CN112640784A

CN112640784A - 一种变异率低的青蒿一次性成苗组织培养方法

Info

Publication number: CN112640784A
Application number: CN202110019528.3A
Authority: CN
Inventors: 唐利忠; 朱旺冲; 孙小成; 欧阳国春; 雷干农; 蒋小军; 谢宜芝; 莫志军
Original assignee: Yongzhou Institute Of Agricultural Sciences
Current assignee: Yongzhou Institute Of Agricultural Sciences
Priority date: 2021-01-07
Filing date: 2021-01-07
Publication date: 2021-04-13
Anticipated expiration: 2041-01-07
Also published as: CN112640784B

Abstract

本发明涉及植物组织培养技术领域，具体涉及一种变异率低的青蒿一次性成苗组织培养方法，取苗期嫩叶为外植体，采用一次性成苗途径及MS+1.0 mg/L 6‑BA+2.0 mg/L NAA激素配比，并添加200mg/L鼠尾草酸，可获得低变异率、高质量的再生苗。本发明培养方法的出愈率、出芽率和生根率分别达97.78%、56.67%、56.67%，大大降低了组织培养再生苗变异发生率，完整保留了青蒿优质种质资源的品种特性。

Description

一种变异率低的青蒿一次性成苗组织培养方法

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，具体涉及一种变异率低的青蒿一次性成苗组织培养方法。

背景技术

青蒿，学名黄花蒿（Artemisia Annua L.），属菊科蒿属一年生草本植物，青蒿素（Artemisinin）是从青蒿叶片、花蕾等地上部分提取的一种具有过氧桥结构的倍半萜内酯，青蒿素及其衍生物联合疗法是目前世界上治疗疟疾最佳手段。近年来，随着青蒿素功能拓展研究的深入，屠呦呦团队发现青蒿中其它暂未发现有抗疟活性的天然组分可以改变青蒿素在人体内作用机理，强化青蒿素抗疟性；同时，青蒿素及其衍生物在治疗系统性红斑狼疮、抗肿瘤和预防艾滋病等方面的研究也已取得阶段性进展。

自1982年青蒿素首次成功以异胡薄荷醇为原料实现化学合成以来，以香茅醛、柠檬烯、薄荷酮、环己烯酮、β-蒎烯等为原料的10余种全化学合成路线陆续被发现，但总得率仅为1%～14%，难以实现工业化生产。同时以青蒿酸为原料的化学半合成法受到越来越多研究者的关注，因省去了前期繁琐的青蒿酸合成步骤，青蒿素化学半合成得率可高达60%，规模化生产前景可观。此外，利用青蒿细胞培养、转基因青蒿或异种植物等手段强化青蒿素的生物合成也屡见报道。研究表明青蒿素前体二氢青蒿酸的生物合成由ALDH1（FJ809784.1）、ADH1 （JF910157.1）、CYP71AV1（DQ268763）等基因负责，利用多基因片段导入小立碗藓（Physcomitrella patens），可将二氢青蒿酸转化为青蒿素，且初期培养产量可达0.07mg/g/d。然而即便如此，从企业效益角度来看，化学合成、半化学合成和生物合成由于技术复杂、得率不高和效益低等问题，依然不具备工业化生产的可能性。

通过现代化的育种手段，利用单倍体育种、多倍体育种和转基因育种技术提高青蒿植株青蒿素含量、产量和抗性是目前较为可行的方法。青蒿高重复序列导致的遗传多态性为大田选育优势变异材料提供了可能，但其高度的自交不亲和性又严重阻碍了高纯合青蒿品系的获得。因此，利用优势青蒿单株的花粉、花药进行单倍体培养经加倍后获得纯合体，以及利用优势青蒿单株的花序、叶片、茎段等进行组织培养以保存该单株的优良性状，对育种工作的开展至关重要。

申请人在对组织培养再生苗大田栽培过程中发现，大部分品种再生苗均出现性状变异，且变异率与再生苗的获取途径有较大关系。因此，系统开展不同组织培养途径下青蒿再生苗变异情况研究，同时通过改进优化组织培养技术，降低再生苗的变异率对较好的保存育种材料及进一步的研究至关重要，然而，有关这方面的研究还未见报导。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种变异率低的青蒿一次性成苗组织培养方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种变异率低的青蒿一次性成苗组织培养方法，采用一次性成苗途径及MS+1.0mg/L 6-BA+2.0 mg/L NAA激素配比，并添加200mg/L鼠尾草酸。

进一步地，包括如下步骤：

S1、取苗期嫩叶为外植体，流水冲洗1 h后无菌滤纸吸干表面水分，置于无菌操作台内用70%酒精消毒10 s，无菌水清洗3遍，0.1%升汞消毒10 min，无菌水清洗5遍，再用无菌滤纸吸干表面水分别置于无菌培养皿中，备用；

S2、将青蒿嫩叶接种在2.0 mg/kg NAA+1.0 mg/kg 6-BA+添加200mg/L鼠尾草酸的MS培养基中，温度23.5～25.0 ℃，光照为2000-2050 Lux，光照时间12 h/d的条件下培养至形成完整的再生苗。

进一步地，所述MS培养基含蔗糖3%，琼脂0.75%，pH值为5.8～5.9。

本发明培养方法的出愈率、出芽率和生根率分别达97.78%、56.67%、56.67%，可获得低变异率、高质量的再生苗，大大降低了组织培养再生苗变异发生率，完整保留了青蒿优质种质资源的品种特性。

附图说明

图1为部分变异株照片；

a：种子苗正常株；b～d：组培苗变异株；e：变异株（上）与正常株（下）叶片；f：变异株（右）与正常株（左）茎秆。

图2为组织培养各阶段照片；

A：出愈；B：出愈和芽分化并存；C：丛芽快速生长；D～E：生根；F：水培炼苗。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例

材料

供试材料选自湖南星辰科技所提供的母本原种（GH10），2018年10月和2019年2月分两批播种在种子发芽箱（韶关市泰宏医疗器械有效公司）内，采用高压灭菌锅（上海迅博实业有限公司）消毒后的基质（N+P₂PO₅+K₂O＞15%）为苗床育苗，2018年11月取10月播种的幼苗上部幼嫩叶片（完全叶，有羽裂）进行组织培养（以下简称组培），所成再生苗与2019年2月播种的种子苗经炼苗后于2019年4月初移栽大田，每处理移栽100株，考察植株性状变异情况。2019年10月于再次播种（GH10），育苗同2018年，进行组培技术优化研究。

试验设计及考察项目

1.2.1 组织培养再生苗的获得

（1）青蒿外植体消毒：

取1.1中幼嫩叶片，流水冲洗1 h后无菌滤纸吸干表面水分，置于无菌操作台内用70%酒精消毒10 s，无菌水清洗3遍，0.1%升汞消毒10 min，无菌水清洗5遍，再用无菌滤纸吸干表面水分别置于无菌培养皿中备用。

（2）青蒿外植体一次性成苗途径（WA1）：

将青蒿嫩叶（完整叶，不切段/片）接种在2.0 mg/kg NAA+1.0 mg/kg 6-BA的MS培养基中， 30 d即可出愈，43 d形成颜色淡绿且致密度适中的愈伤组织块，48 d后开始逐渐分化，62 d部分生根，根量大，根长较长，至此形成完整的再生苗。

（3）外植体-愈伤组织-分化出芽-生根成苗（WA2）：

取接种后40 d愈伤组织块，无菌操作台内切成0.5 cm×0.5 cm小块转接于0.5mg/kg NAA+ 1.0 mg/kg 6-BA的MS培养基中，18 d开始分化出丛状浓绿幼芽，25 d部分嫩芽茎伸长形成无根幼苗；30 d将分化出的幼苗转接于1.0 mg/kg NAA+0.5 mg/kg 6-BA的MS培养基中，16 d开始生根，至25 d产生白色带根毛的不定根，至此形成完整的再生苗。

（4）种子播种后形成种子苗途径（WA0 ）：参照1.1。

上述的培养条件为：MS培养基含蔗糖3%，琼脂0.75%，pH值为5.8～5.9；温度23.5～25.0 ℃，光照为2000-2050 Lux，光照时间12 h/d。

1.2.2 不同组培途径再生苗性状变异情况考察

将1.1和1.2.1中获得WA1和WA2途径再生苗和WA0途径种子苗，于2018年4月5日移栽至肥力中等均匀的大田中，每种不同途径苗移栽3行，每行33～34株，株行距80 cm×60cm共100株，完全随机分布，移栽后120 d观察三者株型、叶型、茎秆形态，详细记录变异情况并计算变异株率。现蕾前约20 d（8月15日）取样，紫外分光光度法初测青蒿素含量，后全株取样晾晒2 d后脱叶称重，折算单株产量。

1.2.3 组织培养植物生长调节剂优化

以1.2.2研究结果为基础，以2019年播种GH10种子苗为材料，取羽裂嫩叶为外植体，对激素配比进行考察，试验设置如表1所示。每处理接种3×10瓶，每瓶3个外植体，3次重复。考察出愈时间、分化时间、出苗量和出苗质量。

1.2.4 外源添加剂选择

以1.2.3的研究结果为基础，针对愈伤组织褐化和丛芽玻璃化现象，拟对不同外源添加剂种类和浓度进行探索，试验设置见表2，组织培养过程参照1.2.3，记录愈伤组织褐化数、褐化率，丛芽玻璃化数、玻璃化率。

数据统计与分析

采用Excel2010进行数据统计；SPSS 22进行方差分析，S-N-K法进行方差齐性检验。

表1 MS培养基中不同植物生长调节剂配比设置

表2 MS培养基中不同抗褐化和玻璃化外源添加剂梯度设置

2结果与分析

2.1 不同组培途径再生苗性状变异情况

植物表型与基因型和环境密切相关，相同栽培环境下，作物表型主要受遗传因子控制。青蒿由于其基因多态性，采用种子繁殖往往出现大量的自然变异株，而这种变异特性，在为青蒿育种提供丰富材料的同时，也严重制约着青蒿优势种质资源的保存。此外，植物采用组织培养获得再生苗的过程中，由于扩繁系数大，细胞分裂和染色体复制频繁，发生变异的几率也大大增加，而这种变异，在青蒿组织培养过程中尤为明显。

如表3所示，种子苗途径（WA0）由于其品系纯度高，大田未发现明显变异株。一次性成苗途径（WA1）中，WA1-3、WA1-16、WA1-66三株单株出现明显变异，表现为株高变高，茎围变小，平均分枝夹角变小；叶色变深，叶片变大，叶型指数降低；茎秆扁化、颜色变深；青蒿素含量和单株产量降低。而经WA2途径变异率达7.00%，且变异方向多元化：相较对照WA0途径，青蒿单株WA2-7、WA2-13、WA2-43、WA2-59、WA2-97变异方向与WA1途径相似；单株WA2-42株高变矮，茎围变小，叶宽变大，叶型指数降低，茎秆颜色变紫，青蒿素含量增加，但单株产量降低；单株WA2-88株高变高，茎围和平均分枝夹角变小，叶宽变大，叶型指数降低，茎秆颜色变紫，青蒿素含量和单株产量均降低。可见不同再生苗获取途径对青蒿表型有较大影响，且变异方向和变异率也不尽相同。相较于常规组织培养（WA2），WA1途径可有效控制其变异的发生。部分变异株情况见图1。

表3 不同成苗途径青蒿农艺性状及变异性分析

注1：WAn-X表示青蒿单株在该成苗途径中的编号（其中n=0～2；X=1～100），如WA1-3表示WA1途径中第3株且存在明显性状变异。

注2：WAn-E*表示某一青蒿成苗途径中较种子苗无显著变异株的均值表现（n=0～3），如WA1-E*表示WA1途径中除明显变异株外其他各单株的均值。

2.2 一次性成苗培养基生长调节剂配比优化

植物生长调节剂的种类和用量直接决定着青蒿外植体能否成功实现一次性成苗，以及成苗速度、成苗数量和质量。本研究选取了一种常用的细胞分裂素6-BA及生长素NAA、IAA、2,4-D，并系统研究了不同含量分裂素和不同种类及含量生长素配比下（表1），组织培养的发生过程和一次性成苗效果。

如表4所示，采用2,4-D为生长素的培养基出愈最快，为10.67～15.67 d，但由于2,4-D强烈抑制芽分化，导致该激素配比无法分化出芽和生根。采用IAA为生长素的培养基出愈最慢，芽分化和生根也较慢，但6-BA和IAA含量的增加可稍加快成苗过程。采用生长素NAA的各种培养基出愈速度无显著差异，但提高分裂素6-BA的浓度水平，可有效加快芽分化和生根进程。进一步研究各激素配比下青蒿外植体一次性成苗效果发现（表5），T13～T16（2,4-D为生长素）四个处理出愈率均为100%，但无法出芽生根。T9～T12（IAA为生长素）处理中除T11外，其它处理出愈、分化出芽和生根效果均一般，而T11处理出愈率、出芽率和生根率分别为67.41%、37.78%和35.56%，出苗效果较好。T1-T8（NAA为生长素）处理中，T4（MS+1.0mg/L 6-BA+2.0 mg/L NAA）处理最佳，其出愈率、出芽率和生根率分别达97.78%、56.67%、56.67%（青蒿组织培养各阶段如图2所示）。然而，随着分裂素和生长素浓度的增大，玻璃化和褐化现象也愈发严重。

表4 不同植物生长调节剂配比下外植体接种后成苗速度

注：同列数据不同小写字母代表在0.05水平差异显著（P＜0.05），下同。

表5 MS培养基中不同植物生长调节剂配比下一次性成苗效果

2.3 不同添加剂抗褐化和玻璃化效果

鉴于青蒿组织培养一次性成苗途径时间跨度长，培养基多酚氧化酶活性高，毒素积累量大，本研究选取了活性炭、半胱氨酸、抗坏血酸和鼠尾草酸这四常用的外源添加剂进行抗褐化和抗玻璃化效果比较（表6）。结果表明，活性炭对青蒿组培一次性成苗抗褐化和玻璃化效果不佳；半胱氨酸和抗坏血酸能在一定程度上缓解褐化和玻璃化问题，且随着两者浓度的增加，效果越好；鼠尾草酸效果最好，200 mg/L浓度下鼠尾草酸就能基本克服一次性成苗过程中的褐化问题，同时减轻玻璃化现象。

表6 MS培养基中不同外源添加剂抗褐化和玻璃化效果比较

注：褐化率（%）=愈伤组织褐化数/出愈数×100；丛芽玻璃化率（%）=丛芽玻璃化数/丛芽数×100。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。

Claims

1.一种变异率低的青蒿一次性成苗组织培养方法，其特征在于：采用一次性成苗途径及MS+1.0 mg/L 6-BA+2.0 mg/L NAA激素配比，并添加200mg/L鼠尾草酸。

2.如权利要求1所述的一种变异率低的青蒿一次性成苗组织培养方法，其特征在于：包括如下步骤：

3.如权利要求2所述的如权利要求1所述的一种变异率低的青蒿一次性成苗组织培养方法，其特征在于：所述MS培养基含蔗糖3%，琼脂0.75%，pH值为5.8～5.9。