CN112639087A - 新型尼古丁降解酶变体 - Google Patents
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Abstract
描述了相对于野生型NicA2酶表现出增加的尼古丁降解活性和/或降低的免疫原性的尼古丁降解酶变体、包括所述变体的组合物和使用所述变体的方法。
Description
相关申请
本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求于2018年8月2日提交的美国临时申请第62/713,814号的优先权,所述申请通过引用整体并入本文。
技术领域
本公开总体上涉及治疗尼古丁成瘾或尼古丁中毒的领域。描述了相对于野生型NicA2酶表现出增加的尼古丁降解活性和/或降低的免疫原性的尼古丁降解酶变体、包括所述变体的组合物和使用所述变体的方法。
背景技术
提供了以下讨论以帮助读者理解本公开,并且不承认以下讨论描述或构成其现有技术。
吸烟是个全球性的医疗保健问题。世界卫生组织估计,全世界目前有13亿吸烟者,并且每年有近五百万人的死与烟草有关。如果目前的吸烟模式继续下去,则到2020年每年因吸烟致死的人数将达到约1000万人。据美国疾病控制中心(CDC)称,在美国,烟草使用是唯一一个可预防的主要死因,每年造成大约438,000人死亡。另外,据估计,吸烟每年导致的与健康相关的经济成本为大约1570亿美元。CDC估计,美国4500万成年吸烟者中,70%的人想戒烟,但在12个月后,尝试戒烟的人中只有不到5%的人保持不吸烟。
难以戒烟的一个原因是对香烟和其它烟草产品中的尼古丁成瘾。尼古丁是一种小分子,吸入体内后迅速进入血液并且随后横跨血脑屏障到达脑。一旦进入脑,尼古丁就会与尼古丁受体结合,这导致如多巴胺等兴奋剂的释放,从而激活犒赏系统(reward system)并为吸烟者提供积极和愉悦的强化体验,由此导致成瘾。
除了与吸烟和其它烟草使用相关的有害健康影响之外,由摄入或吸入过多尼古丁导致的尼古丁中毒是另一种与尼古丁相关的健康问题。尼古丁的LD50对于大鼠来说为50mg/kg,并且对于小鼠来说为3mg/kg。低至30-60mg(0.5-1.0mg/kg)的剂量对成年人类来说可能是致命的,而儿童在摄入一支香烟后可能生病,并且摄入超过这一数量可能导致儿童患重病。另一方面,一些证据表明,对于成年人来说,致死剂量可能高达500mg或更高(1.0-7.1mg/kg)。在任何一种情况下,急性尼古丁中毒通常发生在意外咀嚼尼古丁口香糖或贴片或摄入电子烟的“电子液体”的儿童身上。在极少数情况下,还已经已知的是,儿童在摄入香烟后生病。仅在美国,每月报道的急性尼古丁中毒就达数百例。
通常,尼古丁中毒的初始治疗可以包含施用活性炭以试图减少胃肠道吸收,而另外的治疗可以解决由尼古丁中毒引起的症状。
已经提出使用野生型NicA2酶进行戒烟(参见,例如,Xue等人,《美国化学会志(J.Am.Chem.Soc.)》137:10136-39(2015))。然而,仍然需要用于治疗尼古丁成瘾的其它药剂、组合物和方法以及用于治疗尼古丁中毒的药剂、组合物和方法。
发明内容
本文描述了相对于野生型NicA2酶表现出增加的尼古丁降解活性和/或降低的免疫原性的尼古丁降解酶变体、包括所述变体的组合物和使用所述变体的方法。
在一些实施例中,一种尼古丁降解酶变体包括作为SEQ ID NO:1中所示的野生型NicA2酶的氨基酸序列的变体的氨基酸序列,其中所述变体序列具有SEQ ID NO:1的位置104、106、107、249、355和426中的一个或多个位置处的增加尼古丁降解活性的至少一个取代、添加或缺失。
在一些实施例中,相对于所述野生型NicA2酶,所述变体表现出增加的尼古丁降解活性。在一些实施例中,野生型NicA2序列的变体包括一个或多个取代F104R、F104K、F104I、F104L、F104S、F104T、G106S、G106A、A107T、A107G、A107H、A107P、E249W、E249D、F355H、F355K、F355E、A426Q、A426W、A426P或A426C。在一些实施例中,变体序列包括选自SEQ IDNO:5-12或15-28中的任一个的氨基酸序列。在优选实施例中,变体可以包括F104R取代、F104I取代、F104S取代、F104T取代、G106A取代、A107T取代、A107G取代、F355H取代或A426C取代中的一个或多个取代。在一些实施例中,变体的尼古丁降解活性为野生型NicA2酶的尼古丁降解活性的至少约200%、至少约300%、至少约400%、至少约500%、至少约600%、至少约700%、至少约800%、至少约900%或至少约1000%。在一些实施例中,变体序列包括选自SEQ ID NO:1的位置104、106、107、249、355和426的至少一个、至少两个或至少三个位置处的取代。在一些实施例中,变体可以具有肽的N端处的1-52个氨基酸的缺失。例如,衍生自SEQ ID NO:1的变体可以包括来自肽的N-端的5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、51个或52个氨基酸的缺失。在一些实施例中,另外地或可替代地,变体可以具有来自肽的C端的1个或多个氨基酸的缺失,如C端残基的缺失。在一些实施例中,变体可以进一步包括SEQ ID NO:1的位置91、217、250、340、366、381、427、462或463中的一个或多个位置处的保守取代、非保守取代、添加或缺失。在一些实施例中,变体可以进一步包括选自以下的一个或多个取代:F104L、G106S、A107H、A107P、A107R、A107K、A107T、F355C、F355V、W427Q、W427E、W427S、W427M、W427H、W427L、W427R、R91A、R91Q、R91F、R91G、R91T、R91L、R91S、R91N、T250G、T250L、T250R、T250V、T250P、K340P、K340I、K340V、K340D、K340E、Q366K、Q366E、Q366V、Q366L、Q366I、Q366Y、T381P、T381I、T381V、T381Q、T381N、T381L、T381M、N462L、N462Y、N462S、N462F、N462G、N462E、N462A、N462M、I463F、I463Y、I463A、I463V、I463L、L217Q、L217G、L217E、L217I、L217C和L217S。
在一些实施例中,相对于野生型NicA2酶,NicA2变体表现出降低的免疫原性。在一些实施例中,相对于野生型NicA2酶,免疫原性降低75%或更多。在一些实施例中,变体序列进一步包括选自SEQ ID NO:1的氨基酸10-32、68-94、189-225、248-285、296-327、336-391或435-459的区域内的免疫原性T细胞表位中的至少一个取代、添加或缺失。在一些实施例中,变体序列进一步包括选自SEQ ID NO:1的氨基酸16-24、73-81、258-266、302-310、373-381或447-455的免疫原性T细胞表位中的至少一个取代、添加或缺失。在一些实施例中,变体序列进一步包括选自以下的位置处的至少一个取代、添加或缺失:(a)SEQ ID NO:1的氨基酸残基74、77、78或80;(b)SEQ ID NO:1的氨基酸残基262、263、264或266;(c)SEQ ID NO:1的氨基酸残基303、304、306或310;(d)SEQ ID NO:1的氨基酸残基374、377、378、382或383;和/或(e)SEQ ID NO:1的氨基酸残基450、451、452或457。在一些实施例中,变体序列进一步包括至少一种选自表2中针对表位B所列的取代或取代组合的取代或取代组合。另外地或可替代地,在一些实施例中,变体序列进一步包括至少一种选自表2中针对表位1所列的取代或取代组合的取代或取代组合。另外地或可替代地,在一些实施例中,变体序列进一步包括至少一种选自表2中针对表位2所列的取代或取代组合的取代或取代组合。另外地或可替代地,在一些实施例中,变体序列进一步包括至少一种选自表3中针对表位2所列的取代或取代组合的取代或取代组合。另外地或可替代地,在一些实施例中,变体序列进一步包括至少一种选自表4中针对表位2所列的取代或取代组合的取代或取代组合。在一些实施例中,变体进一步包括至少一种选自以下的取代或取代组合:(a)I262T;(b)I262S;(c)I262A;(d)I262T和A264L;和/或(e)I262T和N263R。
另外地或可替代地,在一些实施例中,变体进一步包括SEQ ID NO:1的至少氨基酸1-38、或SEQ ID NO:1的氨基酸1-50、或SEQ ID NO:1的氨基酸1-51或SEQ ID NO:1的氨基酸1-52的缺失。在一些实施例中,变体可以进一步包括His-标签,如包括SEQ ID NO:32的氨基酸序列的His-标签。另外地或可替代地,在一些实施例中,变体包括一个或多个C端氨基酸的缺失,如对应于野生型序列的S482的残基的缺失。在所述实施例中的任何实施例中,变体可以是长效变体,如其中变体与白蛋白结合肽、白蛋白结合蛋白结构域、人血清白蛋白或惰性多肽(如重组PEG同源氨基酸聚合物(HAP)、脯氨酸-丙氨酸丝氨酸聚合物(PAS)或弹性蛋白样肽(ELP))缀合。在具体实施例中,长效变体与聚乙二醇缀合(即,变体是聚乙二醇化的)。
另外地或可替代地,在一些实施例中,变体可以进一步包括选自由以下组成的组的一种或多种突变(例如,1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种或10种):F163A、Y214A、Y218A、Y242A、M246A、E249A、F353V、F355V、W364V、F353A、F355A和W364A。在另一方面中,本公开提供了一种尼古丁降解酶变体,其包括作为SEQ ID NO:1中所示的野生型NicA2酶的氨基酸序列的变体的氨基酸序列,其中所述变体序列具有选自由以下组成的组的至少一个取代:F163A、Y214A、Y218A、Y242A、M246A、E249A、F353V、F355V、W364V、F353A、F355A和W364A,并且包括1-52个氨基酸的N端缺失。在一些实施例中,N端缺失可以是例如25个、38个或50个氨基酸。
在一些实施例中,提供了包括本文所描述的尼古丁降解酶变体和药学上可接受的载体的药物组合物。在一些实施例中,所述组合物被调配成用于注射或输注。在一些实施例中,所述组合物被调配成用于口服施用。
在一些实施例中,提供了治疗尼古丁成瘾或促进戒烟的方法,所述方法包括向有需要的哺乳动物受试者施用治疗有效量的如本文所描述的尼古丁降解酶变体或组合物。在一些实施例中,所述哺乳动物受试者是人类受试者。在一些实施例中,所述尼古丁成瘾与选自烟草产品和电子烟的尼古丁产品的摄入有关。
在一些实施例中,提供了治疗尼古丁中毒的方法,所述方法包括向有需要的哺乳动物受试者施用治疗有效量的如本文所述的尼古丁降解酶变体或组合物。在一些实施例中,所述哺乳动物受试者是人类受试者,或更具体地说是人类儿童。在一些实施例中,所述尼古丁中毒与选自烟草产品和电子烟的尼古丁产品的消耗有关。
还提供了如本文所述的用于治疗尼古丁成瘾或促进戒烟的尼古丁降解酶变体和组合物。
还提供了如本文所述的尼古丁降解酶变体和组合物的用途,其用于制造用于治疗尼古丁成瘾或促进戒烟的药物。
上述总体说明以及以下详细说明是示例性且说明性的,并且旨在提供对本发明的进一步解释。
附图说明
图1示出了野生型NicA2(SEQ ID NO:1)和NicA2Δ50(SEQ ID NO:2)的His-标记版本的SDS-PAGE分析。通道1:MW标志物(Blue Plus2;英杰公司(Invitrogen));通道2:野生型NicA2(SEQ ID NO:1);和通道3:NicA2Δ50(SEQ ID NO:2)。
图2示出了将野生型NicA2与如本文所描述的变体尼古丁降解酶进行比较的尼古丁降解活性测定的结果。所述测定使用最终浓度为80nM的经过纯化的蛋白质。
图3示出了NicA2晶体结构中的活性位点周围的残基(改编自Tararina等人,《生物化学(Biochem.)》55:6595-98(2016))。壳体一以深灰色示出且壳体二以浅灰色示出。表2中示出了构成第一和第二壳体的残基。
图4A-E示出了携带表位B(图4E)、表位1(图4A)、表位2(图4B)、表位3(图4C)和表位4(图4D)(如表2中所列)的突变的特异性NicA2变体的相对活性,预测所述变体与野生型NicA2相比降低免疫原性潜力。
图5示出了使用SDS-PAGE分析的NicA2的随机聚乙二醇化。这些结果表明,可以通过增加聚乙二醇化试剂的摩尔过量和PEG链长来增加聚乙二醇化。
图6显示,聚乙二醇化增强了施用聚乙二醇化NicA2的动物血清中的NicA2的药代动力学(PK)特性。
图7显示,使用夹心ELISA形式的未缀合的NicA2或聚乙二醇化的NicA2的各种制剂的检测,聚乙二醇化可以掩蔽NicA2上的潜在的免疫原性表位。
图8显示,聚乙二醇化可以降低转基因HLA-DR4小鼠免疫原性模型中的NicA2特异性抗体的滴度。NicA2的聚乙二醇化导致转基因DR4小鼠中的平均NicA2特异性抗体滴度显著降低(≥10倍)(分别来自组NicA2-PEG1、NicA2-PEG2和NicA2-PEG3的4只、2只和2只动物的滴度低于检测限(LOD)),这意味着临床环境中的免疫原性潜力较低。*=p<0.01,**=p<0.001并且***=p<0.0001。
图9显示,聚乙二醇化减弱了通过暴露于NicA2介导的人T细胞增殖应答和细胞因子TNFγ释放。NicA2的聚乙二醇化导致平均T细胞增殖刺激指数的显著降低(左图)以及IFNγ分泌水平的降低(右图)。增加≥3(虚线)被视为显著增加和阳性应答。*=p<0.01,**=p<0.001并且***=p<0.0001。
图10显示,聚乙二醇化的NicA2酶在血清中保留完全的尼古丁降解活性。聚乙二醇化似乎不会阻碍NicA2降解大鼠血清中的尼古丁的能力。*=p<0.01,**=p<0.001并且***=p<0.0001。
图11A-B显示,与野生型NicA2相比,所公开的具有位置104、106、107、355和426处的取代的NicA2变体在低尼古丁浓度下在血清中具有增加的活性。特别地,与wt NicA2(图11A)相比,变体NicA2 A107R、A107T、A107G、F104T、F104I、F104R、G106A、F355H和A426C在测定条件下具有增加的尼古丁降解活性,这与NicA2 F104S(图11B)一样。相比之下,在此测定中,变体E249W似乎没有改善的尼古丁降解活性(图11A)。
图12A-B示出了次级生物传感器测定分析。图12A示出了S-(-)-尼古丁的传感图。图12B示出了稳态下的传感器应答单位(RU)对S-(-)-尼古丁浓度的绘图。
图13A-C示出了在吸烟者中发现的尼古丁浓度下的次级酶筛选测定和经纯化的酶变体的活性。图13A示出了通过抗His-标签mAb从大肠杆菌(E.coli)裂解物中捕获了His-标签的wt NicA2酶(圆圈)或突变体NicA2A107R(正方形)。图13B示出了添加到含有40ng/mLS-(-)-尼古丁的大鼠血清中的经纯化的酶或突变体NicA2A107R。图13C示出了在血清中在40ng/mL尼古丁下,10种变体相比wt NicA2的活性增强。
图14示出了对包含A107R、A107R+F355H和A107R+F104I+A426C的多种酶变体的尼古丁降解活性进行的比较。图示出了大鼠血清中尼古丁浓度(μg/ml)随时间下降。
图15示出了对NicA2A107R与wt NicA2在降低体内血液和脑尼古丁水平方面的效力进行的比较。在0.03mg/kg尼古丁(静脉;每组N=8只大鼠)3分钟之后,wt NicA2或NicA2A107R处理(0.625mg/kg静脉给药)对(A)血液和(B)脑尼古丁水平的影响。每列上方指出了与对照物相比的剩余百分比。对照组给药有BSA。平均尼古丁水平±SD。wt NicA2与NicA2107R之间的差异是显著的:****p<0.0001,*p<0.05。虚线为LOQ:针对血液为2ng/mL,针对脑为2ng/g。
具体实施方式
本文描述了相对于野生型NicA2酶表现出增加的尼古丁降解活性和/或降低的免疫原性的尼古丁降解酶变体、包括所述变体的组合物和使用所述变体的方法,包含用于治疗有需要的受试者的尼古丁成瘾的方法和用于促进所述受试者的尼古丁戒断(例如,戒烟)的方法。
I.定义
除非另外明确指出,否则如本文所使用的,单数形式“一个/种(a/an)”和“所述(the)”可互换使用,并且旨在也包含复数形式并且落入每个含义内。此外,如本文所使用的,“和/或”指代并涵盖所列项目中的一个或多个的任何和所有可能的排列和组合。
如本文所使用的,术语“约”将被本领域普通技术人员理解,并且将根据其所使用的上下文而在一定程度上有所不同。如果存在本领域普通技术人员不清楚的术语使用,则考虑到所述术语使用的上下文,“约”意味着特定术语的多达±10%。
如本文所使用的,短语“治疗有效量”和“治疗水平”是指受试者中提供特定药理作用的尼古丁降解酶剂量或血浆浓度,向需要尼古丁降解酶治疗的受试者施用尼古丁降解酶以实现所述特定药理作用,即降解受试者中的尼古丁、和/或治疗尼古丁成瘾和/或促进戒烟和/或治疗尼古丁中毒。需要强调的是,尼古丁降解酶的治疗有效量或治疗水平在治疗给定受试者的尼古丁成瘾或促进戒烟方面并不总是有效,即使这种剂量被本领域技术人员认为是治疗有效量也是如此。仅为方便起见,下面提供了示例性量。
本领域技术人员可以根据治疗具体受试者所需的标准实践来调整这种量。治疗有效量可以根据施用途径和剂型、受试者的年龄和体重和/或受试者的病状而有所不同,所述状况包含尼古丁成瘾程度、受试者通常消耗/摄入的尼古丁的量、和/或治疗时受试者的血浆尼古丁水平和/或治疗时位于脑中的尼古丁的量。
如本文关于尼古丁成瘾或戒烟所使用的术语“治疗(treatment或treating)”指代以下中的一种或多种:减少、改善或消除尼古丁戒断的一种或多种症状或影响;减少受试者消耗的香烟数量或尼古丁的量;和/或降低受试者的血浆尼古丁水平和/或降低位于受试者的特异性组织(例如,脑/中枢神经系统、心脏和脉管系统等)中的尼古丁的量。
本文关于尼古丁中毒所使用的术语“治疗(treatment或treating)”指代减少、改善或消除尼古丁的一种或多种症状或影响和/或降低受试者的血浆尼古丁水平和/或降低位于受试者的特异性组织(例如,脑/中枢神经系统、心脏和脉管系统等)中的尼古丁的量。
术语“个体”、“受试者”和“患者”在本文中可互换使用,并且指代任何单独的哺乳动物受试者,例如,牛、犬、猫、马或人类。
根据FDA指南,如本文所使用的,“儿童”指代0到约19岁的人类受试者。儿童可以是在大约19岁之前就开始治疗过程的受试者,即使所述受试者超过19岁后继续接受治疗也是如此。
II.尼古丁、尼古丁成瘾和尼古丁毒性
尼古丁是由几种类型的植物(包含烟草和茄科的其它成员)制成的含氮化学品。当人类、哺乳动物和大多数其它类型的动物暴露于尼古丁时,尼古丁会增加其心率、心肌耗氧速率和心搏量。尼古丁的消耗还与警觉性提高、欣快感和放松的感觉有关。然而,尼古丁高度成瘾。
通过与脑中的尼古丁乙酰胆碱受体结合,尼古丁引发其精神活性作用并且增加各种脑结构中几种神经递质的水平。与骨骼肌中的尼古丁受体相比,尼古丁对脑中的尼古丁受体具有更高的亲和力,但是其在骨骼肌中的毒性剂量使其可能引起收缩和呼吸麻痹。尼古丁的选择性被认为是由于这些受体亚型的特定氨基酸差异所导致的。尼古丁的结构如下式I所示。
式I
经常消耗尼古丁并然后突然停止的人会经历戒断症状,所述戒断症状可能包含渴望、空虚感、焦虑、抑郁、情绪低落、烦躁和注意力不集中。美国心脏协会(American HeartAssociation)表示,尼古丁(来自吸用烟草)是最难戒除的物质之一—至少与海洛因一样难。
当个体消耗松散的烟草、香烟、尼古丁口香糖、贴片或电子烟的“电子液体”(例如,电子烟和其它汽化装置中使用的含尼古丁液体)或含有烟草或烟草提取物的其它产品、或含有尼古丁的其它产品、供应品或中间体时,可能发生尼古丁中毒。事实上,最近的一项研究表明,在2012年1月与2015年4月之间,由于暴露于电子烟而引起的尼古丁中毒的发生率增加了1492.9%(Kamboj等人《儿科学(PEDIATRICS)》137(6):e20160041(2016))。尽管通过吸入烟草烟雾(一手或二手)可能发生暴露,但当受试者(通常是儿童)例如通过咀嚼或摄入尼古丁口香糖、摄入香烟或其它烟草叶产品、摄入尼古丁贴片或摄入电子液体而摄入尼古丁时,更常见的结果是尼古丁中毒或尼古丁使用过量。另外,尼古丁可以被皮肤吸收,并且因此尼古丁中毒可能由毒性水平的尼古丁与皮肤直接接触而产生。
尼古丁中毒可能产生神经症状(惊厥、昏迷、抑郁、精神错乱、昏厥、头痛)、心血管症状(心跳加快、高血压)、呼吸道症状(呼吸困难、呼吸急促)、胃肠道症状(流涎增多、腹部绞痛、呕吐)和肌肉骨骼症状(肌肉抽搐、虚弱)以及死亡。
III.尼古丁降解酶变体
本文描述了尼古丁降解酶变体,所述尼古丁降解酶变体包括作为分别在SEQ IDNO:1中所示的野生型NicA2酶的氨基酸序列的变体的氨基酸序列,其中所述变体序列相对于SEQ ID NO:1具有至少一个取代、添加或缺失,相对于野生型NicA2酶,所述取代、添加或缺失增加所述变体的尼古丁降解活性和/或降低其免疫原性。
从恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)菌株S16中分离出NicA2(尼古丁氧化还原酶;PPS_4081;GenBank登录号:AEJ14620.1)。参见,例如,Tang等人,《公共科学图书馆:遗传学(PLOS GENETICS)》,9(10):e1003923(2013)。NicA2的活性是S16降解尼古丁的第一关键步骤,其催化尼古丁氧化成N-甲基麦斯明(N-methylmyosmine)。据报道,其是恶臭假单胞菌S16代谢级联中负责分解尼古丁的必不可少的酶。以下文献中报道了野生型NicA2酶的结构分析:Tararina等人,《生物化学》55:6595-98(2016)。
本公开提供了具有提高的活性和/或降低的免疫原性的野生型NicA2的变体。在一些实施例中,所公开的变体与野生型NicA2的氨基酸同一性可以为约80%、约85%、约90%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%。在一些实施例中,所公开的变体可以与野生型NicA2共享约80%、约85%、约90%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%的同源性。例如,在一些实施例中,所公开的变体可以包括NicA2之间保守的氨基酸残基。
下表1中列示了野生型NicA2和其示例性变体的氨基酸序列。所公开的变体是在C端处用随后被移除的接头和His-标签(GGGGSGSGHHHHHH,SEQ ID NO:32)产生的。His-标签用于帮助纯化变体,但还可以使用不需要His-标签的其它纯化手段或方法。
表1-NicA2和示例性变体的氨基酸序列
如上所述,相对于野生型NicA2酶,尼古丁降解酶变体可以表现出增加的尼古丁降解活性和/或降低的免疫原性。所述变体可以包括野生型NicA2的氨基酸序列的一个或多个突变,包含一个或多个缺失、添加或取代。取代突变可以是“保守的”或“非保守的”。“保守的”指代同一氨基酸家族内的取代,而“非保守的”指代跨氨基酸家族的取代。氨基酸家族和关于氨基酸家族的“保守”和“非保守”取代在本领域中是已知的。例如,天然存在的氨基酸可以分为以下四个家族,并且保守取代将在这些家族中发生,而非保守取代将跨不同家族发生。
1)具有碱性侧链的氨基酸:赖氨酸、精氨酸、组氨酸。
2)具有酸性侧链的氨基酸:天冬氨酸、谷氨酸
3)具有不带电荷极性侧链的氨基酸:天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。
4)具有非极性侧链的氨基酸:甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、半胱氨酸。
在一些实施例中,尼古丁降解酶变体包括野生型NicA2酶的与其尼古丁降解活性相关的活性位点中的一种或多种突变,如选自SEQ ID NO:1的氨基酸残基104、106、107、249、355或426中的任一个氨基酸残基的一个或多个位置处的突变,如位置104、106、107、249、355或426中和图3中的结构上示出的一个或多个保守取代、非保守取代、添加或缺失。图3中标识的壳体一残基构成了腔体表面。在一些实施例中,变体可以包括一个、两个或三个或更多个取代。
在一些实施例中,将至少一个增加酶的尼古丁降解活性或增加其催化活性的突变引入到变体中,从而使变体更快速和/或更高效地分解尼古丁。在一些实施例中,此类突变可以改善酶促性能的各种度量,包含但不限于增加kcat、降低KM、增加kcat/KM和/或增加Vmax。因此,在一些实施例中,变体可以包括野生型NicA2酶的活性位点中和/或芳香笼(aromaticcage)中的1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种或10种或更多种突变,并且相对于野生型NicA2酶,所述变体表现出如通过增加的kcat、降低的KM、增加的kcat/KM和/或增加的Vmax测量的增加的尼古丁降解活性。
在一些实施例中,尼古丁降解酶变体包括一种或多种突变,所述一种或多种突变包含以下中的突变:SEQ ID NO:1的位置104处的苯丙氨酸(F)、SEQ ID NO:1的位置106处的甘氨酸(G)、SEQ ID NO:1的位置107处的丙氨酸(A)、SEQ ID NO:1的位置249处的谷氨酸(E)、SEQ ID NO:1的位置355处的苯丙氨酸(F)和/或SEQ ID NO:1的位置426处的丙氨酸(A),如一个或多个保守取代、非保守取代、添加或缺失。因此,在一些实施例中,增加尼古丁降解活性的突变位于SEQ ID NO:1的位置104、106、107、249、355或426中的一个或多个位置处,如SEQ ID NO:1的位置104、106、107、249、355或426中的一个或多个位置处的保守取代、非保守取代、添加或缺失。在优选实施例中,变体可以包括F104R取代、F104I取代、F104S取代、F104T取代、G106A取代、A107T取代、A107G取代、F355H取代或A426C取代中的一个或多个取代。
在一些实施例中,位置104处的突变是取代F104R,其中SEQ ID NO:1的位置104处的苯丙氨酸(F)被精氨酸(R)取代。具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的变体是这种类型的变体的实例。在一些实施例中,位置104处的突变是取代F104K,其中SEQ ID NO:1的位置104处的苯丙氨酸(F)被赖氨酸(K)取代。具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的变体是这种类型的变体的实例。在一些实施例中,位置104处的突变是取代F104I,其中SEQ ID NO:1的位置104处的苯丙氨酸(F)被异亮氨酸(I)取代。具有SEQ ID NO:7和28的氨基酸序列的变体是这种类型的变体的实例。在一些实施例中,位置104处的突变是取代F104L,其中SEQ ID NO:1的位置104处的苯丙氨酸(F)被亮氨酸(L)取代。具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的变体是这种类型的变体的实例。在一些实施例中,位置104处的突变是取代F104S,其中SEQ ID NO:1的位置104处的苯丙氨酸(F)被丝氨酸(S)取代。具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的变体是这种类型的变体的实例。在一些实施例中,位置104处的突变是取代F104T,其中SEQ ID NO:1的位置104处的苯丙氨酸(F)被苏氨酸(T)取代。具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的变体是这种类型的变体的实例。
在一些实施例中,位置106处的突变是取代G106S,其中SEQ ID NO:1的位置106处的甘氨酸(G)被丝氨酸(S)取代。具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的变体是这种类型的变体的实例。在一些实施例中,位置106处的突变是取代G106A,其中SEQ ID NO:1的位置106处的甘氨酸(G)被丙氨酸(A)取代。具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的变体是这种类型的变体的实例。
在一些实施例中,位置107处的突变是取代A107R,其中SEQ ID NO:1的位置107处的丙氨酸(A)被精氨酸(R)取代。具有SEQ ID NO:13、14、28、34和35的氨基酸序列的变体是这种类型的变体的实例。在一些实施例中,位置107处的突变是取代A107T,其中SEQ ID NO:1的位置107处的丙氨酸(A)被苏氨酸(T)取代。具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的变体是这种类型的变体的实例。在一些实施例中,位置107处的突变是取代A107K,其中SEQ ID NO:1的位置107处的丙氨酸(A)被赖氨酸(K)取代。具有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的变体是这种类型的变体的实例。在一些实施例中,位置107处的突变是取代A107G,其中SEQ ID NO:1的位置107处的丙氨酸(A)被甘氨酸(G)取代。具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的变体是这种类型的变体的实例。在一些实施例中,位置107处的突变是取代A107H,其中SEQ ID NO:1的位置107处的丙氨酸(A)被组氨酸(H)取代。具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的变体是这种类型的变体的实例。在一些实施例中,位置107处的突变是取代A107P,其中SEQ ID NO:1的位置107处的丙氨酸(A)被脯氨酸(P)取代。具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的变体是这种类型的变体的实例。
在一些实施例中,位置249处的突变是取代E249W,其中SEQ ID NO:1的位置249处的谷氨酸(E)被色氨酸(W)取代。具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的变体是这种类型的变体的实例。在一些实施例中,位置249处的突变是取代E249D,其中SEQ ID NO:1的位置249处的谷氨酸(E)被天冬氨酸(D)取代。具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的变体是这种类型的变体的实例。
在一些实施例中,位置355处的突变是取代F355H,其中SEQ ID NO:1的位置355处的苯丙氨酸(F)被组氨酸(H)取代。具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的变体是这种类型的变体的实例。在一些实施例中,位置355处的突变是取代F355K,其中SEQ ID NO:1的位置355处的苯丙氨酸(F)被赖氨酸(K)取代。具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的变体是这种类型的变体的实例。在一些实施例中,位置355处的突变是取代F355E,其中SEQ ID NO:1的位置355处的苯丙氨酸(F)被谷氨酸(E)取代。具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的变体是这种类型的变体的实例。在一些实施例中,位置355处的突变是取代F355C,其中SEQ ID NO:1的位置355处的苯丙氨酸(F)被半胱氨酸(C)取代。具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的变体是这种类型的变体的实例。
在一些实施例中,位置426处的突变是取代A426Q,其中SEQ ID NO:1的位置426处的丙氨酸(A)被谷氨酰胺(Q)取代。具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的变体是这种类型的变体的实例。在一些实施例中,位置426处的突变是取代A426W,其中SEQ ID NO:1的位置426处的丙氨酸(A)被色氨酸(W)取代。具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的变体是这种类型的变体的实例。在一些实施例中,位置426处的突变是取代A426P,其中SEQ ID NO:1的位置426处的丙氨酸(A)被脯氨酸(P)取代。具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的变体是这种类型的变体的实例。在一些实施例中,位置426处的突变是取代A426C,其中SEQ ID NO:1的位置426处的丙氨酸(A)被半胱氨酸(C)取代。具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的变体是这种类型的变体的实例。
另外,可以将增加尼古丁降解活性的前述取代中的任何前述取代与一个或多个另外的取代组合以进一步增加尼古丁降解活性。据信,将所公开的取代与另外的增加活性的取代组合可以对给定变体的尼古丁降解活性具有协同作用(参见例如,实例1的表1或表3中的NicA2Δ50+F104I;A107R(SEQ ID NO:28);NicA2+A107R;F355H(SEQ ID NO:34);NicA2+A107R;F104I;A426C(SEQ ID NO:35))。例如,除了表1中所公开的取代之外,在一些实施例中,变体可以包括SEQ ID NO:1的位置91、217、250、340、366、381、427、462或463处的一个或两个或三个或更多个取代。在一些实施例中,另外的取代可以是选自以下的任何一个或两个或三个或更多个取代:F104L、G106S、A107H、A107P、A107R、A107K、A107T、F355C、F355V、W427Q、W427E、W427S、W427M、W427H、W427L、W427R、R91A、R91Q、R91F、R91G、R91T、R91L、R91S、R91N、T250G、T250L、T250R、T250V、T250P、K340P、K340I、K340V、K340D、K340E、Q366K、Q366E、Q366V、Q366L、Q366I、Q366Y、T381P、T381I、T381V、T381Q、T381N、T381L、T381M、N462L、N462Y、N462S、N462F、N462G、N462E、N462A、N462M、I463F、I463Y、I463A、I463V、I463L、L217Q、L217G、L217E、L217I、L217C和L217S。在一些实施例中,另外的取代可以包括A107R。
另外地或可替代地,在一些实施例中,所公开的NicA2变体可以包括上文所公开的取代和/或缺失突变中的至少一种与一种或多种另外的取代突变的组合。换句话说,在一些实施例中,所公开的NicA2变体可以包括本文所公开的取代和/或缺失突变中的一种或多种取代和/或缺失突变与1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种或10种或更多种另外的取代突变的组合。例如,上文所公开的尼古丁降解酶(例如,表1或图13和14中公开的变体)中的一种或多种尼古丁降解酶可以进一步包括基于其它尼古丁降解酶的一个或多个其它取代,包含但不限于具有以下的NicA2变体:突变F163A、Y214A、Y218A、Y242A、M246A、E249A、F353V、F355V和W364V(在美国2019/0153403中表示为M9);突变F353V、F355V和W364V(在美国2019/0153403中表示为M3V);突变F353A、F355A和W364A(在美国2019/0153403中表示为M3A);突变F353V、F355V、W364V、Y214A和Y218A(在美国2019/0153403中表示为M5);或者突变F353V、F355V、W364V、Y214A和Y218A、F163A、E249A(在美国2019/0153403中表示为M7)。因此,在一些实施例中,尼古丁降解酶变体可以包括例如A107R取代(例如,SEQ ID NO:13、14、28、34或35)加上F163A、Y214A、Y218A、Y242A、M246A、E249A、F353V、F355V和W364V取代中的一个或多个或全部取代。在一些实施例中,尼古丁降解酶变体可以包括例如本文所公开的F355取代之一(例如,SEQ ID NO:21-23、34或37)加上F163A、Y214A、Y218A、Y242A、M246A、E249A、F353V和W364V取代中的一个或多个或全部取代。在一些实施例中,尼古丁降解酶变体可以包括例如上文所公开的双取代或三取代(例如,SEQ ID NO:28、34或35;参见例如图14)加上F163A、Y214A、Y218A、Y242A、M246A、E249A、F353V和W364V取代中的一个或多个或全部取代。在一些实施例中,尼古丁降解酶变体可以包括例如上文所描述并在U.S.2019/0153403中所表示的M9、M3V、M3A、M5或M7突变,并且具有1到52个氨基酸残基的N端缺失,如50个残基缺失(即,Δ50主链)、25个残基缺失(即,Δ25主链)或38个残基缺失(即,Δ38主链)。
另外地或可替代地,上文所公开的尼古丁降解酶变体(例如,表1或图13和14中公开的变体)中的一种或多种尼古丁降解酶变体可以进一步包括SEQ ID NO:1的位置91、104、106、107、217、250、340、355、366、381、427、462和463的一个或多个或全部位置处的一种或多种取代突变。参见WO 2018/144879。
在一些实施例中,尼古丁降解酶变体可以进一步包括一种或多种降低变体的免疫原性的突变。例如,在一些实施例中,所公开的变体可以进一步包括免疫原性T细胞表位内的一个或多个添加、取代或缺失,如选自SEQ ID NO:1的位置10-32、68-94、189-225、248-285、296-327、336-391或435-459的区域内的免疫原性T细胞表位内的一种或多种突变,如选自SEQ ID NO:1的位置16-24、73-81、258-266、302-310、373-381或447-455的免疫原性T细胞表位内的一种或多种突变,如这些区域中的一个或多个区域中的一个或多个保守取代、非保守取代、添加或缺失。因此,在一些实施例中,变体可以进一步包括1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个免疫原性T细胞表位中的1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种或10种或更多种突变。在一些实施例中,当施用于哺乳动物受试者时,与野生型NicA2相比,此类变体表现出降低的免疫原性。在一些实施例中,当施用于哺乳动物受试者时,与T细胞表位中没有一种或多种突变的对应的变体酶相比,此类变体表现出降低的免疫原性。
在一些实施例中,尼古丁降解酶变体可以进一步包括选自SEQ ID NO:1的74、77、78、80、262-266、303、304、306、310、374、377、378、382、383、450-452或457(包含其所有排列和组合)中的一个或多个位置处的免疫原性T细胞表位中的突变。例如,变体可以进一步包括下文所示的突变中的任何一种或多种突变,包含表位B中的示例性突变中的一种或多种突变、表位1中的示例性突变中的一种或多种突变、表位2中的示例性突变中的一种或多种突变、表位3中的示例性突变中的一种或多种突变和/或表位4中的突变中的一种或多种突变。
表2-NicA2表位中的示例性突变(基于SEQ ID NO:1编号)
另外地或可替代地,在一些实施例中,尼古丁降解酶变体包括SEQ ID NO:1的1到52个氨基酸残基的N端缺失。例如,在一些实施例中,变体包括SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-16、1-25、1-38、1-50、1-51或1-52的N端缺失。因此,所公开的变体可以包括1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个或52个连续氨基酸的N端缺失。
在一些实施例中,另外地或可替代地,所公开的变体可以包括肽的C端处的缺失。例如,所公开的变体可以包括肽的C端处的一个或多个氨基酸的缺失。例如,在NicA2变体中,可以缺失对应于野生型序列的S482的氨基酸。
在一些实施例中,如本文所描述的尼古丁降解酶变体与野生型NicA2酶(SEQ IDNO:1)或与具有SEQ ID NO:1的多达52个N端氨基酸残基的缺失的其N端缺失变体具有至少约80%、约81%、约82%、约83%、约84%、约85%、约86%、约87%、约88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%的序列同一性。
在一些实施例中,如本文所描述的尼古丁降解酶变体是或包括SEQ ID NO:5。在一些实施例中,如本文所描述的尼古丁降解酶变体与SEQ ID NO:5的变体序列具有至少约80%、约81%、约82%、约83%、约84%、约85%、约86%、约87%、约88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%的序列同一性。
在一些实施例中,如本文所描述的尼古丁降解酶变体是或包括SEQ ID NO:6。在一些实施例中,如本文所描述的尼古丁降解酶变体与SEQ ID NO:6的变体序列具有至少约80%、约81%、约82%、约83%、约84%、约85%、约86%、约87%、约88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%的序列同一性。
在一些实施例中,如本文所描述的尼古丁降解酶变体是或包括SEQ ID NO:7。在一些实施例中,如本文所描述的尼古丁降解酶变体与SEQ ID NO:7的变体序列具有至少约80%、约81%、约82%、约83%、约84%、约85%、约86%、约87%、约88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%的序列同一性。
在一些实施例中,如本文所描述的尼古丁降解酶变体是或包括SEQ ID NO:8。在一些实施例中,如本文所描述的尼古丁降解酶变体与SEQ ID NO:8的变体序列具有至少约80%、约81%、约82%、约83%、约84%、约85%、约86%、约87%、约88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%的序列同一性。
在一些实施例中,如本文所描述的尼古丁降解酶变体是或包括SEQ ID NO:9。在一些实施例中,如本文所描述的尼古丁降解酶变体与SEQ ID NO:9的变体序列具有至少约80%、约81%、约82%、约83%、约84%、约85%、约86%、约87%、约88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%的序列同一性。
在一些实施例中,如本文所描述的尼古丁降解酶变体是或包括SEQ ID NO:10。在一些实施例中,如本文所描述的尼古丁降解酶变体与SEQ ID NO:10的变体序列具有至少约80%、约81%、约82%、约83%、约84%、约85%、约86%、约87%、约88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%的序列同一性。
在一些实施例中,如本文所描述的尼古丁降解酶变体是或包括SEQ ID NO:11。在一些实施例中,如本文所描述的尼古丁降解酶变体与SEQ ID NO:11的变体序列具有至少约80%、约81%、约82%、约83%、约84%、约85%、约86%、约87%、约88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%的序列同一性。
在一些实施例中,如本文所描述的尼古丁降解酶变体是或包括SEQ ID NO:12。在一些实施例中,如本文所描述的尼古丁降解酶变体与SEQ ID NO:12的变体序列具有至少约80%、约81%、约82%、约83%、约84%、约85%、约86%、约87%、约88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%的序列同一性。
在一些实施例中,如本文所描述的尼古丁降解酶变体是或包括SEQ ID NO:15。在一些实施例中,如本文所描述的尼古丁降解酶变体与SEQ ID NO:15的变体序列具有至少约80%、约81%、约82%、约83%、约84%、约85%、约86%、约87%、约88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%的序列同一性。
在一些实施例中,如本文所描述的尼古丁降解酶变体是或包括SEQ ID NO:16。在一些实施例中,如本文所描述的尼古丁降解酶变体与SEQ ID NO:16的变体序列具有至少约80%、约81%、约82%、约83%、约84%、约85%、约86%、约87%、约88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%的序列同一性。
在一些实施例中,如本文所描述的尼古丁降解酶变体是或包括SEQ ID NO:17。在一些实施例中,如本文所描述的尼古丁降解酶变体与SEQ ID NO:17的变体序列具有至少约80%、约81%、约82%、约83%、约84%、约85%、约86%、约87%、约88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%的序列同一性。
在一些实施例中,如本文所描述的尼古丁降解酶变体是或包括SEQ ID NO:18。在一些实施例中,如本文所描述的尼古丁降解酶变体与SEQ ID NO:18的变体序列具有至少约80%、约81%、约82%、约83%、约84%、约85%、约86%、约87%、约88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%的序列同一性。
在一些实施例中,如本文所描述的尼古丁降解酶变体是或包括SEQ ID NO:19。在一些实施例中,如本文所描述的尼古丁降解酶变体与SEQ ID NO:19的变体序列具有至少约80%、约81%、约82%、约83%、约84%、约85%、约86%、约87%、约88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%的序列同一性。
在一些实施例中,如本文所描述的尼古丁降解酶变体是或包括SEQ ID NO:20。在一些实施例中,如本文所描述的尼古丁降解酶变体与SEQ ID NO:20的变体序列具有至少约80%、约81%、约82%、约83%、约84%、约85%、约86%、约87%、约88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%的序列同一性。
在一些实施例中,如本文所描述的尼古丁降解酶变体是或包括SEQ ID NO:21。在一些实施例中,如本文所描述的尼古丁降解酶变体与SEQ ID NO:21的变体序列具有至少约80%、约81%、约82%、约83%、约84%、约85%、约86%、约87%、约88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%的序列同一性。
在一些实施例中,如本文所描述的尼古丁降解酶变体是或包括SEQ ID NO:22。在一些实施例中,如本文所描述的尼古丁降解酶变体与SEQ ID NO:22的变体序列具有至少约80%、约81%、约82%、约83%、约84%、约85%、约86%、约87%、约88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%的序列同一性。
在一些实施例中,如本文所描述的尼古丁降解酶变体是或包括SEQ ID NO:23。在一些实施例中,如本文所描述的尼古丁降解酶变体与SEQ ID NO:23的变体序列具有至少约80%、约81%、约82%、约83%、约84%、约85%、约86%、约87%、约88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%的序列同一性。
在一些实施例中,如本文所描述的尼古丁降解酶变体是或包括SEQ ID NO:24。在一些实施例中,如本文所描述的尼古丁降解酶变体与SEQ ID NO:24的变体序列具有至少约80%、约81%、约82%、约83%、约84%、约85%、约86%、约87%、约88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%的序列同一性。
在一些实施例中,如本文所描述的尼古丁降解酶变体是或包括SEQ ID NO:25。在一些实施例中,如本文所描述的尼古丁降解酶变体与SEQ ID NO:25的变体序列具有至少约80%、约81%、约82%、约83%、约84%、约85%、约86%、约87%、约88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%的序列同一性。
在一些实施例中,如本文所描述的尼古丁降解酶变体是或包括SEQ ID NO:26。在一些实施例中,如本文所描述的尼古丁降解酶变体与SEQ ID NO:26的变体序列具有至少约80%、约81%、约82%、约83%、约84%、约85%、约86%、约87%、约88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%的序列同一性。
在一些实施例中,如本文所描述的尼古丁降解酶变体是或包括SEQ ID NO:27。在一些实施例中,如本文所描述的尼古丁降解酶变体与SEQ ID NO:27的变体序列具有至少约80%、约81%、约82%、约83%、约84%、约85%、约86%、约87%、约88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%的序列同一性。
在一些实施例中,如本文所描述的尼古丁降解酶变体是或包括SEQ ID NO:28。在一些实施例中,如本文所描述的尼古丁降解酶变体与SEQ ID NO:28的变体序列具有至少约80%、约81%、约82%、约83%、约84%、约85%、约86%、约87%、约88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%的序列同一性。
在一些实施例中,如本文所描述的尼古丁降解酶变体是或包括SEQ ID NO:34。在一些实施例中,如本文所描述的尼古丁降解酶变体与SEQ ID NO:34的变体序列具有至少约80%、约81%、约82%、约83%、约84%、约85%、约86%、约87%、约88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%的序列同一性。
在一些实施例中,如本文所描述的尼古丁降解酶变体是或包括SEQ ID NO:35。在一些实施例中,如本文所描述的尼古丁降解酶变体与SEQ ID NO:35的变体序列具有至少约80%、约81%、约82%、约83%、约84%、约85%、约86%、约87%、约88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%的序列同一性。
在一些实施例中,如本文所描述的尼古丁降解酶变体是或包括SEQ ID NO:36。在一些实施例中,如本文所描述的尼古丁降解酶变体与SEQ ID NO:36的变体序列具有至少约80%、约81%、约82%、约83%、约84%、约85%、约86%、约87%、约88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%的序列同一性。
在一些实施例中,如本文所描述的尼古丁降解酶变体是或包括SEQ ID NO:37。在一些实施例中,如本文所描述的尼古丁降解酶变体与SEQ ID NO:37的变体序列具有至少约80%、约81%、约82%、约83%、约84%、约85%、约86%、约87%、约88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%的序列同一性。
在一些实施例中,相对于野生型NicA2酶,如本文所描述的变体表现出增加的尼古丁降解活性,使得所述变体的活性至少为野生型NicA2酶的活性的约110%、约120%、约130%、约140%、约150%、约160%、约170%、约180%、约190%、约200%、约210%、约220%、约230%、约240%、约250%、约260%、约270%、约280%、约290%、约300%、约310%、约320%、约330%、约340%、约350%、约360%、约370%、约380%、约390%、约400%、约410%、约420%、约430%、约440%、约450%、约460%、约470%、约480%、约490%、约500%、约550%、约600%、约650%、约700%、约750%、约800%、约850%、约900%、约950%、约1000%、约1100%、约1200%、约1300%、约1400%、约1500%、约1600%、约1700%、约1800%、约1900%、约2000%、约2250%、约2500%、约2750%、约3000%、约3250%、约3500%、约3750%、约4000%、约4250%、约4500%、约4750%或约5000%或更多,如通过如Red测定(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific))等测定所测定的。
在一些实施例中,相对于野生型NicA2酶,如本文所述的变体表现出增加的尼古丁降解活性,使得所述变体的活性至少为野生型NicA2酶的活性的约110%、约120%、约130%、约140%、约150%、约160%、约170%、约180%、约190%、约200%、约210%、约220%、约230%、约240%、约250%、约260%、约270%、约280%、约290%、约300%、约310%、约320%、约330%、约340%、约350%、约360%、约370%、约380%、约390%、约400%、约410%、约420%、约430%、约440%、约450%、约460%、约470%、约480%、约490%、约500%、约550%、约600%、约650%、约700%、约750%、约800%、约850%、约900%、约950%、约1000%、约1100%、约1200%、约1300%、约1400%、约1500%、约1600%、约1700%、约1800%、约1900%、约2000%、约2250%、约2500%、约2750%、约3000%、约3250%、约3500%、约3750%、约4000%、约4250%、约4500%、约4750%或约5000%或更多,如通过在37℃下在缓冲液或大鼠血清中与固定浓度的酶一起温育并在固定时间点通过与MeOH混合淬灭活性后使用气相色谱法(GC;Hieda等人,大鼠免疫作用减少尼古丁到脑的分布(Immunization of rats reduces nicotine distribution to brain),《精神药理学(Psychopharmacology)》,143,150-157,1999)测量残余尼古丁浓度的测定来测定的。
在一些实施例中,相对于野生型NicA2,本文所描述的变体在哺乳动物受试者中表现出降低的免疫原性,使得其免疫原性比野生型NicA2酶的免疫原性低至少约5%、约10%、约15%、约20%、约25%、约30%、约35%、约40%、约45%、约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、90%、约95%或约100%。除非另外说明,否则如本文所使用的与野生型NicA2酶相比“降低的免疫原性”指代通过计算机方法、体外测定、体内研究(例如,使用转基因动物)、使用人类T细胞进行的离体研究或用人类受试者进行的临床研究中的一种或多种所显示的降低的免疫原性。
IV.药物组合物
本文所公开的尼古丁降解酶变体可以被调配成适于通过预定的施用途径向目标受试者(即,人或其它哺乳动物)施用的药物组合物,如下文更详细讨论的。
药物组合物可以包含一种或多种如本文所描述的变体和药学上可接受的载体或稀释剂。
组合物可以被调配成用于静脉内、皮下、腹膜内、肌内、口服、鼻、肺、眼、阴道或直肠施用。在一些实施例中,组合物被调配成用于静脉内、皮下、腹膜内或肌内施用,如以溶液、悬浮液、乳液、脂质体调配物等形式。可以使用本领域已知的技术将药物组合物调配成即释组合物、缓释组合物、迟释组合物等。
用于各种剂型的药学上可接受的载体在本领域中是已知的。例如,用于固体制剂的赋形剂、润滑剂、粘合剂和崩解剂是已知的;用于液体制剂的溶剂、增溶剂、悬浮剂、等渗剂、缓冲剂和舒缓剂是已知的。在一些实施例中,药物组合物包含一种或多种另外的组分,如一种或多种防腐剂、抗氧化剂、着色剂、甜味剂/调味剂、吸附剂、润湿剂等。
在一些实施例中,组合物被调配成用于通过注射或输注施用。在一些实施例中,组合物被调配成用于口服施用。
在一些实施例中,尼古丁降解酶变体是已被修饰以延长其体内半衰期(施用后)的长效变体。用于延长肽的循环半衰期的各种技术在本领域中是已知的。例如,在一些实施例中,变体与聚乙二醇(PEG)或延长半衰期的类似聚合物缀合。将PEG与所公开的尼古丁降解酶变体缀合可以改善变体的药代动力学特性。在一些实施例中,聚乙二醇化具有一种或多种选自以下的效果:掩蔽变体的一个或多个免疫原性表位、降低变体特异性抗体滴度和减弱T细胞增殖和/或细胞因子应答。另外地或可替代地,在一些实施例中,将变体与PEG缀合不会降低尼古丁降解酶变体的酶活性,或不会显著降低酶活性,或不会消除酶活性。
可以选择和改变PEG链长度和架构(即线性对支化)以影响、赋予或促进不同的特性,如以下实例中所示。可以通过已知用于将PEG与蛋白质缀合的方法将PEG与变体缀合,所述方法包含下文实例中说明的方法。本文所描述的变体中的任何变体可以被聚乙二醇化,包含由SEQ ID NO:5-12和15-28中的任一个限定或包括其的变体。为了将PEG与所公开的酶变体缀合,PEG聚合物的大小或长度可以有所不同。例如,与所公开的酶变体缀合的线性PEG可以处于1-50kDa、5-40kDa或10-20kDa的范围内,如1kDa、2kDa、3kDa、4kDa、5kDa、6kDa、7kDa、8kDa、9kDa、10kDa、11kDa、12kDa、13kDa、14kDa、15kDa、16kDa、17kDa、18kDa、19kDa、20kDa、25kDa、30kDa、35kDa、40kDa、45kDa或50kDa。另外,PEG聚合物可以是支化的,其大小处于20-80kDa的范围内,如20kDa、40kDa、60kDa或80kDa。
在一些实施例中,变体与白蛋白结合肽、白蛋白结合蛋白结构域、人血清白蛋白或惰性多肽融合。已经被用于增加肽的循环半衰期的示例性惰性多肽包含但不限于(也被称为重组PEG或“rPEG”)、同源氨基酸聚合物(HAP;HAP化)、脯氨酸-丙氨酸丝氨酸聚合物(PAS;PAS化)或弹性蛋白样肽(ELP;ELP化)。除非另外说明,否则如本文所使用的,“与……融合”包含直接地或通过连接子进行的产生含有多个结构域的单个多肽的基因融合。
V.治疗尼古丁成瘾或促进戒烟的方法
如上所述,本文所描述的变体用于治疗有需要的哺乳动物受试者的尼古丁成瘾和/或促进其戒烟(或停止使用其它烟草产品)或预防其吸烟复发(或消耗其它烟草产品)的方法。(为方便起见,在下文的讨论中,将这些方法统称为治疗尼古丁成瘾或促进戒烟。)在一些实施例中,受试者是对尼古丁上瘾的人类受试者,或者是期望戒烟或对抽吸或消耗其它尼古丁产品保持节制或预防抽吸或消耗其它尼古丁产品复发的人类受试者。
所述方法总体上涉及向受试者施用治疗有效量的如本文所述的尼古丁降解酶变体(或包括所述尼古丁降解酶变体的药物组合物)。然而,在一些实施例中,所述方法包括在体内表达变体的构建体中施用编码尼古丁降解酶变体的核酸。例如,在此类实施例中,可以在如腺相关病毒(AAV)基因转移载体等合适的载体中提供核酸。适用于这类方法的其它实例性载体在本领域中是已知的。(参见,例如,Lukashev和Zamyatnin,《生物化学》,81(7):700-8(2016))。示例性载体可以包含一个或多个增强子(例如,巨细胞病毒(CMV)增强子)、启动子(例如,鸡β-肌动蛋白启动子)和/或增强表达盒特性的其它元件。制备合适载体的方法和在体内使用表达载体的一般方法在本领域中是已知的。参见例如,Hicks等人,《科学转化医学(Sci.Transl.Med.)》,4(140):140ra87(2012))。
在一些实施例中,需要用于尼古丁成瘾或促进戒烟的治疗的受试者是消耗如吸用烟草、嚼用烟草、电子烟和/或其它尼古丁递送装置等尼古丁产品的人类受试者。此类受试者可能或可能不在身体上对尼古丁成瘾和/或在心理上沉迷于消耗尼古丁产品。需要戒烟治疗的典型受试者每天抽吸或使用烟草或其它尼古丁产品,如每天抽吸至少1支或更多支香烟,如每天至少约5支、至少约10支、至少约15支、至少约20支或更多支香烟,包含少于10支、10-20支、20-30支、30-40支或40支或更多(或相当地使用其它烟草或尼古丁产品)。
在一些实施例中,治疗有效量的尼古丁降解酶变体是有效降低血浆尼古丁水平、降低位于脑中的尼古丁水平或两者的量。
尼古丁在横跨血脑屏障后发挥其许多显著作用。在一些实施例中,本文所描述的方法和用途减少或防止尼古丁横跨血脑屏障。因此,在一些实施例中,施用如本文所描述的尼古丁降解酶变体会降解在受试者的血流中循环的尼古丁,由此减少或防止尼古丁横跨血脑屏障。因此,在一些实施例中,本文所描述的方法减少或防止源自脑的生理和心理上的尼古丁影响。因为受试者将经历这些影响的减少或停止,所以他/她将失去消耗尼古丁产品的欲望。另外地或可替代地,所公开的尼古丁降解酶变体可以通过影响尼古丁刺激外周神经系统的能力而发挥作用。
所施用的尼古丁降解酶的具体量可以取决于以下中的一种或多种:受试者的年龄和/或体重、常规消耗的尼古丁的量(例如,抽吸、咀嚼或吸入)和/或治疗时受试者脑或血浆中的尼古丁水平。在一些实施例中,以约0.01mg/kg到约20mg/kg、约0.1mg/kg到约18mg/kg、约1mg/kg到约16mg/kg、约2mg/kg到约14mg/kg或约5mg/kg到约10mg/kg的剂量施用变体。在一些实施例中,以约0.01mg/kg、约0.02mg/kg、约0.03mg/kg、约0.04mg/kg、约0.05mg/kg、约0.06mg/kg、约0.07mg/kg、约0.08mg/kg、约0.09mg/kg、约0.1mg/kg、约0.2mg/kg、约0.3mg/kg、约0.4mg/kg、约0.5mg/kg、约0.6mg/kg、约0.7mg/kg、约0.8mg/kg、约0.9mg/kg、约1mg/kg、约1.5mg/kg、约2mg/kg、约2.5mg/kg、约3mg/kg、约3.5mg/kg、约4mg/kg、约4.5mg/kg、约5mg/kg、约5.5mg/kg、约6mg/kg、约6.5mg/kg、约7mg/kg、约7.5mg/kg、约8mg/kg、约8/5mg/kg、约9mg/kg、约9.5mg/kg、约10mg/kg、约10.5mg/kg、约12mg/kg、约12.5mg/kg、约13mg/kg、约13.5mg/kg、约14mg/kg、约14.5mg/kg、约15mg/kg、约15.5mg/kg、约16mg/kg、约16.5mg/kg、约17mg/kg、约17.5mg/kg、约18mg/kg、约18.5mg/kg、约19mg/kg、约19.5mg/kg或约20mg/kg的剂量施用变体。在一些实施例中,以约0.5mg、约1mg、约2.5mg、约5mg、约10mg、约15mg、约20mg、约25mg、约50mg、约75mg、约100mg、约150mg、约200mg、约250mg、约300mg、约350mg、约400mg、约450mg、约500mg、约550mg、约600mg、约650mg、约700mg、约750mg、约800mg、约850mg、约900mg、约950mg、约1000mg、约1050mg、约1100mg、约1150mg、约1200mg、约1250mg、约1300mg、约1350mg、约1400mg、约1450mg、约1500mg、约1550mg、约1600mg、约1650mg、约1700mg、约1750mg、约1800mg、约1850mg、约1900mg、约1950mg、约2000mg、约2050mg、约2100mg、约2150mg、约2200mg、约2250mg、约2300mg、约2350mg、约2400mg、约2450mg或约2500mg的剂量施用变体。当施用多于一种变体时,所施用的变体的总量可以依照前述指导。
在一些实施例中,所述方法包括施用单剂量的一种或多种尼古丁降解酶变体(或包括所述尼古丁降解酶变体的组合物)。在一些实施例中,所述方法包括施用重复剂量,持续预定时间段,直到尼古丁成瘾的症状或影响得到减少、改善或消除,或直到受试者停止抽吸或以其它方式消耗尼古丁。在一些实施例中,如果体征/症状/影响持续存在或者如果受试者继续渴望尼古丁或重新经历尼古丁渴望,则用另外剂量的一种或多种变体重复治疗。
在一些实施例中,所述方法包括每天三次或更多次、每天两次或每天一次施用一种或多种尼古丁降解酶变体(或包括所述尼古丁降解酶变体的组合物)。在一些实施例中,所述方法包括每隔一天、每周三次、每周两次、每周一次、每隔一周、每三周一次、每月一次或更低频率地施用一种或多种尼古丁降解酶变体(或包括所述尼古丁降解酶变体的组合物)。在这种实施例中,尼古丁降解酶变体可以是如上所述的长效尼古丁降解酶变体。
在一些实施例中,治疗可以持续1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天或21天或更多天;1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、13周、14周、15周、16周、17周或18周或更多周;或1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月或12个月或更多个月;或1年、2年或3年或更多年,或者直到受试者不再经历尼古丁渴望或其它尼古丁戒断症状或受试者已停止抽吸或使用其它烟草产品。
VI.治疗尼古丁中毒的方法
所公开的尼古丁降解酶变体可以用于治疗尼古丁中毒、尼古丁过量或尼古丁毒性。为方便起见,在本文中将这些方法统称为治疗尼古丁中毒。在一些方面,本文所描述的治疗尼古丁中毒的方法包括向有需要的哺乳动物受试者施用如本文所公开的尼古丁降解酶变体或包括所述尼古丁降解酶变体的药物组合物。在一些实施例中,所述方法包括向已经摄入或消耗有毒量的尼古丁的受试者施用尼古丁降解酶变体。在一些实施例中,所述方法可以包括施用尼古丁降解酶变体和用于治疗尼古丁中毒的另一种化合物(如活性炭或另一种药剂)两者。在这种实施例中,可以通过相同或不同的组合物依次或同时施用酶变体和第二种化合物(例如,活性炭)。因此,治疗可以包含施用活性炭和/或其它支持性治疗以解决尼古丁中毒的症状和/或影响。
在一些实施例中,治疗有效量的尼古丁降解酶变体有效地减少、改善或消除尼古丁中毒或过量的一种或多种症状或影响。所施用的具体量可以取决于以下中的一种或多种:受试者的年龄和/或体重、被认为已摄入的尼古丁的量、和/或治疗时受试者的血浆尼古丁水平、和/或治疗时受试者的脑尼古丁水平。在一些实施例中,正在进行尼古丁中毒治疗的受试者是成年人,而在一些实施例中,受试者是儿童(即,年龄小于19岁)。在一些实施例中,治疗有效量的尼古丁降解酶变体是有效降低血浆尼古丁水平和/或减少位于受试者的特异性组织(例如,脑/中枢神经系统、心脏和脉管系统等)中的尼古丁量的量。在具体实施例中,治疗有效量的尼古丁降解酶变体是有效降低血浆尼古丁水平、降低位于脑中的尼古丁水平或两者的量。
所施用的尼古丁降解酶的具体量可以取决于以下中的一种或多种:受试者的年龄和/或体重、急剧消耗的尼古丁的量和/或治疗时受试者脑或血浆中的尼古丁水平。在一些实施例中,以约0.01mg/kg到约20mg/kg、约0.1mg/kg到约18mg/kg、约1mg/kg到约16mg/kg、约2mg/kg到约14mg/kg或约5mg/kg到约10mg/kg的剂量施用变体。在一些实施例中,以约0.01mg/kg、约0.02mg/kg、约0.03mg/kg、约0.04mg/kg、约0.05mg/kg、约0.06mg/kg、约0.07mg/kg、约0.08mg/kg、约0.09mg/kg、约0.1mg/kg、约0.2mg/kg、约0.3mg/kg、约0.4mg/kg、约0.5mg/kg、约0.6mg/kg、约0.7mg/kg、约0.8mg/kg、约0.9mg/kg、约1mg/kg、约1.5mg/kg、约2mg/kg、约2.5mg/kg、约3mg/kg、约3.5mg/kg、约4mg/kg、约4.5mg/kg、约5mg/kg、约5.5mg/kg、约6mg/kg、约6.5mg/kg、约7mg/kg、约7.5mg/kg、约8mg/kg、约8/5mg/kg、约9mg/kg、约9.5mg/kg、约10mg/kg、约10.5mg/kg、约12mg/kg、约12.5mg/kg、约13mg/kg、约13.5mg/kg、约14mg/kg、约14.5mg/kg、约15mg/kg、约15.5mg/kg、约16mg/kg、约16.5mg/kg、约17mg/kg、约17.5mg/kg、约18mg/kg、约18.5mg/kg、约19mg/kg、约19.5mg/kg或约20mg/kg的剂量施用变体。在一些实施例中,以约0.5mg、约1mg、约2.5mg、约5mg、约10mg、约15mg、约20mg、约25mg、约50mg、约75mg、约100mg、约150mg、约200mg、约250mg、约300mg、约350mg、约400mg、约450mg、约500mg、约550mg、约600mg、约650mg、约700mg、约750mg、约800mg、约850mg、约900mg、约950mg、约1000mg、约1050mg、约1100mg、约1150mg、约1200mg、约1250mg、约1300mg、约1350mg、约1400mg、约1450mg、约1500mg、约1550mg、约1600mg、约1650mg、约1700mg、约1750mg、约1800mg、约1850mg、约1900mg、约1950mg、约2000mg、约2050mg、约2100mg、约2150mg、约2200mg、约2250mg、约2300mg、约2350mg、约2400mg、约2450mg或约2500mg的剂量施用变体。当施用多于一种变体时,所施用的变体的总量可以依照前述指导。
因为尼古丁中毒与呕吐有关,因此可以使用非口服施用途径。此外,静脉内施用可能比腹膜内施用更有效。因此,在治疗尼古丁中毒的方法的一些实施例中,静脉内施用一种或多种尼古丁降解酶变体(或包括所述尼古丁降解酶变体的组合物)。
在一些实施例中,所述方法包括施用单剂量的一种或多种尼古丁降解酶变体(或包括所述尼古丁降解酶变体的组合物)。在一些实施例中,所述方法包括施用重复剂量,持续预定时段,或直到尼古丁中毒或毒性的症状或影响得到减少、改善或消除,或直到受试者停止抽吸或以其它方式消耗尼古丁。在一些实施例中,如果体征/症状/影响持续存在,则用另外剂量的一种或多种变体重复治疗。
在一些实施例中,治疗可以在过量后持续一天或多天,如过量后1-3天、或1-5天、或1天、2天、3天、4天或5天。在一些实施例中,治疗可以持续,直到受试者不再经历任何尼古丁中毒或毒性症状或直到受试者的血浆和/或脑中的尼古丁水平降低到足够安全的水平。在一些实施例中,尼古丁降解酶变体可以是如上所描述的长效尼古丁降解酶变体。
本领域的技术人员将容易理解,本公开内容非常适于实现所述目标并获得所提到的目的和优点,以及其中固有的目的和优点。本领域的技术人员将想到其中的修改和其它用途。这些修改涵盖在本公开的精神内。给出以下实例以说明本发明。然而,应当理解的是,本发明并不限于这些实施例的具体条件或细节。
实例
实例1-尼古丁降解酶变体的开发和测试
3D分子图形可视化
使用Discovery Studio 4.5(达索系统BIOVIA公司(Dassault Systemes,BIOVIACorp.),圣地亚哥,加利福尼亚州)使NicA2蛋白质可视化以确定活性位点残基。基于对结构(PDB ID编号5TTJ)的检查、FAD的位置和推定关键活性位点残基的报告,限定了假定的活性位点腔。构成此腔体的暴露表面的所有残基,包含侧链和骨架原子两者,均被归为活性位点残基:ARG9、PHE104、GLY105、GLY106、ALA107、TRP108、LEU217、TYR214、TYR218、GLU249、THR250、LYS340、PHE355、TRP364、GLN366、THR381、TRP417、ALA426、TRP427、ALA461、ASN462、ILE463。
表达和纯化NicA2
Wt NicA2和其变体用来自转化到大肠杆菌BL21(DE3)的基于pET-22b(+)(诺瓦根公司(NOVAGEN))的表达质粒的C端His6-标签来表达。根据制造商的方案,使用CobaltTALONTM His-标签纯化树脂(克隆科技公司(CLONTECH))通过固定金属亲和色谱法(IMAC)进行纯化。
初级筛选测定
将针对具有C端His6-标签的野生型(wt)NicA2氨基酸序列(GenBank登录号:AEJ14620.1)的大肠杆菌表达的合成基因(GeneArt/英杰公司的定制DNA合成)密码子克隆到pET-22b(+)(诺瓦根公司)的NdeI-XhoI位点中,并将表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。表1(SEQ ID NO:1)中示出了从这一构建体表达的预测的野生型NicA2氨基酸序列。
通过从编码SEQ ID NO:1的构建体表达的并根据制造商方案使用Cobalt TALONTMHis-标签纯化树脂(克隆科技公司)通过固定化金属亲和色谱法(IMAC)进行纯化的蛋白质的SDS-PAGE来鉴定大小异质性(图1;49kDa标志物周围的主要带和次要带)。当通过His-标签纯化蛋白质时,异质性被推断为处于N端处。利用在线搜索工具PRED-TAT(compgen.org/tools/PRED-TAT;Pantelis等人,使用隐马尔可夫模型对Tat和Sec信号肽进行综合预测(Combined prediction of Tat and Sec signal peptides with Hidden MarkovModels),2010《生物信息学(BIOINFORMATICS)》),鉴定了在SEQ ID NO:1的位置37处的丙氨酸(A)残基之后具有相关切割位点的推定TAT前导序列。
在消除任何非必需细菌序列(包含在SEQ ID NO:1的位置16-24处的特定计算机预测的T细胞表位序列)、降低免疫原性风险以及消除推定N端切割位点和相关的产物异质性的努力中,制备了去除前50个N端残基的缺失构建体(NicA2Δ50;SEQ ID NO:2)。
据信,可以在不损害催化活性的情况下缺失此区域;因此,NicA2Δ50(SEQ ID NO:2)在大肠杆菌中表达并如上所述那样进行纯化。如图1所示,通过SDS-PAGE分析,经过纯化的NicA2Δ50(SEQ ID NO:2)表现出同质性。
使用Amplex Red测定对经过纯化的蛋白质进行酶活性分析(Reszka等人,《过氧化物酶底物对Amplex red/过氧化物酶测定的影响:蒽环类抗生素的抗氧化特性(Effects ofperoxidase substrates on the Amplex red/peroxidase assay:Antioxidantproperties of anthracyclines)》,《分析生物化学(ANALYTICAL BIOCHEMISTRY)》342:327-337(2005))。简而言之,NicA2对尼古丁的氧化导致产生H2O2,所述H2O2产生与HRP(辣根过氧化物酶)将无色Amplex Red试剂转化为其红色荧光产物-试卤灵(resorufin)相关。除了将S-尼古丁(西格玛公司(Sigma))添加到最终测定浓度10μM外,基本上按照测定试剂盒的供应商(赛默飞科技公司;目录号A22188)的推荐进行测定。在黑色半区平底96孔测定板(康宁(Corning),目录号3993)中在总体积100μL/孔下进行测定。在SpectraMax M2多模微孔板读板仪(分子装置公司(Molecular Devices))中使用以下设置检测荧光的发展:Ex为555nm;Em为590nm,在SoftMax Pro数据演进程序包(分子装置公司)中使用“Plate Blank”孔来减去每个时间点源自无酶对照的值。将活性表示为标绘为时间的函数的荧光增加与平行运行的野生型NicA2酶相比的相对斜率。
Amplex Red测定显示,相对于野生型NicA2,经过纯化的NicA2Δ50蛋白质显示出23%的活性降低(图2)。产生并测试两个较短的缺失构建体(NicA2Δ25(SEQ ID NO:3)和NicA2Δ38(SEQ ID NO:4)),但与野生型酶相比,所述构建体类似地显示出活性降低。总之,相对于野生型,所有三个缺失突变体均显示出降低的活性。
因此,决定设计并鉴定表现出的尼古丁降解活性将至少与野生型的尼古丁降解活性相当的NicA2和NicA2Δ50变体。根据申请PCT/US2018/016664中显示的方法制备和测试新型变体的文库,所述申请通过引用整体并入本文。如前所述的在Amplex Red筛选测定中筛选此文库导致鉴定出经改进的具有位置104、106、107、249、355和/或426处的突变的变体(表3;SEQ ID NO 5-28)。
Revolve生物技术公司(Revolve Biotechnologies,Inc.)提供了定制的综合饱和诱变(Comprehensive Saturation Mutagenesis,CSM)文库(Firnberg等人,《公共科学图书馆:综合(PLoS One)》,7:e52031(2012)),其探测SEQ ID NO:1的位置104、106、107、249、355和/或426处的所有单个氨基酸(aa)取代(每种变体一种突变)。这些位置是构成NicA2的活性位点的位置的子集。
将文库转化到BL21 Gold(DE3)(安捷伦科技公司(Agilent Technologies))中,并挑取单个集落,并将所述单个集落在96孔板中在含有羧苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基中生长过夜。将过夜LB培养物稀释到含有475μl自诱导Magic Media(英杰公司)+羧苄青霉素(100μg/ml)的新的96孔深孔板中,并将其在室温下剧烈振荡生长18小时。通过以4000rpm离心15分钟在平板中收获细菌,并将沉淀物在-80℃下冷冻。通过将沉淀物溶解于每1ml含有1KU r-溶菌酶(诺瓦根公司)的100μl室温Bug Buster HT试剂(诺瓦根公司)中并在室温下在振荡平台上温育20分钟来裂解所述沉淀物。通过用Bug Buster HT试剂以1:1(体积:体积)稀释并通过在4℃下以4400rpm离心20分钟去除不可溶细胞碎片来制备澄清的裂解液。将25μl澄清裂解液转移到新的96孔板中,并在PBS中的2%牛奶中1:1(体积:体积)稀释。将经过稀释的裂解液转移到测定板(黑色96孔半区高结合板(康宁),所述测定板在4℃下用PBS中的5μg/ml抗His标签抗体(R&D系统公司(R&D Systems))涂覆过夜;每孔50μl;然后,在室温下用4%牛奶(在PBS中)封闭2小时)并在室温下轻轻摇动3小时进行温育,以确保固定化的抗His mAb的饱和以及表达的His-标记酶摩尔过量。此步骤基本上导致使由生长、诱导条件、内在表达水平等的差异提供的任何浓度差异归一化,并确保在后续步骤中在每个孔中测定一致量的酶的活性。这也消除了对各孔中的酶进行定量以精确测量和比较变体的相对活性的需要。将板用PBST(PBS+0.1%Tween-20)洗涤6次并用Amplex Red试剂缓冲液(赛默飞科技公司)洗涤1次以去除未结合的物质。通过向每个孔中加入50μl包含10μM S-尼古丁的Amplex Red溶液(赛默飞科技公司)并监测荧光随时间的发展来进行酶测定。
从具有过夜LB培养物的主板从中分离测定活性与来自表达野生型NicA2的所包含集落的值相比有所增强的克隆,并且在Amplex Red测定(如上所述)中重新生长并重新筛选8个单独随机集落。制备质粒DNA并对其进行测序以鉴定导致活性增加的一种或多种突变。表3中示出了Amplex Red测定中鉴定的变体的活性列表(如上所描述重新测定的每种变体的8个单独集落的平均值)。表1公开了这些变体的序列。
表3-NicA2变体(经过纯化的蛋白质)的相对活性
如表3所示,所有这些示例性突变提供了全长酶中的活性增强。对应地,NicA2A107R变体(SEQ ID NO:13)的高活性在NicA2Δ50A107R变体(SEQ ID NO:14)中得到保留。因此,预期表3中列出的所有突变将在全长NicA2和如NicA2Δ50、NicA2Δ25、NicA2Δ38或任何类似的高达并包含NicA2的至少前50个N端残基的缺失等缺失变体或任何N端或C端缺失变体二者的背景下改善活性,条件是所述变体的酶活性为全长wt NicA2的酶活性的至少20%。
可以通过位点特异性诱变产生携带选自表3的多个残基中的突变的特异性变体,并且可以如上所述那样产生并筛选由选自表3的多个位置中的多个突变组成的文库。这些努力可以允许鉴定具有同一分子中的多个位置中的酶活性高于表3中列出的任何单独的单突变的酶活性的变体。
生成了组合文库,其中包含以下单一突变,这些突变表明在低尼古丁浓度下血清中的催化活性增强(参见表3):
·F104R,S,I,T
·G106A
·A107R,T,G(作为由NNK编码的密码子的子集)
·F355H
使用以下寡核苷酸(所有3个简并寡核苷酸编码G106G/A和A107NNK)通过重叠PCR将突变引入到pETNicA2Δ50表达构建体(产生具有前50个氨基酸的N端缺失的变体;参见表1,SEQ ID NO.2):
Combi-1:
5'-GCAGGTCAAGAAATTGAATTTGGTGSCNNKTGGGTTCATTGGTTACAGC-3'
(wt F104;SEQ ID NO:29)
Combi-2:
5'-GCAGGTCAAGAAATTGAACGTGGTGSCNNKTGGGTTCATTGGTTACAGC-3'(F104R;SEQ IDNO:30)
Combi-3:
5'-GCAGGTCAAGAAATTGAAABCGGTGSCNNKTGGGTTCATTGGTTACAGC-3'(F104TSI;SEQID NO:31)
通过以1:1:3的比率混合含有重叠PCR突变的经纯化的PCR片段,获得位置F104中的5个密码子的相等表示。将重叠PCR片段的产物克隆到两个不同的载体片段中,一个对NicA2Δ50wt序列进行编码,一个对NicA2Δ50F355H突变进行编码。通过组合来自这两个连接的BL21 Gold(DE3)中相等数量的转化子获得最终文库。如实例1所描述的,在Amplex Red初级测定中筛选文库,使用NicA2Δ50A107R作为筛选板上的参考。命中的测序揭示了NicA2Δ50F104I、A107R是含有两种突变的变体,其活性比其任一个单一突变更好,即,比NicA2Δ50A107R增加1.4倍(表3)。Δ50N端缺失去除NicA2酶的潜在免疫原性区域,而仅引起活性的适度下降(表3)。
通过示出可能缺失仅对活性有适度影响的第一表位的具有SEQ ID NO 2-4的变体,表3中提供的数据表明,可以通过表3中列出的突变来减轻或克服这一活性降低。
如上文所描述的针对表位B、表位2、表位3和表位4制备并评估基于表2中所示的四个其它表位中的突变的变体。如图4A-E所看到的,用分别来自表位B、表位2和表位3的野生型NicA2酶的活性的≥90%测定值鉴定了2种、4种和7种变体,从而表明这些变体(L74N和Y77R、R78Q、V304A和M306Q、V394A、V304T和M306I、M306I和L310R、L374Q和I377S、L374A和I377A;L374N和I382Q、I377A和I382T、I377T和I382T、I377T和L374N和A383Q;参见图4)具有与野生型类似的酶促活性,并且基于计算机预测被预测具有较低的免疫原性潜力。有趣的是,与wt NicA2相比,针对表位4提出的变体均未显示出超过40%的活性(参见图4D)。可以将本实例中鉴定的突变(每个表位一种突变)引入到NicA2骨架中,或与表3中描述的其它所鉴定的单突变变体中的任何变体组合,或与由突变的组合而产生的任何数量的突变组合,以产生酶活性等于或优于wt NicA2的酶活性的单个去免疫酶变体。
实例2-鉴定NicA2 MHCII表位
基于8种最常见的HLA-DR等位基因(Cantoret等人,《美国国家科学院院刊(PNAS)》108:1272-1277(2011);DRB1*0101、DRB1*1501、DRB1*1301、DRB1*1101、DRB1*0801、DRB1*0701、DRB1*0401和DRB1*0301)执行NicA2 MHCII表位的计算机搜索。使用免疫表位数据库(Vita等人,《核酸研究(Nucleic acids research)》,43:D405-D412(2015))和百分位共识等级方法进行搜索以评估NicA2的预测免疫原性潜力。跨所有8个HLA-DR等位基因对每个重叠的15聚体NicA2肽的百分位共识评分进行求平均。然后,通过选择与整体平均结合评分相比,与MHCII的紧密预测结合的标准偏差>1的所有NicA2序列来确定NicA2的免疫原性潜力。此方法揭示了跨反映预测具有广泛免疫原性的SEQ ID NO:1的残基10-32、68-94、189-225、248-285、296-327、336-391和435-459(在表1中以灰色突出显示)的NicA2序列的45%的八个连续序列。
在计算机中进行仅使用DRB1*0401等位基因的更窄的搜索。此搜索产生了在表1的SEQ ID NO:1中以下划线强调的六个排名最高的免疫原性T细胞表位。
实例3-尼古丁降解酶的聚乙二醇化
NicA2的聚乙二醇化
以5mg/mL的蛋白质浓度并使用10或20kDa NHS-PEG试剂(ME-100TS或ME-200TS;NOF美国公司(NOF America Corporation))在7倍或20倍摩尔过量下在100mMNa3PO4中在pH 7.6下在冰上进行wt NicA2的随机聚乙二醇化,持续≥2小时。使用截止值为50kDa的Amicon Ultra-15离心过滤装置消除未缀合的PEG试剂。将对应于2μg蛋白质的样品在MOPS运行缓冲液中运行的SDS-PAGE凝胶上分析,并使用SimplyBlue SafeStain(英杰公司)进行染色。
聚乙二醇化NicA2的分析
进行实验以开发用于将聚乙二醇(PEG)与NicA2和其它尼古丁降解酶(如所公开的变体)缀合的方案并确定聚乙二醇化对活性和半衰期的影响。
SDS-PAGE分析表明,聚乙二醇化的程度随着聚乙二醇化试剂的摩尔过量和PEG链长的增加而增加。以5mg/mL的蛋白质浓度并使用10或20kDa NHS-PEG试剂(ME-100TS或ME-200TS;NOF美国公司)在7倍或20倍摩尔过量下在100mM Na3PO4中在pH 7.6下在冰上进行野生型(wt)NicA2的随机聚乙二醇化,持续≥2小时。使用截止值为50kDa的Amicon Ultra-15离心过滤装置消除未缀合的PEG试剂。将对应于2μg蛋白质的样品上样到在MOPS运行缓冲液中运行的SDS-PAGE凝胶上,并使用SimplyBlue SafeStain(英杰公司)进行染色。如图5所示,可以通过控制聚乙二醇化试剂的过量摩尔比来控制聚乙二醇化程度。选择通过SDS-PAGE未检测到残余的未缀合蛋白质的制剂NicA2-PEG1、NicA2-PEG2和NicA2-PEG3以进行进一步分析。
为了确定聚乙二醇化是否可以增强NicA2的药代动力学(PK)特性,在大鼠中静脉内(i.v.)给药(5mg/mL;N=4;2M+2F)后随着时间的推移测定血清浓度。图6中示出了来自这些实验的数据。简而言之,用抗His标签抗体(R&D系统公司)将MaxiSorp ELISA板(Nunc)涂覆过夜,所述抗His标签抗体可以与NicA2和经过聚乙二醇化的NicA2蛋白质上的C端His-标签结合。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的1%无脂干奶(NFDM)将板封闭约1小时。将NicA2和NicA2-PEG1-3标准品和血清样品在PBS+0.1%Tween-20中的1%NFDM中的稀释液加入板中,并将其在室温下温育2小时。在洗去未结合的物质(在PBS+0.1%Tween-20中进行的所有洗涤步骤)后,将兔抗NicA2多克隆初级检测抗体加入孔中温育1小时。洗涤步骤之后加入辣根过氧化物酶(HRP)缀合的山羊抗兔IgG(Fc)(KPL国际公司(KPL International))。将板洗涤,并用TMB底物(3,3′,5,5′-四甲基联苯胺;KPL国际公司)检测剩余的结合复合物。一旦用酸终止,就在分光光度计上在450nm处读板,并在Pro版本5.4(分子装置公司)中分析数据。
进行另外的实验以确定聚乙二醇化是否掩蔽NicA2上的表位。在用于在上述PK实验中测量血清浓度的同一三明治ELISA测定(sandwich ELISA assay)中测试未经聚乙二醇化或经过聚乙二醇化的NicA2制剂的PBS中的系列稀释液(图6),并将信号(A450)绘制为浓度的函数。测定灵敏度随着聚乙二醇化程度的增加而显著降低(相对于未经聚乙二醇化的分子,浓度比获得1.0的A450所需的NicA2-PEG2和NicA2-PEG3的浓度高约1000倍),从而表明由检测抗体试剂识别的表位在经过聚乙二醇化的分子中较不易获得。图7中示出了这些结果。
显示的是,聚乙二醇化降低转基因HLA-DR4小鼠免疫原性模型中的NicA2特异性抗体的滴度。特别地,研究了在将弗氏不完全佐剂(Freunds Incomplete Adjuvant)皮下(s.c.)注射到人DR4转基因小鼠(N=6;3M+3F;Taconic生物科学公司(TaconicBiosciences))中后10天NicA2特异性抗体滴度的降低。此小鼠模型携带具有人HLA-DRA和HLA-DRB*0401(代表DR4超型)的抗原结合结构域的杂合MHC II类分子,并且不表达内源性小鼠MHC II类分子。将滴度定义为血清稀释度,以便使用NicA2涂覆板在ELISA中达到OD450=0.5,并通过山羊α-小鼠IgG-γ-HRP进行检测。测试的最低血清稀释度是50倍(检测限(LOD);在图8中由虚线指示)。NicA2的聚乙二醇化导致转基因DR4小鼠中平均NicA2特异性抗体滴度发生显著的≥10倍的降低(图8;分别来自组NicA2-PEG1、NicA2-PEG2和NicA2-PEG3的4只、2只和2只动物的滴度低于LOD),这意味着经过聚乙二醇化的变体可能在临床环境中表现出较低的免疫原性。
还观察到,聚乙二醇化减弱了通过暴露于NicA2介导的人T细胞增殖应答和细胞因子TNFγ释放,如图9所示。NicA2的聚乙二醇化导致平均T细胞增殖刺激指数的显著降低(图9,左图)以及IFNγ分泌水平的降低(图9,右图)(来自五名健康志愿者的独立实验)。阳性对照:植物血凝素(PHA)。与基线应答(PBMC)相比,针对三个测试浓度下的NicA2和NicA2-PEG2的T细胞增殖应答刺激指数(SI;通过3H-胸苷摄取测量)(左)和IFNγ分泌水平的成倍增加(通过流式细胞术和流式微珠阵列试剂盒(BD生物科学公司(BD Biosciences))测量)(右)显示了五个独立实验的测试结果。增加≥3(虚线)被视为显著增加和阳性应答。
还显示的是,经过聚乙二醇化的酶在血清中保留完全的尼古丁降解活性,如图10所示。按0.075mg/ml的最终浓度将Wt NicA2或NicA2-PEG2加入到在37℃下预温育的含有40ng/mL S-尼古丁(250nM,其相当于在典型吸烟者中观察到的血浆水平)的大鼠血清中。在各个时间点取出样品,并通过加入甲醇和快速混合来立即淬灭酶活性。通过气相色谱法(GC)测定残余的尼古丁浓度。GC测定的LOD为2ng/mL,由虚线表示。聚乙二醇化似乎不会阻碍NicA2降解尼古丁的能力。
实例4-血清中的尼古丁降解活性
为了研究活性是否不仅在测定缓冲液中且在Amplex Red测定的高(10μM)尼古丁浓度下得到改善(参见表3),而且在与在典型吸烟者中遇到的浓度更相关的使用尼古丁的血清浓度中也得到改善,在使用血清而不是缓冲溶液的测定中纯化和评估在Amplex Red测定中改进的示例性变体。根据制造商的方案,使用Cobalt TALONTM His-标签纯化树脂(克隆科技公司)通过固定金属亲和色谱法(IMAC)进行纯化,并且基于每种变体在280nm处的吸光度和理论消光系数,计算在PBS中透析后的浓度。
按1.5μg/ml的最终浓度将经过纯化的酶添加到在37℃下预温育的含有40ng/mlS-(-)-尼古丁(250nM,其相当于在典型吸烟者中观察到的血浆水平)的大鼠血清中。在各个时间点取出样品,并通过加入甲醇和快速混合来立即淬灭酶活性。通过气相色谱法(GC;Hieda等人,大鼠免疫减少尼古丁到脑的分布,《精神药理学》,143,150-157,1999)测定残余的尼古丁浓度。GC测定的检测水平为2ng/mL。如图11A和11B所看到的,与wt NicA2相比,变体NicA2A107R(在PCT/US2018/016664中公开的阳性对照物)、A107T、A107G、F104T、F104I、F104R、F104S、G106A、F355H和A426C在这些条件下的尼古丁降解活性增加。相比之下,在此测定中,变体E249W似乎没有改善的尼古丁降解活性,即使在Amplex Red测定中在底物浓度为10μM时,活性相比wt增加了5.5倍(表3)。
不受理论的束缚,据信在10μM下观察到对Vmax(和kcat)的影响,并且在AmplexRed测定中看到的更高活性并不总是转化为在低尼古丁浓度(≤250nM)下观察到的对应结果的原因是突变可能对Km产生负面影响(即,增加Km),因此在低底物浓度下的速率最终会降低或与wt NicA2所观察到的速率类似。然而,这仅仅是基于迄今为止的观察结果的假设,并且另外的研究可以表明,Amplex Red测定中的活性通常也将倾向于预测血清降解活性中的活性。
实例5-次级酶筛选测定
尼古丁生物传感器测定:使用BiOptix 404pi增强型SPR仪器进行实验。使用标准EDC/NHS胺结合用乙醇胺阻断剩余活性酯将在要测量的浓度范围中间具有合适KD的IgG1(S-(-)-尼古丁为66nM)的尼古丁特异性mAb ATI-1119固定在BiOptix CMD200m传感器芯片上。对于标准曲线,在运行缓冲液(10mM HEPES(pH 7.4),150mM NaCl,3mM EDTA,0.05%Tween-20)中以不同浓度(3x系列稀释)注射S-(-)-尼古丁。每次注射后,在25℃下的缓冲液中流动20分钟,以使尼古丁与mAb分离并为下一次进样准备芯片。针对每种尼古丁浓度进行三(3)次独立随机注射。使用Scrubber2软件确定稳态时的应答单位。
对于酶活性的测定,如初级筛选测定中所描述的制备粗裂解物。使用固定的抗His标签mAb(每个测定点一个孔)从裂解物中捕获酶。在洗掉未结合的材料之后,通过添加100μl起始尼古丁浓度为250nM的运行缓冲液开始测定,以模拟典型吸烟者中遇到的血液浓度(40ng/mL)。通过将90μl转移至预先标记的PCR管中来终止反应,并加热到90℃/10分钟以灭活潜在的残余酶活性。将样品转移到96孔样品板上,然后将其加载到BiOptix仪器的自动进样器(保持在10℃下)。
结果
共有58个在10μM底物上具有增强的活性的单独变体(浓度比已公开的wt NicA2的Km高100倍;反映了相比wt具有增强的kcat),设计了新型次级筛选测定法,以有效鉴定那些在吸烟者血液中遇到的尼古丁浓度较低时活性也得到改善的变体(例如,250nM;典型的每日最大值)。如此处简要描述的,实施了能够高效且准确筛选变体,而无需完全纯化和定量的自动尼古丁生物传感器测定。如图12A和12B所示,使用表面等离子体共振(SPR),固定在传感器芯片上的尼古丁特异性mAb可以给出应答曲线,其中稳态下的SPR信号(以应答单位RU表示)与通过芯片表面的缓冲液中的尼古丁浓度成比例。此测定允许针对S-(-)-尼古丁KD为66nM的此特定抗体(ATI-1119),对缓冲液中未知的尼古丁水平(单位数范围为nM到1μM)进行定量。简而言之,图12A示出了在一系列尼古丁浓度内在具有固定的抗尼古丁抗体的传感器表面之上传递的运行缓冲液中的S-(-)-尼古丁的3倍连续稀释的传感图(如所指示的,一式三份)。在达到稳定水平的结合之后,将不含尼古丁的运行缓冲液通过芯片(从t=240秒开始),以使尼古丁与mAb分离。图12B示出了稳态下(来自图C的实验)的传感器应答单位(RU)对S-(-)-尼古丁浓度的绘图。
设计了测定,其中残余尼古丁浓度可以作为酶温育时间的函数进行测量。简而言之,图13A-C示出了在吸烟者中发现的尼古丁浓度下的这些次级酶筛选测定和经纯化的酶变体的活性的结果。图13A示出了通过测定孔中的抗His-标签mAb从大肠杆菌裂解物中捕获了His-标签的wt NicA2酶(圆圈)或突变体NicA2A107R(正方形)。添加含有250nM S-尼古丁的缓冲液,取回样品,并在指定的时间点加热灭活。在生物传感器仪器上运行样品,并将应答单位绘制为时间的函数。如图13A中所看到的,对于wt NicA2的裂解物观察到RU随时间的降低。对于来自初级筛选测定中最佳变体的裂解物A107R,尼古丁的降解速率显著快于wt。为确保使用完全纯化的蛋白质和血清复制数据,使用高灵敏度且定量气相色谱(GC)测定对wt和改进的变体降低血清中尼古丁浓度的能力进行了比较。GC测定仅在此最终体外测定步骤中使用,因为它的通量低,并且筛选所有最初的命中物将非常耗时。图13B示出了将经纯化的酶或突变体NicA2A107R添加到含有40ng/mL S-(-)-尼古丁的大鼠血清中,并在指定的时间点取出样品并通过添加MeOH淬灭活性。通过GC测量残余尼古丁浓度。如图13B所看到的,在血清中在吸烟者中发现的尼古丁浓度下,与wt NicA2相比,活性最高的变体NicA2A107R的尼古丁降解活性增加。此增强的活性得以复制并证实了生物传感器的测定结果。
在实施并验证次级测定的情况下,在SPR测定中在较低的尼古丁浓度下,对初级筛选测定中相比wt NicA2活性增加了至少2倍的所有变体进行了测试,并且发现变体F104T,I,R和S;G106A;A107R,T,G、F355H和A426C相比wt有所改善。随后将所述变体进行纯化并在血清/GC测定中进行测试。图13C示出了在血清中在40ng/mL尼古丁下,10种变体相比wtNicA2的活性增强。将每个经纯化的变体(1.5μg/mL)在37℃下添加到含有40ng/mL尼古丁的大鼠血清中,并在不同时间点用甲醇淬灭活性。空心符号指示与此测定中的wt>3倍相比,活性增加。通过GC测量尼古丁浓度。如图13C所示,这些变体在血清中确实也得到了改善。
图13C(表2)中数据的模拟表明,至少对于一种变体(A107R)而言,增强的kcat是以增加KM(以达到最大催化速率的50%所需的酶浓度,Vmax)为代价的。为了验证低烟尼古丁进程曲线的动力学模型,发现wt NicA2具有明显的kcat/KM为6.4×104M-1s-1,与先前的报道非常吻合。图13C中所示的变体显示出改善的kcat/KM值的范围比wt NicA2高出1.7倍(G106A)到3倍(A107R)(表2)。模拟进一步表明,与wt NicA2相比,仅A107R表现出显著增加的KM(830nM),所述值与在广泛的尼古丁浓度范围内对此变体进行的稳态动力学分析非常一致(数据未示出)。
表4-GC分析的结果
使用低尼古丁测定结果(图13C)使用米凯利斯-门顿(Michaelis-Menten)等式的形式(v0/[E]=kcat/KM*[S])计算明显的kcat/KM值,并构建拟合简单动力学模型(KinTek)的进程曲线,以得出明显的kcat值。所得kcat/KM和kcat值用于计算明显的KM值。
实例6-A107R突变体的体内活性的改善
大鼠尼古丁分布研究
购买了分别重约300g和250g的雄性和雌性斯普拉格-多雷(Sprague Dawley)大鼠,并使颈静脉导管就位(查尔斯河实验室(Charles River Labs))。以0.625mg/kg的剂量通过导管用牛血清白蛋白、wt NicA2或NicA2A107R预处理三组8只大鼠(每组4只雄性+4只雌性)。最少5分钟后,每组均静脉接受0.03mg/kg尼古丁。在尼古丁给药后3分钟处死大鼠。如先前所描述的,通过断头术并用甲醇淬灭来获得血液和脑样品。通过针对多重比较的单向ANOVA与邦费罗尼校正(bonferroni correction)对血液或脑中尼古丁的浓度进行比较。
畜牧业
每个研究组使用相等数量的年龄匹配的雄性和雌性斯普拉格-多雷大鼠(查尔斯河实验室)或HLA转基因小鼠。将经过手术改性的研究动物单独圈养在一次性微型隔离笼中(由纽约因奴白公司(Innovive))。设置环境控制以维持以下条件:64到79°F的温度范围、30至70%的相对湿度范围,十次或更多次换气/每小时,以及光照12小时/黑暗12小时周期。随意获得食物和水。动物福利遵循美国国家卫生研究院实验动物护理和使用指南(NIH guidefor Care and Use of Laboratory Animals)(第8版),并且所有方案均获得Noble生命科学公司(Noble Life Sciences(NLS))机构动物护理和使用委员会的批准。NLS是AAALACi认证和USDA许可(51-12-0092)和OLAW保证(A4633-01)的设施。在异氟烷麻醉下从动物收集血液,并采取了使动物经受的痛苦最小化的必要步骤。在符合AVMA指南的异氟烷麻醉下,通过开胸术收集血液之后,对研究动物实施安乐死。
结果
为了确保将先前测定中示出的增强的体外功效转化为增强的体内功效,还测试了0.625mg/kg wt NicA2或NicA2A107R给药对尼古丁到血液和脑分布的影响。每组八只大鼠预先给药有酶或牛血清白蛋白(BSA;对照物),并在10分钟后通过静脉团注在10秒内递送给予0.03mg/kg尼古丁剂量(相当于2支香烟的尼古丁剂量,以mg/kg计)。3分钟后,分离血液和脑,如先前所描述的立即终止酶活性,并使用气相色谱法分析样品的尼古丁含量(图14)。与对照物相比(18.8±3.3ng/mL),NicA2A107R将血液的尼古丁浓度降低到3.25±1.5ng/mL对wt NicA2的13.6±3.1ng/mL(p<0.0001,采用邦费罗尼校正的单向ANOVA,将A107R与wtNicA2进行了比较),或分别降低83%对降低27%。在0.625mg/kg剂量下,与当给药20mg/kgwt NicA2时的降低95%相比,脑尼古丁水平仅部分降低:NicA2A107R降低35%,并且wtNicA2降低13%(p=0.02)。这些数据表明,在这些条件下,NicA2A107R的体内效力比wtNicA2高大约3倍。
使用包含以下的组合变体执行基于血清的相同分析:(i)A107R突变和F355H突变(SEQ ID NO:34)和(ii)A107R、F104I和A426C突变(SEQ ID NO:35)。图14中示出了此分析的结果。
实例7-慢性毒理学试验表明在存在尼古丁的情况下NicA2具有良好的耐受性。
在存在尼古丁的情况下NicA2的毒理学测试
这项研究的目的是评估使用大鼠模型在存在1毫克/千克/天的尼古丁的情况下通过静脉持续给予28天,每4天给药一次(共140mg/kg)的七(7)次固定静脉给药20mg/kgNicA2-ABD(NicA2的长效形式,其中酶与白蛋白结合结构域(ABD)缀合)的重复剂量耐受性。选择此剂量是因为在大鼠尼古丁-PK研究中20mg/kg足以使脑尼古丁水平降低95%,并且药物供应受到限制。
将二十(20)只雌性和二十(20)只雄性斯普拉格-多雷大鼠(225-300克)分成两组十六(16)只动物和一组八(8)只动物。在研究时间段,使动物植入有渗透泵,以递送连续剂量的尼古丁或媒剂。通过静脉注射递送NicA2-ABD(每四天一次)。由于可获得药物供应有限,16只动物接受了生理盐水,16只动物接受了仅尼古丁,并且只有8只动物接受了NicA2-ABD。
所有动物均接受全剂量(7×20mg/kg静脉),动物中的任何动物中没有与注射有关的行为变化、注射位点反应并且没有引起死亡。日常临床观察发现,在任何组中均未观察到在进食或厌恶方面的行为变化或改变。在研究持续时间内,每周两次监测体重,并且发现治疗组之间无显著差异。在研究第28天,收集血液并分析血液学、血清化学和凝血。取血浆的另外等分试样用于测定NicA2-ABD的血液水平。在血液收集之后,将动物用异氟烷麻醉并通过开胸术处死。
毒性评估基于在28天研究期间的死亡率、临床观察和体重,以及基于研究结束时的器官重量、总体解剖病理学、血液学、血清临床化学和凝血。
在研究结束时,对动物进行尸检,任何动物中没有明显的大体病理学发现。将主要器官(肝、肺、脾、心脏、肾、睾丸或卵巢)进行分离并称重。在这些组织中没有明显的总体病理学发现,也未发现器官重量的统计学显著变化(肾、睾丸和卵巢成对称重)。收集血液,并执行全血细胞计数以确定血液学参数的任何变化。尽管偶尔动物的值超出正常范围(例如,淋巴细胞或血红蛋白略有下降),但在任何组中均未发现明显变化或趋势。在仅接受尼古丁的对照动物中的一些对照动物中存在轻度多色性的趋势。23种不同分析物的血清临床化学和血浆凝血在治疗组之间未发现任何显著变化。
已经对心脏、肝、肺、肾、脾、骨骼肌、脑、结肠、胃、卵巢和睾丸进行了组织病理学评估。将组织立即固定在福尔马林中,并且嵌入石蜡中,用H&E染色,并且由兽医病理学家检查。组织病理学检查未在任何所检查的组织中发现与测试物品相关的病变。专门检查组织是否有任何免疫组织病理学反应的证据,并且在所测试的20mg/mL的剂量下均未观察到任何证据。
评估人HLA-DR4小鼠模型中的免疫原性的潜力
研究了在将弗氏不完全佐剂(Freunds Incomplete Adjuvant)皮下(s.c.)注射到人DR4转基因小鼠(N=6;3M+3F;Taconic生物科学公司(Taconic Biosciences))中后10天NicA2特异性抗体滴度的降低。此小鼠模型携带具有人HLA-DRA和HLA-DRB*0401(代表DR4超型)的抗原结合结构域的杂合MHC II类分子,并且不表达内源性小鼠MHC II类分子。将滴度定义为血清稀释度,以便使用NicA2涂覆板在ELISA中达到OD450=0.5,并通过山羊α-小鼠IgG-γ-HRP进行检测。测试的最低血清稀释度是50倍(检测限(LOD)。使用用于多重比较的克鲁斯卡尔-沃利斯检验(Kruskal-Wallis test)和邓尼特检验(Dunn's test)使用单向ANOVA将NicA2-PEG1、-PEG2和PEG3的滴度与未经聚乙二醇化的NicA2进行比较。
人T细胞中的T细胞刺激和IFN-γ分泌测定
在研究开始之前,已获得当地研究伦理委员会(LREC,英国东北部纽卡斯尔(Northeast Newcastle,UK))的批准。接受书面知情同意书后,从健康志愿者(n=5)获得外周血(60mL)。使用密度梯度离心(LYMPHOPREPTM,肝细胞技术有限公司(StemcellTechnologies))分离外周血单核细胞(PBMC),并且然后用于CD14+单核细胞的阳性选择。收集CD14-级分并用作自体淋巴细胞的来源。如先前所描述的,生成了单核细胞源性树突状细胞(MoDC)。通过将测试化合物与自体MoDC一起温育,并且然后由自体T细胞活化5天来进行T细胞增殖测定。将每个样品设置在三个一组的孔中。wt NicA2和NicA2-PEG2两者均以24μg/mL、2.4μg/mL和0.24μg/mL的浓度进行测试。植物血凝素(PHA)(5μg/mL)用作阳性对照物。为了确定基线增殖,将未经处理的MoDC与自体淋巴细胞共培养。在第5天添加[3H]胸苷之前,收集上清液用于IFN-γ分析。
通过[3H]-胸苷掺入以每分钟计数(cpm)测量T细胞增殖。通过将针对测试样品获得的cpm值除以基线cpm值计算T细胞增殖的刺激指数(SI)来进行分析。通过将用每种药物处理的细胞的值除以基线值,计算出IFN-γ水平(pg/mL)的成倍增加(通过流式细胞术使用流式微珠阵列试剂盒测量,BD生物科学公司)。3倍增加的临界值被认为是阳性应答。使用用于多重比较的克鲁斯卡尔-沃利斯检验和邓尼特检验使用单向ANOVA进行分析。
结果
为了评估在存在尼古丁的情况下的NicA2的安全性,对大鼠进行了28天的重复剂量毒理学研究,所述大鼠每4天静脉注射20mg/kg NicA2-ABD,并通过连续输注泵以1毫克/千克/天添加尼古丁(相当于按毫克/千克计,每天>30支香烟的尼古丁值)。包含两个对照组,分别是生理盐水组或仅尼古丁组。长效NicA2-ABD通过显著降低给药频率和所需材料量使这项研究成为可能。NicA2-ABD的循环半衰期为61小时。研究结束时的血清NicA2-ABD水平平均为81μg/mL。NicA2-ABD在治疗组中的耐受性良好,没有观察到病理学,包含血液学评估、血清临床化学评估以及肝、脾、心脏、肺、肾、脑、骨骼肌、胃、结肠和卵巢或睾丸的病理学检查。
实例8-治疗尼古丁成瘾和/或促进戒烟
此实例展示了使用如本文所述的变体治疗人类成人的尼古丁成瘾和/或促进其戒烟的方法。
通过口服或静脉注射或皮下注射向定期吸烟但希望戒烟的成年人类受试者施用治疗有效量的包括尼古丁降解酶变体(例如,SEQ ID NO:5-28或其长效形式)的药物组合物。评估受试者的血浆中循环的尼古丁水平,以及与尼古丁戒断相关的体征和症状(如头痛、烦躁、焦虑和失眠)的存在和/或严重程度,以及在给定的一天抽吸的香烟的数量。通过重复施用来治疗受试者,直至血浆中循环的尼古丁水平达到目标(降低)水平,和/或直至尼古丁戒断的一种或多种体征/症状得到减少、改善或消除,和/或直至受试者已经降低尼古丁产品的消耗水平(例如,每天抽吸的香烟减少),和/或直至受试者停止消耗尼古丁产品(例如,已经戒烟)。
实例9-用尼古丁降解酶变体治疗小儿患者
此实例展示了使用尼古丁降解酶变体治疗小儿患者的尼古丁中毒的方法。
通过静脉内注射、肌肉内注射或皮下注射向已知已经摄入或疑似摄入尼古丁的儿童施用治疗有效量的包括尼古丁降解酶变体的药物组合物。评估儿童的与尼古丁中毒相关的体征和症状(包含但不限于癫痫发作、昏迷、呼吸短促和心率增加)的存在和/或严重程度,并且对儿童进行治疗,直至一种或多种体征/症状得到减少、改善或消除。任选地,如果体征/症状持续存在和/或如果尼古丁血浆/脑水平保持升高,则施用另一剂量的药物组合物。
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Claims (59)
1.一种尼古丁降解酶变体,其包括作为SEQ ID NO:1中所示的野生型NicA2酶的氨基酸序列的变体的氨基酸序列,其中所述变体序列具有SEQ ID NO:1的位置104、106、107、249、355和426中的一个或多个位置处的至少一个取代、添加或缺失。
2.根据权利要求1所述的变体,其中所述变体序列包括选自SEQ ID NO:1的104、106、107、249、355和/或426的氨基酸位置处的至少一个取代。
3.根据权利要求2所述的变体,其中相对于野生型NicA2酶,所述取代增加了所述变体的尼古丁降解活性。
4.根据权利要求2所述的变体,其中所述变体序列包括取代F104R、F104K、F104I、F104L、F104S或F104T。
5.根据权利要求2所述的变体,其中所述变体序列包括选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:28的氨基酸序列。
6.根据权利要求2所述的变体,其中所述变体序列包括取代G106S或G106A。
7.根据权利要求2所述的变体,其中所述变体序列包括选自SEQ ID NO:11和SEQ IDNO:12的氨基酸序列。
8.根据权利要求2所述的变体,其中所述变体序列包括取代A107T、A107G、A107H或A107P。
9.根据权利要求2所述的变体,其中所述变体序列包括选自SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:28的氨基酸序列。
10.根据权利要求2所述的变体,其中所述变体序列包括取代E249W或E249D。
11.根据权利要求2所述的变体,其中所述变体序列包括选自SEQ ID NO:19和SEQ IDNO:20的氨基酸序列。
12.根据权利要求2所述的变体,其中所述变体序列包括取代F355H、F355K或F355E。
13.根据权利要求2所述的变体,其中所述变体序列包括选自SEQ ID NO:21、SEQ IDNO:22和SEQ ID NO:23的氨基酸序列。
14.根据权利要求2所述的变体,其中所述变体序列包括取代A426Q、A426W、A426P或A426C。
15.根据权利要求2所述的变体,其中所述变体序列包括选自SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27的氨基酸序列。
16.根据权利要求1或2所述的变体,其中所述变体包括选自以下的取代中的一个或多个取代:F104R取代、F104I取代、F104S取代、F104T取代、G106A取代、A107T取代、A107G取代、F355H取代和A426C取代。
17.根据权利要求1或2所述的变体,其中所述变体序列包括选自SEQ ID NO:1的104、106、107、249、355和/或426的两个或更多个氨基酸位置处的至少两个取代。
18.根据权利要求1或2所述的变体,其中所述变体序列包括选自SEQ ID NO:1的104、106、107、249、355和/或426的三个或更多个氨基酸位置处的至少三个取代。
19.根据权利要求1或2所述的变体,其中所述变体的尼古丁降解活性为野生型NicA2酶的尼古丁降解活性的至少约200%、约300%、约400%、约500%、约600%、约700%、约800%、约900%或约1000%。
20.根据权利要求1或2所述的变体,其中所述变体进一步包括SEQ ID NO:1的位置91、217、250、340、366、381、427、462或463中的一个或多个位置处的保守取代、非保守取代、添加或缺失。
21.根据权利要求1或2所述的变体,其中所述变体进一步包括选自以下的一个或多个取代:F104L、G106S、A107H、A107P、A107R、A107K、A107T、F355C、F355V、W427Q、W427E、W427S、W427M、W427H、W427L、W427R、R91A、R91Q、R91F、R91G、R91T、R91L、R91S、R91N、T250G、T250L、T250R、T250V、T250P、K340P、K340I、K340V、K340D、K340E、Q366K、Q366E、Q366V、Q366L、Q366I、Q366Y、T381P、T381I、T381V、T381Q、T381N、T381L、T381M、N462L、N462Y、N462S、N462F、N462G、N462E、N462A、N462M、I463F、I463Y、I463A、I463V、I463L、L217Q、L217G、L217E、L217I、L217C和L217S。
22.根据权利要求1到21中任一项所述的变体,其中所述变体相对于野生型NicA2酶表现出降低的免疫原性。
23.根据权利要求22所述的变体,其中相对于野生型NicA2酶,所述免疫原性降低75%或更多。
24.根据权利要求1到23中任一项所述的变体,其中所述变体进一步包括选自SEQ IDNO:1的74、77、78、80、262-266、303、304、306、310、374、377、378、382、383、450-452和457的氨基酸位置处的降低所述变体的所述免疫原性的至少一个取代。
25.根据权利要求24所述的变体,其中所述取代降低所述变体的所述免疫原性。
26.根据权利要求24所述的变体,其中所述变体进一步包括氨基酸位置262或263处的取代。
27.根据权利要求24所述的变体,其中所述变体进一步包括氨基酸位置262和263处的取代。
28.根据权利要求26或27所述的变体,其中所述变体进一步包括选自SEQ ID NO:1的氨基酸10-32、68-94、189-225、248-285、296-327、336-391和435-459的区域内的免疫原性T细胞表位中的至少一个取代、添加或缺失。
29.根据权利要求26到28中任一项所述的变体,其中所述变体进一步包括选自SEQ IDNO:1的氨基酸16-24、73-81、258-266、302-310、373-381和447-455的免疫原性T细胞表位中的至少一个取代、添加或缺失。
30.根据权利要求26到29中任一项所述的变体,其中所述变体进一步包括选自以下的位置处的至少一个取代、添加或缺失:
(a)SEQ ID NO:1的氨基酸残基74、77、78或80;
(b)SEQ ID NO:1的氨基酸残基262、263、264或266;
(c)SEQ ID NO:1的氨基酸残基303、304、306或310;
(d)SEQ ID NO:1的氨基酸残基374、377、378、382或383;和/或
(e)SEQ ID NO:1的氨基酸残基450、451、452或457。
31.根据权利要求26到30中任一项所述的变体,其中所述变体进一步包括选自以下的至少一个取代或取代组合:
(a)L74N和Y77R;
(b)L74N和Y77K;
(c)L74Q和Y77R;
(d)L74Q和Y77N;
(e)L74N和Y77Q;
(f)L74N和Y77H;
(g)L74N和L80H;
(h)L80F;
(i)Y77R;以及
(j)R78Q。
32.根据权利要求26到30中任一项所述的变体,其中所述变体进一步包括选自以下的至少一个取代或取代组合:
(a)I262A和A264Q;
(b)I262K和L266D;
(c)I262T;
(d)I262S;
(e)I262D和L266K;
(f)I262A
(g)I262T和A264L;
(h)I262T和N263R;
(i)M265H;以及
(j)I262A和A264N。
33.根据权利要求26到30中任一项所述的变体,其中所述变体进一步包括选自以下的至少一个取代或取代组合:
(a)V303T、V304N和M306I;
(b)V304A和M306Q;
(c)V304A、M306N;
(d)V304A;
(e)V304A和M306H;
(f)V304N和M306H;
(g)V304Q和M306H;
(h)V304N、M306I;
(i)V304T和M306I;以及(j)M306I和L310R。
34.根据权利要求26到30中任一项所述的变体,其中所述变体进一步包括选自以下的至少一个取代或取代组合:
(a)L374Q和I377S;
(b)L374A和I377A;
(c)L374Q和I377A;
(d)L374N和I377A;
(e)L374N和I382Q;
(f)I377A和I382T;
(g)I377A和L378N;
(h)I377T和I382T;
(i)I377T;以及
(j)L374N和A383Q。
35.根据权利要求26到30中任一项所述的变体,其中所述变体进一步包括选自以下的至少一个取代或取代组合:
(a)I448Q和F450S;
(b)I448E和F450N;
(c)I448A和F450N;
(d)I448Q和F450Q;
(e)I448T和F450Q;
(f)I448E和F450L;
(g)T455K;
(h)L449H和F450A;
(i)F450A;以及
(j)I448A和F450Y。
36.根据权利要求26到30中任一项所述的变体,其中所述变体进一步包括选自以下的至少一个取代或取代组合:
(a)I262T;
(b)I262S;
(c)I262A;
(d)I262T和A264L;以及
(e)I262T和N263R。
37.根据权利要求1到36中任一项所述的变体,其进一步包括SEQ ID NO:1的至少氨基酸1-38的缺失。
38.根据权利要求1到36中任一项所述的变体,其进一步包括SEQ ID NO:1的氨基酸1-50的缺失。
39.根据权利要求1到38中任一项所述的变体,其进一步包括选自由以下组成的组的一种或多种突变:F163A、Y214A、Y218A、Y242A、M246A、E249A、F353V、F355V、W364V、F353A、F355A和W364A,任选地,所述变体可以包括A107R、F104I+A107R或AF104I+A107R+A426C和F163A、Y214A、Y218A、Y242A、M246A、E249A、F353V、F355V和W364V,或者所述变体可以包括F355H或A107R+F355H和F163A、Y214A、Y218A、Y242A、M246A、E249A、F353V和W364V。
40.一种尼古丁降解酶变体,其包括作为SEQ ID NO:1中所示的野生型NicA2酶的氨基酸序列的变体的氨基酸序列,其中所述变体序列具有选自由以下组成的组的至少一个取代:F163A、Y214A、Y218A、Y242A、M246A、E249A、F353V、F355V、W364V、F353A、F355A和W364A,并且包括1-52个氨基酸的N端缺失。
41.根据权利要求40所述的变体,其中所述N端缺失是25个、38个或50个氨基酸。
42.根据权利要求1到41中任一项所述的变体,其中所述变体是长效变体。
43.根据权利要求1到42中任一项所述的变体,其中所述变体是包括与白蛋白结合肽、白蛋白结合蛋白结构域、人血清白蛋白或惰性多肽融合的变体的长效变体。
44.根据权利要求1到43中任一项所述的变体,其中所述变体是包括与选自重组PEG(XTEN)、同源氨基酸聚合物(HAP)、脯氨酸-丙氨酸丝氨酸聚合物(PAS)或弹性蛋白样肽(ELP)的惰性多肽融合的变体的长效变体。
45.根据权利要求1到43中任一项所述的变体,其中所述变体是聚乙二醇化的。
46.一种药物组合物,其包括根据权利要求1到45中任一项所述的尼古丁降解酶变体和药学上可接受的载体。
47.根据权利要求46所述的组合物,其被调配成用于注射或输注。
48.根据权利要求46所述的组合物,其被调配成用于口服施用。
49.根据权利要求1到45中任一项所述的变体,其中所述变体进一步包括His-标签。
50.一种治疗尼古丁成瘾或促进戒烟的方法,所述方法包括向有需要的哺乳动物受试者施用治疗有效量的根据权利要求1到45中任一项所述的尼古丁降解酶变体或根据权利要求46到48中任一项所述的药物组合物。
51.根据权利要求50所述的方法,其中所述哺乳动物受试者是人类受试者。
52.根据权利要求50所述的方法,其中所述尼古丁成瘾与选自烟草产品和电子烟的尼古丁产品的消耗相关联。
53.根据权利要求1到45中任一项所述的尼古丁降解酶变体或根据权利要求46到48中任一项所述的药物组合物,其用于治疗尼古丁成瘾或促进戒烟。
54.一种根据权利要求1到45中任一项所述的尼古丁降解酶变体或根据权利要求46到48中任一项所述的药物组合物的用途,其用于制造用于治疗尼古丁成瘾或促进戒烟的药物。
55.一种治疗尼古丁中毒或尼古丁毒性的方法,所述方法包括向有需要的哺乳动物受试者施用治疗有效量的根据权利要求1到45中任一项所述的尼古丁降解酶变体或根据权利要求46到48中任一项所述的药物组合物。
56.根据权利要求55所述的方法,其中所述哺乳动物受试者是人类受试者。
57.根据权利要求56所述的方法,其中所述人类受试者是儿童。
58.根据权利要求1到45中任一项所述的尼古丁降解酶变体或根据权利要求46到48中任一项所述的药物组合物,其用于治疗尼古丁中毒或尼古丁毒性。
59.一种根据权利要求1到45中任一项所述的尼古丁降解酶变体或根据权利要求46到48中任一项所述的药物组合物的用途,其用于制造用于治疗尼古丁中毒或尼古丁毒性的药物。
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