CN112679563A - 一种葡苷四糖及其制备方法和应用 - Google Patents

一种葡苷四糖及其制备方法和应用 Download PDF

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王春明
殷小雨
张哲�
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Abstract

本发明公开了一种葡苷四糖及其制备方法和应用，涉及天然产物工程化和免疫学交叉领域，所述葡苷四糖的主链结构为D‑Man‑D‑Man‑D‑Man‑D‑Glc，该葡苷四糖能特异性激活Toll样受体，从而介导免疫应答，为开发新型、有效且安全的Toll样受体激活剂或免疫佐剂方面提供了新思路。

Description

一种葡苷四糖及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及天然产物工程化和免疫学交叉领域，具体而言，涉及一种葡苷四糖及其制备方法和应用。
背景技术
哺乳动物通过先天免疫系统侦探和抵御微生物入侵。细菌，无论是病原体、共生体或两者之间都会产生病原体相关的分子模式(pathogen-associated molecularpatterns，PAMPs)，这些PAMPs被多种类型的模式识别受体(pattern-recognitionreceptor，PRR)识别。当PAMPs被机体检测到时，会导致炎症反应，这有助于消除入侵的微生物。
一些典型的PAMPs来源于细菌细胞壁上的分子，例如脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，脂蛋白、肽聚糖和鞭毛蛋白。长期以来的研究表明，与细菌细胞壁相关的PAMPs会被Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)检测到，从而诱发炎症。但现有市场上的微生物来源的TLRs靶向物质或者试剂由于毒性太大且具有异质性，难以应用在免疫治疗临床应用中。因此，迫切需要开发新的，安全的和特异性的Toll样受体激动剂。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种葡苷四糖及其制备方法和应用。
本发明是这样实现的：
第一方面，实施例提供了一种葡苷四糖，所述葡苷四糖的主链结构为D-Man-D-Man-D-Man-D-Glc。
第二方面，实施例提供了如前述实施例所述的葡苷四糖的制备方法，其包括：从葡苷寡糖混合物中分离提纯所述葡苷四糖。
第三方面，实施例提供了如前述实施例所述的葡苷四糖在制备Toll样受体TLR激动剂中的应用。
第四方面，实施例提供了一种Toll样受体TLR激动剂，其包括如前述实施例所述的葡苷四糖。
第五方面，实施例提供了一种如前述实施例所述的葡苷四糖在制备免疫佐剂中的应用。
第六方面，实施例提供了一种免疫佐剂，其包括如前述实施例所述的葡苷四糖。
第七方面，实施例提供了如前述实施例所述的葡苷四糖在激活Toll样受体TLR中的应用，所述应用不以疾病的诊断或治疗为直接目的。
本发明具有以下有益效果：
本发明实施例提供了一种葡苷四糖，所述葡苷四糖的主链结构为D-Man-D-Man-D-Man-D-Glc，该葡苷四糖能特异性激活Toll样受体，从而介导免疫应答，为开发新型、有效且安全的Toll样受体激活剂或免疫佐剂方面提供了新思路。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为Tetra-GM-1样品的结构及其HPLC-ELSD的检测结果；
图2为Tetra-GM-2样品的结构及其HPLC-ELSD的检测结果；
图3为Tetra-GM-1样品的1H-NMR谱图；
图4为Tetra-GM-1样品的13C-NMR谱图；
图5为Tetra-GM-1样品的1H-1H COSY谱图；
图6为Tetra-GM-1样品的HSQC谱图；
图7为Tetra-GM-1样品的HMBC谱图；
图8为Tetra-GM-2的1H-NMR谱图；
图9为Tetra-GM-2的13C-NMR谱图；
图10为Tetra-GM-2的1H-1H COSY谱图；
图11为Tetra-GM-2的HSQC谱图；
图12为Tetra-GM-2的HMBC谱图；
图13为Tetra-GM-1的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱谱图(MALDI-TOF-MS)；
图14为Tetra-GM-2的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱谱图；
图15为Tetra-GM-1以及Tetra-GM-2在HEK TLR2 blue细胞和HEK TLR4 blue细胞中激活TLR的情况；
图16为Tetra-GM-1以及Tetra-GM-2在TLR2-/-BMDM以及TLR4-/-BMDM中典型促炎基因的表达情况。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
本发明实施例提供了一种葡苷四糖，所述葡苷四糖的主链结构为D-Man-D-Man-D-Man-D-Glc。
发明人经一系列提供了一种葡苷四糖，该葡苷四糖能够特异性地激活Toll样受体，为Toll样受体激活剂的研究提供一种新的方向。
需要说明的是，结构中：Man，Manp均为甘露糖；Glc，Glcp均为葡萄糖；D为顺时针编号，代表末端羟基甲基向下。
对Toll样受体TLR不作具体限定，葡苷四糖可以激活如人源TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10以及鼠源TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR11、TLR12和TLR13。
优选地，所述Toll样受体为TLR2。葡苷四糖能够特异性地激活TLR2(哺乳动物)，通过激活TLR2，以激活由TLR2介导的免疫信号，从而调控免疫反应。
可选地，所述葡苷四糖由4个糖单元组成，所述糖单元选自葡萄糖单元和甘露糖单元。构成葡苷四糖的葡萄糖单元的个数可以为1～3个，构成葡苷四糖的甘露糖单元的个数可以为1～3个，优选地，甘露糖单元(Man)的个数为3，葡萄糖单元(Glc)的个数为1。
优选地，所述糖单元之间的连接方式为β-(1，4)糖苷键或α-(1，4)糖苷键。
优选地，所述葡苷四糖上连接有乙酰基或不含乙酰基。乙酰基的分子式为CH3CO-或记为Ac-，是一个由甲基和羰基组成的酰基官能团，可存在于C6位上。
优选地，所述葡苷四糖的分子量为666.352Da。
优选地，所述葡苷四糖的结构：α-D-Manp-(1→4)-α-D-Manp-(1→4)-α-D-Manp-(1→4)-α/β-D-Glcp，其中，“α/β”是指α和/或β，代表其包括-α-D-Manp-(1→4)-α-D-Manp-(1→4)-α-D-Manp-(1→4)-α-D-Glcp，和–α-D-Manp-(1→4)-α-D-Manp-(1→4)–α-D-Manp-(1→4)-β-D-Glcp中的至少一种结构。
本发明实施例还提供了如前述任一实施方式提供的葡苷寡糖的制备方法，其包括从葡苷寡糖混合物中分离提纯所述葡苷四糖。
优选地，所述葡苷寡糖混合物由葡甘聚糖降解而成。本发明实施例对葡甘聚糖的种类不作具体限制，可以为天然多糖，优选为白芨多糖和/或魔芋多糖；更优选地，所述葡甘聚糖的来源于魔芋茎部和/或白芨根茎部。
优选地，所述葡苷寡糖混合物为葡甘聚糖冻干粉，其获取途径可以为：取葡甘聚糖完全溶解在去离子水中，进行搅拌，搅拌时间2～12h，然后对葡甘聚糖溶液进行冻干，得到葡甘聚糖冻干粉。
优选地，所述葡甘聚糖的降解方式选自：酶降解葡甘聚糖方法、酸降解葡甘聚糖方法、碱降解葡甘聚糖方法以及超声降解葡甘聚糖方法中的至少一种；
优选地，在所述酶降解葡甘聚糖方法中，酶解的条件为：pH值为4.6～5.0，温度为30～50℃，酶解时间为24～72h，然后使酶灭活，灭活方式可为加热至80～100℃，终止反应后过滤离心，保留上清液。
具体地，酶解温度可以为30℃、32℃、34℃、36℃、38℃、40℃、42℃、44℃、46℃、48℃和50℃中的任意温度。酶解时间可以为24h、25h、30h、35h、40h、45h、50h、55h、60h、65h、70h和72h中的任意时间。
优选的，酶解时，可选用内切-1，4-β-甘露聚糖酶(EC:3.2.1.78)，β-甘露糖苷酶(EC:3.2.1.25)，β-葡糖苷酶(EC:3.2.1.21)以及纤维素酶(EC232.734.4)进行对葡甘聚糖的酶降解处理反应。其中，优选纤维素酶。
优选地，酶解时，酶与葡甘聚糖的质量比为1:(8～12)。
优选地，所述分离提纯的方式选自：葡聚糖层析柱、羟丙基葡聚糖凝胶层析柱、硅胶柱以及C18柱中的至少一种。
本发明实施例还提供了如前述任一实施方式提供的葡苷四糖在制备Toll样受体TLR激动剂中的应用。
在一些实施方式中，对Toll样受体TLR不作具体限定，葡苷四糖可以激活如人源TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10以及鼠源TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR11、TLR12和TLR13。
优选地，所述Toll样受体为TLR2。
本发明实施例还提供了一种Toll样受体TLR激动剂，其包括如前述任一实施方式提供的葡苷四糖。
在一些实施方式中，对Toll样受体TLR不作具体限定，葡苷四糖可以激活如人源TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10以及鼠源TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR11、TLR12和TLR13。
优选地，所述Toll样受体为TLR2。
本发明实施例还提供了如前述任一实施方式所述的葡苷寡糖在制备免疫佐剂中的应用。
优选地，所述葡苷寡糖通过激活Toll样受体以达到调控免疫的作用。
在一些实施方式中，对Toll样受体TLR不作具体限定，葡苷四糖可以激活如人源TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10以及鼠源TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR11、TLR12和TLR13。
优选地，所述Toll样受体为TLR2。
本发明实施例还提供了一种免疫佐剂，其包括如前述任一实施方式所述的葡苷四糖。
本发明实施例还提供了如前述任一实施方式所述的葡苷四糖在激活Toll样受体TLR中的应用，所述应用不以疾病的诊断或治疗为直接目的。
在一些实施方式中，对Toll样受体TLR不作具体限定，葡苷四糖可以激活如人源TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10以及鼠源TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR11、TLR12和TLR13。
优选地，所述Toll样受体为TLR2。
实施例1
本实施例提供一种葡苷四糖的制备方法，具体包括以下步骤。
取天然魔芋块茎部提取而来的葡甘聚糖1g完全溶解在体积为100mL的去离子水中，进行搅拌，搅拌时间2h，然后对魔芋葡甘聚糖溶液进行冻干，得到魔芋葡甘聚糖冻干粉；
接下来酶降解处理魔芋多糖冻干粉：首先，魔芋葡甘聚糖冻干粉500mg充分溶解在100mL去离子水中，加入60mg纤维素酶，反应温度35℃，反应时间24h，反应结束后加热至100℃使得酶灭活，终止反应后过滤离心，留上清液(寡糖溶液)；
将寡糖溶液通过Sephadex G-25葡聚糖层析和Sephadex LH-20羟丙基葡聚糖凝胶层析进一步分离纯化，收集分离洗脱液，冻干后获得纯度95％以上的葡甘四糖(Tetra-GM-1)，结构为：α-D-Manp-(1→4)-α-D-Manp-(1→4)-α-D-Manp-(1→4)-α/β-D-Glcp-Ac；如图1中A所示。
利用高效液相色谱(HPLC)对制备而得的Tetra-GM-1样品进行纯度鉴定。取1mL的浓度为1mg/mL的Tetra-GM-1，进行高效液相色谱蒸发光散射检测分析(HPLC-ELSD)，测试结果如图1中B，Tetra-GM-1的纯度在95％以上。
实施例2
本实施例提供一种葡苷四糖的制备方法，具体包括以下步骤。
取天然白芨根茎部提取而来的葡甘聚糖1g完全溶解在体积为100mL的去离子水中，进行搅拌，搅拌时间2h，然后对白芨葡甘聚糖溶液进行冻干，得到白芨葡甘聚糖冻干粉；
接下来酶降解处理白芨多糖冻干粉：首先，白芨葡甘聚糖冻干粉500mg充分溶解在100mL去离子水中，加入60mg纤维素酶，反应温度35℃，反应时间24h，反应结束后加热至100℃使得酶灭活，终止反应后过滤离心，留上清液；
将寡糖溶液PA18080900，收集分离洗脱液，冻干后获得纯度95％以上的葡甘四糖，结构为：α-D-Manp-(1→4)-α-D-Manp-(1→4)-α-D-Manp-(1→4)-α/β-D-Glcp，具体参照图2中A。
利用高效液相色谱(HPLC)对制备而得的Tetra-GM-2样品进行纯度鉴定。取1mL的浓度为1mg/mL的Tetra-GM-2，进行高效液相色谱蒸发光散射检测分析(HPLC-ELSD)，测试结果如图2中B，Tetra-GM-2的纯度在95％以上。
验证例1
利用核磁共振波谱法(NMR)解析对所制备而得的Tetra-GM-1和Tetra-GM-2样品进行结构解析，结果如图3～12所示。
首先，对Tetra-GM-1的NMR谱图进行解析，可看出氢谱信号主要集中在3.0-5.5ppm之间。δ3.2-4.0ppm为糖环质子信号，主要端基质子峰δ5.13、4.67、4.65、4.57、4.44的信号峰集中分布在4.3-5.5ppm区域内。核磁碳谱信号主要集中在60-120ppm之间。通过观察碳谱，可以看到主要异头碳信号峰δ103.76、101.48、101.27、97.12、93.18异头碳区域主要在δ93-105之间。而79.84、79.70、77.83、77.83、77.77、77.63、77.24、76.18、75.97、75.35、75.14、74.10、74.10、72.65、72.65、72.44、71.82、71.41、71.20、67.88、62.14、62.14、62.14、61.66、61.45。主要信号峰分布在60-85ppm区域。通过HSQC图谱，可以观察到异头碳信号为δ97.12，HSQC图谱中对应的异头氢信号是δ4.57，通过HH-COSY，H1-2的信号为4.57/3.19；H2-3的信号为3.19/3.56；H3-4的信号为3.56/3.34；H4-5的信号为3.34/3.48；H5-6的信号为3.48/3.63；我们可以推断出H1，H2，H3，H4，H5，H6分别为δ4.57、3.19、3.56、3.34、3.48、3.63、3.84。对应的C1-C6为97.12、75.14、74.10、77.63、67.88、62.14；因此，该信号应归属于糖苷键-4)-β-D-Glcp。通过HSQC图谱，可以观察到异头碳信号为δ93.18，HSQC图谱中对应的异头氢信号是δ5.13，通过HH-COSY，H1-2的信号为5.13/3.49；H2-3的信号为3.49/3.73；H3-4的信号为3.73/3.61；H4-5的信号为3.61/3.85；H5-6a的信号为3.85/3.72我们可以推断出H1，H2，H3，H4，H5，H6a分别为δ5.13、3.49、3.73、3.61、3.85、3.72。对应的C1-C6为δ93.18、72.44、72.58、79.70、71.41、61.66；因此，该信号应归属于糖苷键-4)-α-D-Glcp。在HMBC图谱的分析中，根据核磁一维二维图谱，我们进一步对多糖的糖苷键信号进行归属。在HMBC分析中，进一步验证了该多糖的链连结构。
于Tetra-GM-2的NMR谱图解析类似于Tetra-GM-1，从而可以得到Tetra-GM-2的糖链结构。
验证例2
实施例1提供的Tetra-GM-1和实施例2提供的Tetra-GM-2样品的单糖组成分析遵循以下步骤。
首先，在120℃加热的条件下，利用三氟乙酸对样品进行酸处理，称量样品10mg溶解于三氟乙酸进行水解，以暴露出组成单糖单元。甘露糖标准品和葡萄糖标准品具有相同的处理。然后通过添加甲醇除去三氟乙酸。随后将降解后的样品溶解在0.3M NaOH的体系中，在70℃加热的条件下用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)衍生化1h，然后加入0.3M HCl中和，再加入CH2、Cl2从而除去PMP。最后通过高效液相色谱和二极管阵列检测器联用(HPLC-DAD)分别检测在紫外吸收波长λ＝245nm时，Tetra-GM-1、Tetra-GM-2以及甘露糖标准品和葡萄糖标准品的吸收，得到HPLC-DAD谱图，积分峰面积，从而得到单糖组成比例(见表1)。
表1单糖组成比例
样品 甘露糖 葡萄糖
Tetra-GM-1 78.73％ 21.27％
Tetra-GM-2 76.57％ 23.43％
验证例3
Tetra-GM-1和Tetra-GM-2样品的分子量通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)进行确定。
结果如图13和图14所示，Tetra-GM-1带有明显的乙酰基。根据分子量，进一步验证了Tetra-GM-1和Tetra-GM-2为葡甘四糖。
验证例4
验证实施例1～2中所制备而得的Tetra-GM-1和Tetra-GM-2样品对特异性激活Toll样受体。
利用了HEK TLR2 blue细胞和HEK TLR4 blue细胞来检测。按照说明进行操作，HEK-BlueTM检测法可确定TLR是否被激活。
首先，在96孔板中进行孵育，180μL细胞悬液(每孔约50,000个细胞)与20μL激动剂或样品混合，然后在37℃，5％CO2的培养箱中共同孵育。处理24小时后，将180μL QUANTI-BlueTM溶液加入20μL HEK TLR Reporter细胞上清液中。在96孔板中进行孵育2小时后，通过分光光度计在650nm下确定分泌型胚胎碱性磷酸酶(secreted embryonic alkalinephosphatase，SEAP)水平。每组包含三个重复。其中阳性对照TLR2激动剂为Pam3CKS4(50ng/mL)，阳性对照TLR4激动剂为LPS(100ng/mL)，Tetra-GM-1和Tetra-GM-2样品以及甘露糖标准品和葡萄糖标准品的浓度为100μg/mL，设空白组。
结果如图15所示，可明显看出Tetra-GM-1以及Tetra-GM-2特异性激活了TLR2受体。
验证例5
验证实施例1～2中所制备而得的Tetra-GM-1和Tetra-GM-2样品是否特异性激活Toll样受体2。
分别采用TLR2-/-小鼠(B6.129-Tlr2tmlKir/J，C57BL/6J源，美国The JacksonLaboratory)和TLR4-/-小鼠(Tlr4lps-del，C57BL/10ScN源，美国The JacksonLaboratory)来源的原代骨髓巨噬细胞(mBMDM，实验室方法从C57BL/6J小鼠体内提取原代细胞)进行诱导极化实验：
将小鼠骨髓来源的巨噬细胞(5×106个细胞/每个10cm petri培养皿)接种在10cmpetri培养皿中，用RPMI-1640培养基+10％胎牛血清+1％青霉素-链霉素培养，置入37℃，5％CO2培养箱中待细胞贴壁后，分别Tetra-GM-1和Tetra-GM-2样品以及甘露糖标准品和葡萄糖标准品(100μg/mL)，其中阳性对照TLR2激动剂为Pam3CKS4(50ng/mL)，阳性对照TLR4激动剂为LPS(100ng/mL)，设空白组，每组包含三个重复。共同孵育24h后，提取RNA，用实时定量PCR法检测巨噬细胞前后炎症相关细胞因子(IL-6，白细胞介素-6；IL-12p70，白细胞介素-12)的表达水平，结果如图16所示。
由结果可知，在与TLR2-/-BMDM共同孵育24h之后，Tetra-GM-1和Tetra-GM-2样品组别中均没有典型促炎基因在转录水平上的明显增高，而在TLR4-/-BMDM的实验中，Tetra-GM-1和Tetra-GM-2样品均使得典型促炎基因在转录水平上有明显的增高，这表明了Tetra-GM-1以及Tetra-GM-2确实特异性激活了TLR2受体。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种葡苷四糖，其特征在于，所述葡苷四糖的主链结构为：D-Man-D-Man-D-Man-D-Glc。
2.根据权利要求1所述的葡苷四糖，其特征在于，所述葡苷四糖的糖单元之间的连接方式为β-(1，4)糖苷键或α-(1，4)糖苷键；
优选地，所述葡苷四糖上连接有乙酰基或不含乙酰基。
3.根据权利要求1所述的葡苷四糖，其特征在于，所述葡苷四糖的分子量为666.352Da。
4.如权利要求1～3任一项所述的葡苷四糖的制备方法，其特征在于，其包括：从葡苷寡糖混合物中分离提纯所述葡苷四糖。
5.根据权利要求4所述的葡苷四糖的制备方法，其特征在于，所述分离提纯的方式选自：葡聚糖层析柱、羟丙基葡聚糖凝胶层析柱、硅胶柱以及C18柱中的至少一种；
优选地，所述葡苷寡糖混合物由葡甘聚糖降解而成；
优选地，所述葡甘聚糖的降解方式选自：酶降解葡甘聚糖方法、酸降解葡甘聚糖方法、碱降解葡甘聚糖方法以及超声降解葡甘聚糖方法中的至少一种；
优选地，所述葡甘聚糖为白芨多糖或魔芋多糖。
6.如权利要求1～3任一项所述的葡苷四糖在制备Toll样受体TLR激动剂中的应用；
优选地，所述Toll样受体为TLR2。
7.一种Toll样受体TLR激动剂，其特征在于，其包括如权利要求1～3任一项所述的葡苷四糖；
优选地，所述Toll样受体为TLR2。
8.如权利要求1～3任一项所述的葡苷四糖在制备免疫佐剂中的应用；
优选地，所述葡苷四糖通过激活Toll样受体以达到调控免疫的作用；
优选地，所述Toll样受体为TLR2。
9.一种免疫佐剂，其特征在于，其包括如权利要求1～3任一项所述的葡苷四糖。
10.如权利要求1～3任一项所述的葡苷四糖在激活Toll样受体TLR中的应用，所述应用不以疾病的诊断或治疗为直接目的。
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