CN112640740B - 金丝桃苷在提高植物结实率和/或千粒重中的应用、金丝桃苷制剂及其使用方法 - Google Patents

金丝桃苷在提高植物结实率和/或千粒重中的应用、金丝桃苷制剂及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了金丝桃苷在提高植物结实率和/或千粒重中的应用、金丝桃苷制剂及其使用方法，属于植物栽培及基因工程领域，在本发明中，所述金丝桃苷通过复合体MYB30‑UF3GaT1的介导来提高植物结实率，通过对植株喷施金丝桃苷制剂能够简单、快速、高效的提高植物结实率。喷施本发明所述的金丝桃苷制剂能够显著提高林下经济植物的结实率和千粒重，以金葵花为例，结实率最高可达87.4％，千粒重最高可达80.3g。

Description

金丝桃苷在提高植物结实率和/或千粒重中的应用、金丝桃苷 制剂及其使用方法
技术领域
本发明属于植物栽培及基因工程领域，尤其涉及金丝桃苷在提高植物结 实率和/或千粒重中的应用、金丝桃苷制剂及其使用方法。
背景技术
在林下经济种植中，传统的通过促进风媒或者虫媒提高授粉率以 及减少其他营养器官发育来提高结实率的方法不仅效果不明显、操作 繁复，成本还比较高昂，所以新的操作简单、成本低、效果显著的促 进结实率方法的研究刻不容缓。
金丝桃苷，是林下经济植物中的黄酮类次生代谢产物，具有良好的抗氧 化能力，不仅可以促进植物自身的生长发育，还可以治疗一些人类疾病，如 血液循环和心脑血管症状，具有十分重要的药用价值，目前金丝桃苷在植物 开花结实方面的作用并不清楚。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供金丝桃苷在提高植物结实率和/或千粒 重中的应用、金丝桃苷制剂及其使用方法。在本发明中，所述金丝桃苷通过 复合体MYB30-UF3GaT1的介导来提高植物结实率，通过对植株喷施金丝桃 苷制剂能够简单、快速、高效的提高植物结实率。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了金丝桃苷在提高植物结实率和/或千粒重中的应用。
优选的，所述植物为林下经济植物。
优选的，所述林下经济植物包括金花葵、所述林下经济植物包括金花葵、 长毛黄葵、黄蜀葵和箭叶秋葵。
优选的，所述金丝桃苷的应用浓度为5～100mg/L。
本发明提供了一种提高植物结实率和/或千粒重的金丝桃苷制剂，包括金 丝桃苷和缓冲溶液。
优选的，所述缓冲溶液以水为溶剂，每升包括以下组分：0.19g KNO3、1.65gNH4NO3、0.17g KH2PO4、0.00178g FeSO4·7H2O、0.0373g Na2·EDTA、 0.004g甘氨酸、0.0002g VB盐酸硫酸铵、0.001g维生素B6、0.1g肌醇、 0.0062g H3BO3、0.00083g KI和10g蔗糖。
优选的，所述缓冲溶液的pH值为5.0～5.2。
优选的，所述金丝桃苷制剂中金丝桃苷的浓度为20～100mg/L。
本发明提供了所述金丝桃苷制剂的使用方法，用所述金丝桃苷制剂对植 物进行喷施。
优选的，所述喷施为全株喷施，所述喷施的总次数为3～6次，相邻两次 喷施间隔的时间为1～2天。
本发明的有益效果：本发明提供了提供金丝桃苷在提高植物结实率和/ 或千粒重中的应用、金丝桃苷制剂及其使用方法。在本发明中，所述金丝桃 苷通过复合体MYB30-UF3GaT1的介导来提高植物结实率，外源性施加金丝 桃苷促进了MYB30基因的上调表达，MYB30通过与UF3GaT1启动子结合 提高提转录水平，从而提高受UF3GaT1基因影响的金丝桃苷的合成；通过 对植株喷施金丝桃苷制剂能够简单、快速、高效的提高植物结实率。
喷施本发明所述的金丝桃苷制剂能够显著提高林下经济植物的结实率 和千粒重，以金葵花为例，结实率最高可达87.4％，千粒重最高可达80.3g。
附图说明
图1为本发明中空白对照、仅施加缓冲溶液、施加金丝桃苷制剂三个不 同处理对金花葵结实的影响；A为果实大小比较，B为种粒大小比较，C为 平均果实重量、长度、宽度、结实率、种粒数、千粒重和种子大小等的比较 结果；
图2为本发明中MYB30-UF3GaT1复合体的验证结果，表明MYB30可 以直接结合UF3GaT1启动子；
图3为本发明中MYB30或UF3GaT1基因的过表达和抑制表达对平均 结实率的影响；其中A为MYB30过表达和抑制表达，B为UF3GaT1过表 达和抑制表达；
图4为本发明中金丝桃苷介导的MYB30-UF3GaT1复合体影响结实的作 用机制。
具体实施方式
本发明提供了金丝桃苷在提高植物结实率和/或千粒重中的应用。在本发 明中，所述植物优选为林下经济植物；所述林下经济植物包括金花葵、长毛 黄葵(Abelmoschuscrinitus Wall.)、黄蜀葵(Abelmoschus manihot(Linn.) Medicus)、箭叶秋葵(Abelmoschus muliensis Feng)。在本发明具体实施过 程中，以金花葵为例。在本发明中，所述金丝桃苷的应用浓度优选为 5～100mg/L，更优选为20～80mg/L，最优选为50mg/L。
在本发明中，所述金丝桃苷通过复合体MYB30-UF3GaT1的介导来提高 植物结实率，具体作用机制如图4所示。外源性喷施金丝桃苷溶液，促进植 物体内MYB30转录因子的上调表达，MYB30通过直接结合UF3GaT1的启 动子来提高UF3GaT1的转录表达，UF3GaT1是金丝桃苷生物合成途径中的 关键酶，所以UF3GaT1的上调表达增加了植物体内金丝桃苷的含量，具体 见结果图2。本发明通过对于上述完整作用机制的了解，验证并支持了金丝 桃苷在促进生殖发育中的作用，从而达到促进林下经济植物结实的目的。实 施例中的结果数据也证明了本发明提供的金丝桃苷制剂以及使用方法，可实 现简单、快速、高效的促进林下经济植物结实的目的。
本发明提供了一种提高植物结实率和/或千粒重的金丝桃苷制剂，包括金 丝桃苷和缓冲溶液。在本发明中，所述制剂中金丝桃苷的浓度优选为 20～100mg/L，更优选为40～60mg/L，最优选为50mg/L。
在本发明中，所述缓冲溶液以水为溶剂，每升优选的包括以下组分：0.19g KNO3、1.65g NH4NO3、0.17g KH2PO4、0.00178g FeSO4·7H2O、0.0373g Na2·EDTA、0.004g甘氨酸、0.0002g VB盐酸硫酸铵、0.001g维生素B6、 0.1g肌醇、0.0062g H3BO3、0.00083g KI和10g蔗糖。本发明中，所述缓冲 溶液的pH值优选为5.0～5.2，更优选为5.1。本发明对所述缓冲溶液中的试 剂来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品即可，在本发明具体实施过 程中，所述试剂购自Sigma(西格玛奥德里奇贸易有限公司)。
本发明对所述金丝桃苷制剂的制备方法没有特殊限定，采用本领域常规 的液体制剂制备方法即可，将金丝桃苷溶解于所述缓冲溶液即可。
本发明还提供了所述金丝桃苷制剂的使用方法，用所述金丝桃苷制剂对 植物进行喷施。在本发明中，所述喷施选择喷施叶片、花朵或全株，优选为 喷施全株。本发明对所述喷施具体的喷施量没有特殊限定，喷施至植株湿润 即可。在本发明中，以金葵花为例，优选的每升金丝桃苷制剂喷施10株植 株，至全株叶片湿润。在本发明中，所述喷施的总次数优选为3～6次，更优 选为4～5次，每次喷施间隔的时间优选为1～2天，更优选为1天。在本发明 中，以金葵花为例，优选的当植株高度达到1m，冠幅达到50cm时，进行首 次喷施。本发明对所述喷施的方法没有特殊限定，采用本领域常规喷施方法 即可，优选的采用自动喷雾机进行喷施。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把 它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
林下经济植物植株的选择：选定实验对象金花葵，选择“金光”品种的质 量良好的金花葵种子(质量良好的标准为种子饱满，无破损，形状、颜色一 致)，在温室(白天在25℃，晚上20℃，上下温差2℃；空气湿度70％) 培育20天后移栽田间，移栽后生长3个月，选择株高95～105m，冠幅大小 50cm，长势健壮并一致的金花葵植株进行后续操作。
(2)配置本发明的金丝桃苷制剂：金丝桃苷制剂由金丝桃苷与缓冲液 混合而成的，其配比是在每1L的缓冲液中混合50mg金丝桃苷，现用现配。 缓冲液以水为溶剂，每升加入如下的成分：0.19g KNO3、1.65g NH4NO3、0.17g KH2PO4、0.00178g FeSO4·7H2O、0.0373gNa2·EDTA、0.004g甘氨酸、0.0002g VB盐酸硫酸铵、0.001g维生素B6、0.1g肌醇、0.0062gH3BO3、0.00083g KI、 10g蔗糖并调节缓冲液的pH值至5.1。
(3)按照如下的方法进行喷施操作：
喷施部位：使用金丝桃苷制剂对金花葵整株进行喷施；
喷施时间：开始喷施的时间是当植株高度达到1m，冠幅达到50cm时， 共喷施四次；
喷施周期：每隔1天喷施一次；
喷施用量：每升金丝桃苷溶液均匀喷施10株植株，至全株叶片湿润。
在上述方案的基础上，使用自动喷雾机将配置好的金丝桃苷制剂均匀的 喷施在整个林下经济植物植株表面。
3个月后收获种子进行结实率和千粒重的测定。结实率通过人工判断法 进行测定。通过人工主观方法判断空瘪粒，同时进行空秕粒和饱满籽粒的计 数，饱满籽粒与种子总数之比为结实率。重复三次实验，取三次结果的平均 值结果。千粒重测定通过随机数出三个1000粒种子，分别称重，求其平均 值。三次实验结实率为：85.9％、90.5％和85.8％，平均结实率为87.4％。三 次千粒重测定结果为：70.9g、89.2g和80.8g，平均千粒重为80.3g。
实施例2
将金丝桃苷制剂中金丝桃苷的浓度为5mg/L，其余步骤和参数与实施例 1保持一致。
实施例3
将金丝桃苷制剂中金丝桃苷的浓度为10mg/L，其余步骤和参数与实施 例1保持一致。
实施例4
将金丝桃苷制剂中金丝桃苷的浓度为20mg/L，其余步骤和参数与实施 例1保持一致。
实施例5
将金丝桃苷制剂中金丝桃苷的浓度为100mg/L，其余步骤和参数与实施 例1保持一致。
实施例1～5的结实率和千粒重对比结果见表1。
表1不同浓度金丝桃苷溶液对金丝桃苷促进金花葵结实率的影响
Figure BDA0002831468970000051
Figure BDA0002831468970000061
由表1可知，当喷施浓度为50mg/L，可达到最佳促进金花葵结实率的 目的。
实施例6
喷施间隔时间为2天，其余步骤和参数与实施例1保持一致。
对比例1
喷施间隔时间为3天，其余步骤和参数与实施例1保持一致。
对比例2
喷施间隔时间为4天，其余步骤和参数与实施例1保持一致。
实施例1、对比例1～2的结果对比见表2。
表2不同金丝桃苷溶液喷施周期对金丝桃苷促进金花葵结实率的影响
间隔 结实率(％) 千粒重(g)
间隔1天 87.4 80.3
间隔2天 75.1 66.4
间隔3天 73.2 64.2
间隔4天 69.3 62.4
由表2可知，当喷施周期为每隔1天一次，可达到最佳促进金花葵结实 率的目的。
实施例7
喷施部位为金花葵花朵，其余步骤和参数与实施例1保持一致。
实施例8
喷施部位为金花葵叶片，其余步骤和参数与实施例1保持一致。
实施例1、实施例7和实施例8的结果对比见表3。
表3不同金丝桃苷溶液喷施部位对金丝桃苷促进金花葵结实率的影响
喷施部位 结实率(％) 千粒重(g)
叶片 74.3 66.5
全株 87.4 80.3
花朵 70.1 67.2
由表3可知，当喷施部位为金花葵全株时，可达到最佳促进金花葵结实 率的目的。
实施例9
喷施植物为长毛黄葵、黄蜀葵、箭叶秋葵全株，其余步骤和参数与实施 例1保持一致。
表4金丝桃苷制剂对不同林下植物结实率的影响
结实率(％) 长毛黄葵 黄蜀葵 箭叶秋葵
对照 66.4 70.1 54.3
缓冲溶液 64.1 68.9 52.2
金丝桃苷制剂 70.5 75.8 65.1
由表4可知，金丝桃苷制剂对多种林下植物均有促进其结实的作用。
实施例10
为证明MYB30能够与UF3GaT1的启动子结合，通过酵母单杂交实验 进行验证。选取UF3GaT1基因起始密码子前1235bp的基因序列作为其启动 子区域，并将该区域分为4个部分(P：-1235–0；P1：-411–0；P2：-801 –-411；P3：-1235–-801)。将P、P1、P2、P3片段分别构建到pAbAi载体 上，并转化入YIHGOLD酵母细胞中。与此同时，将转录因子MYB30构建 至pGADT7载体上，并分别转化入上述酵母细胞中。转化后，将其涂布于异 亮氨酸缺陷培养基中，根据其在200μg/mlAbA中菌斑的有无，判断目的基 因与MYB30是否互作。结果发现P和P2显示出与MYB30的互作关系，具 体结果见图2。
实施例11
为了验证金花葵中AeMYB30和AeUF3GaT1在结实中的作用，测定了 AeMYB30和AeUF3GaT1过表达和抑制表达的稳定转基因金花葵植株中结 实率。为了在金花葵中过表达AeMYB30和AeUF3GaT1，将AeMYB30与AeUF3GaT1分别连接到GFP-pROKII载体中，以产生过表达载体： pROKII-AeMYB30-GFP-OE和pROKII-AeUF3GaT1-GFP-OE。此外，还分 别将一个253bp的AeMYB30片段和268bp的AeUF3GaT1片段克隆到 pROKII的NcoI/SwaI和Xbal/BamHI限制性酶切位点中，以生成RNA干 扰载体：pROKII-AeMYB30-RNAi和pROKII-AeUF3GaT1-RNAi。将重组质 粒转入K599农杆菌中以待后续使用。
选择饱满，无破损，形状、颜色一致的成熟种子，将其切开和农杆菌 在愈伤组织诱导培养基上一起培养10～15d。然后，将成熟的愈伤组织转移至 芽诱导培养基以诱导芽的形成。出芽后，将3～5cm的芽转移到根诱导培养基 中，使其生根。最后将生根的芽转移到温室中，3个月后获得种子。
表5AeMYB30对金花葵结实率的影响
平均结实率(％)
对照 59.4
空载体 51.3
MYB30抑制表达-1 20.3
MYB30抑制表达-2 37.6
MYB30过表达-1 83.3
MYB30过表达-2 87.1
表6AeUF3GaT1对金花葵结实率的影响
平均结实率(％)
对照 62.2
空载体 57.9
UF3GaT1抑制表达-1 29.7
UF3GaT1抑制表达-2 35.5
UF3GaT1过表达-1 83.2
UF3GaT1过表达-2 91.0
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的 普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和 润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.金丝桃苷制剂在提高植物结实率和/或千粒重中的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤，当植株高度达到1m，冠幅达到50cm时，用所述金丝桃苷制剂对植物进行喷施；所述植物为金花葵；
所述喷施为全株喷施，所述喷施的总次数为3～6次，相邻两次喷施间隔的时间为1天。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述金丝桃苷制剂中金丝桃苷的应用浓度为5～100mg/L。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述金丝桃苷制剂包括金丝桃苷和缓冲溶液；
所述缓冲溶液以水为溶剂，每升包括以下组分：0.19g KNO3、1.65gNH4NO3、0.17gKH2PO4、0.00178g FeSO4·7H2O、0.0373gNa2·EDTA、0.004g甘氨酸、0.0002g VB盐酸硫酸铵、0.001g维生素B6、0.1g肌醇、0.0062gH3BO3、0.00083g KI和10g蔗糖。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述缓冲溶液的pH值为5.0～5.2。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述金丝桃苷制剂中金丝桃苷的浓度为20～100mg/L。
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