CN112675308B - 抑制enpp2基因和/或蛋白表达的物质在制备治疗多发性骨髓瘤的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及抑制ENPP2基因和/或ENPP2蛋白表达的物质在制备治疗多发性骨髓瘤的药物中的应用，属于生物技术和基因治疗。本发明所述应用不仅提供了一种ENPP2基因和/或蛋白的新用途，而且还提供了多发性骨髓瘤治疗的新靶点，能够制备得到多发性骨髓瘤治疗的新药物。

Description

抑制ENPP2基因和/或蛋白表达的物质在制备治疗多发性骨髓瘤的药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术和基因治疗技术领域，具体涉及抑制ENPP2基因和/或ENPP2蛋白表达的物质在制备治疗多发性骨髓瘤的药物中的应用。

背景技术

多发性骨髓瘤是一种高度异质性的浆细胞恶性克隆性疾病，其聚集在骨髓中。由于免疫调节药物沙利度胺和来那度胺与蛋白酶体抑制剂硼替佐米联合使用，多发性骨髓瘤患者的预后在过去十年中得到了显著改善。然而，多发性骨髓瘤在大多数患者中仍然无法治愈，复发的可能性很高。因此，有必要寻找新的药物靶点和治疗方案。

发明内容

本发明的目的在于提供抑制ENPP2基因和/或ENPP2蛋白表达的物质在制备治疗多发性骨髓瘤的药物中的应用。本发明所述应用不仅提供了一种ENPP2基因和/或蛋白的新用途，而且还提供了多发性骨髓瘤治疗的新靶点。

本发明提供了抑制ENPP2基因和/或ENPP2蛋白表达的物质在制备治疗多发性骨髓瘤的药物中的应用。

本发明还提供了抑制ENPP2基因和/或ENPP2蛋白表达的物质在制备抑制多发性骨髓瘤生长的药物中的应用。

本发明还提供了抑制ENPP2基因和/或ENPP2蛋白表达的物质在制备促进多发性骨髓瘤细胞凋亡的药物中的应用。

本发明还提供了抑制ENPP2基因和/或ENPP2蛋白表达的物质在制备降低RANKL和/或MIP-1α蛋白表达水平的药物中的应用。

优选的是，所述抑制包括下调或敲除。

优选的是，所述物质包括能够抑制ENPP2基因和/或ENPP2蛋白表达的病毒载体、质粒、重组细胞、化合物或组合物。

本发明还提供了一种治疗多发性骨髓瘤的药物，所述药物包括能够抑制ENPP2基因和/或ENPP2蛋白表达的物质。

优选的是，所述药物包括抑制ENPP2基因和/或ENPP2蛋白表达的病毒载体、质粒、重组细胞、化合物或组合物。

优选的是，所述药物包括ENPP2抑制剂，所述ENPP2抑制剂包括ENPP2蛋白酶抑制剂，所述ENPP2蛋白酶抑制剂包括PF-8380。

本发明提供了抑制ENPP2基因和/或ENPP2蛋白表达的物质在制备治疗多发性骨髓瘤的药物中的应用。本发明通过研究ENPP2对骨髓瘤细胞增殖和凋亡的影响以及对ENPP2诱导的骨髓瘤细胞溶骨活性的调控作用，最终发现：IL-6能够上调ENPP2在骨髓瘤细胞中的表达，并且ENPP2在CD138+细胞中的mRNA和蛋白水平比在CD138-细胞表达要高。ENPP2蛋白能促进骨髓瘤细胞的增殖，抑制细胞的凋亡，促进RANKL和MIP-1α在mRNA和蛋白质水平的表达，促进DKK1的表达，增加LPA的产生。干涉ENPP2能够抑制肿瘤的生长，减轻肿瘤的负荷，促进肿瘤的凋亡，肿瘤局部RANKL,MIP-1α蛋白表达水平降低，小鼠血清中LPA、ENPP2、RANK、MIP-1α水平降低。ENPP2具有调控骨髓瘤细胞破骨细胞活化因子的作用，对于多种病因引起的骨髓瘤细胞溶骨性病变的保护具有重要意义。本发明所述应用不仅提供了一种ENPP2基因和/或蛋白的新用途，而且还提供了多发性骨髓瘤治疗的新靶点，能够制备得到多发性骨髓瘤治疗的新药物。

附图说明

图1为本发明实施例1提供的IL-6能够上调ENPP2在骨髓瘤细胞中的表达的结果图；其中，A为用不同浓度的IL-6处理U266B1细胞12h后检测ENPP2蛋白的表达；B为U266B1细胞经IL-6处理不同时间后检测ENPP2蛋白表达；C为不同浓度IL-6处理RPMI-8226细胞12h后检测ENPP2蛋白表达；D为IL-6对RPMI-8226细胞进行不同时间的处理后检测ENPP2蛋白表达；

图2为本发明实施例2提供的ENPP2及破骨细胞活化因子在骨髓瘤CD138+细胞中高表达的结果图；其中，A为用CD138微球分离骨髓瘤细胞，分离前后用CD138-Alexa fluor647标记细胞，测定纯度；B为测定原代骨髓瘤病人CD138+细胞和CD138-细胞中ENPP2、RANKL和MIP-1α蛋白的表达水平；C为实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)测定原代骨髓瘤病人CD138+细胞和CD138-细胞的ENPP2、RANKL、MIP-1α、MCSF、DKK1的mRNA水平；

图3为本发明实施例3提供的ENPP2高表达促进骨髓瘤细胞增殖，抑制细胞凋亡，上调破骨细胞活化因子表达的结果图；其中，A为50MOI的Ad.ENPP2或Ad.Null感染U266B1细胞48h检测ENPP2、RANKL、MIP-1α蛋白的水平；B为Ad.ENPP2或Ad.Null感染U266B1细胞48h检测ENPP2，RANKL、MIP-1α、MCSF、DKK1的mRNA的水平；C为Ad.ENPP2或Ad.Null感染U266B1细胞，分别在24h和48h取细胞进行凋亡检测的细胞凋亡的流式图；D为Ad.ENPP2或Ad.Null感染U266B1细胞，分别在24h和48h取细胞进行凋亡检测细胞凋亡的统计图；E为Ad.ENPP2或Ad.Null感染U266B1细胞；孵育24h、48h、72h、96h后，用CCK-8检测细胞增殖情况；

图4为本发明实施例3提供的ENPP2抑制剂下调破骨细胞活化因子表达，增加骨髓瘤细胞凋亡，降低细胞增殖和存活的结果图；其中A为ENPP2抑制剂处理U266B1细胞48h，检测ENPP2、RANKL、MIP-1α的蛋白水平；B为ENPP2抑制剂处理U266B1细胞48h，检测RANKL、MIP-1α、MCSF、DKK1的mRNA水平；C为ENPP2抑制剂处理U266B1细胞24h和48h，进行细胞凋亡检测的细胞凋亡的流式图；D为ENPP2抑制剂处理U266B1细胞24h和48h，进行细胞凋亡检测细胞凋亡的统计图；E为不同浓度ENPP2抑制剂处理U266B1细胞24h、48h、72h和96h后检测细胞增殖情况；F为U266B1-Luc细胞使用不同浓度的ENPP2抑制剂处理24h和48h，使用ONE-Glo荧光素酶检测系统检测细胞存活情况；

图5为本发明实施例3提供的IL-6和ENPP2过表达增加了LPA产生的结果图；其中，A为U266B1细胞LPA受体的mRNA水平；B为RPMI-8226细胞LPA受体的mRNA水平；C为U266B1细胞用IL-6，ENPP2抑制剂或DMSO处理，或用Ad.ENPP2/Ad.Null病毒感染；酶联免疫吸附法(ELISA)测定U266B1细胞上清液中LPA的水平；D为RPMI-8226细胞用IL-6，ENPP2抑制剂或DMSO处理，或用Ad.ENPP2/Ad.Null病毒感染；ELISA测定RPMI-8226细胞上清液中LPA的水平；

图6为本发明实施例4提供的ENPP2基因敲除抑制了NCIH929异种移植模型骨髓瘤细胞生长的结果图；其中，A为NCIH929细胞经ENPP2-shRNA和对照载体转染48h，流式细胞术和荧光显微镜检测的结果图；B为NCIH929细胞经ENPP2-shRNA和对照载体转染48h，检测ENPP2、RANKL、MIP-1α、MCSF、DKK1的mRNA水平；C为经ENPP2-shRNA和对照载体转染的NCIH929细胞的增殖情况；D为将B-NSG小鼠皮下注射scramble shRNA转导的NCIH929细胞(Scr)或ENPP2敲除的NCI-H929细胞(5×10⁶个/鼠)，建立骨髓瘤异种移植模型(每组n＝4只)；分别于第1、7、14天用生物荧光成像(BLI)监测肿瘤负荷；E为BLI的量化结果；F为第14天，处死小鼠，切除原位肿瘤称重；

图7为本发明实施例5提供的敲低ENPP2在体内抑制肿瘤细胞增殖，促进细胞凋亡，下调破骨细胞活化因子的表达的结果图；其中，A为肿瘤组织分别用末端脱氧核苷酸转移UTP标记法(TUNEL)和Ki67染色法观察细胞的凋亡和增殖情况；B为TUNEL的相应统计分析结果；C为Ki67染色相应的统计分析结果；D为通过免疫组织化学方法观察肿瘤组织ENPP2、RANKL和MIP-1α蛋白的水平；E为ENPP2蛋白在肿瘤组织中表达的统计分析结果；F为肿瘤组织中RANKL表达的统计分析结果；G为MIP-1α在肿瘤组织中表达的统计分析结果；H为在第14天收集肿瘤组织，检测肿瘤组织中ENPP2，RANKL、MIP-1α、MCSF和DKK1的mRNA水平；I为第1、7、14天分别采集小鼠外周血，采用ELISA检测血清中LPA的水平；J为第1、7、14天分别采集小鼠外周血，采用ELISA检测血清中ENPP2的水平；K为第1、7、14天分别采集小鼠外周血，采用ELISA检测血清中RANKL的水平；L为第1、7、14天分别采集小鼠外周血，采用ELISA检测血清中MIP-1α的水平。

具体实施方式

本发明提供了抑制ENPP2基因和/或ENPP2蛋白表达的物质在制备治疗多发性骨髓瘤的药物中的应用。在本发明中，所述ENPP2蛋白为焦磷酸酶/磷酸二酯酶2，所述ENPP2基因用于编码所述ENPP2蛋白。焦磷酸酶/磷酸二酯酶2(Ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 2,ENPP2)也被称为自分泌运动因子(Autotaxin,ATX)，是一种分泌的溶血磷脂酶D(lysophospholipase D,LysoPLD)，作用于循环的溶血磷脂酰胆碱(Lysophosphatidylcholine,LPC)，产生溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid,LPA)。本发明所述ENPP2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：ATGGCAAGGAGGAGCTCGTTCCAGTCGTGTCAGATAATATCCCTGTTCACTTTTGCCGTTGGAGTCAATATCTGCTTAGGATTCACTGCACATCGAATTAAGAGAGCAGAAGGATGGGAGGAAGGTCCTCCTACAGTGCTATCAGACTCCCCCTGGACCAACATCTCCGGATCTTGCAAGGGCAGGTGCTTTGAACTTCAAGAGGCTGGACCTCCTGATTGTCGCTGTGACAACTTGTGTAAGAGCTATACCAGTTGCTGCCATGACTTTGATGAGCTGTGTTTGAAGACAGCCCGTGGCTGGGAGTGTACTAAGGACAGATGTGGAGAAGTCAGAAATGAAGAAAATGCCTGTCACTGCTCAGAGGACTGCTTGGCCAGGGGAGACTGCTGTACCAATTACCAAGTGGTTTGCAAAGGAGAGTCGCATTGGGTTGATGATGACTGTGAGGAAATAAAGGCCGCAGAATGCCCTGCAGGGTTTGTTCGCCCTCCATTAATCATCTTCTCCGTGGATGGCTTCCGTGCATCATACATGAAGAAAGGCAGCAAAGTCATGCCTAATATTGAAAAACTAAGGTCTTGTGGCACACACTCTCCCTACATGAGGCCGGTGTACCCAACTAAAACCTTTCCTAACTTATACACTTTGGCCACTGGGCTATATCCAGAATCACATGGAATTGTTGGCAATTCAATGTATGATCCTGTATTTGATGCCACTTTTCATCTGCGAGGGCGAGAGAAATTTAATCATAGATGGTGGGGAGGTCAACCGCTATGGATTACAGCCACCAAGCAAGGGGTGAAAGCTGGAACATTCTTTTGGTCTGTTGTCATCCCTCACGAGCGGAGAATATTAACCATATTGCAGTGGCTCACCCTGCCAGATCATGAGAGGCCTTCGGTCTATGCCTTCTATTCTGAGCAACCTGATTTCTCTGGACACAAATATGGCCCTTTCGGCCCTGAGATGACAAATCCTCTGAGGGAAATCGACAAAATTGTGGGGCAATTAATGGATGGACTGAAACAACTAAAACTGCATCGGTGTGTCAACGTCATCTTTGTCGGAGACCATGGAATGGAAGATGTCACATGTGATAGAACTGAGTTCTTGAGTAATTACCTAACTAATGTGGATGATATTACTTTAGTGCCTGGAACTCTAGGAAGAATTCGATCCAAATTTAGCAACAATGCTAAATATGACCCCAAAGCCATTATTGCCAATCTCACGTGTAAAAAACCAGATCAGCACTTTAAGCCTTACTTGAAACAGCACCTTCCCAAACGTTTGCACTATGCCAACAACAGAAGAATTGAGGATATCCATTTATTGGTGGAACGCAGATGGCATGTTGCAAGGAAACCTTTGGATGTTTATAAGAAACCATCAGGAAAATGCTTTTTCCAGGGAGACCACGGATTTGATAACAAGGTCAACAGCATGCAGACTGTTTTTGTAGGTTATGGCTCAACATTTAAGTACAAGACTAAAGTGCCTCCATTTGAAAACATTGAACTTTACAATGTTATGTGTGATCTCCTGGGATTGAAGCCAGCTCCTAATAATGGGACCCATGGAAGTTTGAATCATCTCCTGCGCACTAATACCTTCAGGCCAACCATGCCAGAGGAAGTTACCAGACCCAATTATCCAGGGATTATGTACCTTCAGTCTGATTTTGACCTGGGCTGCACTTGTGATGATAAGGTAGAGCCAAAGAACAAGTTGGATGAACTCAACAAACGGCTTCATACAAAAGGGTCTACAGAAGAGAGACACCTCCTCTATGGGCGACCTGCAGTGCTTTATCGGACTAGATATGATATCTTATATCACACTGACTTTGAAAGTGGTTATAGTGAAATATTCCTAATGCCACTCTGGACATCATATACTGTTTCCAAACAGGCTGAGGTTTCCAGCGTTCCTGACCATCTGACCAGTTGCGTCCGGCCTGATGTCCGTGTTTCTCCGAGTTTCAGTCAGAACTGTTTGGCCTACAAAAATGATAAGCAGATGTCCTACGGATTCCTCTTTCCTCCTTATCTGAGCTCTTCACCAGAGGCTAAATATGATGCATTCCTTGTAACCAATATGGTTCCAATGTATCCTGCTTTCAAACGGGTCTGGAATTATTTCCAAAGGGTATTGGTGAAGAAATATGCTTCGGAAAGAAATGGAGTTAACGTGATAAGTGGACCAATCTTCGACTATGACTATGATGGCTTACATGACACAGAAGACAAAATAAAACAGTACGTGGAAGGCAGTTCCATTCCTGTTCCAACTCACTACTACAGCATCATCACCAGCTGTCTGGATTTCACTCAGCCTGCCGACAAGTGTGACGGCCCTCTCTCTGTGTCCTCCTTCATCCTGCCTCACCGGCCTGACAACGAGGAGAGCTGCAATAGCTCAGAGGACGAATCAAAATGGGTAGAAGAACTCATGAAGATGCACACAGCTAGGGTGCGTGACATTGAACATCTCACCAGCCTGGACTTCTTCCGAAAGACCAGCCGCAGCTACCCAGAAATCCTGACACTCAAGACATACCTGCATACATATGAGAGCGAGATTTAA(NCBI ReferenceSequence:NM_001040092.3(2592nt))，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：MARRSSFQSCQIISLFTFAVGVNICLGFTAHRIKRAEGWEEGPPTVLSDSPWTNISGSCKGRCFELQEAGPPDCRCDNLCKSYTSCCHDFDELCLKTARGWECTKDRCGEVRNEENACHCSEDCLARGDCCTNYQVVCKGESHWVDDDCEEIKAAECPAGFVRPPLIIFSVDGFRASYMKKGSKVMPNIEKLRSCGTHSPYMRPVYPTKTFPNLYTLATGLYPESHGIVGNSMYDPVFDATFHLRGREKFNHRWWGGQPLWITATKQGVKAGTFFWSVVIPHERRILTILQWLTLPDHERPSVYAFYSEQPDFSGHKYGPFGPEMTNPLREIDKIVGQLMDGLKQLKLHRCVNVIFVGDHGMEDVTCDRTEFLSNYLTNVDDITLVPGTLGRIRSKFSNNAKYDPKAIIANLTCKKPDQHFKPYLKQHLPKRLHYANNRRIEDIHLLVERRWHVARKPLDVYKKPSGKCFFQGDHGFDNKVNSMQTVFVGYGSTFKYKTKVPPFENIELYNVMCDLLGLKPAPNNGTHGSLNHLLRTNTFRPTMPEEVTRPNYPGIMYLQSDFDLGCTCDDKVEPKNKLDELNKRLHTKGSTEERHLLYGRPAVLYRTRYDILYHTDFESGYSEIFLMPLWTSYTVSKQAEVSSVPDHLTSCVRPDVRVSPSFSQNCLAYKNDKQMSYGFLFPPYLSSSPEAKYDAFLVTNMVPMYPAFKRVWNYFQRVLVKKYASERNGVNVISGPIFDYDYDGLHDTEDKIKQYVEGSSIPVPTHYYSIITSCLDFTQPADKCDGPLSVSSFILPHRPDNEESCNSSEDESKWVEELMKMHTARVRDIEHLTSLDFFRKTSRSYPEILTLKTYLHTYESEI(NCBI Reference Sequence:NP_001035181.1(863aa))。具体的，本发明利用重组腺病毒Ad.ENPP2(携带ENPP2基因的腺病毒载体(Ad.ENPP2)购自ViGene Biosciences(山东维真生物科技有限公司))感染骨髓瘤细胞，观察其对骨髓瘤细胞增殖，凋亡，LPA的产生以及RANKL、MIP-1α、MCSF、DKK1表达的影响(MCSF(Macrophage colony stimulatingfactor)巨噬细胞集落刺激因子；RANKL(Receptor activator ofnuclear factor kappa Bligand)核因子κB受体活化因子配体；DKK1(dickkopfs1)Dickkopf家族相关蛋白1；MIP-1α(macrophage inflammatoryprotein 1alpha)巨噬细胞炎性蛋白1α。)。利用ENPP2抑制剂处理骨髓瘤细胞，观察其对骨髓瘤细胞增殖，凋亡，生存，LPA的产生，以及RANKL、MIP-1α、MCSF、DKK1表达的影响。利用慢病毒干涉载体pHBLV-ENPP2-shRNA感染骨髓瘤细胞构建ENPP2敲低细胞系，皮下注射B-NSG小鼠，建立骨髓瘤异种移植模型。结果表明：IL-6能够上调ENPP2在骨髓瘤细胞中的表达，并且ENPP2在CD138+细胞中的mRNA和蛋白水平比在CD138-细胞表达要高。ENPP2蛋白能促进骨髓瘤细胞的增殖，抑制细胞的凋亡，促进RANKL和MIP-1α在mRNA和蛋白质水平的表达，促进DKK1的表达，增加LPA的产生。干涉ENPP2能够抑制肿瘤的生长，减轻肿瘤的负荷，促进肿瘤的凋亡，肿瘤局部RANKL、MIP-1α蛋白表达水平降低，小鼠血清中LPA、ENPP2、RANKL、MIP-1α水平降低。ENPP2具有调控骨髓瘤细胞破骨细胞活化因子的作用，对于多种病因引起的骨髓瘤细胞溶骨性病变的保护具有重要意义。

本发明还提供了抑制ENPP2基因和/或ENPP2蛋白表达的物质在制备抑制多发性骨髓瘤生长的药物中的应用。

本发明还提供了抑制ENPP2基因和/或ENPP2蛋白表达的物质在制备促进多发性骨髓瘤细胞凋亡的药物中的应用。

本发明还提供了抑制ENPP2基因和/或ENPP2蛋白表达的物质在制备降低RANKL和/或MIP-1α蛋白表达水平的药物中的应用。

在本发明中，所述抑制包括下调或敲除。

在本发明中，所述物质包括能够抑制ENPP2基因和/或ENPP2蛋白表达的病毒载体、质粒、重组细胞、化合物或组合物。

本发明还提供了一种治疗多发性骨髓瘤的药物，所述药物包括能够抑制ENPP2基因和/或ENPP2蛋白表达的物质。

在本发明中，所述药物包括抑制ENPP2基因和/或ENPP2蛋白表达的病毒载体、质粒、重组细胞、化合物或组合物。

在本发明中，所述药物包括ENPP2抑制剂，所述ENPP2抑制剂包括ENPP2蛋白酶抑制剂，所述ENPP2蛋白酶抑制剂包括PF-8380。

下面结合具体实施例对本发明所述的抑制ENPP2基因和/或ENPP2蛋白表达的物质在制备治疗多发性骨髓瘤的药物中的应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

IL-6对骨髓瘤细胞ENPP2表达的影响：

(1)IL-6对U266B1细胞ENPP2表达的影响

分别用20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL的IL-6处理U266B1细胞12h、WesternBlot检测ENPP2的表达。结果见图1中的A，图1中的A显示：与对照组相比，不同浓度的IL-6均能诱导U266B1细胞ENPP2的表达，并具有浓度依赖性。用50ng/mL的IL-6处理U266B1细胞6h、12h、24、Western Blot检测ENPP2的表达。结果见图1中的B，图1中的B显示：IL-6能诱导U266B1细胞ENPP2的表达、并具有时间依赖性。

(2)IL-6对RPMI-8226细胞ENPP2表达的影响

分别用20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL的IL-6处理RPMI-8226细胞12h、WesternBlot检测ENPP2的表达。结果见图1中的C，图1中的C显示：与对照组相比，不同浓度的IL-6均能诱导RPMI-8226细胞ENPP2的表达，并具有浓度依赖性。用50ng/mL的IL-6处理RPMI-8226细胞6h、12h、24、WesternBlot检测ENPP2的表达。结果见图1中的D，图1中的D显示：IL-6能诱导RPMI-8226细胞ENPP2的表达、并具有时间依赖性。

实施例2

ENPP2及破骨细胞活化因子在原代骨髓瘤CD138+细胞中的表达水平

(1)CD138+细胞的分选

通过Ficoll密度梯度离心加磁珠分选的方法研究ENPP2及破骨细胞活化因子在原代骨髓瘤CD138+细胞中的表达水平，从骨髓瘤病人样本中纯化CD138+的骨髓瘤细胞。结果如图2中的A所示：经过上述方法分选后，CD138+的骨髓瘤细胞纯度达到了90％以上。

(2)CD138+细胞中ENPP2及破骨细胞活化因子的表达

通过Western Blot检测CD138+及CD138-细胞中ENPP2、RANKL、MIP-1α的表达。结果如图2中的B所示：三例患者的CD138+细胞中ENPP2、RANKL、MIP-1α蛋白的表达水平均高于CD138-细胞。通过qRT-PCR检测CD138+及CD138-细胞中ENPP2、RANKL、MIP-1α、MCSF、DKK1的表达。结果如图2中的B所示：CD138+细胞中ENPP2、RANKL、MIP-1α、DKK1的表达水平均高于CD138-细胞。

实施例3

ENPP2对U266B1细胞生物学特性的影响：

(1)过表达ENPP2对U266B1细胞RANKL、MIP-1α表达的影响

用Western Blot和qRT-PCR分别检测了过表达ENPP2后RANKL、MIP-1α在RNA水平和蛋白水平的表达情况。结果如图3所示：与对照病毒相比，无论是在蛋白水(图3中的A)还是平mRNA水平(图3中的B)，过表达ENPP2可促进RANKL、MIP-1α表达的升高。

(2)过表达ENPP2对U266B1细胞凋亡的影响

U266B1细胞分别感染Ad.ENPP2与Ad.Null后继续培养24h，48h，通过流式细胞仪检过表达ENPP2对U266B1细胞凋亡的影响。结果见图3中的C和D，其中C为细胞凋亡的流式图，D为细胞凋亡的统计图，图3中的C和D显示：与对照组相比，在24h和48h时Ad.ENPP2明显抑制U266B1细胞凋亡。

(3)过表达ENPP2对U266B1细胞增殖的影响

U266B1细胞分别感染Ad.ENPP2与Ad.Null后继续培养96h，通过CCK8法检测过表达ENPP2对U266B1细胞增殖的影响。结果见图3中的E，图3中的E显示：与对照组相比，在24h，48h和72h时，Ad.ENPP2明显促进U266B1细胞增殖。

(4)抑制ENPP2对U266B1细胞RANKL、MIP-1α表达的影响

用WesternBlot检测20uMENPP2抑制剂(PF-8380)处理U266B1细胞后ENPP2、RANKL、MIP-1α在RNA蛋白水平的表达情况。结果如图4中的A所示：与DMSO相比，在蛋白水平，ENPP2抑制剂可降低ENPP2、RANKL、MIP-1α表达。用qRT-PCR检测了U266B1细胞ENPP2抑制后、RANKL、MIP-1α，MCSF、DKK1在RNA水平的表达情况。结果如图4中的B所示：与DMSO相比，在RNA水平，ENPP2抑制后能降低RANKL、MIP-1α、MCSF的表达。

(5)抑制ENPP2对U266B1细胞凋亡的影响

U266B1细胞分别用20uM PF-8380处理24h和48h，收集细胞进行凋亡检测。结果见图4中的C和D，其中C为细胞凋亡的流式图，D为细胞凋亡的统计图，图4中的C和D显示：与DMSO相比，在24h和48h时，抑制ENPP2明显促进U266B1细胞凋亡。

(6)抑制ENPP2对U266B1细胞增殖的影响

U266B1细胞分别用不同浓度的PF-8380处理24h、48h、72h，96h，通过CCK8法检测抑制ENPP2对U266B1细胞增殖的影响。结果见图4中的E，图4中的E显示：与DMSO相比，20uM PF-8380在24h，48h，72h和96h时明显抑制U266B1细胞增殖。

(7)抑制ENPP2对U266B1细胞生存的影响

U266B1-Luc细胞使用不同浓度的PF-8380处理24h和48h，使用ONE-Glo荧光素酶检测系统检测细胞存活率。结果如图4中的F显示：与DMSO相比，不同浓度的PF-8380在24h和48h均能明显降低U266B1细胞的存活率。

(8)ENPP2对骨髓瘤细胞分泌LPA的影响

用qRT-PCR检测U266B1细胞及RPMI-8226细胞LPA受体的表达情况来研究ENPP2对U266B1细胞分泌LPA的影响。结果如图5所示：U266B1细胞(图5中的A)及RPMI-8226细胞(图5中的B)均不同程度表达LPAR1-6。进一步，将U266B1细胞及RPMI-8226细胞用50ng/mL IL-6、20uM PF8380或DMSO处理，或用Ad.ENPP2/Ad.null转导，采用ELISA测定细胞上清液中LPA浓度。结果如图5所示：IL-6和ENPP2过表达增加了U266B1细胞(图5中的C)及RPMI-8226细胞(图5中的D)分泌LPA。

实施例4

ENPP2基因敲除抑制了NCIH929异种移植模型骨髓瘤细胞生长

(1)NCIH929-ENPP2敲低细胞系的构建及鉴定

NCIH929细胞经ENPP2-shRNA和对照载体转染48h，流式细胞术和荧光显微镜检测的结果，如图6中的A所示：ENPP2-shRNA和对照载体转染效率均在90％以上。NCIH929细胞经ENPP2-shRNA和对照载体转染48h，检测ENPP2、RANKL、MIP-1α、MCSF、DKK1的mRNA水平，如图6中的B所示：与对照载体相比，ENPP2干涉载体能明显抑制ENPP2、RANKL、MIP-1α、MCSF、DKK1的表达。NCIH929细胞经ENPP2-shRNA和对照载体转染48h后继续培养96h，通过CCK8法检测干涉ENPP2对NCIH929细胞增殖的影响，如图6中的C所示：干涉ENPP2明显抑制细胞增殖。

(2)干涉ENPP2基因抑制了肿瘤的生长

将B-NSG小鼠皮下注射scramble shRNA转导的NCIH929细胞(Scr)或ENPP2敲除的NCI-H929细胞(5×10⁶个/鼠)，建立骨髓瘤异种移植模型(每组n＝4只)。分别于第1、7、14天用生物荧光成像(BLI)监测肿瘤负荷(如图6中的D所示)，结果如图6中的E所示：在第7、14天，ENPP2-ShRNA小鼠的肿瘤负荷明显低于Scr对照组。第14天，处死小鼠，切除原位肿瘤称重、结果如图6中的F所示：ENPP2-ShRNA小鼠的肿瘤重量明显低于Scr对照组。

实施例5

干涉ENPP2在体内抑制肿瘤细胞增殖，促进细胞凋亡，下调破骨细胞活化因子的表达

(1)干涉ENPP2在体内抑制肿瘤细胞增殖，促进细胞凋亡

第14天，处死小鼠，肿瘤组织分别用末端脱氧核苷酸转移UTP标记法(TUNEL)和Ki67染色法观察细胞的凋亡和增殖情况。结果图7A-C所示：敲低ENPP2，促进细胞的凋亡(图7中的B)，抑制肿瘤细胞的增殖(图7中的C)。

(2)干涉ENPP2抑制肿瘤组织RANKL、MIP-1α蛋白表达

通过免疫组织化学方法观察肿瘤组织ENPP2、RANKL和MIP-1α蛋白的水平，结果图7D-G所示：干涉ENPP2明显降低了肿瘤组织ENPP2(图7中的E)、RANKL(图7中的F)和MIP-1α(图7中的G)蛋白的表达。

(3)干涉ENPP2抑制肿瘤细胞RANKL、MIP-1α、MCSF、DKK1的表达

在第14天收集肿瘤组织，用qRT-PCR检测肿瘤组织中ENPP2、RANKL、MIP-1α、MCSF和DKK1的mRNA水平、结果图7中的H所示：与对照组相比，干涉ENPP2抑制肿瘤细胞RANKL、MIP-1α、MCSF、DKK1的表达。

(4)干涉ENPP2抑制肿瘤细胞分泌LPA、ENPP2、RANKL、MIP-1α蛋白

第1、7、14天分别采集小鼠外周血，采用ELISA检测血清中LPA、ENPP2、RANKL和MIP-1α的水平。结果图7中的I-L所示：与正常小鼠相比，Scr对照组和ENPP2-ShRNA组小鼠的肿瘤细胞分泌LPA(图7中的I)、ENPP2(图7中的J)、RANKL(图7中的K)、MIP-1α(图7中的L)蛋白明显增加；与Scr对照组相比，ENPP2-ShRNA组小鼠的肿瘤细胞分泌LPA、ENPP2、RANKL、MIP-1α蛋白明显增加。

经上述实验证明：IL-6能够上调ENPP2在骨髓瘤细胞中的表达，并且ENPP2在CD138+细胞中的mRNA和蛋白水平比在CD138-细胞表达要高。ENPP2蛋白能促进骨髓瘤细胞的增殖，抑制细胞的凋亡，促进RANKL和MIP-1α在mRNA和蛋白质水平的表达，促进DKK1的表达，增加LPA的产生。干涉ENPP2能够抑制肿瘤的生长，减轻肿瘤的负荷，促进肿瘤的凋亡，肿瘤局部RANKL、MIP-1α蛋白表达水平降低，小鼠血清中LPA、ENPP2、RANKL、MIP-1α水平降低。ENPP2具有调控骨髓瘤细胞破骨细胞活化因子的作用，对于多种病因引起的骨髓瘤细胞溶骨性病变的保护具有重要意义。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

中关村三有利再生医学研究中心

<120> 抑制ENPP2基因和/或蛋白表达的物质在制备治疗多发性骨髓瘤的药物中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2592

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggcaagga ggagctcgtt ccagtcgtgt cagataatat ccctgttcac ttttgccgtt 60

ggagtcaata tctgcttagg attcactgca catcgaatta agagagcaga aggatgggag 120

gaaggtcctc ctacagtgct atcagactcc ccctggacca acatctccgg atcttgcaag 180

ggcaggtgct ttgaacttca agaggctgga cctcctgatt gtcgctgtga caacttgtgt 240

aagagctata ccagttgctg ccatgacttt gatgagctgt gtttgaagac agcccgtggc 300

tgggagtgta ctaaggacag atgtggagaa gtcagaaatg aagaaaatgc ctgtcactgc 360

tcagaggact gcttggccag gggagactgc tgtaccaatt accaagtggt ttgcaaagga 420

gagtcgcatt gggttgatga tgactgtgag gaaataaagg ccgcagaatg ccctgcaggg 480

tttgttcgcc ctccattaat catcttctcc gtggatggct tccgtgcatc atacatgaag 540

aaaggcagca aagtcatgcc taatattgaa aaactaaggt cttgtggcac acactctccc 600

tacatgaggc cggtgtaccc aactaaaacc tttcctaact tatacacttt ggccactggg 660

ctatatccag aatcacatgg aattgttggc aattcaatgt atgatcctgt atttgatgcc 720

acttttcatc tgcgagggcg agagaaattt aatcatagat ggtggggagg tcaaccgcta 780

tggattacag ccaccaagca aggggtgaaa gctggaacat tcttttggtc tgttgtcatc 840

cctcacgagc ggagaatatt aaccatattg cagtggctca ccctgccaga tcatgagagg 900

ccttcggtct atgccttcta ttctgagcaa cctgatttct ctggacacaa atatggccct 960

ttcggccctg agatgacaaa tcctctgagg gaaatcgaca aaattgtggg gcaattaatg 1020

gatggactga aacaactaaa actgcatcgg tgtgtcaacg tcatctttgt cggagaccat 1080

ggaatggaag atgtcacatg tgatagaact gagttcttga gtaattacct aactaatgtg 1140

gatgatatta ctttagtgcc tggaactcta ggaagaattc gatccaaatt tagcaacaat 1200

gctaaatatg accccaaagc cattattgcc aatctcacgt gtaaaaaacc agatcagcac 1260

tttaagcctt acttgaaaca gcaccttccc aaacgtttgc actatgccaa caacagaaga 1320

attgaggata tccatttatt ggtggaacgc agatggcatg ttgcaaggaa acctttggat 1380

gtttataaga aaccatcagg aaaatgcttt ttccagggag accacggatt tgataacaag 1440

gtcaacagca tgcagactgt ttttgtaggt tatggctcaa catttaagta caagactaaa 1500

gtgcctccat ttgaaaacat tgaactttac aatgttatgt gtgatctcct gggattgaag 1560

ccagctccta ataatgggac ccatggaagt ttgaatcatc tcctgcgcac taataccttc 1620

aggccaacca tgccagagga agttaccaga cccaattatc cagggattat gtaccttcag 1680

tctgattttg acctgggctg cacttgtgat gataaggtag agccaaagaa caagttggat 1740

gaactcaaca aacggcttca tacaaaaggg tctacagaag agagacacct cctctatggg 1800

cgacctgcag tgctttatcg gactagatat gatatcttat atcacactga ctttgaaagt 1860

ggttatagtg aaatattcct aatgccactc tggacatcat atactgtttc caaacaggct 1920

gaggtttcca gcgttcctga ccatctgacc agttgcgtcc ggcctgatgt ccgtgtttct 1980

ccgagtttca gtcagaactg tttggcctac aaaaatgata agcagatgtc ctacggattc 2040

ctctttcctc cttatctgag ctcttcacca gaggctaaat atgatgcatt ccttgtaacc 2100

aatatggttc caatgtatcc tgctttcaaa cgggtctgga attatttcca aagggtattg 2160

gtgaagaaat atgcttcgga aagaaatgga gttaacgtga taagtggacc aatcttcgac 2220

tatgactatg atggcttaca tgacacagaa gacaaaataa aacagtacgt ggaaggcagt 2280

tccattcctg ttccaactca ctactacagc atcatcacca gctgtctgga tttcactcag 2340

cctgccgaca agtgtgacgg ccctctctct gtgtcctcct tcatcctgcc tcaccggcct 2400

gacaacgagg agagctgcaa tagctcagag gacgaatcaa aatgggtaga agaactcatg 2460

aagatgcaca cagctagggt gcgtgacatt gaacatctca ccagcctgga cttcttccga 2520

aagaccagcc gcagctaccc agaaatcctg acactcaaga catacctgca tacatatgag 2580

agcgagattt aa 2592

<210> 2

<211> 863

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ala Arg Arg Ser Ser Phe Gln Ser Cys Gln Ile Ile Ser Leu Phe

1               5                   10                  15

Thr Phe Ala Val Gly Val Asn Ile Cys Leu Gly Phe Thr Ala His Arg

            20                  25                  30

Ile Lys Arg Ala Glu Gly Trp Glu Glu Gly Pro Pro Thr Val Leu Ser

        35                  40                  45

Asp Ser Pro Trp Thr Asn Ile Ser Gly Ser Cys Lys Gly Arg Cys Phe

    50                  55                  60

Glu Leu Gln Glu Ala Gly Pro Pro Asp Cys Arg Cys Asp Asn Leu Cys

65                  70                  75                  80

Lys Ser Tyr Thr Ser Cys Cys His Asp Phe Asp Glu Leu Cys Leu Lys

                85                  90                  95

Thr Ala Arg Gly Trp Glu Cys Thr Lys Asp Arg Cys Gly Glu Val Arg

            100                 105                 110

Asn Glu Glu Asn Ala Cys His Cys Ser Glu Asp Cys Leu Ala Arg Gly

        115                 120                 125

Asp Cys Cys Thr Asn Tyr Gln Val Val Cys Lys Gly Glu Ser His Trp

    130                 135                 140

Val Asp Asp Asp Cys Glu Glu Ile Lys Ala Ala Glu Cys Pro Ala Gly

145                 150                 155                 160

Phe Val Arg Pro Pro Leu Ile Ile Phe Ser Val Asp Gly Phe Arg Ala

                165                 170                 175

Ser Tyr Met Lys Lys Gly Ser Lys Val Met Pro Asn Ile Glu Lys Leu

            180                 185                 190

Arg Ser Cys Gly Thr His Ser Pro Tyr Met Arg Pro Val Tyr Pro Thr

        195                 200                 205

Lys Thr Phe Pro Asn Leu Tyr Thr Leu Ala Thr Gly Leu Tyr Pro Glu

    210                 215                 220

Ser His Gly Ile Val Gly Asn Ser Met Tyr Asp Pro Val Phe Asp Ala

225                 230                 235                 240

Thr Phe His Leu Arg Gly Arg Glu Lys Phe Asn His Arg Trp Trp Gly

                245                 250                 255

Gly Gln Pro Leu Trp Ile Thr Ala Thr Lys Gln Gly Val Lys Ala Gly

            260                 265                 270

Thr Phe Phe Trp Ser Val Val Ile Pro His Glu Arg Arg Ile Leu Thr

        275                 280                 285

Ile Leu Gln Trp Leu Thr Leu Pro Asp His Glu Arg Pro Ser Val Tyr

    290                 295                 300

Ala Phe Tyr Ser Glu Gln Pro Asp Phe Ser Gly His Lys Tyr Gly Pro

305                 310                 315                 320

Phe Gly Pro Glu Met Thr Asn Pro Leu Arg Glu Ile Asp Lys Ile Val

                325                 330                 335

Gly Gln Leu Met Asp Gly Leu Lys Gln Leu Lys Leu His Arg Cys Val

            340                 345                 350

Asn Val Ile Phe Val Gly Asp His Gly Met Glu Asp Val Thr Cys Asp

        355                 360                 365

Arg Thr Glu Phe Leu Ser Asn Tyr Leu Thr Asn Val Asp Asp Ile Thr

    370                 375                 380

Leu Val Pro Gly Thr Leu Gly Arg Ile Arg Ser Lys Phe Ser Asn Asn

385                 390                 395                 400

Ala Lys Tyr Asp Pro Lys Ala Ile Ile Ala Asn Leu Thr Cys Lys Lys

                405                 410                 415

Pro Asp Gln His Phe Lys Pro Tyr Leu Lys Gln His Leu Pro Lys Arg

            420                 425                 430

Leu His Tyr Ala Asn Asn Arg Arg Ile Glu Asp Ile His Leu Leu Val

        435                 440                 445

Glu Arg Arg Trp His Val Ala Arg Lys Pro Leu Asp Val Tyr Lys Lys

    450                 455                 460

Pro Ser Gly Lys Cys Phe Phe Gln Gly Asp His Gly Phe Asp Asn Lys

465                 470                 475                 480

Val Asn Ser Met Gln Thr Val Phe Val Gly Tyr Gly Ser Thr Phe Lys

                485                 490                 495

Tyr Lys Thr Lys Val Pro Pro Phe Glu Asn Ile Glu Leu Tyr Asn Val

            500                 505                 510

Met Cys Asp Leu Leu Gly Leu Lys Pro Ala Pro Asn Asn Gly Thr His

        515                 520                 525

Gly Ser Leu Asn His Leu Leu Arg Thr Asn Thr Phe Arg Pro Thr Met

    530                 535                 540

Pro Glu Glu Val Thr Arg Pro Asn Tyr Pro Gly Ile Met Tyr Leu Gln

545                 550                 555                 560

Ser Asp Phe Asp Leu Gly Cys Thr Cys Asp Asp Lys Val Glu Pro Lys

                565                 570                 575

Asn Lys Leu Asp Glu Leu Asn Lys Arg Leu His Thr Lys Gly Ser Thr

            580                 585                 590

Glu Glu Arg His Leu Leu Tyr Gly Arg Pro Ala Val Leu Tyr Arg Thr

        595                 600                 605

Arg Tyr Asp Ile Leu Tyr His Thr Asp Phe Glu Ser Gly Tyr Ser Glu

    610                 615                 620

Ile Phe Leu Met Pro Leu Trp Thr Ser Tyr Thr Val Ser Lys Gln Ala

625                 630                 635                 640

Glu Val Ser Ser Val Pro Asp His Leu Thr Ser Cys Val Arg Pro Asp

                645                 650                 655

Val Arg Val Ser Pro Ser Phe Ser Gln Asn Cys Leu Ala Tyr Lys Asn

            660                 665                 670

Asp Lys Gln Met Ser Tyr Gly Phe Leu Phe Pro Pro Tyr Leu Ser Ser

        675                 680                 685

Ser Pro Glu Ala Lys Tyr Asp Ala Phe Leu Val Thr Asn Met Val Pro

    690                 695                 700

Met Tyr Pro Ala Phe Lys Arg Val Trp Asn Tyr Phe Gln Arg Val Leu

705                 710                 715                 720

Val Lys Lys Tyr Ala Ser Glu Arg Asn Gly Val Asn Val Ile Ser Gly

                725                 730                 735

Pro Ile Phe Asp Tyr Asp Tyr Asp Gly Leu His Asp Thr Glu Asp Lys

            740                 745                 750

Ile Lys Gln Tyr Val Glu Gly Ser Ser Ile Pro Val Pro Thr His Tyr

        755                 760                 765

Tyr Ser Ile Ile Thr Ser Cys Leu Asp Phe Thr Gln Pro Ala Asp Lys

    770                 775                 780

Cys Asp Gly Pro Leu Ser Val Ser Ser Phe Ile Leu Pro His Arg Pro

785                 790                 795                 800

Asp Asn Glu Glu Ser Cys Asn Ser Ser Glu Asp Glu Ser Lys Trp Val

                805                 810                 815

Glu Glu Leu Met Lys Met His Thr Ala Arg Val Arg Asp Ile Glu His

            820                 825                 830

Leu Thr Ser Leu Asp Phe Phe Arg Lys Thr Ser Arg Ser Tyr Pro Glu

        835                 840                 845

Ile Leu Thr Leu Lys Thr Tyr Leu His Thr Tyr Glu Ser Glu Ile

    850                 855                 860

Claims (3)

1.抑制ENPP2基因表达的ENPP2-shRNA在制备治疗多发性骨髓瘤的药物中的应用。

2.抑制ENPP2基因表达的ENPP2-shRNA在制备抑制多发性骨髓瘤生长的药物中的应用。

3.抑制ENPP2基因表达的ENPP2-shRNA在制备促进多发性骨髓瘤细胞凋亡的药物中的应用。

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