CN112640855A - 一种利用黄藿散药渣和牛粪养殖蚯蚓的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及蚯蚓养殖方法的技术领域，具体公开了一种利用黄藿散药渣和牛粪养殖蚯蚓的应用和养殖方法。本发明以黄藿散药渣、牛粪作为饲料养殖蚯蚓，具体步骤为：铺设好基料土、洒水湿润、投放蚯蚓、铺设黄藿散药渣、浇水、铺设发酵好的牛粪，进行蚯蚓养殖。本发明添加了黄藿散药渣对蚯蚓进行饲喂，提高了蚯蚓对牛粪的适应性，最终实现了对蚯蚓的增重，提高了蚯蚓的生长和繁殖性能。

Description

一种利用黄藿散药渣和牛粪养殖蚯蚓的方法
本申请权利要求3～8项要求在先专利申请的优先权，在先专利申请的申请号为：CN202010033633.8，申请日为：2020.01.13。
技术领域
本发明涉及蚯蚓养殖方法技术领域，尤其涉及一种利用黄藿散药渣和牛粪养殖蚯蚓的方法。
背景技术
近年来随着世界经济的迅猛发展，人民收入的增加，人民对生活水平的要求，也由追求温饱，转为追求更高生活质量。人民对肉蛋奶等畜禽产品的需求不断增加，使得养殖业得到迅猛发展。养殖业快速发展的同时，养殖过程中的粪污过剩问题，成了制约养殖业发展和环境友好的一个重大问题。我国作为世界第一的畜产品大国，更是严重受到粪污处理问题的制约。预计2030年，我国畜禽的粪污量将达到37.43亿吨，畜禽粪便量将远远超过土地所能容纳的最适负荷量。牛养殖过程中，排粪量大，每头牛每天排泄量大约20～45kg，我国每年牛粪的排放量超过17.3亿吨。这往往导致养殖场牛粪的大量堆积。大量堆积的牛粪，不能及时利用和处理，这不仅成为养殖者们敏感的问题，更成为环境所必要解决的问题。由于粪便的大量堆积，造成大量温室气体以及臭味气体的排放，给空气造成巨大影响。与此同时，由于牛粪中含有大量的氮、磷、钾等元素，加上堆积过程中粪便经过淋溶，使得土地的土壤以及土壤养分，以及水体受到污染。另外由于粪便中含有一定量的病原微生物、药物残留、重金属等，这又给人民生命健康带来了巨大的威胁。
近年来，随着抗生素在养殖及人类医疗行业中过度使用，导致人们越来越关注抗生素及合成药物的副作用。随着我国减抗限抗政策的出台，中药产品及原料的需求增加数倍，随之带来大量药渣堆积。据统计我国每年中药消费达到7000万吨，产生药渣大约3000万吨。目前，我国中药生产过程中产生的中药残渣多采取露天堆放、卫生填埋、焚烧等处理方式，这就造成了严重的环境污染。除此以外，中药渣还含有丰富的有机质、氮、磷等营养物质，随意的堆放和填埋，同样会对土壤及土壤养分造成巨大影响。并且，中药渣经过中药提取后仍然有药用活性成分的残留，其药用活性成分残留一般在30～50％左右。这就使得随意堆置大量中药渣，不仅影响环境，更造成药渣中营养及药用活性成分的极大浪费。
蚯蚓堆肥处理技术作为一项传统技术，目前在有机废弃物的处理中已有广泛的应用和研究。通过堆肥后，蚯蚓可以作为动物性蛋白饲料，蚯蚓粪可以生产有机肥，从而实现废弃物的资源化利用。但是在利用蚯蚓进行粪便发酵过程中还存在很多问题。例如，经前人研究发现蚯蚓体温不恒定，温度对蚯蚓的生长发育、后代繁殖、活动强度和新陈代谢有不可忽视的影响作用，间接的对蚯蚓处理有机物的能力产生影响；湿度是维持蚯蚓正常生理活动的基础，同时又调节蚯蚓体温，因此，物料湿度的高低，会影响蚯蚓的活性，严重时可造成蚯蚓的死亡，但蚯蚓在处理粪便时适宜的湿度目前并没有固定的范围。同样粪便的腐熟程度、粪料的组合以及辅料的成分对蚯蚓采食、增长、排粪、逃逸数量以及繁殖性能都具有显著的影响。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种利用黄藿散药渣和牛粪养殖蚯蚓的应用和养殖方法。
本发明提供了黄藿散药渣搭配牛粪在养殖蚯蚓中的应用。
优选的，所述黄藿散药渣搭配牛粪在促进蚯蚓生长和繁殖方面的应用。
本发明还提供了一种利用黄藿散药渣和牛粪养殖蚯蚓的方法，包括以下步骤：
S1，将黄藿散药渣经过干燥后，备用，所述黄藿散药渣为制备黄藿口服液后的残留药渣；
S2，取新鲜牛粪于24～26℃条件下有氧发酵20～24天，发酵完毕，备用；
S3，于蚯蚓养殖盆底层铺设基料土后洒水至基料土湿润，将蚯蚓置于所述基料土上，随后铺设S1中干燥的黄藿散药渣，浇水浸湿药渣后铺设S2中发酵好的牛粪，浇水湿润牛粪，进行蚯蚓养殖，养殖期间养殖盆内物料湿度控制在60％～70％，温度控制在24～26℃。
进一步的，S3中，铺设的所述基料土、黄藿散药渣与发酵好的牛粪的质量比为20～30:2.2～4.2:7。
进一步的，S1中，干燥方法为阳光暴晒或烘干。
更进一步的，选择阳光暴晒进行干燥时，暴晒天数为3～4天。
进一步的，S2中，发酵温度为25℃。
进一步的，蚯蚓养殖盆的尺寸为长52cm、宽35cm、高15～18cm。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1、降低了牛粪和中药渣因不能被合理处理，造成对环境的污染，实现变废为宝。
2、不同配比的黄藿散药渣均提高了蚯蚓的适应性和生长、繁殖性能，与牛粪按照3:7的质量比搭配时作用效果最好；
3、黄藿散药渣与牛粪按照3:7的质量比搭配饲喂蚯蚓，改变了蚯蚓能量代谢相关的信号通路和催产素信号通路的基因表达，其PIK3CA、PRKAG、ACACA、pckA、GYS、PPP2R2、pfkA基因表达量降低与CALM、PRKCA、EEF2、PKA基因表达量升高，增强了蚯蚓的生长和繁殖功能；
4、蚯蚓堆肥可提高物料全氮含量和pH值，降低有机碳含量，黄藿散药与牛粪搭配进行堆肥，还可提高堆肥产物中的全磷含量；
附图说明
图1为赤子爱胜蚓Unigene与Nr数据库对比分布图；
图2为赤子爱胜蚓Unigene功能的GO分类图；
图3为赤子爱胜蚓Unigene的KOG功能注释图；
图4为赤子爱胜蚓Unigene的功能KEGG分类图；
图5为物料pH值变化图；
图6为物料中有机碳含量变化图；
图7为物料中全氮含量变化图；
图8为物料中全磷含量变化图；
图9为物料中全钾含量变化图。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明各实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
材料准备
赤子爱胜蚓“太平3号”，购自河北省藁城蚯蚓养殖基地，青年蚯蚓的体重为100～300mg，成蚓的体重为300～400mg，买回后均在普通泥中暂养10天，缓解运输应激，待其适应后，随机选取蚯蚓进行实验；
蚯蚓养殖盆，规格：长52cm宽35cm高15cm，购于喀斯玛商城；
普通泥土，取自河北农业大学，作为基料土；
牛粪，取自河北农业大学标本园，取回后在长80cm宽60cm高34cm的塑料盆内，进行有氧发酵，塑料盆敞口，接上通气管，在室内25℃的环境下发酵20天，发酵完毕，备用；
黄藿散药渣，所述黄藿散药渣为制备黄藿口服液后的残留药渣，由河北锦坤动物药业有限公司提供；将黄藿散药渣经阳光暴晒3天，备用。
实施例1
实验设A、B、C和D组，每组3个重复，A、B、C组分别为将药渣与牛粪按照质量比1:9、2:8、3:7搭配，作为蚯蚓饲料饲喂，D组为空白对照组，仅使用发酵牛粪作为蚯蚓饲料。4组盆中粪和药渣的总重均为200g、基料土均为500g。养殖时先将基料土铺设于蚯蚓养殖盆中，然后洒水使其湿润，再将20条青年蚓称重后放置基料土上，随后按比例铺上干燥的黄藿散药渣，浇水浸湿药渣表面，再加上发酵的牛粪，浇水湿润牛粪，进行养殖。
在室内养殖19天。每天检查两次，控制温度为24℃，定期洒水以保证养殖湿度为60％。每天检查时，观察蚯蚓是否有逃逸或死亡，每隔5天将料和蚯蚓全部倒出后，记录蚯蚓的数量。最终统计19天蚯蚓逃逸或死亡数量，并观察盆内是否有蚓茧出现，记录19天蚯蚓产茧数量。蚯蚓记重时，将每盆内的全部蚯蚓取出后放置地上静置10～20分钟除去蚯蚓身上的泥，然后进行蚯蚓称重，计算蚯蚓试验前平均体重、试验末平均体重、平均日增重。结果见下表。
表1黄藿散药渣对蚯蚓适应性和繁殖状况的影响
组别 添加比例 逃逸或死亡数量 产茧量
A组 1:9 1.00±0.58<sup>ab</sup> 1.67±0.67<sup>BCb</sup>
B组 2:8 1.33±0.33<sup>ab</sup> 3.33±3.33<sup>ABa</sup>
C组 3:7 0.33±0.33<sup>b</sup> 4.67±0.33<sup>Aa</sup>
D组 全牛粪 3.33±1.20<sup>a</sup> 0.67±0.33<sup>Cb</sup>
注：同列内，不同小写字母上标表示差异显著(P<0.05)；不同大写字母上标表示差异极显著(P<0.01)；相同字母表示差异不显著(P>0.05)，下同。
由表1可知，黄藿散药渣降低了蚯蚓逃逸或死亡的数量，提高了产茧量，证明黄藿散药渣能够提高蚯蚓的适应性和繁殖性能，且在药渣和牛粪3:7搭配下作用效果最好。
表2黄藿散药渣对蚯蚓生长情况的影响
Figure BDA0002892282640000051
由表2可知，黄藿散药渣提高了蚯蚓的平均日增重，能够显著促进了蚯蚓的生长。
实施例2室外堆肥试验
黄藿散药渣与发酵牛粪按照质量比3:7配比，作为配比饲料饲喂蚯蚓，设为E组，F组为空白对照组，仅使用发酵牛粪作为蚯蚓饲料，每组3个重复。试验中，各盆中均用7500g基料土在盆内铺成长73cm宽64cm，厚度4～5cm的蚯蚓养殖床，每盆中配比饲料的总重均为3000g。试验时将蚯蚓养殖床铺设完成后，洒水三遍使其完全润湿，再将10条青年蚯蚓放置养殖床上，观察其状态，确定养殖床适宜，在蚯蚓无逃逸、状态良好的情况下，每盆内放入200g同一阶段的青年蚯蚓，并按比例铺上药渣，浇水浸湿药渣表面；再加上发酵牛粪，浇水浸湿表面；对照组则直接铺上3000g牛粪；在室外养殖32天，室外温度为24～25℃。每两天检查一次，定期洒水以保证养殖床湿度在65％。每隔8天将盆内料和蚯蚓全部倒出，使养殖床能够透气，同时进行相应测定和取样。取E组和F组蚯蚓以及基料与饲料混合的物料，取样时将盆中的物料和蚯蚓全部倒出，平铺并分成四个部分，每部分取25g物料，每盆共取100g，装袋标号，用于进行理化指标测定；每部分取5条蚯蚓，每盆取20条，将每盆取出的蚯蚓放置在塑料布上10～20分钟，除去蚯蚓身上的泥，称重并计算蚯蚓试验前平均体重、试验末平均体重、平均日增重，以及整个过程中的平均个体重量变化，并测量其长度变化。将第32天取出的E组和F组蚯蚓留出备用。记录最终1000g物料中蚯蚓的产茧量，及蚓茧孵化时间及蚓茧孵化率。结果见下表：
表3黄藿散药渣对蚯蚓室外堆肥体重、体长变化
Figure BDA0002892282640000061
由表3可以看出，黄藿散药渣室外堆肥过程中蚯蚓增重和体长增加，表明黄藿散药渣对蚯蚓体长和体重的增长有促进作用，且增重和增长的趋势均为先升高后降低。
表4黄藿散药渣蚯蚓室外堆肥繁殖状况
Figure BDA0002892282640000062
由表4可以看出，黄藿散药渣能显著提高蚯蚓的产茧量，但对蚓茧的孵化时间和孵化率没有明显影响。
实施例3转录组分析基因差异表达
将实施例2第32天取出的E组和F组的蚯蚓，用蒸馏水洗净，放在垫有蒸馏水润湿滤纸的培养皿中空肠48h，蒸馏水中4℃麻醉后，将蚯蚓放于泡沫盒上，迅速加入液氮，30秒后，取出蚯蚓冰上解剖，从环带后部切除蚯蚓含有各类器官的头部，并纵向剖开蚯蚓腹部，去掉肠内容物，无水乙醇冲洗，避免污染，获得的组织-80℃冷冻保存。
将取好的蚯蚓组织放在研钵内加1ml TRIZOL，充分研磨，将匀浆转移至2mL无酶离心管内，4℃12000rpm离心10min；取上清转移到1.5mL离心管内，剧烈震荡15s；加入200μL氯仿，颠倒混匀，室温放置5min；4℃12000r离心15min；取上清至1.5mL离心管内，加入等体积4℃预冷的异丙醇，轻轻混匀，室温放置10min；4℃12000rpm离心15min，弃去上层液体，加入1mL无RNase的80％乙醇，洗涤沉淀，4℃10000rpm离心5min；弃取上清，离心管倒扣卫生纸上，通风干燥5～10min，加入20μL DEPC水，待RNA完全沉淀其中；2μL提取的RNA，利用Agilent 2100bioanalyzer精确检测RNA完整性后，建立cDNA文库。
将所有cDNA样本在高通量测序(Illumin)平台上测序，测得的图像数据经CASAVA碱基识别转化为序列数据(reads)，称为Raw Reads，文件为fastq格式，其中主要包含测序片段的序列信息以及其对应的测序质量信息。随后对Raw Reads进行质量检测及过滤，得到最终用于分析的数据(Clean Reads)。Raw Reads质量检测，通过单个碱基位置测序错误率分布检查反映测序数据的质量，测序错误率用Error表示，测序碱基质量用Qphred表示，有Qphred＝-10log10(e)的关系。随后将Raw Reads过滤，Raw Reads中包含少量带有测序接头或测序质量较低的reads，去除带接头(adapter)的reads；去除含N(N表示无法确定碱基信息)的reads；去除低质量reads(Qphred≤20的碱基数占整个read长度的50％以上的reads)，最终得到Clean Reads。
1.转录本的拼接及功能注释
对于无参考基因组转录组测序，在获得Clean Reads后，需要对Clean Reads进行拼接以获取后续分析的参考序列。采用Trinity(Grabherr et al,2011)对cleanreads进行拼接。Trinity拼接得到的转录本序列，以Corset层次聚类去冗余后，得到最长Cluster序列(Unigene)，通过与NR、NT、KO、SwissProt、PFAM、GO、KOG，这七种数据库进行比对，进行功能注释。
对经过高通量测序获得的原始数据过滤、测序错误率检查、GC含量分布检查，获得后续分析使用的Clean reads。由表5可知，各个样品测序得到的Raw Reads，碱基错误率均低于1％，Q20值大于95％，Q30值大于90％，说明测序质量较高。经过原始数据过滤后，最终得到37.35G的Clean reads，满足后续分析要求。
表5样本质量测序汇总
Figure BDA0002892282640000081
对于无参考基因组转录组测序，在获得Clean Reads后，需要对Clean Reads进行拼接以获取后续分析的参考序列。采用Trinity(Grabherr et al,2011)对clean reads进行拼接。
由表6可知，Clean reads采用Trinity拼接后得到总核苷酸数36345488，平均长度629kp的转录本参考序列，以Corset层次聚类去冗余后得到总核苷酸数25354613，平均长度579kp的Unigene参考序列，得到的Unigene的N50值为601kp，符合转录本拼接情况，可以进行功能注释。基因注释比例详见表7。
表6拼接情况汇总
Figure BDA0002892282640000082
Figure BDA0002892282640000091
拼接去冗余后得到43755条Unigene，与七大数据库进行比对，得到至少被一个数据库注释的基因比例达到100％，而被全部数据库所注释的基因比例为3.48％，这可能由于赤子爱胜蚓为无参转录本生物，全部基因序列未被注释，所以此功能注释符合后续分析要求。
表7基因功能注释比例
Unigene数量 注释比例(％)
NR数据库 13720 31.35
NT数据库 4857 11.1
KO数据库 6906 15.78
SwissProt数据库 10706 24.46
PFAM数据库 12485 28.53
GO数据库 12485 28.53
KOG数据库 5746 13.13
全部数据库 1527 3.48
至少一个数据库 43755 100
Unigene总数 43755 100
将得到的43755条Unigene与Nr数据库进行比对注释，获得了赤子爱胜蚓基因序列，与近缘物种基因序列的相似性。如图1所示，其中16.5％的基因序列与环节动物门的海蠕虫(Capitella teleta)相符合，15.6％的基因序列与环节动物门的水蛭(Helobdellarobusta)相符合。另外，基因序列与海豆芽(Lingula anatina)、虾夷扇贝(Mizuhopectenyessoensis)、福寿螺(Pomacea canaliculata)相符合的比例分别为6.9％、3.0％和2.7％，以上动物分别属于腕足动物门和软体动物门。蚯蚓为环节动物门寡毛纲动物，与其他环节动物基因序列匹配度较高，说明转录本拼接较好，与腕足动物门和软体动物门的基因序列有一定匹配。
将43755条Unigene通过GO数据库比对，有12485条成功比对。将基因编码产物，按参与生物过程(Biological Process)、所具有的分子功能(Molecular Function)和所在细胞位置(Cellular Component)进行分类，得到41组功能注释，如图2所示。
根据GO数据库比对结果可知，其中基因编码的产物，主要参与的生物过程为细胞内形成和代谢过程，主要为细胞大分子代谢、氮化合物代谢、有机环化合物代谢、有机氮化合物代谢、杂环代谢、细胞芳香化合物代谢、细胞生物合成、初级代谢调节等过程。而所具有的分子功能主要为结合、催化反应活性，主要为核酸结合、阳离子结合、阴离子结合、转移酶活性、离子跨膜转运蛋白活性等分子功能。基因编码的产物发挥作用位置主要在细胞和含蛋白的复合体中，主要为细胞器内、膜结合的细胞器内、非膜的细胞器内、细胞器膜、膜蛋白复合物等位置发挥作用。
将Unigene与KOG数据库中来自不同物种的同源基因所组成的不同Ortholog簇进行比对，结果如图3所示。在成功注释的5746条Unigene中，14.42％的基因与翻译后修饰，蛋白质转换，分子伴侣功能相关，11.85％的基因与预测参与一般功能相关，11.81％的基因与信号转导机制相关。
Unigene的基因做KO注释后，根据它们的产物和化合物在细胞中的代谢途径以及这些基因产物的功能，进行了KEGG代谢通路分类，如图4所示。代谢通路分为细胞过程(A，Cellular Processes)，环境信息处理(B，Environmental Information Processing)，遗传信息处理(C，Genetic Information Processing)，代谢(D，Metabolism)，有机系统(E，Organismal Systems)五种类型。成功注释的6906条基因中参与细胞过程中的转运和分解代谢的基因为735条占总数的10.64％，主要为细胞粘着斑通路、胞吞作用、溶酶体作用、紧密连接作用、肌动蛋白细胞骨架的调节作用等通路；参与环境信息处理中的信号转导的基因为1148条占总数的16.62％，主要的参与信号转导通路为PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、Rap1信号通路、cAMP信号通路、cGMP-PKG信号通路等；参与遗传信息处理的折叠、分类和降解的基因为537条占总数的7.77％，主要涉及内质网蛋白质加工、核糖体、剪接体、RNA转运、泛素介导的蛋白降解等过程；参与代谢过程中碳水化合物代谢的基因为449条占总数的6.50％，主要为二氧化碳代谢、嘌呤代谢、氧化磷酸化、氨基酸生物合成过程；参与有机系统中内分泌系统的基因为628条占总数的9.09％，主要为催产素信号通路、胰岛素信号通路、肾上腺素信号通路、雌性激素信号通路、甲状腺激素信号通路等信号通路。并且Unigene基因中参与机体有机系统的基因最多，共为2808条。
通过基因注释发现，(1)蚯蚓与环节动物中的海蠕虫、水蛭的基因相似度高，且与一些软体动物的基因有一定相似性，这说明它们在物种进化上有一定的亲缘关系，基因的功能有一定相似性。目前海蠕虫、水蛭基因研究较为丰富，未来对蚯蚓基因功能的研究可以与亲缘关系近的物种作为参考进行研究。(2)蚯蚓有机系统中主要有催产素信号通路、胰岛素信号通路、肾上腺素信号通路、雌性激素信号通路、甲状腺激素信号通路等信号通路。
2.基因表达差异及功能分析
将Trinity拼接得到的转录本作为参考序列(Ref)，将每个样品的Clean Reads往Ref上做mapping，结果见表8。样品比对到基因的reads数目的比对率在72.53％～81.72％，高于比对率60％，满足后续进行基因表达水平的分析要求。
表8 Clean Reads与参考基因比对情况
Sample name Total reads Total mapped
H1 44060580 36004710(81.72％)
H2 44520184 33753796(75.82％)
H3 41835570 32330796(77.28％)
E1 39344010 30547284(77.64％)
E2 39357274 29681140(75.41％)
E3 39869448 28916672(72.53％)
根据log2FoldChange绝对值大于等于1，P-value小于0.05的筛选标准，对F组和E组比对到基因的readcount进行统计，得到F组与E组相比共有2326个基因发生显著差异表达，结果见表9，其中1108个基因发生显著上调的差异表达，1218个基因发生显著下调的差异表达。
表9差异基因结果统计
Compare All Up Down
HvsE 2326 1108 1218
空白对照组(F组)与黄藿散药渣组(E组)相比显著差异表达的基因在KEGG功能中富集最高的20个通路(见表10)中，与三大代谢直接相关的通路有9个，包括磷酸戊糖代谢途径、糖酵解/糖异生代谢、蛋白质的消化吸收代谢途径、脂肪细胞因子信号通路、磷脂酰肌醇信号通路等。且与生物能量代谢相关的关键通路，AMPK信号通路中的基因也发生显著富集(见表11)。空白对照组在AMPK信号通路中，表达升高的基因最终会抑制糖原合成、抑制脂肪酸的合成、抑制升糖基因表达、抑制细胞生长和蛋白合成、糖酵解、糖异生。试验表明，用黄藿散药渣饲喂蚯蚓时，与能量代谢过程有关的基因产生明显变化，导致蚯蚓能量摄入产生差异，最终影响蚯蚓生长发育过程。
表10差异基因的KEGG功能富集最高的20个通路
Figure BDA0002892282640000121
Figure BDA0002892282640000131
表11 AMPK信号通路相关的基因
Figure BDA0002892282640000132
Figure BDA0002892282640000141
根据log2FoldChange绝对值由大到小排列，选出空白对照组与黄藿散药渣组相比显著差异表达降低的前10个基因(见表12)，其中转录本编号为Cluster-2829.0、Cluster-30676.1的基因功能与蚯蚓的催产素信号通路有关。与催产素信号通路相关的10个基因中，除以上2个基因表达量降低，还有6个基因表达量降低(见表13)。表达降低的基因除调节催产素表达，还与机体蛋白质合成、糖的摄取有关。试验表明，蚯蚓催产素信号通路与蚯蚓繁殖和能量代谢相关，饲喂黄藿口服液药渣后，影响了催产素信号通路，导致蚯蚓繁殖和能量代谢发生改变，最终导致黄藿口服液药渣组蚯蚓生长繁殖更好。
表12前10个显著差异表达下调的基因
gene_id H_readcount E_readcount log2FoldChange pval
Cluster-9897.0 0 488.8409 -10.857 0.001092
Cluster-30676.1 0 329.6177 -10.288 0.002155
Cluster-2829.0 0 298.1261 -10.143 0.002493
Cluster-19956.1 0 213.9572 -9.6646 0.003953
Cluster-8796.0 0 213.9437 -9.6645 0.004261
Cluster-8623.0 0 198.9266 -9.5596 0.004638
Cluster-5269.0 0 182.8874 -9.438 0.001345
Cluster-10895.0 0 179.0217 -9.4075 0.004893
Cluster-18374.0 0 173.9936 -9.3662 0.000883
Cluster-21035.0 0 173.4043 -9.3615 0.004763
表13与催产素信号通路相关的差异基因
Figure BDA0002892282640000142
Figure BDA0002892282640000151
实施例4对物料理化性质的影响
1.对物料pH的影响
由图5可知。E组pH值变化呈先升高后降低、再升高的趋势，0～16天为先升高再降低的过程，此时pH值在7.0～7.5左右波动；在16～24天时，pH值为升高过程，最终在7.5～8.0之间，为偏碱性的pH范围。对照组F组，pH值为先升高再缓慢降低的趋势，0～8天为pH值升高过程，此时pH值由低于7.0升高至接近8.0，为偏碱性的范围；8～24天pH值缓慢降低，并稳定在7.5以上的范围。变化过程中，F组在8～16天的pH值一直比E组高，但最终E组pH值比F组高。试验表明，药渣搭配初期可以降低牛粪的pH值，蚯蚓堆肥过程会提高物料的pH值。
2.对物料有机碳的影响
由图6可知。E组有机碳含量在0～16天一直高于对照组F组，且此时E组有机碳含量变化不明显，在16～24天时，有机碳含量明显降低，由400.00g/kg左右降至350.00g/kg左右。而F组的有机碳含量在0～24天持续下降趋势，最终有机碳含量也降至350.00g/kg左右。试验表明，药渣的加入后提高了物料中的有机碳含量；物料经过蚯蚓堆肥处理，有机碳含量降低。
3.对物料全氮含量的影响
图7表明。E组与对照组F组，两组在0～24天的堆肥过程中，全氮含量变化均为逐渐升高的趋势，且堆肥过程中两组物料全氮含量差异不明显。两组物料的全氮含量均由低于15.00g/kg升高至接近20.00g/kg。试验表明，蚯蚓堆肥过程，可提高物料中全氮的含量，药渣的加入对提升堆肥过程中全氮含量没有明显作用。
4.对物料全磷含量的影响
图8表明。E组物料在0～24天堆肥过程中，全磷含量逐渐升高，由初始的接近5.00g/kg升高至接近12.00g/kg。与对照组F组相比，黄藿散药渣的加入对物料全磷含量提升作用明显。对照组的全磷含量在整个堆肥过程中没有明显变化，一直与初始含量相同。试验表明，30％黄藿散药渣搭配牛粪，可提升堆肥过程中物料全磷含量；直接利用牛粪进行蚯蚓堆肥，对提升堆肥过程中物料全磷含量没有明显作用。
5.对物料全钾含量的影响
由图9可知。E组和对照组F组，两组堆肥过程中全钾含量变化趋势相同，均为先升高后降低的趋势。堆肥过程中，E组在8天时出现全钾含量最高值，F组在16天时出现全钾含量最高值；且E组全钾含量最高值高于10.00g/kg，F组全钾含量最高值低于10.00g/kg。0～16天堆肥过程中，E组物料全钾始终含量高于F组。在24天时两组物料全钾含量降低，且无明显差异，与0天时无明显差别。试验表明，30％黄藿散药渣搭配下，物料全钾含量在8天时出现最高值，最终降至与初始值相似。
以上实施例表明，不同配比的黄藿散药渣均提高了蚯蚓的适应性和生长、繁殖性能，与牛粪按照3:7的质量比搭配时作用效果最好；用黄藿散药渣饲喂蚯蚓，改变了蚯蚓能量代谢相关的信号通路和催产素信号通路的基因表达，其PIK3CA、PRKAG、ACACA、pckA、GYS、PPP2R2、pfkA基因表达量降低与CALM、PRKCA、EEF2、PKA基因表达量升高，增强了蚯蚓的生长和繁殖功能；蚯蚓堆肥可提高物料全氮含量和pH值，降低有机碳含量，黄藿散药与牛粪搭配进行堆肥，还可提高堆肥产物中的全磷含量。
事实上在堆肥过程中，有机碳含量高的降低、全磷含量的增加以及钾含量的增长是蚯蚓与菌群共同作用的结果，因此，物料理化性质的改变与微生物群落和蚯蚓的活动有着密不可分的关系。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.黄藿散药渣搭配牛粪在养殖蚯蚓中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述黄藿散药渣搭配牛粪在促进蚯蚓生长和繁殖方面的应用。
3.一种利用黄藿散药渣和牛粪养殖蚯蚓的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，将黄藿散药渣经过干燥后，备用，所述黄藿散药渣为制备黄藿口服液后的残留药渣；
S2，取新鲜牛粪于24～26℃条件下有氧发酵20～24天，发酵完毕，备用；
S3，于蚯蚓养殖盆底层铺设基料土后洒水至基料土湿润，将蚯蚓置于所述基料土上，随后铺设S1中干燥的黄藿散药渣，浇水浸湿药渣后铺设S2中发酵好的牛粪，浇水湿润牛粪，进行蚯蚓养殖，养殖期间养殖盆内物料湿度控制在60％～70％，温度控制在24～26℃。
4.如权利要求3所述的黄藿散药渣和牛粪养殖蚯蚓的方法，其特征在于，S3中，铺设的所述基料土、黄藿散药渣与发酵好的牛粪的质量比为20～30:2.2～4.2:7。
5.如权利要求3所述的利用黄藿散药渣和牛粪养殖蚯蚓的方法，其特征在于，S1中，干燥方法为阳光暴晒或烘干。
6.如权利要求5所述的黄藿散药渣和牛粪养殖蚯蚓的方法，其特征在于，选择阳光暴晒进行干燥时，暴晒天数为3～4天。
7.如权利要求3所述的黄藿散药渣和牛粪养殖蚯蚓的方法，其特征在于，S2中，发酵温度为25℃。
8.如权利要求3所述的利用黄藿散药渣和牛粪养殖蚯蚓的方法，其特征在于，蚯蚓养殖盆的尺寸为长52cm、宽35cm、高15～18cm。
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