CN112655502A - 一种筛选棉花抗旱相关基因的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种筛选棉花抗旱相关基因的方法，该方法包括以下步骤：实验组：对待测棉花进行干旱胁迫处理；对照组：对所述待测棉花不进行干旱胁迫处理；分别取实验组和对照组植物植株叶片，利用双向凝胶电泳技术寻找差异蛋白，初步获取与植物抗旱相关的候选基因；高光谱表型性状关联的候选基因抗旱功能验证，结合候选基因在不干旱胁迫和干旱胁迫下表达量数据进行eQTL分析，利用候选基因的突变体或转基因材料，进行抗旱表型性状的考查，确认候选基因的抗旱功能；本发明能快速有效的筛选出棉花的抗感相关联的候选基因且该技术可以广泛应用于植物抗旱等抗逆性状的研究和开发并且结合转基因技术来培育抗逆性强的植物新品种。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种筛选棉花抗旱相关基因的方法。
背景技术
全球气候变化加剧，水资源缺乏，温室效应加剧，土壤盐渍化严重，已严重制约我国农业生产。从世界范围内来看，干旱是影响面积最广，造成经济损失最为严重，被认为是世界上最严重的自然灾害之一。全世界土地28％干旱，我国有2/3土地干旱。随着我国粮棉争地的矛盾日益突出，棉花、马铃薯等经济作物的生产形势起伏不定，不容乐观。针对棉花的抗旱性研究，一直都是国内外学者研究的热点，更是增加棉花单位面积产量、提高棉花品质，解决棉花产能不足的关键所在。据统计，我国旱地总面积约为7.58×107hm2，占我国总耕地面积的73.70％，截止2010年我国共有5.5×105hm2耕地受旱，每年造成的经济损失约占总自然灾害的70％以上。因此，开展干旱胁迫对我国经济作物的影响研究，合理开发利用旱地，对我农业生产和经济发展具有重要战略意义。
棉花因具有较强的抗逆性，而被誉为盐碱地的先锋作物。研究棉花的抗旱性，挖掘抗旱相关基因，提高棉花抗逆性，具有重要意义。
发明内容
发明的目的在于提供一种筛选棉花抗旱相关基因的方法，解决了背景技术中的问题。
本发明是这样实现的，一种筛选棉花抗旱相关基因的方法，该方法包括以下步骤：
步骤一、实验组：对待测棉花进行干旱胁迫处理；对照组：对所述待测棉花不进行干旱胁迫处理；
步骤二、分别取实验组和对照组植物植株叶片，利用双向凝胶电泳技术寻找差异蛋白，初步获取与植物抗旱相关的候选基因；
步骤三、高光谱表型性状关联的候选基因抗旱功能验证，结合候选基因在不干旱胁迫和干旱胁迫下表达量数据进行eQTL分析，利用候选基因的突变体或转基因材料，进行抗旱表型性状的考查，确认候选基因的抗旱功能。
本发明的进一步技术方案是：所述步骤一中实验组与对照组的处理包括萌发期、苗期以及成株期的处理。
本发明的进一步技术方案是：所述萌发期：从每份棉花种质中选取50粒大小均匀一致、饱满的种子，用水溶液浸种24h，然后摆放在发芽盒中，种子间距离为粒长的1.5倍，在发芽盒中加入水溶液，将发芽盒置于人工气候箱，设置昼/夜温度为28℃/25℃，湿度为85％，光照/黑暗为12h/12h，光照强度为340μmol/(m2·s)，连续培养10d，每2d补充适量蒸馏水，以保持渗透势不变，以蒸馏水进行相同处理为对照，重复3次。
本发明的进一步技术方案是：所述苗期：在旱棚内进行盆栽试验，播种前各盆施高效复合肥，并浇水至田间持水量的80％，从每份棉花种质中选取50粒大小均匀一致、饱满的种子，按每盆50粒进行播种，播种后覆土2cm，采用随机区组设计，设置正常供水和反复干旱2个处理，3次重复，反复干旱处理为出苗后正常供水，待幼苗长至四叶期时停止供水，当土壤绝对含水量降至田间持水量的20％时，复水至田间持水量的80％，第一次复水后不再供水，当土壤绝对含水量降至田间持水量的20％时，复水至田间持水量的80％。
本发明的进一步技术方案是：所述成株期：在旱棚内进行田间试验，设正常灌水和干旱胁迫2个处理，重复3次，各处理供试材料采用随机区组排列，小区行距50cm，窝距20cm，每窝留苗2株，种植5行，小区之间留一空行，区组间隔60cm，播种行与区组走向垂直，试验地四周播种3行保护行，播种前施高效复合肥作为种肥，干旱胁迫处理播种前灌一次水，以保证苗齐苗全，出苗至成熟期不再灌水，使其充分受旱，对照处理按当地大田生产管理，全生育期灌水6次，以满足正常生长发育的水分需求。
本发明的进一步技术方案是：所述步骤二分别取实验组和对照组植物植株叶片，液氮研磨、离心、裂解处理，获取叶片中的蛋白质样品。
本发明的进一步技术方案是：所述步骤二中双向凝胶电泳技术为：对所得蛋白质样品分别进行双向凝胶电泳处理，等电聚焦采用pH4-7的预制IPG胶条进行，待第二向电泳结束后取下凝胶，放入固定液中室温固定4h-8h，然后放入考马斯亮蓝染色液中进行饱和染色，利用清水清洗凝胶之后即进行凝胶图像扫描，得到实验组和对照组叶片的蛋白双向凝胶电泳图。
本发明的进一步技术方案是：所述步骤二中对所得双向凝胶电泳图进行统计分析，利用单因素方差分析，对实验组和对照组蛋白质表达量的比值进行以2为底的对数转换，选择在∣log2expression ratio∣≧1、P<0.05条件下对实验组和对照组蛋白质表达谱进行统计学分析，即获得差异蛋白质；并进一步确定在干旱处理叶片中高表达的蛋白质，即初步筛选出与植物抗旱相关的候选基因。
本发明的进一步技术方案是：所述步骤三中的高光谱表型性状关联的候选基因抗旱功能验证为：对获得的候选基因进行简单的功能注释，结合候选基因在不干旱胁迫和干旱胁迫下表达量数据进行eQTL分析，以及与其他抗旱表型的候选基因关联分析结果，参考这些结果，挑选一些没有报道抗旱功能的候选基因，进行抗旱性分析；利用候选基因的突变体或转基因材料，进行抗旱表型性状的考查，确认候选基因的抗旱功能。
本发明的有益效果：本发明能快速有效的筛选出棉花的抗感相关联的候选基因且该技术可以广泛应用于植物抗旱等抗逆性状的研究和开发并且结合转基因技术来培育抗逆性强的植物新品种。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
一种筛选棉花抗旱相关基因的方法，该方法包括以下步骤：
步骤一、实验组：对待测棉花进行干旱胁迫处理；对照组：对所述待测棉花不进行干旱胁迫处理；
步骤二、分别取实验组和对照组植物植株叶片，利用双向凝胶电泳技术寻找差异蛋白，初步获取与植物抗旱相关的候选基因；
步骤三、高光谱表型性状关联的候选基因抗旱功能验证，结合候选基因在不干旱胁迫和干旱胁迫下表达量数据进行eQTL分析，利用候选基因的突变体或转基因材料，进行抗旱表型性状的考查，确认候选基因的抗旱功能。
所述步骤一中实验组与对照组的处理包括萌发期、苗期以及成株期的处理。
所述萌发期：从每份棉花种质中选取50粒大小均匀一致、饱满的种子，用水溶液浸种24h，然后摆放在发芽盒中，种子间距离为粒长的1.5倍，在发芽盒中加入水溶液，将发芽盒置于人工气候箱，设置昼/夜温度为28℃/25℃，湿度为85％，光照/黑暗为12h/12h，光照强度为340μmol/(m2·s)，连续培养10d，每2d补充适量蒸馏水，以保持渗透势不变，以蒸馏水进行相同处理为对照，重复3次。
所述苗期：在旱棚内进行盆栽试验，播种前各盆施高效复合肥，并浇水至田间持水量的80％，从每份棉花种质中选取50粒大小均匀一致、饱满的种子，按每盆50粒进行播种，播种后覆土2cm，采用随机区组设计，设置正常供水和反复干旱2个处理，3次重复，反复干旱处理为出苗后正常供水，待幼苗长至四叶期时停止供水，当土壤绝对含水量降至田间持水量的20％时，复水至田间持水量的80％，第一次复水后不再供水，当土壤绝对含水量降至田间持水量的20％时，复水至田间持水量的80％。
所述成株期：在旱棚内进行田间试验，设正常灌水和干旱胁迫2个处理，重复3次，各处理供试材料采用随机区组排列，小区行距50cm，窝距20cm，每窝留苗2株，种植5行，小区之间留一空行，区组间隔60cm，播种行与区组走向垂直，试验地四周播种3行保护行，播种前施高效复合肥作为种肥，干旱胁迫处理播种前灌一次水，以保证苗齐苗全，出苗至成熟期不再灌水，使其充分受旱，对照处理按当地大田生产管理，全生育期灌水6次，以满足正常生长发育的水分需求。
所述步骤二分别取实验组和对照组植物植株叶片，液氮研磨、离心、裂解处理，获取叶片中的蛋白质样品。
所述步骤二中双向凝胶电泳技术为：对所得蛋白质样品分别进行双向凝胶电泳处理，等电聚焦采用pH4-7的预制IPG胶条进行，待第二向电泳结束后取下凝胶，放入固定液中室温固定4h-8h，然后放入考马斯亮蓝染色液中进行饱和染色，利用清水清洗凝胶之后即进行凝胶图像扫描，得到实验组和对照组叶片的蛋白双向凝胶电泳图。
所述步骤二中对所得双向凝胶电泳图进行统计分析，利用单因素方差分析，对实验组和对照组蛋白质表达量的比值进行以2为底的对数转换，选择在∣log2expressionratio∣≧1、P<0.05条件下对实验组和对照组蛋白质表达谱进行统计学分析，即获得差异蛋白质；并进一步确定在干旱处理叶片中高表达的蛋白质，即初步筛选出与植物抗旱相关的候选基因。
所述步骤三中的高光谱表型性状关联的候选基因抗旱功能验证为：对获得的候选基因进行简单的功能注释，结合候选基因在不干旱胁迫和干旱胁迫下表达量数据进行eQTL分析，以及与其他抗旱表型的候选基因关联分析结果，参考这些结果，挑选一些没有报道抗旱功能的候选基因，进行抗旱性分析；利用候选基因的突变体或转基因材料，进行抗旱表型性状的考查，确认候选基因的抗旱功能。
实施例一：
一种筛选棉花抗旱相关基因的方法，该方法包括以下步骤：
步骤一、实验组：对待测棉花进行干旱胁迫处理；对照组：对所述待测棉花不进行干旱胁迫处理；
步骤二、分别取实验组和对照组植物植株叶片，利用双向凝胶电泳技术寻找差异蛋白，初步获取与植物抗旱相关的候选基因；
步骤三、高光谱表型性状关联的候选基因抗旱功能验证，结合候选基因在不干旱胁迫和干旱胁迫下表达量数据进行eQTL分析，利用候选基因的突变体或转基因材料，进行抗旱表型性状的考查，确认候选基因的抗旱功能。
所述步骤一中实验组与对照组的处理包括萌发期、苗期以及成株期的处理。
所述萌发期：从每份棉花种质中选取50粒大小均匀一致、饱满的种子，用水溶液浸种24h，然后摆放在发芽盒中，种子间距离为粒长的1.5倍，在发芽盒中加入水溶液，将发芽盒置于人工气候箱，设置昼/夜温度为28℃/25℃，湿度为85％，光照/黑暗为12h/12h，光照强度为340μmol/(m2·s)，连续培养10d，每2d补充适量蒸馏水，以保持渗透势不变，以蒸馏水进行相同处理为对照，重复3次。
所述苗期：在旱棚内进行盆栽试验，播种前各盆施高效复合肥，并浇水至田间持水量的80％，从每份棉花种质中选取50粒大小均匀一致、饱满的种子，按每盆50粒进行播种，播种后覆土2cm，采用随机区组设计，设置正常供水和反复干旱2个处理，3次重复，反复干旱处理为出苗后正常供水，待幼苗长至四叶期时停止供水，当土壤绝对含水量降至田间持水量的20％时，复水至田间持水量的80％，第一次复水后不再供水，当土壤绝对含水量降至田间持水量的20％时，复水至田间持水量的80％。
所述成株期：在旱棚内进行田间试验，设正常灌水和干旱胁迫2个处理，重复3次，各处理供试材料采用随机区组排列，小区行距50cm，窝距20cm，每窝留苗2株，种植5行，小区之间留一空行，区组间隔60cm，播种行与区组走向垂直，试验地四周播种3行保护行，播种前施高效复合肥作为种肥，干旱胁迫处理播种前灌一次水，以保证苗齐苗全，出苗至成熟期不再灌水，使其充分受旱，对照处理按当地大田生产管理，全生育期灌水6次，以满足正常生长发育的水分需求。
所述步骤二分别取实验组和对照组植物植株叶片，液氮研磨、离心、裂解处理，获取叶片中的蛋白质样品。
所述步骤二中双向凝胶电泳技术为：对所得蛋白质样品分别进行双向凝胶电泳处理，等电聚焦采用pH5的预制IPG胶条进行，待第二向电泳结束后取下凝胶，放入固定液中室温固定4h，然后放入考马斯亮蓝染色液中进行饱和染色，利用清水清洗凝胶之后即进行凝胶图像扫描，得到实验组和对照组叶片的蛋白双向凝胶电泳图。
所述步骤二中对所得双向凝胶电泳图进行统计分析，利用单因素方差分析，对实验组和对照组蛋白质表达量的比值进行以2为底的对数转换，选择在∣log2expressionratio∣≧1、P<0.05条件下对实验组和对照组蛋白质表达谱进行统计学分析，即获得差异蛋白质；并进一步确定在干旱处理叶片中高表达的蛋白质，即初步筛选出与植物抗旱相关的候选基因。
所述步骤三中的高光谱表型性状关联的候选基因抗旱功能验证为：对获得的候选基因进行简单的功能注释，结合候选基因在不干旱胁迫和干旱胁迫下表达量数据进行eQTL分析，以及与其他抗旱表型的候选基因关联分析结果，参考这些结果，挑选一些没有报道抗旱功能的候选基因，进行抗旱性分析；利用候选基因的突变体或转基因材料，进行抗旱表型性状的考查，确认候选基因的抗旱功能。
实施例二：
一种筛选棉花抗旱相关基因的方法，该方法包括以下步骤：
步骤一、实验组：对待测棉花进行干旱胁迫处理；对照组：对所述待测棉花不进行干旱胁迫处理；
步骤二、分别取实验组和对照组植物植株叶片，利用双向凝胶电泳技术寻找差异蛋白，初步获取与植物抗旱相关的候选基因；
步骤三、高光谱表型性状关联的候选基因抗旱功能验证，结合候选基因在不干旱胁迫和干旱胁迫下表达量数据进行eQTL分析，利用候选基因的突变体或转基因材料，进行抗旱表型性状的考查，确认候选基因的抗旱功能。
所述步骤一中实验组与对照组的处理包括萌发期、苗期以及成株期的处理。
所述萌发期：从每份棉花种质中选取50粒大小均匀一致、饱满的种子，用水溶液浸种24h，然后摆放在发芽盒中，种子间距离为粒长的1.5倍，在发芽盒中加入水溶液，将发芽盒置于人工气候箱，设置昼/夜温度为28℃/25℃，湿度为85％，光照/黑暗为12h/12h，光照强度为340μmol/(m2·s)，连续培养10d，每2d补充适量蒸馏水，以保持渗透势不变，以蒸馏水进行相同处理为对照，重复3次。
所述苗期：在旱棚内进行盆栽试验，播种前各盆施高效复合肥，并浇水至田间持水量的80％，从每份棉花种质中选取50粒大小均匀一致、饱满的种子，按每盆50粒进行播种，播种后覆土2cm，采用随机区组设计，设置正常供水和反复干旱2个处理，3次重复，反复干旱处理为出苗后正常供水，待幼苗长至四叶期时停止供水，当土壤绝对含水量降至田间持水量的20％时，复水至田间持水量的80％，第一次复水后不再供水，当土壤绝对含水量降至田间持水量的20％时，复水至田间持水量的80％。
所述成株期：在旱棚内进行田间试验，设正常灌水和干旱胁迫2个处理，重复3次，各处理供试材料采用随机区组排列，小区行距50cm，窝距20cm，每窝留苗2株，种植5行，小区之间留一空行，区组间隔60cm，播种行与区组走向垂直，试验地四周播种3行保护行，播种前施高效复合肥作为种肥，干旱胁迫处理播种前灌一次水，以保证苗齐苗全，出苗至成熟期不再灌水，使其充分受旱，对照处理按当地大田生产管理，全生育期灌水6次，以满足正常生长发育的水分需求。
所述步骤二分别取实验组和对照组植物植株叶片，液氮研磨、离心、裂解处理，获取叶片中的蛋白质样品。
所述步骤二中双向凝胶电泳技术为：对所得蛋白质样品分别进行双向凝胶电泳处理，等电聚焦采用pH7的预制IPG胶条进行，待第二向电泳结束后取下凝胶，放入固定液中室温固定6h，然后放入考马斯亮蓝染色液中进行饱和染色，利用清水清洗凝胶之后即进行凝胶图像扫描，得到实验组和对照组叶片的蛋白双向凝胶电泳图。
所述步骤二中对所得双向凝胶电泳图进行统计分析，利用单因素方差分析，对实验组和对照组蛋白质表达量的比值进行以2为底的对数转换，选择在∣log2expressionratio∣≧1、P<0.05条件下对实验组和对照组蛋白质表达谱进行统计学分析，即获得差异蛋白质；并进一步确定在干旱处理叶片中高表达的蛋白质，即初步筛选出与植物抗旱相关的候选基因。
所述步骤三中的高光谱表型性状关联的候选基因抗旱功能验证为：对获得的候选基因进行简单的功能注释，结合候选基因在不干旱胁迫和干旱胁迫下表达量数据进行eQTL分析，以及与其他抗旱表型的候选基因关联分析结果，参考这些结果，挑选一些没有报道抗旱功能的候选基因，进行抗旱性分析；利用候选基因的突变体或转基因材料，进行抗旱表型性状的考查，确认候选基因的抗旱功能。
上述方法采用棉花来筛选抗旱基因，能够获得优良的抗旱基因，采用高光谱表型性状关联的候选基因抗旱功能验证能够较全面、准确的筛选出棉花的抗旱基因。筛选出的抗旱基因可以用于培育新的抗旱植株。创造出在植物育种具有优良抗旱能力的新品种。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种筛选棉花抗旱相关基因的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：
步骤一、实验组：对待测棉花进行干旱胁迫处理；对照组：对所述待测棉花不进行干旱胁迫处理；
步骤二、分别取实验组和对照组植物植株叶片，利用双向凝胶电泳技术寻找差异蛋白，初步获取与植物抗旱相关的候选基因；
步骤三、高光谱表型性状关联的候选基因抗旱功能验证，结合候选基因在不干旱胁迫和干旱胁迫下表达量数据进行eQTL分析，利用候选基因的突变体或转基因材料，进行抗旱表型性状的考查，确认候选基因的抗旱功能。
2.根据权利要求1所述的一种筛选棉花抗旱相关基因的方法，其特征在于：所述步骤一中实验组与对照组的处理包括萌发期、苗期以及成株期的处理。
3.根据权利要求2所述的一种筛选棉花抗旱相关基因的方法，其特征在于：所述萌发期：从每份棉花种质中选取50粒大小均匀一致、饱满的种子，用水溶液浸种24h，然后摆放在发芽盒中，种子间距离为粒长的1.5倍，在发芽盒中加入水溶液，将发芽盒置于人工气候箱，设置昼/夜温度为28℃/25℃，湿度为85％，光照/黑暗为12h/12h，光照强度为340μmol/(m2·s)，连续培养10d，每2d补充适量蒸馏水，以保持渗透势不变，以蒸馏水进行相同处理为对照，重复3次。
4.根据权利要求2所述的一种筛选棉花抗旱相关基因的方法，其特征在于：所述苗期：在旱棚内进行盆栽试验，播种前各盆施高效复合肥，并浇水至田间持水量的80％，从每份棉花种质中选取50粒大小均匀一致、饱满的种子，按每盆50粒进行播种，播种后覆土2cm，采用随机区组设计，设置正常供水和反复干旱2个处理，3次重复，反复干旱处理为出苗后正常供水，待幼苗长至四叶期时停止供水，当土壤绝对含水量降至田间持水量的20％时，复水至田间持水量的80％，第一次复水后不再供水，当土壤绝对含水量降至田间持水量的20％时，复水至田间持水量的80％。
5.根据权利要求2所述的一种筛选棉花抗旱相关基因的方法，其特征在于：所述成株期：在旱棚内进行田间试验，设正常灌水和干旱胁迫2个处理，重复3次，各处理供试材料采用随机区组排列，小区行距50cm，窝距20cm，每窝留苗2株，种植5行，小区之间留一空行，区组间隔60cm，播种行与区组走向垂直，试验地四周播种3行保护行，播种前施高效复合肥作为种肥，干旱胁迫处理播种前灌一次水，以保证苗齐苗全，出苗至成熟期不再灌水，使其充分受旱，对照处理按当地大田生产管理，全生育期灌水6次，以满足正常生长发育的水分需求。
6.根据权利要求1所述的一种筛选棉花抗旱相关基因的方法，其特征在于：所述步骤二分别取实验组和对照组植物植株叶片，液氮研磨、离心、裂解处理，获取叶片中的蛋白质样品。
7.根据权利要求6所述的一种筛选棉花抗旱相关基因的方法，其特征在于：所述步骤二中双向凝胶电泳技术为：对所得蛋白质样品分别进行双向凝胶电泳处理，等电聚焦采用pH4-7的预制IPG胶条进行，待第二向电泳结束后取下凝胶，放入固定液中室温固定4h-8h，然后放入考马斯亮蓝染色液中进行饱和染色，利用清水清洗凝胶之后即进行凝胶图像扫描，得到实验组和对照组叶片的蛋白双向凝胶电泳图。
8.根据权利要求7所述的一种筛选棉花抗旱相关基因的方法，其特征在于：所述步骤二中对所得双向凝胶电泳图进行统计分析，利用单因素方差分析，对实验组和对照组蛋白质表达量的比值进行以2为底的对数转换，选择在∣log2expression ratio∣≧1、P<0.05条件下对实验组和对照组蛋白质表达谱进行统计学分析，即获得差异蛋白质；并进一步确定在干旱处理叶片中高表达的蛋白质，即初步筛选出与植物抗旱相关的候选基因。
9.根据权利要求1所述的一种筛选棉花抗旱相关基因的方法，其特征在于：所述步骤三中的高光谱表型性状关联的候选基因抗旱功能验证为：对获得的候选基因进行简单的功能注释，结合候选基因在不干旱胁迫和干旱胁迫下表达量数据进行eQTL分析，以及与其他抗旱表型的候选基因关联分析结果，参考这些结果，挑选一些没有报道抗旱功能的候选基因，进行抗旱性分析；利用候选基因的突变体或转基因材料，进行抗旱表型性状的考查，确认候选基因的抗旱功能。
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