射时间30分钟。
抽取正常人外周血全血样品3mL，肝素抗凝，接种0.5mL全血至5.0mL RPMI1640培养基，共接种5瓶，用黑纸包裹培养瓶，37℃培养箱中避光培养至24小时，加入BrdU，使培养体系中BrdU的终浓度为10μg/mL。继续避光培养至48小时，加入秋水仙素，使培养体系中秋水仙素的终浓度为0.4μg/mL，继续避光培养至52小时，富集有丝分裂中期相。
以0.075mol/L KCl为低渗液，甲醇与冰醋酸3：1体积混合为固定液，在微光条件下，按常规方法收获细胞，制备染色体，汇集5份收获的染色体为1份并混匀(保证每张载玻片上的染色体是同一来源)，同一实验条件下，将染色体分散到20张载玻片上。将分散有染色体的载玻片放入70℃烤箱中烘烤1小时，20张染色体片随机分成2组，每组10张，分别用传统方法和本发明应用设计的方法处理，10％姬姆萨染色液染色5分钟，显微镜下分析染色体图像。
油镜下选择处于第二次分裂，染色体分散良好、长度适宜，染色单体差别染色鲜明、染色体数为46±1条的中期相进行SCE计数。每一个染色单体末端的互换计为1次，短臂或长臂中间发生的互换计为2次。在计数30个以上中期相的SCE后，计算每个细胞的SCE平均值(SCE数/细胞数)，即为该个体的SCE频率。分析两种差别染色方法的结果，传统方法10张染色体片用时328分钟，SCE平均值是4.48/每个细胞；本发明装置方法10张染色体片用时288分钟，SCE平均值是4.85/每细胞。使用本发明的差别染色装置的染色体姐妹染色单体颜色差别更明显，更容易识别，分析时间明显减少，识别的SCE平均值高于传统方法。
Claims (3)
1.一种姐妹染色单体互换差别染色辅助装置，其特征在于：它包括容器、石英玻璃片和紫外线灯；所述容器中装有2×SSC溶液；所述石英玻璃片与所述溶液接触；所述紫外线灯照射的紫外线透过所述石英玻璃片照射在完全浸泡在所述溶液中的待染色的细胞上；
所述石英玻璃片的厚度为0.5mm~2mm；
所述装置还包括载玻片；所述紫外线灯照射的紫外线透过所述石英玻璃片照射在位于所述载玻片上的待染色的细胞上；所述载玻片和所述石英玻璃片之间通过支撑物设有间距；所述间距为0.05mm~5.0mm；
当所述紫外线灯位于所述容器的上方时，所述石英玻璃片位于所述容器底部的支撑物上且所述溶液的液面不超过所述石英玻璃片的上表面；所述容器上方的所述紫外线灯照射的紫外线透过所述石英玻璃片和所述溶液照射在位于所述石英玻璃片下方的载玻片上表面的待染色的细胞上；
当所述紫外线灯位于所述容器下方时，所述容器的底部开设有透光孔；所述石英玻璃片与所述透光孔密封配合；所述载玻片位于所述石英玻璃片的上方；所述容器下方的所述紫外线灯照射的紫外线透过所述石英玻璃片和所述溶液照射在位于所述载玻片的下表面的样品上。
2.根据权利要求1所述的装置，其特征在于：所述紫外线灯距离所述待染色的细胞的垂直距离为10cm~15cm。
3.利用权利要求1或2所述的装置进行辅助染色的方法。
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