CN112638429A - 包含作为基准标记物的荧光染料的溶液 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及一种包含非水溶性碳水化合物和荧光染料诸如近红外(NIR)造影剂的溶液，其中该溶液在水性条件下诸如在体内凝固而形成例如凝胶、玻璃、半固体、固体、晶体或它们的任何混合物。本公开还涉及此类溶液的制备以及此类溶液用于体内成像和/或外科手术或介入性治疗手术的引导的用途。

Description

包含作为基准标记物的荧光染料的溶液
技术领域
本公开涉及一种包含非水溶性碳水化合物和荧光染料诸如近红外(NIR)造影剂的溶液，其中该溶液在水性条件下诸如在体内凝固而形成例如凝胶、玻璃、半固体、固体、晶体或它们的任何混合物。本公开还涉及此类溶液的制备以及此类溶液用于体内成像和/或外科手术和/或介入性手术的引导的用途。
背景技术
外科手术长期以来一直都是实体肿瘤治疗的基石。外科手术的范围、外科手术方法及其成功结局根据癌的类型、其阶段、大小、分布和位置而有差别。在癌早期进行外科手术会产生良好治疗结局。外科手术的目标可为姑息性或根治性的。姑息性外科手术的目的在于缓解癌所引起的症状并且根治性外科手术具有治愈性意图。有时也以预防癌为目的进行外科手术，如切除结直肠癌前病变或切除肺部磨玻璃样影的情况。对于具有治愈性和预防性意图的癌外科手术而言，从患者体内去除所有恶性细胞最为重要。因此，外科手术的精准度变得最为重要。
当外科医生的肉眼无法看见靶标时，需要外科手术的周密规划。出于规划目的，使用术前扫描(最常用MRI和CT)来构建靶标结构和器官的3D模型。由术前扫描进行的体积重建也是建立患者特定的虚拟现实仿真的基础，外科医生可在实施实际干预之前通过该患者特定的虚拟现实仿真来执行手术培训。
利用得越来越多的另一种方法是外科手术的实时图像引导的使用。诸如C形臂和术中锥束计算机断层扫描(CBCT)之类的技术被整合进综合手术室中。这同样适用于荧光透视和磁共振成像(MRI)。然而，C形臂和CBCT均以基于x射线的成像为基础，其中软组织不可见并且金组织标记物通常用作伴侣。如就乳腺癌而言，超声有时也用于术中引导(使用和不使用标记物)。
在肺癌中，筛查程序不断涌现并且越来越多数量的小型孤立性肺结节(SPN)在早期被鉴别。最佳地，应在诊断时通过电视辅助胸腔镜手术(VATS)来手术摘除此类SPN以防止该疾病的进展。该情况给外科医生和患者都带来了棘手问题，这是因为大多数SPN具有较小的大小和/或离胸膜的距离，因而是非扪及性的，使得外科医生不可能定位和摘除它们。因此，VATS手术要一直延迟到结节已长到可扪及的大小。此类延迟是不尽人意的并且增加了进展到转移癌的风险，这会显著恶化预后并增加治疗相关费用。
现代乳腺X线摄影能鉴别对于外科医生准确定位和切除富有挑战性的大小越来越小的病变。当前应用了多种方法来改善手术结局，包括导丝导向定位(WGL)和放射导向隐匿性病灶定位(ROLL)。所观察到的手术引导的有益效果已将ROLL技术的使用扩展到孤立性肺肿瘤和甲状腺癌。
为了克服在外科手术期间鉴别癌病变的问题，因此深入探究了可在外科手术期间定位和鉴别的标记物以在外科手术披露(surgical disclosure)期间充分利用诊断图像的潜能。所测试的标记物的示例是：(i)组织颜色染料(诸如亚甲基蓝)和近红外(NIR)染料(诸如ICG)，(ii)碘油(一种不透射线的油)，(iii)带钩钢丝(Hook wire)，(iv)金基准，以及(v)99mTc放射性标记的标记物。最佳标记物是：i)诊断图像上可见，ii)在外科手术期间易于定位在任何组织深度处，iii)在布置后不会移位或迁移，iv)可以以高精准度定位，以及v)不会给患者带来附加风险，诸如气胸或其他不必要的并发症。然而，当前可用的标记物均不满足这些标准。
NIR-相机、SPECT扫描仪和γ探针检测器不仅被整合进标准外科手术中，而且被整合进机器人手术系统中，诸如得自直觉外科手术公司(Intuitive Surgical)的达芬奇系统。这同样适用于PET扫描仪。机器人辅助外科手术使用机械臂来执行腹腔镜手术。使用机器人外科手术的优点包括更佳的可视化、增强的敏捷度和更大的精准度，这给患者带来了许多有益效果，包括减少的疼痛和不适、更快的恢复时间和更快重返正常活动、更小的切口，从而降低感染的风险并最大程度减少疤痕的形成。
因此本领域迫切需要开发良好的基准标记物以与图像引导外科手术领域中不断发展的技术一起使用。
发明内容
本公开提供了用于引导外科干预或体内部位的标记(诸如在活检之后)的优异基准标记物。本公开提供了一种可注射溶液，该可注射溶液在水性条件诸如在体内凝固而形成例如凝胶、玻璃、半固体、固体、晶体或它们的任何混合物，之后其可提供用于荧光染料的控制释放或保留的系统和/或充当通过一种或多种成像模式来成像的组织标记物。本公开的溶液将现代生物材料和染料技术结合到新的外科手术标记物中，该新的外科手术标记物是生物相容性的，可降解的，在多种图像模式上可见，并且可易于注射，与最先进的支气管镜相容。本公开的溶液的其他优点包括其与常规注射器和针注射以及最先进的注射技术相容，该最先进的注射技术包括但不限于：内窥镜、CT和US引导抽吸和注射技术。因此本公开的溶液提供了荧光染料在所定义的位置处例如在肿瘤、异物、临界边缘和神经的部位处的沉积。
本公开涉及一种溶液，该溶液包含非水溶性碳水化合物、荧光染料和具有-2至2范围内的logP的溶剂。在一个方面，荧光染料具有高于2的logP。荧光染料的疏水性确保荧光染料在溶液中的扩散速率较低和/或其对水相的亲和力较低，从而荧光染料保留在沉积的溶液中。在将溶液施用到例如肿瘤的部位后，溶液的溶剂扩散到周围环境中，使得溶液粘度增加并最终使溶液凝固而形成例如凝胶、玻璃、半固体、固体、晶体或它们的任何混合物，从而提供荧光染料的动力学陷阱。从而荧光染料保留在所施用的注射部位或直接施用(例如肿瘤切除之后分散在手术瘤床中)的部位处，这允许基准标记物的精准定位。在第二另选方面，荧光染料共价地缀合至聚乙二醇(PEG)并且具有高于2000的分子量。PEG的亲水性质提供了荧光染料从溶液的释放，之后当向有此需要的个体施用时，荧光染料-PEG缀合物可进入区域淋巴系统，对该区域淋巴系统进行染色并且积聚在淋巴结中。
本公开的基于凝胶的基准标记物的有益效果包括与当前标准程序相比凝胶不易因扩散而迁移或散布，可适应多种成像模式诸如NIR/PET/SPECT/CT标记物，不需要在治疗结束后进行外科手术移除，具有改善的生物相容性并且可使用微创应用方法来插入/注射。总的来说，这引起了改善的患者舒适度和治疗结局，并且通过小号针或支气管镜的易注射性扩展了基准标记物相关的可能指征。
如上文所述，图像引导外科手术领域中需要良好基准标记物。本公开的溶液可适应多种成像模式诸如NIR/PET/SPECT/CT/MRI/US标记物，并且可与PET或SPECT成像或者手持式γ探针检测一起使用。当前，还没有能够将放射性保留在注射部位的液体基准标记物技术，而是采用不太有吸引力的方法，在该方法中在CT引导下将用CT造影剂稀释的99mTc标记大团聚体的溶液注射到结节中。然而，此类溶液存在标记物的快速清除和活性的散布，这会降低精准度和可用性。
理想标记物应在诊断图像上可见并且在VATS手术期间易于鉴别。本公开描述了这样的多模态基准标记物：i)易于使用非引导式注射、注射的超声(US)、计算机断层扫描(CT)或荧光透视图像引导来注射进患病组织中，以及ii)将改善对例如甚至位于远离胸膜表面的肺组织深处的小型结节、软组织中的异物、肿瘤边缘、临界结构和需要在此切除附加组织的术后瘤床进行定位的概率。这些标记物是注射之前的流体并且与最先进的电磁导航支气管镜(ENB)相容，从而使得能够以高精准度布置标记物。注射后，溶液凝固而形成凝胶、玻璃、半固体、固体、晶体或它们的任何组合，从而最大程度降低了迁移的风险并使外科医生能够通过触诊来鉴别位于外周的SPN的病变。
本公开的溶液可用于基准标记物对于引导有必要的所有外科手术/指征。机器人外科手术是本公开的另一个应用领域，其中通过成像来引导允许机器人使用诊断图像作为路线图并使用患者体内的基准标记物作为信标来导航。
因此，在一个方面，本公开涉及一种溶液，该溶液包含：
a.非水溶性碳水化合物，
b.荧光染料，和
c.具有-2至2范围内的logP的有机溶剂。
在一个方面，本公开涉及如本文所公开的溶液，其中荧光染料具有高于2的logP，从而在水性条件下提供荧光染料在溶液中的保留。
在一个方面，本公开涉及如本文所公开的溶液，其中荧光染料共价地缀合至聚乙二醇并且具有高于2000Da的分子量，从而在水性条件下提供荧光染料从溶液的释放。
荧光染料-PEG缀合物的此类释放可在体内从溶液释放之后提供所述缀合物在淋巴结中的积聚。
在一个方面，本公开涉及如本文所述的溶液，其中荧光染料配位至放射性核素。荧光染料配位至放射性核素可提供可通过多种成像模式和核医学检测技术检测的基准标记物。
在一个方面，本公开涉及用作体内成像工具的如本文所述的溶液。
在另一个方面，本公开涉及一种体内成像的方法，该方法包括：
a.向有此需要的个体施用如本文所述的溶液，
b.荧光染料的激发，以及
c.荧光染料的检测。
在一个方面，本公开涉及如本文所述的溶液用于体内成像的用途。
在一个方面，本公开涉及如本文所述的溶液用于引导外科手术和介入性治疗手术的用途。
附图说明
图1：溶解于甲苯或标记物制剂中的PC1、PC2和PC3的吸光度和荧光光谱。(A)溶解于甲苯中和(B)溶解于SAIB:xSAIB:EtOH 70:10:20标记物制剂中的PC1。(C)溶解于甲苯中和(D)溶解于SAIB:xSAIB:EtOH 70:10:20标记物制剂中的PC2。(E)溶解于甲苯中和(F)溶解于SAIB:BA 80:20标记物制剂中的PC3。
图2：SAIB:x-SAIB:EtOH 70:10:20中的酞菁染料PC2的荧光自淬灭分析。(A)作为染料浓度的函数给出的PC2的荧光发射光谱。(B)作为PC2染料浓度的函数给出的(A)中获得的PC2的归一化最大荧光强度。通过768nm下的激发来记录发射光谱三次。(C)在使用(+EtOH)和不使用EtOH(-EtOH)的情况下记录的一系列不同PC2染料浓度的表面荧光强度图像。(D)作为PC2染料浓度的函数给出的从(C)获得的PC2的归一化表面荧光强度。通过使用ImageJ进行强度分析来获得表面荧光图像强度。
图3：PC2染料从SAIB:xSAIB:EtOH 70:10:20制剂的体外释放率。在注射到缓冲液中之后第6天，PBS释放介质中的PC2的紫外可见光谱(进行三次)。包括与10％释放率相对应的标准品以供参考。几乎没有PC2染料在6天的时间范围内释放。
图4：通过紫外可见光和荧光来研究的SAIB:xSAIB:EtOH 70:10:20中的PC2染料的铜致淬灭。(A)作为Cu/PC2比率的函数给出的PC2的归一化吸收光谱。(B)作为Cu/PC2比率的函数给出的PC2的归一化荧光强度。
图5：在配制于SAIB:xSAIB:EtOH 70:10:20或LOIB:xSAIB:EtOH:D&Cv2 70:10:20:0.1中时SSIB-Cy7.5的荧光发射。(A)对于不同SSIB-Cy7.5染料浓度而言SAIB:xSAIB:EtOH70:10:20标记物制剂中的SSIB-Cy7.5的荧光发射。(B)LOIB:xSAIB:EtOH:D&Cv2:SSIB-Cy7.570:10:20:0.1:0.01的归一化吸光度和发射。
图6：从雄性大鼠的大腿和睾丸手术切除SSIB-Cy7.5 NIR标记物(LOIB:xSAIB:EtOH:D&Cv2:SSIB-Cy7.5 70:10:20:0.1:0.01)。从大鼠的右大腿的手术切除的RGB(A)和NIR(B)图像。大鼠的睾丸内的标记物的RGB(C)和NIR(D)图像(NIR相机积分时间40ms)。
图7：猪肺组织中的SSIB-Cy7.5标记物(LOIB:xSAIB:EtOH:D&Cv2:SSIB-Cy7.5 70:10:20:0.1:0.01)的注射。(A)打开的胸腔，(B)100μL SSIB-Cy7.5标记物在三个位置处的注射。(C)标记物位置和组织深度的RGB图像(左侧＝深，中间＝中等，右侧＝表层)。(D)这三个标记物的NIR图像(83ms积分时间)。虚线圆插入在C和D中以突出显示这三个标记物的位置。
图8：用64Cu放射性标记的SAIB:xSAIB:EtOH:PC2(70:10:20:0.01)的放射-TLC色谱图。(A)SAIB:xSAIB:EtOH标记物中的64Cu-PC2的络合物形成，得出Rf＝0.9-1.0。(B)不包含PC2的SAIB:xSAIB:EtOH标记物的放射性标记的对照实验，得出Rf＝0。
图9：包含PC2染料的64Cu放射性标记的SAIB:xSAIB:EtOH 70:10:20标记物制剂的转移效率和体外释放率。(A)作为PC2染料浓度的函数给出的64Cu放射性标记的SAIB:xSAIB:EtOH 70:10:20标记物制剂的转移效率。(B)对于包含不同PC2染料浓度的SAIB:xSAIB:EtOH70:10:20标记物制剂而言作为时间的函数给出的64Cu进入TRIS缓冲的含EDTA脂质体的介质中的体外释放率。所有实验均进行三次，并且结果报告为平均值±SEM。
图10：64Cu的生物分布、标记物体积和标记物荧光强度随注射后时间的变化。(A)基于PET得出的标记物、肝、心脏和膀胱中的64Cu的生物分布。(B)作为时间的函数给出的标记物体积。(C)作为施用后时间的函数给出的从标记物发射的总NIR荧光强度。(D)基于器官孔计数数据得出的注射后48小时的64Cu的生物分布。
图11：皮下注射了64Cu放射性标记的SAIB:xSAIB:EtOH:PC270:10:20:0.01标记物制剂的一只小鼠的代表性图像。在注射后1小时、24小时和48小时示出冠状PET和CT图像，而FLI图像示出注射后1小时、24小时、48小时、2周、3周和4周的PC2的NIR荧光。
图12：(A)皮下注射了64Cu(8HQ)放射性标记的LOIB:xSAIB:EtOH:D&Cv2:SSIB-Cy7.5 70:10:20:0.1:0.01标记物的小鼠的PET/CT/FLI/NIR图像，以及64Cu生物分布、NIR荧光强度和标记物体积的对应变化。(B)作为时间的函数的标记物、肝和肾中的64Cu生物分布。(C)在注射后18小时和44小时之后在标记物的NIR荧光中记录的总通量。(D)作为注射后时间的函数给出的标记物的相对体积变化。
图13：作为时间的函数给出的皮下注射了50μL 125I-放射性标记的LOIB:xSAIB:EtOH:D&Cv2:SSIB-Cy7.5标记物制剂的一只小鼠的代表性SPECT/CT和FLI/X射线图像。在注射后10分钟、1周、2周和3周对小鼠进行扫描和成像。
具体实施方式
本公开涉及一种包含荧光染料诸如NIR造影剂的溶液，其中该溶液在水性条件下诸如在体内凝固而形成例如凝胶、玻璃、半固体、固体、晶体或它们的任何混合物，从而该溶液提供荧光染料在所定义的位置处例如在肿瘤的部位处的沉积。
本公开的溶液还可用作基准标记物，用于体内成像并用于外科手术期间的引导。
定义
如本文所用，术语“溶液”是指包含本发明的组分的液体组合物。在一个实施方案中，所有组分溶解于所述液体组合物中。在另一个实施方案中，一些或所有组分分散在所述液体组合物中，以便形成胶态分散体。术语“溶液”和“分散体”可在本文中互换使用。
如本文所用，术语“溶液的凝固”是指溶液从流体形式变为凝胶形式、半固体形式、固体形式、晶体形式或它们的任何组合的物理特性的变化。本公开的溶液呈流体形式直到经受水性条件诸如体内条件，此时有机溶剂扩散到周围环境中，引起溶液的凝固而形成凝胶、半固体、固体、晶体或它们的任何组合。换句话说，在水性条件下“溶液凝固”而形成凝胶、半固体、固体、晶体或它们的任何组合。因此，当提及“凝固的溶液”时，其是指溶液在水性条件下形成的凝胶、半固体、固体、晶体或它们的任何组合。类似地，当提及凝胶、凝胶混合物、半固体、固体、晶体或它们的任何组合时，其是指本发明的溶液经受水性条件而产生的组合物或贮库。因此“凝固的溶液的形式”可为凝胶、半固体、固体、晶体或它们的任何组合。术语“凝固的溶液”、“凝胶”和“贮库”可在本文中互换使用。
如本文所用，术语“logP”是指给定化合物在水相和1-辛醇相之间的分配系数。LogP作为给定化合物在水相和1-辛醇相中的浓度的比率的对数给出。LogP是化合物在这两个相中的溶解度的差异的量度。正logP值通常是疏水性化合物的特征，而负logP值指示亲水性化合物。
如本文所用，术语“水性条件”是指主要包含水的溶液和/或条件。水性条件可为体外条件，诸如缓冲体系。另选地，水性条件可处于人类或动物组织内，也称为体内条件，诸如在肿瘤部位处。
术语“包含”应以包含性的方式理解。从而，作为示例，包含化合物X的组合物可包含化合物X和任选附加化合物。
术语“福斯特共振能量转移(FRET)”，也称为荧光共振能量转移(FRET)、共振能量转移(RET)或电子能量转移(EET)，其是指描述两个光敏分子(发色团)之间的能量转移的机制。最初处于其电子激发态的供体发色团可通过非辐射偶极-偶极耦合将能量转移到受体发色团。该能量转移的效率与供体和受体之间的距离的六次方成反比，从而使FRET对距离的微小变化极其敏感。
溶液
本公开涉及一种溶液，该溶液包含非水溶性碳水化合物、荧光染料和有机溶剂。在水性条件下，有机溶剂扩散到周围环境中，使得溶液凝固而形成例如凝胶、玻璃、半固体、固体、晶体或它们的任何组合。
因此，在一个实施方案中，本公开涉及一种溶液，该溶液包含：
a.非水溶性碳水化合物，
b.荧光染料，和
c.具有-2至2范围内的logP的有机溶剂。
溶液有时在本文中称为“标记物”。
溶液被设计成控制荧光染料在溶液和/或凝固的溶液中的扩散速率。更优选地，溶液被设计成控制荧光染料从溶液和/或凝固的溶液向外的扩散速率。通过控制所述扩散速率，能控制荧光染料从溶液和/或凝固的溶液的释放或保留。这允许设计在水性条件下提供荧光染料的控制释放或荧光染料的保留的溶液。
可通过感兴趣部位处的注射来执行本公开的溶液的施用。因此，在一个实施方案中，本公开的溶液可通过注射针来注射。本公开的溶液可为粘稠溶液。因此，在一个实施方案中，溶液的粘度在1cP-1000cP的范围内，例如在1cP-750cP的范围内，诸如在1cP-500cP的范围内，例如在1-250的范围内，诸如在1-100的范围内，例如在100cP-1000cP的范围内，诸如在100cP-500cP的范围内。
溶液的非水溶性碳水化合物提供在水性条件下凝固的溶液的特性。可通过所述非水溶性碳水化合物的性质来控制溶液和凝固的溶液的疏水性和粘度，从而控制荧光染料的扩散速率。
本公开的凝固的溶液通常在体内在3-12个月内降解。本公开的溶液的非水溶性碳水化合物是生物相容性化合物，其在降解或水解后形成在组织、器官等中耐受性良好的糖。
在一个方面，溶液的荧光染料具有高于2的logP。与具有低LogP的荧光染料相比，具有高LogP的荧光染料可能不易从沉积的溶液向外扩散到水相中。荧光染料的疏水性确保荧光染料在溶液中的扩散速率较低和/或其对水相的亲和力较低，从而荧光染料保留在沉积的溶液中。从而荧光染料保留在施用的部位处，这允许基准标记物的精准定位。
在第二方面，溶液的荧光染料共价地缀合至聚乙二醇(PEG)并且具有高于2000的分子量。PEG的亲水性质提供了荧光染料从溶液的释放，之后当向有此需要的个体施用时，荧光染料-PEG缀合物可进入淋巴系统并且积聚在淋巴结中。
溶液的溶剂用于溶解非水溶性碳水化合物和荧光染料。溶剂应具有如下特性：a)能够溶解溶液的组分以及b)在水性条件下从溶液扩散到周围环境中。
在一个实施方案中，有机溶剂的量在1％至30％的范围内，例如1％至20％，诸如1％至15％，例如1％至10％，诸如5％至10％。
本公开的溶液在一个实施方案中还可包含另外一种溶剂，其在本文中也称为助溶剂，诸如甘油单酯、甘油二酯和/或甘油三酯。
因此，在一个实施方案中，本公开涉及一种溶液，该溶液包含：
a.非水溶性碳水化合物，
b.荧光染料，
c.具有-2至2范围内的logP的有机溶剂，以及
d.另外一种溶剂，诸如甘油单酯、甘油二酯和/或甘油三酯。
在一个实施方案中，另外一种溶剂的量在0至50％的范围内，诸如在0至40％的范围内，例如在0至30％的范围内，诸如在0至20％的范围内，例如在0至10％的范围内。
本公开的溶液还可包含成像剂。一旦沉积在例如体内，此类成像剂就允许通过除溶液的NIR之外的成像模式来可视化。
因此，在一个实施方案中，本公开涉及一种溶液，该溶液包含：
a.非水溶性碳水化合物，
b.荧光染料，
c.具有-2至2范围内的logP的有机溶剂，以及
d.成像剂。
在单独实施方案中，本公开涉及一种溶液，该溶液包含：
a.非水溶性碳水化合物，
b.荧光染料，
c.具有-2至2范围内的logP的有机溶剂，
d.另外一种溶剂，诸如甘油单酯、甘油二酯和/或甘油三酯，以及
e.成像剂。
在一个实施方案中，本公开涉及一种溶液，该溶液包含：
a.40-60重量/重量％范围内的根据式(II)的非水溶性碳水化合物，
b.0,001-1重量/重量％范围内的配位至Cu-64的2,11,20,29-四叔丁基-2,3-萘酞菁，
c.15-25重量/重量％范围内的乙醇，以及
d.20-40重量/重量％范围内的根据式(III)的成像剂。
在一个实施方案中，本公开涉及一种提供所述荧光染料的控制释放的溶液。
在单独实施方案中，本公开涉及一种提供所述荧光染料的保留的溶液。
非水溶性碳水化合物
溶液的非水溶性碳水化合物提供在水性条件下凝固的溶液的特性。可通过所述非水溶性碳水化合物的性质来控制溶液和凝固的溶液的疏水性和粘度，从而控制荧光染料的扩散速率。此外，可通过改变溶液的非水溶性碳水化合物来改变凝固的溶液的形式。
如本文所用，术语“非水溶性碳水化合物”是指这样的碳水化合物，其logP在2-20的范围内，诸如在2-15的范围内，例如在2-10的范围内，诸如在2-5的范围内，例如在4-20的范围内，诸如在4-15的范围内，例如在4-10的范围内。非水溶性碳水化合物可为任何单糖、二糖、三糖或低聚糖。
在一个实施方案中，非水溶性碳水化合物选自单糖、二糖、三糖和低聚糖。
如本文所用，术语“低聚糖”是指包含至多10个单糖单元，诸如至多9个单糖单元，例如至多8个单糖单元，诸如至多7个单糖单元，例如至多6个单糖单元，诸如至多5个单糖单元，例如至多4个单糖单元的糖聚合物。低聚糖可为直链或支链的。
在一个实施方案中，非水溶性碳水化合物是选自以下的单糖：葡萄糖胺、半乳糖胺、甘露糖胺、甘露糖、鼠李糖、鼠李糖胺、半乳糖、阿洛糖、阿洛糖胺、阿卓糖、阿卓糖胺、古洛糖、古洛糖胺、艾杜糖、艾杜糖胺、塔罗糖和塔罗糖胺。
本公开的糖可呈L形式或D形式。此外，二糖、三糖和低聚糖的单糖单元可由α或β糖苷键连接，其中可存在任何比率的α、β异头混合物。
在一个实施方案中，非水溶性碳水化合物是选自以下的二糖：麦芽糖、海藻糖、乳糖、蔗糖、Galp-(1→2)-Glc、Galp-(1→3)-GlcN、Galp-(1→4)-Glc、Glcp-(1→4)-Glc、Glcp-(1→6)-Glc、Glcp-(1→2)-GlcN、Galp-(1→4)-ManN、Glcp-(1→4)-GalN、Manp-(1→3)-Glc、ManNp-(1→4)-Gal、GalNp-(1→3)-ManN、GlcNp-(1→6)-GalN、Rhamnp-(1→6)-Glc、Glcp-(1→1)-Glcp、Talp-(1→4)-Glu、Glup(1→3)-ldo、GlcNp-(1→4)-GlcN、GlcNp-(1→6)-GlcN。
在一个实施方案中，非水溶性碳水化合物是选自以下的二糖：麦芽糖、海藻糖、乳糖和蔗糖。
在一个实施方案中，非水溶性碳水化合物是选自以下的三糖：棉子糖、Galp-(1→2)-Glcp-(1→3)-Galp、Galp-(1→4)-Glcp-(1→6)-GlcN、Galp-(1→4)-Glcp-(1→6)-Gal、Glcp-(1→4)-Glcp-(1→4)-Glcp、Glcp-(1→6)-Glcp-(1→6)-Glc、Galp-(1→6)-Glcp(1→2)-Fruf、Glcp-(1→3)-Fruf-(2→1)-Glcp、Galp-(1→4)-ManNp-(1→3)-Glu、Glcp-(1→4)-GalN-(1→2)-Man、Manp-(1→3)-Glcp-(1→4)-GlcN、ManNp-(1→4)-Galp-(1→3)-Glc、GalNp-(1→3)-ManNp-(1→6)-GlcN。Rhamnp-(1→6)-Glcp-(1→4)-GlcN、Galp-(1→6)-Glcp-(1→1)-Glcp、Talp-(1→4)-Glup-(1→2)-Man、Glup(1→3)-ldop-(1→6)-Glu、GlcNp-(1→6)-GlcNp(1→4)-GlcN。
在一个实施方案中，非水溶性碳水化合物是棉子糖。
在一个实施方案中，非水溶性碳水化合物是选自以下的低聚糖：Galp-(1→4)-Glcp-(1→6)-glcp-(1→4)-Glc、Galp-(1→4)-Glcp-(1→4)-Glcp-(1→4)-Glcp-(1→4)-Glc、Galp-(1→4)-Glcp-(1→4)-Galp-(1→4)-Glc、Glcp-(1→4)-Glcp-(1→4)-Glcp-(1→4)-Glc、Galp-(1→6)-Glcp-(1→6)-Galp-(1→6)-Glc、Galp-(1→6)-Glcp-(1→6)-Galp-(1→4)-Glc、Galp-(1→6)-Glcp-(1→6)-Glcp-(1→4)-Glc、GlcNp-(1→4)-GlcNp-(1→6)-GlcNp-(1→4)-GlcN、GlcNp-(1→6)-Galp-(1→6)-Glcp-(1→2)-Fruf、Galp-(1→4)-Glcp-(1→3)-Fruf-(2→1)-Glcp、Talp-(1→4)-Glup-(1→2)-Man-(1-3)-Glu、Glup(1→3)-ldop-(1→6)-Glup-(1→2)-Gal、醋酸纤维素、醋酸丁酸纤维素和醋酸丙酸纤维素。
在一个实施方案中，非水溶性碳水化合物包含被官能化而形成酯的一个或多个羟基。可通过碳水化合物的羟基与烷酰基的羰基之间的键合来形成此类酯。
在一个实施方案中，非水溶性碳水化合物包含被官能化而形成C2-C7酯的一个或多个羟基。
如本文所用，术语“Cn-Cm酯”是指通过醇与包含n至m个碳原子的烷酰基之间的键合来形成的酯官能团。例如，C2-C7酯是通过醇与C2-C7烷酰基的羰基之间的键合来形成的酯官能团，烷酰基包含2至7个碳原子。
因此，在一个实施方案中，非水溶性碳水化合物包含被官能化而形成酯的一个或多个羟基，其中通过碳水化合物的羟基与烷酰基的羰基之间的键合来形成所述酯。
在一个实施方案中，被官能化而形成酯的非水溶性碳水化合物的羟基的数量为n、n-1、n-2、n-3、n-4或n-5，其中n为碳水化合物的羟基的总数。
在一个实施方案中，非水溶性碳水化合物的所有羟基被官能化而形成酯。
在一个实施方案中，非水溶性碳水化合物的酯是C2-C10酯，诸如C2-C9酯，例如C2-C8酯，诸如C2-C7酯，例如C2-C6酯，诸如C2-C5酯，例如C2-C4酯，诸如C2-C3酯。
在一个实施方案中，非水溶性碳水化合物的酯是C2-C7酯。
在一个实施方案中，烷酰基选自乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、戊酰基、己酰基、庚酰基和苯甲酰基。
在一个实施方案中，烷酰基选自乙酰基、丙酰基、异丁酰基和苯甲酰基。
在一个实施方案中，非水溶性碳水化合物选自麦芽糖八异丁酸酯(MOIB)、蔗糖二乙酸六异丁酸酯(SAIB)、蔗糖八异丁酸酯(SOIB)、乳糖八异丁酸酯(LOIB)、海藻糖八异丁酸酯(TOIB)。
在一个实施方案中，非水溶性碳水化合物选自蔗糖二乙酸六异丁酸酯(SAIB)和乳糖八异丁酸酯(LOIB)。
非水溶性碳水化合物可为不同非水溶性碳水化合物的混合物。在实施方案中，非水溶性碳水化合物是乳糖八异丁酸酯和乳糖八苯甲酸酯的混合物、或乳糖八异丁酸酯和蔗糖八苯甲酸酯的混合物。
在一个实施方案中，非水溶性碳水化合物具有根据式(I)的结构，
Figure BDA0002841420130000141
在一个实施方案中，非水溶性碳水化合物具有根据式(II)的结构，
Figure BDA0002841420130000142
在一个实施方案中，非水溶性碳水化合物是棉子糖十一异丁酸酯。
荧光染料
在一个实施方案中，荧光染料选自罗丹明、BODIPY、Alexa Fluor、NBD、花青染料(Cy3)和羧基-荧光素。
在一个实施方案中，荧光染料是NIR造影剂。
常规和近红外(NIR)荧光团通常由高度缀合的分子构成，其特征在于具有疏水性(logP>0)，除非通过掺入带电残基和/或亲水性聚合物诸如PEG来对其进行化学改性而可溶于水溶液。此类染料的疏水特性确保了与本公开的疏水性溶液的良好相容性并且实现了溶液和/或凝固的溶液中的高保留率。此类荧光团通过由不同大小的斯托克斯位移隔开的激发和发射光谱来表征。常规荧光团在可见光谱(200nm-700nm)范围内发射光子，NIR-1荧光团在700nm-900nm范围内发射光子，而NIR-II荧光团在高于900nm的范围内发射光子。然而，光子的组织吸收和散射在可见光谱范围(低于600nm)内较高，因此从常规荧光团发射的荧光高度衰减。在高于600nm下，组织吸光度高度降低，并且所发射的光子的散射随着光子波长而逐渐降低。因此在NIR-I和NIR-II区域内发射光的荧光团在数厘米的组织深度处可见，即激发和发射的光子可穿过数厘米的组织，这允许在外科手术期间使用器官内的NIR相机来鉴别NIR标记的标记物。NIR-I和NIR-II光谱区域中来自组织的较低水平的自体荧光也改善了信噪比，从而实现了组织中的此类染料的更佳可检测性。NIR-II染料经历组织中的光子散射的最大减少，从而实现更大组织深度处的可视化以及更聚焦(更少分散)的荧光信号的采集，这是使用基准标记物进行外科成像的主要优点。
在一个实施方案中，可在溶液中掺入两种或多种染料，从而可允许FRET(福斯特共振能量转移)。多个荧光团的此类包含可用于引发激发光和发射光之间的更大位移。
用作生物分子缀合用标记试剂的当前有机荧光团在光稳定性方面具有限制。这会影响它们在需要光稳定荧光报告基团的应用中的性能。例如，在分子成像和单分子显微镜法中，光稳定荧光标记对于在延长时间段内观察和跟踪单独分子事件很重要。在本公开中，高浓度的染料可嵌入在溶液中，这规避了光漂白问题。
此外，保证了嵌入的染料的更高光稳定性，因为这实现了长时间成像，即使在重复暴露/NIR成像之后或在暴露于其他光源时，也能确保溶液作为NIR标记物的性能的再现性。改善的贮存稳定性是更高光稳定性的又一个结果。酞菁和萘酞菁及卟啉染料是用于嵌入在溶液中的最佳疏水性NIR染料，并且与传统有机染料相比，表现出极大的光稳定性。这些染料是当前近IR荧光团例如Alexa
Figure BDA0002841420130000151
680、Cy 5.5、Cy 7和IRDyeTM 800CW染料的光稳定性的约40至125倍；并且是四甲基罗丹明(TMR)(光稳定性最大的有机染料之一)的光稳定性的约20倍。
在一个实施方案中，NIR造影剂是NIR-I造影剂。
在一个实施方案中，NIR造影剂是NIR-II造影剂。
在一个实施方案中，NIR造影剂选自吲哚菁绿(ICG)、亚甲基蓝(MB)、CH1055、IRDye800CW、非磺化和磺化花青染料(Cy5、Cy5.5、Cy7、Cy7.5)、两性离子花青染料(ZW800-1)、膦酸化花青染料(Pam78、P800SO3)、季铵花青染料(C700-OMe、C800-OMe)、BODIPY染料(mPB、BAP-5)、Alexa Fluor染料(Alexa Fluor 702、Alexa Fluor 749和Alexa Fluor790)。
在一个实施方案中，NIR造影剂是选自以下的花青染料：花青7.5-炔烃、花青7.5-胺、花青7.5-叠氮化物、花青7.5-羧酸、花青7.5-酰肼、花青7.5-马来酰亚胺、花青7.5-NHS酯、花青7.5-四嗪、花青7炔烃、花青7-胺、花青7-叠氮化物、花青7-羧酸、花青7-酰肼、花青7-马来酰亚胺、花青7-NHS酯、花青7-四嗪、Cy5-炔烃和Cy5.5-炔烃。
在一个实施方案中，NIR造影剂是选自以下的花青染料：花青7.5-炔烃、花青7.5-胺、花青7.5-叠氮化物、花青7.5-羧酸、花青7.5-酰肼、花青7.5-马来酰亚胺、花青7.5-NHS酯和花青7.5-四嗪。
在一个实施方案中，NIR造影剂是选自以下的花青染料：花青7炔烃、花青7-胺、花青7-叠氮化物、花青7-羧酸、花青7-酰肼、花青7-马来酰亚胺、花青7-NHS酯和花青7-四嗪。
在一个实施方案中，NIR造影剂是选自以下的花青染料：Cy5-炔烃、Cy5.5-炔烃、Cy7-炔烃和Cy7.5-炔烃。
在一个实施方案中，NIR造影剂选自卟啉、酞菁和萘酞菁。
在一个实施方案中，NIR造影剂选自2,3,7,8,12,13,17,18-八乙基-21H,23H-卟吩、5,10,15,20-四苯基-21H,23H-卟吩、2,9,16,23-四叔丁基-29H,31H-酞菁、1,4,8,11,15,18,22,25-八丁氧基-29H,31H-酞菁、2,3,9,10,16,17,23,24-八(辛氧基)-29H,31H-酞菁、2,11,20,29-四叔丁基-2,3-萘酞菁、5,9,14,18,23,27,32,36-八丁氧基-2,3-萘酞菁和蒽菁(Antracocyanine)。
在一个实施方案中，NIR造影剂选自2,9,16,23-四叔丁基-29H,31H-酞菁、1,4,8,11,15,18,22,25-八丁氧基-29H,31H-酞菁、2,3,9,10,16,17,23,24-八(辛氧基)-29H,31H-酞菁和2,11,20,29-四叔丁基-2,3-萘酞菁、5,9,14,18,23,27,32,36-八丁氧基-2,3-萘酞菁。
在一个实施方案中，NIR造影剂选自IFP1.4、IFP2.0、iRFP713和miRFP703。
在一个实施方案中，NIR造影剂选自IR-780、IR-792、IR-895、IR-140、IR-26/27、IR-1048、IR-1061、NIR-II荧光团-H1(3,6-双[5-{7-氨基-9,9-双-[2-(2-三甲基硅烷基-乙氧羰基)-乙基]-9H-芴-2-基}-噻吩-2-基]苯并[1,2-c；4,5-c']双[1,2,5]噻二唑)、1,4,8,11,15,18,22,25-八丁氧基-29H,31H-酞菁和5,9,14,18,23,27,32,36-八丁氧基-2,3-萘酞菁。
在一个实施方案中，NIR造影剂选自IR-780、IR-792、IR-895、IR-140、IR-26/27、IR-1048和IR-1061。
在一个实施方案中，NIR造影剂选自NIR-II荧光团-H1、1,4,8,11,15,18,22,25-八丁氧基-29H,31H-酞菁和5,9,14,18,23,27,32,36-八丁氧基-2,3-萘酞菁。
在一个实施方案中，NIR造影剂配位至金属。NIR造影剂与金属的此类配位可有利于NIR造影剂的激发和发射波长的微调。配位至金属的NIR造影剂的示例包括但不限于：酞菁铅(II)、酞菁锰(II)、酞菁Cu(II)、酞菁钴(II)、酞菁氯化铝(III)、酞菁氯化镓(III)、酞菁氯化铟(III)、酞菁氯化铁(III)、酞菁氯化锰(III)、酞菁镍(II)、氧钛酞菁、酞菁二氯化钛(IV)、酞菁锌(II)。3,10,17,24-四叔丁基-1,8,15,22-四(二甲氨基)-29H,31H-酞菁氧钒、2,3-萘酞菁氧钒、2,3-萘酞菁钴(II)、2,3-萘酞菁铜(II)、5,9,14,18,23,27,32,36-八丁氧基-2,3-萘酞菁铜(II)、5,9,14,18,23,27,32,36-八丁氧基-2,3-萘酞菁镍(II)、2,3-萘酞菁二氯化锡(IV)和2,11,20,29-四叔丁基-2,3-萘酞菁氧钒。
因此在一个实施方案中，NIR造影剂选自酞菁铅(II)、酞菁锰(II)、酞菁Cu(II)、酞菁钴(II)、酞菁氯化铝(III)、酞菁氯化镓(III)、酞菁氯化铟(III)、酞菁氯化铁(III)、酞菁氯化锰(III)、酞菁镍(II)、氧钛酞菁、酞菁二氯化钛(IV)、酞菁锌(II)和3,10,17,24-四叔丁基-1,8,15,22-四(二甲氨基)-29H,31H-酞菁氧钒。
在单独实施方案中，NIR造影剂选自2,3-萘酞菁氧钒、2,3-萘酞菁钴(II)、2,3-萘酞菁铜(II)、5,9,14,18,23,27,32,36-八丁氧基-2,3-萘酞菁铜(II)、5,9,14,18,23,27,32,36-八丁氧基-2,3-萘酞菁镍(II)、2,3-萘酞菁二氯化锡(IV)和2,11,20,29-四叔丁基-2,3-萘酞菁氧钒。
根据本公开的溶液基于与不同疏水性的溶剂混合的非水溶性碳水化合物。在将溶液施用到例如肿瘤的部位后，溶液的溶剂扩散到周围环境中，使得溶液粘度增加并最终使溶液凝固而形成例如凝胶、玻璃、半固体、固体、晶体或它们的任何混合物，从而提供溶液内容物的动力学陷阱。从而溶液及其内容物(例如可能与放射性核素配位的荧光染料)保留在施用的部位处。为了使荧光团染料有效地陷入动力学陷阱，溶液必须凝固，由此其粘度从100cP-1000cP增加到100000cP-1000000cP或更高以实现固体贮库。根据斯托克斯-爱因斯坦关系，粘度的这种1000倍增加引起溶液中的扩散速率的1000倍降低，从而阻碍染料逃离粘稠溶液。同样，增加扩散染料的分子横截面额外降低了染料的迁移率，从而减少了染料从溶液的浸出。表1中给出了具有增加分子横截面的染料的示例，该表中呈现了具有增加分子量的所选择的染料。为了降低扩散速率而增加分子横截面的另选策略依赖于更小染料与更大构建体(例如聚合物，诸如PNIPAM的PLA)的缀合。
因此，在一个实施方案中，荧光染料缀合至选自以下的聚合物：PNIPAM、醋酸丁酸纤维素、醋酸纤维素、全氟碳化物、泊洛沙姆普兰尼克、聚乙二醇(PEG)、聚乳酸(PLA)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚(L-丙交酯)(PLA)、聚(乙交酯)(PGA)、聚(DL-丙交酯)(DLPLA)、聚(二氧环己酮)(PDO)、聚(DL-丙交酯-共-L-丙交酯)(LDLPLA)、聚(DL-丙交酯-共-乙交酯)(DLPLG)、聚(乙交酯-共-三亚甲基碳酸酯)PGA-TMC、聚(L-丙交酯-共-乙交酯)(LPLG)或聚(己内酯)(PCL)。
另选地，荧光染料可缀合至非水溶性碳水化合物。非水溶性碳水化合物可为如本文其他地方所定义的任何非水溶性碳水化合物。在一个实施方案中，荧光染料缀合至选自以下的非水溶性碳水化合物：SAIB、SSIB、LOIB、三糖、低聚糖和纤维素。在一个实施方案中，荧光染料缀合至选自以下的非水溶性碳水化合物：SAIB、SSIB、LOIB、三糖、低聚糖和纤维素。在一个实施方案中，荧光染料Cy7.5缀合至非水溶性碳水化合物SSIB。
在注射溶液之后，在溶液完全凝固(5至6小时)且动力学陷阱有效之前，可通过选择对溶液具有高亲和力并且对水性介质具有最小亲和力的染料来使溶液成分(染料、放射性核素等)在溶液中达到热力学上稳定，从而防止泄漏。对溶液具有高亲和力的染料具有高于4，诸如高于8，例如高于12的logP值，这增强了溶液和染料的疏水相互作用，并且另外最大程度降低了染料在水性介质中的溶解度。
在一个实施方案中，荧光染料具有高于2，诸如高于3，例如高于4，诸如高于5，例如高于6，诸如高于8，例如高于10，诸如高于15的logP。
慢扩散荧光染料
量子点(Qdot)是可因如下原因而在本公开的溶液中陷入动力学陷阱的颗粒：其大小和/或用诸如PNIPAM之类的聚合物的表面功能化以确保对溶液的亲和力和/或因聚合物缠结引起的受阻扩散。量子点以变体的形式存在，同时覆盖了NIR-I和NIR-II光学范围。
此外量子点是规避与有机荧光团的使用相关联的淬灭的一些问题的任选解决方案，量子点已作为另选生物标记而出现。量子点标记的一个独特特性是易于通过改变颗粒的大小或化学组成来调谐发射波长。与常规有机染料相比，量子点具有：a)更长荧光寿命(>10ns)；b)更加尖锐、良好分离的发射峰；c)单个紫外或可见光光源即能有效激发；以及d)明亮的荧光。最重要地，量子点表现出显著的光稳定性，而这是有机染料的最大局限性。定量测量结果指示量子点抗光漂白的稳定性是罗丹明6G的约100倍。在发生光漂白之前单个量子点发射的光子的总数估计比典型有机染料分子高一至两个数量级。
利用本公开中提出的溶液所构成的动力学陷阱的另一种另选策略是使用与更小染料诸如花青染料Cy5、Cy7.5等相比具有增加的横截面积的颗粒或棒。此类颗粒由于阻力增加而在粘性介质中具有降低的扩散速率。此类实施方案的示例是被荧光染料诸如花青染料官能化的1μm-1000μm大小的金属或聚合物纳米颗粒。低亲和力染料可另选地被截留在此类颗粒内以便改善溶液中的保留。
而另选策略是利用固有荧光颗粒或棒诸如量子点或碳纳米管。量子点和碳纳米管均具有高量子产率并且跨越从NIR-I至NIR-II(即500nm-1600nm)的光学范围。
因此在一个实施方案中，如本文所述的溶液的荧光染料选自量子点、纳米颗粒和碳纳米管。
在一个实施方案中，荧光染料是选自以下的量子点：CdTe、CdHgTe CdTe/ZnS、CdTe/CdSe、CdSeTe/CdS、CdTe/CdS/ZnS、PbS、PbS/CdS、PbS/CdS/ZnS、InAs/ZnS、InAs/ZnSe、InAs/InP/ZnSe、InAsxP1-x/InP/ZnSe、CuInS2/ZnS、(CuInSexS2-x)/ZnS、Ag2S Ag2Se和Si。
在一个实施方案中，荧光染料是选自以下的稀土纳米颗粒：NaYF4:Er,Ho,Tm,Pr(主体：掺杂剂)；NaGdF4:Nd,Yb,Tm；SrF2:Nd LaF3:Nd；LiYF4:Nd NaY0.78Yb0.2Er0.02F4。
在一个实施方案中，荧光染料是选自以下的金属纳米簇：Au、Ag或Cu纳米簇。
在一个实施方案中，荧光染料是碳纳米管，诸如单壁碳纳米管。
有机溶剂
本公开的溶液的有机溶剂起到溶解溶液的组分的作用，例如溶解非水溶性碳水化合物和荧光染料。当荧光染料以颗粒的形式提供时，溶剂分散这些颗粒。此外，有机溶剂应与水具有一些混溶性，从而具有在溶液与水相之间分配的倾向。
因此，在一个实施方案中，有机溶剂的logP在-2至2的范围内，例如在-1.8至1.8的范围内，诸如在-1.5至1.5的范围内，例如在-1至1的范围内，诸如在-2至1的范围内，例如在-1.5至1的范围内，例如在-1至2的范围内，诸如在-1至1.5的范围内。
在一个实施方案中，有机溶剂是醇。
在一个实施方案中，有机溶剂是C1-C7醇，诸如C1-C6醇，例如C1-C5醇，诸如C1-C4醇。
如本文所用，术语Cn-Cm醇是指具有n至m个碳原子的醇。例如，术语C1-C4醇是指具有1至4个碳原子的醇。
在一个实施方案中，有机溶剂选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、异丁醇、叔丁醇、苯甲醇、碳酸丙烯酯和二甲亚砜。
在一个实施方案中，有机溶剂选自乙醇、苯甲醇、碳酸丙烯酯和二甲亚砜。
在一个实施方案中，本公开的溶液中的有机溶剂的量在1％至30％的范围内，例如1％至20％，诸如1％至15％，例如1％至10％，诸如5％至10％。
另外的溶剂
本公开的溶液可包含另外的溶剂。另外的溶剂也称为助溶剂，如本文所述。另外的溶剂可包括但不限于甘油单酯、甘油二酯和/或甘油三酯。
在溶液中包含另外的溶剂可提供用于调谐荧光染料的释放速率的方式。在一个实施方案中，增加量的另外的溶剂引起荧光染料从溶液和/或凝固的溶液的增加释放。
在一个实施方案中，另外的溶剂是选自以下的甘油三酯：三癸酸甘油酯(GTD)、三辛酸甘油酯(GTO)和三己酸甘油酯(GTH)。
在一个实施方案中，另外一种溶剂的量在0至50％的范围内，诸如在0至40％的范围内，例如在0至30％的范围内，诸如在0至20％的范围内，例如在0至10％的范围内。
成像模式
本公开的一些实施方案包含作为螯合剂的荧光染料，诸如NIR造影剂。此类染料是多功能的，因为它们允许使用例如NIR荧光设备使溶液可视化，但另外实现了放射性核素的络合。此类溶液不仅可为NIR相机可见的，而且通过经由疏水性NIR-螯合剂将放射性核素嵌入在溶液中，也可在PET或SPECT图像中可见。此类NIR-螯合剂的示例是萘酞菁和酞菁衍生染料、卟啉衍生染料诸如德克萨卟啉(texaphyrin)。
在金属阳离子螯合后，NIR-螯合剂染料的光谱特性改变，这可用于修改基准标记物的光学特性，或用于在注射后检测存在于组织中的特殊阳离子。
通过NIR和PET成像均可见的此类溶液的应用允许外科医生例如在外科手术之前在注射后经由PET使基准标记物可视化，并且在外科手术披露期间使用NIR相机来鉴别基准标记物。其他放射性核素类型的掺入进一步允许外科手术期间的SPECT成像或手持式γ探针引导。此类溶液的应用允许外科医生使用γ探针定位更大组织深度处的基准标记物并且仍使用NIR成像来使中间组织深度处的基准标记物可视化。
另外，不透射线造影剂诸如碘化碳水化合物酯、碘化聚合物或金纳米颗粒还可包含在溶液中，从而允许外科手术期间的CT成像或荧光透视引导。此外，本公开的溶液因材料的固有低水含量而在磁共振成像(MRI)中可见，并且因与组织相比更高的粘度和/或延展性而通过超声(US)可见。
充当在NIR/PET/SPECT/CT/MRI和US中可见的多模态基准标记物的本公开的溶液是非常有必要的，因为其在用作若干图像模式中的公共参考点时提供桥接/对准这些图像模式的可能性。此外，本公开的溶液易于注射，可在注射/植入期间通过US或荧光透视来实时跟踪，之后使外科医生能够在外科手术期间在大组织深度处使用γ探针检测器或在浅至中等组织深度处使用NIR成像来鉴别/定位难以到达的靶标。还可在外科手术中利用此类标记物的PET和SPECT成像，要么用于验证标记物实际标记了坏死组织/病变的位置，要么用于实时SPECT引导外科手术。
因此，在一个实施方案中，溶液包含另外的成像剂。
成像模式包括但不限于X射线成像、CT成像、MRI、PET成像、单光子发射计算机断层扫描(SPECT)成像、核素闪烁成像、超声扫描成像和/或超声成像。
在一个实施方案中，另外的成像剂选自X射线剂、CT剂、MRI剂、PET剂和SPECT剂。
在一个实施方案中，荧光染料配位至放射性核素。
在一个实施方案中，放射性核素选自Tc-99m、In-111、Ga-67、Lu-177、Tl-201、Sn-117m、Cu-64、Mn-52、Zr-89、Co-55、Sc-44、Ti-45、Sc-43、Cu-61、As-72、Te-152、F-18、Ga-68、C-11、Nd-140和Te-149。
在一个实施方案中，放射性核素选自Tc-99m、In-111、Ga-67、Lu-177、Tl-201和Sn-117m。
在一个实施方案中，放射性核素选自Cu-64、Mn-52、Zr-89、Co-55、Sc-44、Ti-45、Sc-43、Cu-61、As-72和Te-152。
在一个实施方案中，放射性核素选自Cu-67、Cu-64、Mn-52、Zr-89、Co-55、Sc-44、Ti-45、Sc-43、Cu-61、As-72和Te-152。
在一个实施方案中，溶液可因溶液中的相关放射性核素例如Tc-99m、In-111、Ga-67、Lu-177、Tl-201、Sn-117m、Cu-64、Mn-52、Zr-89、Co-55、Sc-44、Ti-45、Sc-43、Cu-61、As-72、Te-152、F-18、Ga-68、C-11、Nd-140、Te-149的嵌入而提供PET成像和/或SPECT成像。
在一个实施方案中，溶液可包含放射性卤化非水溶性碳水化合物，诸如放射性碘化或放射性氟化非水溶性碳水化合物。因此在一个实施方案中，溶液可包含用131I、125I和/或18F标记的非水溶性碳水化合物。此类标记可允许通过PET和/或SPECT来使溶液可视化。
在一个实施方案中，另外的成像剂是X射线剂。X射线剂可包括一种或多种碘化聚合物、碘化低聚物、碘化脂质、碘化糖、碘化二糖、碘化多糖、碘化肽、或它们的衍生物或组合。优选的成像剂是碘化化合物诸如聚合物或糖分子，诸如葡萄糖或蔗糖的衍生物或二糖、三糖或低聚糖的衍生物。X射线剂可另选地为固体颗粒，该固体颗粒包含以下物质或由以下物质组成：一种或多种X射线成像剂，即能够阻挡或减弱X射线辐射的化合物。此类化合物包括过渡金属、稀土金属、碱金属、碱土金属、其他金属，如周期表所定义。
在一个实施方案中，X射线成像剂选自碘(I)、金(Au)、钯(Pd)、银(Ag)、铋(Bi)、钆(Gd)、铁(Fe)、钡(Ba)、钙(Ca)和镁(Mg)。
在一个实施方案中，另外的成像剂具有根据式(III)的结构，
Figure BDA0002841420130000231
在一个实施方案中，溶液包含掺杂到包含相同类别非碘化非水溶性碳水化合物的溶液中的非水溶性碳水化合物的碘化衍生物。
在一个实施方案中，溶液还可包含用于诸如MRI的成像模式的顺磁性化合物。
在一个实施方案中，溶液可因溶液的可忽略的水含量而提供具有负性造影的MRI成像。
在一个实施方案中，溶液可因与组织相比更高的粘度和/或延展性而在超声(US)上可见。
在另一个实施方案中，溶液还包含包封在脂质、聚合物或无机基颗粒中的一种或多种气体以用于超声扫描成像。所述气体可包括空气、卤化硫诸如六氟化硫或十氟化二硫；碳氟化合物，诸如全氟碳化物；氟化(例如，全氟化)酮，诸如全氟丙酮(periluoroacetone)；以及氟化(例如，全氟化)醚，诸如全氟二乙醚。
溶液的物理特性
本公开的溶液包含非水溶性碳水化合物和具有极性至非极性特性的溶剂，它们一起形成粘度在100cP-1000cP范围内的溶液或分散体。在本公开的一些实施方案中，非水溶性碳水化合物具有4-10范围内的logP值，而所使用的溶剂具有-2-2范围内的logP。当注射到水性介质或包含间质液的组织中时，溶液发生非溶剂致相分离(NIPS)，其中溶液的溶剂分配到周围水相中，从而引起非水溶性碳水化合物的沉淀和具有反映碳水化合物的材料特性的贮库的形成。在NIPS后，一些碳水化合物形成高粘性液体(100000-1000000cP)，例如SAIB，而其他碳水化合物形成脆性或韧性固体，例如麦芽糖八异丁酸酯、蔗糖八异丁酸酯、乳糖八异丁酸酯、海藻糖八异丁酸酯或棉子糖十一异丁酸酯。脆硬碳水化合物可被表征为无定形状态、结晶状态、玻璃状态或它们的混合物。此类实施方案的示例是这样的溶液，该溶液包含SAIB:EtOH 80:20、SAIB:xSAIB:EtOH 50:30:20、LOIB:EtOH 80:20或LOIB:xSAIB:EtOH 50:30:20，任选地包括其他碳水化合物、溶剂以及它们的变型形式。
在一个实施方案中，有机溶剂在水性条件下从溶液向外扩散，从而提供凝胶、玻璃、半固体、固体、晶体或它们的任何组合。
在一个实施方案中，溶液的粘度在水性条件下增加超过1000厘泊(cP)，诸如超过5000cP，例如超过10000cP，诸如超过50000cP，例如超过100000cP。
在一个实施方案中，凝固的溶液的粘度在100000cP-1000000cP的范围内，诸如在100000cP-750000cP的范围内，例如在100000cP-500000cP的范围内，诸如在100000cP-250000cP的范围内。
在一个实施方案中，凝固的溶液的粘度在100000cP-1000000cP的范围内，诸如在250000cP-1000000cP的范围内，例如在500000cP-1000000cP的范围内，诸如在750000cP-1000000cP的范围内。
在为高粘性液体的贮库中和在为脆性状态、韧性状态、无定形状态、结晶状态或玻璃状态的贮库中，截留的荧光染料均陷入动力学陷阱，因为扩散受到贮库的高粘度或固体特性的阻碍。对于更大的荧光染料或纳米颗粒而言，溶液内的扩散会因阻力/摩擦增强而更进一步地减少，从而改善这些荧光染料或纳米颗粒在凝固的溶液中陷入动力学陷阱的有效性。
在某个实施方案中，以4-10范围内的logP值为特征的助溶剂(诸如但不限于甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯)包含在如本文所述的溶液中。当注射到水性介质或包含间质液的组织中时，此类溶液发生NIPS，从而引起碳水化合物助溶剂溶液形成贮库，该贮库具有反映碳水化合物材料特性、助溶剂粘度和碳水化合物与助溶剂之比的可调粘度。此类实施方案的示例是SAIB:GTH:EtOH 64:28:8、SAIB:GTO:EtOH 83:9:8、SAIB:xSAIB:GTO:EtOH 66:9:17:8、LOIB:GTO:EtOH 64:28:8、LOIB:xSAIB:GTO:EtOH 50:9:33:8或它们的变型形式。
在注射到水性介质或包含间质液的组织中后从此类溶液的溶剂外排动力学取决于溶剂在溶液中的水溶解度以及溶剂对非水溶性碳水化合物的亲和力。具有更高logP的溶剂引起更慢的溶剂释放以及NIPS所形成的碳水化合物贮库的粘度的更慢增加。作为一个示例，对于SAIB:xSAIB:EtOH50:20:20的溶液而言，95％EtOH外排在体内在2小时内完成，即，这些溶液凝固，在几小时内发生NIPS，从而引起溶液在注射后5小时-6小时内完全凝固。在溶液凝固时间段之后，流体的粘度在固体贮库中沉积或扩散能力降低，阻碍荧光染料逃逸。
在一个实施方案中，溶液在水性条件下在小于10小时，诸如小于8小时，例如小于6小时，诸如小于5小时，诸如小于4小时，例如小于3小时，诸如小于2小时内凝固。
在本公开的一些实施方案中，具有低粘度和荧光染料高保留率的溶液是必要的。通过将非水溶性碳水化合物与助溶剂混合，获得更低粘度。
在碳水化合物和助溶剂完全相容(即具有类似logP，如例如LOIB和GTO或SAIB和GTH)的情况下，主要形成单相系统，该单相系统不能够基于动力学陷阱原理来保留荧光染料，这是由于助溶剂的存在使得粘度降低。然而，选择不太相容的碳水化合物酯和助溶剂可引起微相分离(MPS)，其中嵌入的化合物诸如荧光染料可被隔离到一个相或另一个相中。在本公开的某个实施方案中，这些相是非连续或不完全渗滤的结构并且阻碍了截留的化合物的扩散和逃逸。示例可为保留荧光染料的凝固的溶液内的液滴的液-液共存。通过包含助溶剂来获得最小释放率的本公开的一个实施方案是由SAIB:GTO:EtOH构成的溶液。
在一个实施方案中，荧光染料的扩散速率使得荧光染料保留在溶液中直到溶液已凝固，从而使荧光染料在凝固的溶液中陷入动力学陷阱，而没有或只有有限的荧光染料的释放。
溶液中的保留
当前在诊所中通过注射自由扩散染料诸如亚甲基蓝和吲哚菁绿(ICG)来使用外科干预的引导。这两种染料都是NIR-I型，并且用于组织的标记或用于使用NIR相机设备来监测器官灌注。然而，此类染料的器官内注射引起扩散所致的迅速散布，这妨碍了这些染料对于手术引导的最佳利用。本公开的溶液通过荧光染料的保留来解决该问题。在注射溶液后，溶液凝固并且因染料与溶液之间的高亲和力而使NIR染料陷入动力学陷阱或保留染料。这样，在注射部位处保留高浓度的染料，从而允许外科医生在外科手术期间鉴别感兴趣区域。
由于如上文所述的溶液的物理特性，荧光染料可保留在溶液和/或凝固的溶液中。这允许荧光染料在期望位置处的精准且稳定的定位，并且向周围组织和/或器官的泄漏最少。
荧光染料在溶液和/或凝固的溶液中的保留可由溶液的组成来控制，诸如控制溶液的粘度、凝固的溶液的形式、荧光染料的疏水性、荧光染料的大小以及溶剂和/或另外的溶剂的疏水性。
此外，荧光染料在溶液和/或凝固的溶液中的保留可由溶液的不同组分的相对logP值来控制，如上文在“溶液的物理特性”一节中所述。
在一个实施方案中，在水性条件下5小时后从溶液和/或凝固的溶液释放小于10％的荧光染料，诸如小于5％，例如小于4％，诸如小于2％。
在一个实施方案中，在水性条件下4小时后从溶液和/或凝固的溶液释放小于10％的荧光染料，诸如小于5％，例如小于4％，诸如小于2％。
在一个实施方案中，在水性条件下3小时后从溶液和/或凝固的溶液释放小于10％的荧光染料，诸如小于5％，例如小于4％，诸如小于2％。
在一个实施方案中，在水性条件下2小时后从溶液和/或凝固的溶液释放小于10％的荧光染料，诸如小于5％，例如小于4％，诸如小于2％。
在一个实施方案中，水性条件是体外条件，诸如缓冲体系。
在一个实施方案中，水性条件是体内条件，诸如肿瘤部位处的注射。
荧光染料从本公开的溶液的低释放率可提供基准标记物的更精准且稳定的定位。此外，荧光染料从本公开的溶液的低释放率可提供荧光染料对期望组织的标记的长持续时间。
从溶液的控制释放
本公开的溶液还可提供荧光染料从溶液和/或凝固的溶液的控制释放。荧光染料的控制释放可提供引流淋巴结的标记。
荧光染料从溶液和/或凝固的溶液的释放速率可由溶液的组成来控制，诸如控制溶液的粘度、凝固的溶液的形式、荧光染料的疏水性、溶剂和/或另外的溶剂的疏水性。
此外，荧光染料从溶液和/或凝固的溶液的释放速率可由溶液的不同组分的相对logP值来控制，如上文在“溶液的物理特性”一节中所述。作为一个示例，包含完全相容(即，具有类似logP)的非水溶性碳水化合物和溶剂的溶液将引起荧光染料从溶液和/或凝固的溶液的更高释放率。在碳水化合物和溶剂完全相容(即具有类似logP，如例如LOIB和GTO或SAIB和GTH)的情况下，主要形成单相系统，该单相系统不能够基于动力学陷阱原理来保留荧光染料，这是由于助溶剂的存在使得粘度降低。
在碳水化合物与助溶剂混合而形成粘度降低的基准标记物的情况下，可基于扩散受限动力学来促进截留的化合物的控制释放。截留的化合物(也就是NIR染料-聚合物构建体)可按贮库的粘度和/或扩散NIR染料-聚合物构建体的分子横截面限定的受控方式来释放。此类聚合物构建体可包括缀合至荧光染料(诸如酞菁、萘酞菁、卟吩、蒽菁)的PNIPAM、醋酸丁酸纤维素、醋酸纤维素、全氟碳化物、泊洛沙姆普兰尼克、聚乙二醇(PEG)、聚乳酸(PLA)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚(L-丙交酯)(PLA)、聚(乙交酯)(PGA)、聚(DL-丙交酯)(DLPLA)、聚(二氧环己酮)(PDO)、聚(DL-丙交酯-共-L-丙交酯)(LDLPLA)、聚(DL-丙交酯-共-乙交酯)(DLPLG)、聚(乙交酯-共-三亚甲基碳酸酯)PGA-TMC、聚(L-丙交酯-共-乙交酯)(LPLG)或聚(己内酯)(PCL)。从贮库的释放速率由大小(分子横截面)、聚合物与溶液的缠结和相互作用、以及聚合物在水性介质中的溶解度来控制。
在本公开的其他实施方案中，可从凝固的溶液释放荧光颗粒或棒，诸如量子点或碳纳米管。而在另一个实施方案中，可利用实现控制释放的类似原理来释放截留荧光染料或被荧光染料表面官能化的聚合物或金属纳米颗粒。
在释放荧光标记颗粒、聚合物或棒后，这些颗粒、聚合物或棒通过扩散散布在肿瘤组织中并且积聚在引流淋巴结中。淋巴结积聚程度取决于聚合物大小、疏水性和/或靶向配体的缀合。
在本公开的一些实施方案中，所释放的构建体可携带诊断性同位素以用于引流淋巴结的SPECT/PET或γ探针检测。在本公开的另一个实施方案中，所释放的构建体可包括用于治疗例如引流淋巴结中的转移癌的前药。在本公开的另一个实施方案中，所释放的构建体可包括酶、氧化还原剂或pH可活化荧光染料以用于肿瘤或淋巴结的功能成像。
在一个实施方案中，荧光染料共价地缀合至聚乙二醇(PEG)并且具有高于2000的分子量。荧光染料与亲水性PEG聚合物的缀合可在水性条件下提供荧光染料从溶液的释放。
在一个实施方案中，在体内从溶液释放之后，所释放的荧光染料-PEG缀合物积聚在淋巴结中。
在一个实施方案中，荧光染料-PEG缀合物具有高于2000Da，诸如高于3000Da，例如高于4000Da，诸如高于5000Da，例如高于10000Da，诸如高于15000Da，例如高于20000Da的分子量。
溶液的用途
根据本公开的溶液可为粘度在100cP-1000cP范围内的液体，从而能够通过薄注射针经皮、内窥镜或支气管镜施用到人体内的几乎任何部位中。
因此，本公开的一个方面涉及如本文所述的溶液作为基准标记物的用途。
外科手术的引导
如上所述，本领域需要开发良好的基准标记物以与图像引导外科手术领域中不断发展的技术一起使用。
如本文所述的溶液可具有与手术引导相关的作为基准标记物的多模态图像模式。这些溶液包含非水溶性碳水化合物，该非水溶性碳水化合物固有地具有因其可忽略的水含量引起的MRI上的负性造影，以及因其与软组织相比的固有高粘度和延展性引起的超声造影。这些溶液可进一步经由碘化碳水化合物酯、碘化聚合物或金纳米颗粒的掺入来实现CT成像，并且经由诊断性放射性核素与截留在溶液中的荧光染料的配位来实现SPECT/PET成像。
在溶液的注射期间，可经由对包含不透射线成分诸如xSAIB的溶液的超声成像或基于x射线的技术(例如荧光透视)来实时监测基准标记物的位置和体积变化。因此注射标记物的医疗专业人员能够在推进外科手术之前评价基准标记物的质量和精准度。当对注射质量存疑时，可在继续进行外科干预之前进一步采用基于x射线的成像(例如CT)来确保标记物的正确位置。此类多模态标记物在图像引导外科手术中具有高潜能，这将改善外科手术和治疗性干预，减轻患者的不适和术后疼痛，提高生存率，缩短住院时间，并且降低医疗费用。
本公开的溶液可用于基准标记物对于引导有必要的所有外科手术和介入性手术/指征。
因此，在一个实施方案中，本公开涉及如本文所述的溶液用于引导外科手术的用途。
在一个实施方案中，如本文所述的溶液用于在外科手术后标记参考点。作为一个示例，如本文所述的溶液可用于标记组织活检手术的参考点或定位治疗装置。
外束放射治疗的引导
放射治疗是具有成本效益且广泛采用的癌症治疗解决方案，其中被确诊患有实体肿瘤的患者中超过50％接受了某种形式的放射治疗。单是在美国和欧洲，每年就有超过250万患者接受放射治疗。如下事实也反映了该治疗选项的盛行：欧洲超过1000家医疗中心配备有称为直线加速器(或linac)的放射治疗设备。最常以若干治疗分次(有时多达30次)递送放疗治疗，并且有效治疗的终极关键是在这些治疗分次中的每个治疗分次时精准地攻击肿瘤。对于一些癌而言，其位置和软组织造影与周围组织太类似，无法依据直线加速器设备中包括的基于x射线的成像技术来准确界定。对于此类情况而言，包含具有高放射造影的基准标记物可提供参考点以用于患者的准确定位和放射治疗的递送。
为了能够实现这一点，需要软组织标记物或基准标记物。
放射治疗方面的技术进步使得涌现了新型、优化的治疗方法，所有这些治疗方法都依赖于改进的图像引导治疗和对软组织标记物的需要。
因此，在一个方面，本公开涉及如本文所述的用于引导EBRT的溶液。
在一个实施方案中，本公开涉及如本文所述的溶液用于引导外束放射治疗的用途。
具有特异性酶活性/环境的部位的标记(利用可裂解的淬灭剂)
在一个实施方案中，本公开的溶液的荧光染料缀合至淬灭剂。
荧光染料-淬灭剂缀合物可在一定条件下裂解，诸如通过特异性酶促反应、通过低pH或通过氧化还原电势的变化来裂解。
因此，在荧光染料-淬灭剂缀合物中，未从溶液提供信号。然而，在荧光染料-淬灭剂缀合物从凝固的溶液发生控制释放后，荧光染料可在具有例如低pH、特异性氧化还原电势或给定酶的存在的感兴趣部位处活化。
联合治疗
本公开的溶液要么通过利用本公开与其他治疗的组合，要么通过在已经描述的基准标记物功能之上包括额外/其他特征来提供联合治疗的一系列可能性。
本公开的溶液可与不同活性药物成分(诸如伤口愈合剂或消毒剂)共配制。在注射此类溶液后，伤口愈合剂或消毒剂局部地释放。另选地，本公开的溶液可与抗生素剂共配制。
在本公开的又一个实施方案中，用于光动力学治疗(PDT)的光敏剂(诸如对溶液具有减弱的亲和力(减小的logP)的酞菁或萘酞菁衍生物)可释放以实现光敏剂在肿瘤组织中的最佳积聚并且允许随后光对光敏剂的活化，从而破坏癌细胞。
制备用试剂盒
本公开还可涉及一种用于在施用部位附近或施用部位处制备本公开的溶液的试剂盒。这在荧光染料将与放射性核素配位的情况下可为有利的，因为溶液的非放射性组分可在例如医院处提供并储存，而放射性源可在需要时提供并且最终在收到或现场生成后应用。
因此，在一个实施方案中，本公开涉及一种试剂盒，该试剂盒包含：
a.如本文所述包含非水溶性碳水化合物、具有-2至2范围内的logP的溶剂以及任选另外的溶剂和/或另外的成像剂的溶液，
b.如本文所述包含荧光染料的溶液。
在一个实施方案中，该试剂盒还包含放射性核素作为组分b)的一部分或作为单独组分c)。
在一个实施方案中，该试剂盒的组分a)的各组分作为单独部分或作为包含a)固体组分和b)液体组分的两个组分来提供。
在一个实施方案中，该试剂盒的组分b)的各组分作为单独部分或作为包含a)固体组分和b)液体组分的两个组分来提供。
项目
1.一种溶液，该溶液包含：
a.非水溶性碳水化合物，
b.荧光染料，和
c.具有-2至2范围内的logP的有机溶剂。
2.根据项目1所述的溶液，其中荧光染料具有高于2的logP，从而在水性条件下提供荧光染料在溶液中的保留。
3.根据前述项目中任一项所述的溶液，其中荧光染料具有高于2，诸如高于3，例如高于4，诸如高于5，例如高于6，诸如高于8，例如高于10，诸如高于15的logP。
4.根据前述项目中任一项所述的溶液，其中在水性条件下5小时后释放小于10％的荧光染料，诸如小于5％。
5.根据项目1所述的溶液，其中荧光染料共价地缀合至聚乙二醇并且具有高于2000Da的分子量，从而在水性条件下提供荧光染料从溶液的释放。
6.根据项目5所述的溶液，其中在体内从溶液释放之后，所释放的荧光染料-PEG缀合物积聚在淋巴结中。
7.根据项目5和6所述的溶液，其中荧光染料-PEG缀合物具有高于2000Da，诸如高于3000Da，例如高于4000Da，诸如高于5000Da，例如高于10000Da，诸如高于15000Da，例如高于20000Da的分子量。
8.根据前述项目中任一项所述的溶液，其中荧光染料是颗粒的一部分。
9.根据项目8所述的溶液，其中颗粒选自量子点、被荧光染料官能化的金属纳米颗粒、被荧光染料官能化的聚合物纳米颗粒以及碳纳米管。
10.根据项目8至9中任一项所述的溶液，其中颗粒涂覆有聚合物。
11.根据前述项目中任一项所述的溶液，其中荧光染料是近红外(NIR)造影剂。
12.根据前述项目中任一项所述的溶液，其中荧光染料是NIR-I造影剂。
13.根据前述项目中任一项所述的溶液，其中荧光染料是NIR-II造影剂。
14.根据前述项目中任一项所述的溶液，其中NIR造影剂选自酞菁、萘酞菁、卟吩、蒽菁和花青染料。
15.根据前述项目中任一项所述的溶液，其中NIR造影剂选自酞菁、萘酞菁、卟吩、蒽菁。
16.根据前述项目中任一项所述的溶液，其中NIR造影剂是酞菁，诸如PC1、PC2和/或PC3。
17.根据前述项目中任一项所述的溶液，其中荧光染料缀合至聚合物。
18.根据前述项目中任一项所述的溶液，其中荧光染料在亚NIR范围内发射光子。
19.根据前述项目中任一项所述的溶液，其中荧光染料在700nm-900nm范围内发射光子。
20.根据前述项目中任一项所述的溶液，其中荧光染料在高于900nm的范围内发射光子。
21.根据前述项目中任一项所述的溶液，其中非水溶性碳水化合物包含被官能化而形成C2-C7酯的一个或多个羟基。
22.根据前述项目中任一项所述的溶液，其中通过碳水化合物的羟基与C2-C7烷酰基的羰基之间的键合来形成C2-C7酯。
23.根据前述项目中任一项所述的溶液，其中被官能化而形成C2-C7酯的羟基的数量为n、n-1、n-2、n-3、n-4或n-5，其中n为碳水化合物的羟基的总数。
24.根据前述项目中任一项所述的溶液，其中所有羟基被官能化而形成C2-C7酯。
25.根据前述项目中任一项所述的溶液，其中非水溶性碳水化合物选自单糖、二糖、三糖和低聚糖。
26.根据前述项目中任一项所述的溶液，其中非水溶性碳水化合物是选自以下的单糖：葡萄糖胺、半乳糖胺、甘露糖胺、甘露糖、鼠李糖、鼠李糖胺、半乳糖、阿洛糖、阿洛糖胺、阿卓糖、阿卓糖胺、古洛糖、古洛糖胺、艾杜糖、艾杜糖胺、塔罗糖和塔罗糖胺。
27.根据前述项目中任一项所述的溶液，其中非水溶性碳水化合物是选自以下的二糖：麦芽糖、海藻糖、乳糖、蔗糖、Galp-(1→2)-Glc、Galp-(1→3)-GlcN、Galp-(1→4)-Glc、Glcp-(1→4)-Glc、Glcp-(1→6)-Glc、Glcp-(1→2)-GlcN、Galp-(1→4)-ManN、Glcp-(1→4)-GalN、Manp-(1→3)-Glc、ManNp-(1→4)-Gal、GalNp-(1→3)-ManN、GlcNp-(1→6)-GalN、Rhamnp-(1→6)-Glc、Glcp-(1→1)-Glcp、Talp-(1→4)-Glu、Glup(1→3)-ldo、GlcNp-(1→4)-GlcN、GlcNp-(1→6)-GlcN。
28.根据前述项目中任一项所述的溶液，其中非水溶性碳水化合物是选自以下的三糖：棉子糖、Galp-(1→2)-Glcp-(1→3)-Galp、Galp-(1→4)-Glcp-(1→6)-GlcN、Galp-(1→4)-Glcp-(1→6)-Gal、Glcp-(1→4)-Glcp-(1→4)-Glcp、Glcp-(1→6)-Glcp-(1→6)-Glc、Galp-(1→6)-Glcp(1→2)-Fruf、Glcp-(1→3)-Fruf-(2→1)-Glcp、Galp-(1→4)-ManNp-(1→3)-Glu、Glcp-(1→4)-GalN-(1→2)-Man、Manp-(1→3)-Glcp-(1→4)-GlcN、ManNp-(1→4)-Galp-(1→3)-Glc、GalNp-(1→3)-ManNp-(1→6)-GlcN。Rhamnp-(1→6)-Glcp-(1→4)-GlcN、Galp-(1→6)-Glcp-(1→1)-Glcp、Talp-(1→4)-Glup-(1→2)-Man、Glup(1→3)-ldop-(1→6)-Glu、GlcNp-(1→6)-GlcNp(1→4)-GlcN。
29.根据前述项目中任一项所述的溶液，其中非水溶性碳水化合物是选自以下的低聚糖：Galp-(1→4)-Glcp-(1→6)-glcp-(1→4)-Glc、Galp-(1→4)-Glcp-(1→4)-Glcp-(1→4)-Glcp-(1→4)-Glc、Galp-(1→4)-Glcp-(1→4)-Galp-(1→4)-Glc、Glcp-(1→4)-Glcp-(1→4)-Glcp-(1→4)-Glc、Galp-(1→6)-Glcp-(1→6)-Galp-(1→6)-Glc、Galp-(1→6)-Glcp-(1→6)-Galp-(1→4)-Glc、Galp-(1→6)-Glcp-(1→6)-Glcp-(1→4)-Glc、GlcNp-(1→4)-GlcNp-(1→6)-GlcNp-(1→4)-GlcN、GlcNp-(1→6)-Galp-(1→6)-Glcp-(1→2)-Fruf、Galp-(1→4)-Glcp-(1→3)-Fruf-(2→1)-Glcp、Talp-(1→4)-Glup-(1→2)-Man-(1-3)-Glu、Glup(1→3)-ldop-(1→6)-Glup-(1→2)-Gal、醋酸纤维素、醋酸丁酸纤维素和醋酸丙酸纤维素。
30.根据前述项目中任一项所述的溶液，其中C2-C7烷酰基选自乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、戊酰基、己酰基、庚酰基和苯甲酰基。
31.根据前述项目中任一项所述的溶液，其中C2-C7烷酰基选自乙酰基、丙酰基、异丁酰基和苯甲酰基。
32.根据前述项目中任一项所述的溶液，其中非水溶性碳水化合物具有根据式(I)的结构，
Figure BDA0002841420130000351
33.根据前述项目中任一项所述的溶液，其中非水溶性碳水化合物具有根据式(II)的结构，
Figure BDA0002841420130000352
34.根据前述项目中任一项所述的溶液，其中有机溶剂在水性条件下从溶液向外扩散，从而提供凝胶、玻璃、半固体、固体、晶体或它们的任何组合。
35.根据前述项目中任一项所述的溶液，其中粘度在水性条件下增加超过1000厘泊(cP)，诸如超过5000cP，例如超过10000cP，诸如超过50000cP，例如超过100000cP。
36.根据前述项目中任一项所述的溶液，其中溶液在水性条件下在小于5小时，诸如小于4小时，例如小于3小时，诸如小于2小时内凝固。
37.根据前述项目中任一项所述的溶液，其中水性条件是体外条件，诸如缓冲体系。
38.根据前述项目中任一项所述的溶液，其中水性条件是体内条件。
39.根据前述项目中任一项所述的溶液，其中有机溶剂的logP在-2至2的范围内，例如在-1.8至1.8的范围内，诸如在-1.5至1.5的范围内，例如在-1至1的范围内，诸如在-2至1的范围内，例如在-1.5至1的范围内，例如在-1至2的范围内，诸如在-1至1.5的范围内。
40.根据前述项目中任一项所述的溶液，其中有机溶剂是醇。
41.根据前述项目中任一项所述的溶液，其中有机溶剂是C1-C4醇。
42.根据前述项目中任一项所述的溶液，其中有机溶剂选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、异丁醇、叔丁醇、苯甲醇、碳酸丙烯酯和二甲亚砜。
43.根据前述项目中任一项所述的溶液，其中有机溶剂的量在1％至30％的范围内，例如1％至20％，诸如1％至15％，例如1％至10％，诸如5％至10％。
44.根据前述项目中任一项所述的溶液，该溶液还包含甘油单酯、甘油二酯和/或甘油三酯。
45.根据前述项目中任一项所述的溶液，其中甘油三酯选自三癸酸甘油酯(GTD)、三辛酸甘油酯(GTO)和三己酸甘油酯(GTH)。
46.根据前述项目中任一项所述的溶液，其中甘油单酯、甘油二酯和/或甘油三酯的量在0至50％的范围内，诸如在0至40％的范围内，例如在0至30％的范围内，诸如在0至20％的范围内，例如在0至10％的范围内。
47.根据前述项目中任一项所述的溶液，其中荧光染料配位至放射性核素。
48.根据前述项目中任一项所述的溶液，其中放射性核素选自Tc-99m、In-111、Ga-67、Lu-177、Tl-201、Sn-117m、Cu-64、Mn-52、Zr-89、Co-55、Sc-44、Ti-45、Sc-43、Cu-61、As-72、Te-152、F-18、Ga-68、C-11、Nd-140和Te-149。
49.根据前述项目中任一项所述的溶液，该溶液包含Cu-64和PC1、PC2和/或PC3。
50.根据前述项目中任一项所述的溶液，该溶液包含另外的成像剂。
51.根据前述项目中任一项所述的溶液，其中另外的成像剂选自X射线剂、CT剂、MRI剂、PET剂和SPECT剂。
52.根据前述项目中任一项所述的溶液，其中另外的成像剂具有根据式(III)的结构，
Figure BDA0002841420130000371
53.根据前述项目中任一项所述的溶液用作体内诊断工具。
54.一种体内成像的方法，该方法包括：
a.向有此需要的个体施用根据前述项目中任一项所述的溶液，
b.荧光染料的激发，以及
c.荧光染料的检测。
55.根据前述项目中任一项所述的方法，其中通过注射和/或涂抹来施用溶液。
56.根据前述项目中任一项所述的溶液用于体内成像的用途。
57.根据前述项目中任一项所述的溶液用作基准标记物的用途。
58.根据前述项目中任一项所述的溶液用于引导外科手术的用途。
实施例
实施例1：荧光染料和凝胶材料的疏水性和分子量
常规和近红外(NIR)荧光团通常由高度缀合的分子构成，其特征在于具有疏水性(logP>0)，除非通过掺入带电残基和/或亲水性聚合物诸如PEG来对其进行化学改性而可溶于水溶液。此类染料的疏水特性确保了与疏水性溶液的良好相容性并且实现了高溶液保留率。表1中描述了此类染料的示例，而表2中描述了相关溶液材料
通过基于Viswanadhan等人的算法的计算来获得LogP值(Viswanadhan,V.N.、Ghose,A.K.、Revankar,G.R.、Robins,R.K.，《化学信息与计算机科学杂志》(J.Chem.Inf.Comput.Sci.)，1989年，第29卷，第163页-172页；)。还可通过辛醇-水分配实验来确定logP值。正logP值是疏水性化合物的特征，而负logP值指示亲水性化合物。
表1：所选择的染料的LogP、分子量和最大吸收波长
Figure BDA0002841420130000381
表2：所选择的溶液基质化合物的LogP和分子量
Figure BDA0002841420130000391
讨论
所选择的染料在从可见光(400nm-600nm)向上进入NIR-I范围(700nm-900nm)的光学范围内激发。表1中的染料都是疏水性的，具有大于4的logP值，并且显示出分子量与logP之间的正线性相关(R2＝0.86)。因此预测具有大分子量的染料能更有效地保留在本公开中所述的溶液中，这不仅由于经由与溶液的疏水相互作用增强了亲和力，而且更大的分子横截面使得粘稠溶液中的扩散能力降低。
能够螯合阳离子(诸如放射性核素)的荧光团由表1中的卟吩、酞菁、萘酞菁和蒽菁表示。与更小的花青染料Cy5-Cy7.5相比，所有这些染料都是具有高logP值的更大构建体，从而指示高溶液保留率。此类染料的水溶性非常低并且预期此类染料具有最小释放率。
已发现碳水化合物酯和甘油三酯助溶剂的疏水性(logP)随酰基链长度增加而增加。已发现适用于凝胶形成的溶剂跨越从-1.4至1.21的logP值范围，从而指示它们倾向于在注射到水性介质中后从溶液向外扩散并且引起非溶剂致相分离。已发现甘油三酯助溶剂跨越从5.59至10.92的logP范围，而碳水化合物酯跨越从-1.17至15.30的logP范围。
在助溶剂与碳水化合物酯之间确定了logP值的特定匹配，例如助溶剂碳水化合物混合物SAIB:GTH和LOIB:GTO的logP值相差小于1，从而指示类似的疏水性和相容性。助溶剂与碳水化合物酯之间的logP值的较大差值可为引起溶液的微相分离的不相容的预测变量，进一步参见“溶液的物理特性”一节。
结论
已通过用于所选择的溶液基质和染料化合物的计算方法来确立LogP值，并且已利用这些LogP值预测助溶剂与碳水化合物酯之间的相容性，而且预测螯合染料的更高保留率。
实施例2：材料和方法
除非另外指明，否则所有化学品均购自西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)。用于ICP-MS测量的试剂是
Figure BDA0002841420130000401
并且硝酸购自佛鲁卡分析公司(Fluka Analytical)。由氢化大豆L-α-磷脂酰胆碱(HSPC)、胆固醇(CHOL)和1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](铵盐)(DSPE-PEG2000)以HSPC:CHOL:DSPE-PEG2000(56.5:38.2:5.3)的摩尔比率构成的预混脂质混合物购自利宝益公司(Lipoid GmbH)。
蔗糖醋酸异丁酸酯(SAIB)购自西格玛公司(Sigma)并且乳糖八异丁酸酯(LOIB)和xSAIB通过内部定制合成来制备。
125I([125I]NaI)和LCS混合液Ultima gold购自珀金埃尔默公司(Perkin Elmer)。
CT26(小鼠结肠癌)购自美国马里兰州罗克维尔的美国典型培养物保藏中心(ATTC(Rockville,MD,USA))。补充有10％胎牛血清和青霉素-链霉素的DMEM培养基购自丹麦的英杰公司(Invitrogen Inc.(Denmark))。
所使用的所有水均收集自Milli-Q系统(密理博公司(Millipore))。在Milli-Q水中制备TRIS等渗缓冲液(10mM TRIS，150mM NaCl)并且用HCl将该TRIS等渗缓冲液调节至pH7.8。
缩写：
8HQ：8-羟基喹啉
SAIB：蔗糖二乙酸六异丁酸酯，式(I)
LOIB：乳糖八异丁酸酯，式(II)
xSAIB：根据式(III)的碘化SAIB衍生物
Figure BDA0002841420130000411
实施例3：6’-(花青7.5)-异丁酸蔗糖(蔗糖七异丁酸酯花青7.5，SSIB-Cy7.5)的合 成
在当前实施例中，NIR染料花青7.5化学地连接到疏水性碳水化合物酯蔗糖七异丁酸酯，得到产物SSIB-Cy7.5。
方法：
所有反应都在惰性气氛(N2)下进行。经由注射器转移水敏性液体和溶液。用于洗涤分离的产物的水在所有情况下都是MilliQ水。通过30℃-60℃和200毫巴-0毫巴下的旋转蒸发来浓缩有机溶液。使用预先涂覆有硅胶60F的铝板(Merck 5554)来进行薄层色谱法(TLC)。在紫外光下检查TLC板或使用硫酸铈铵溶液(10％硫酸溶液中的1％硫酸铈(IV)和2.5％七钼酸铵)使TLC板显色。
试剂：花青7.5NHS酯购自Lumiprobe公司，并且干溶剂购自阿克洛斯有机物公司(Acros Organics)(AcroSeal，超干，含分子筛)。所有其他化学品购自西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)并且按原样使用。
仪器：将nmr溶剂中的剩余非氚化溶剂残留用作内标，在配有298K下的5mm H-宽带双通道z-梯度Prodigy冷冻探针的Bruker AscendTM 400MHz(对于1H在401.3MHz下操作并且对于13C在100.62MHz下操作)上采集中间体的核磁共振(NMR)。利用配备有TCI冷冻探针的800MHz Bruker Avance IIIHD光谱仪(布鲁克公司(Bruker))来采集最终产物的NMR以便获得最佳光谱分辨率。所有耦合常数(J)都以Hz表示。在Mnova Suite中处理FID文件。在Bruker Autoflex SpeedTM质谱仪上采集MALDI-TOF MS。用于MALDI-TOF的基质是用三氟乙酸钠的乙醇溶液(60mg/mL)加标的2,5二羟基苯甲酸(DHB)的混合物。在配有二元溶剂管理器和TUV检测器的Waters Acquity超高效LC系统上进行UPLC。在配有Waters 2489紫外/可见光检测器的Waters 600泵和控制器上进行制备型HPLC。
Figure BDA0002841420130000421
用于SSIB-Cy7.5合成的反应方案
6’-TBDPS-异丁酸蔗糖(2)
将蔗糖(1)(2.5g，7.3mmol)悬浮在35mL干吡啶与10mL干DMF的溶剂混合物中。之后，添加DMAP(0.36g，2.92mmol)并且搅拌混合物直到适当溶解。然后，在10-15分钟内通过注射器逐滴添加TBDPS-Cl(1.1mL，4.0mmol(0.55当量))，并且使反应持续过夜。16小时后，添加另一部分TBDPS-Cl(1.1mL，4.0mmol(0.55当量))，然后再次使反应搅拌过夜。之后，UPLC(柱：C8。进样体积：5μL。洗脱剂：A：0.1％甲酸的水溶液。B：乙腈，0.1％甲酸。梯度：6分钟内5％-100％B。波长220nm和280nm)示出了以2:1关系转化为单和双tbdps蔗糖(保留时间：分别为3.1分钟和5.2分钟)。不分离所形成的6’-TBDPS-蔗糖，相反混合物直接与异丁酸酐反应，然后纯化而得到(2)。添加异丁酸酐(34mL，0.21mol)，并且将反应在室温下搅拌1天。反应之后进行MALDI-TOF MS。在完成时，在硅藻土(celite)上真空浓缩反应混合物。通过快速色谱法(EtOAc的己烷溶液，2％增量)进行纯化。产率＝14.8g(50％)。1H-NMR(400MHz，DMSO-D6)：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ7.63-7.57(m,4H),7.47-7.37(m,6H),5.62(d,J＝3.6Hz,1H),5.51-5.46(m,2H),5.39-5.33(m,1H),5.04(t,J＝9.8Hz,1H),4.87(dd,J＝10.4,3.7Hz,1H),4.25(ddd,J＝10.3,4.2,2.0Hz,1H),4.20-4.03(m,4H),3.91(dd,J＝12.5,2.0Hz,1H),3.87-3.77(m,2H),2.60-2.51(m,3H),2.47-2.33(m,3H),1.15-1.07(m,12H),1.07-0.94(m,40H)。
13C-NMR(101MHz，DMSO-d6)：δ175.6,175.2(2C),175.0,174.9(2C),174.5,135.0(4C),132.4,132.2,129.9(2C),127.8(4C),102.4,89.1,80.0,75.2,73.5,69.2 69.1,68.1,67.1,63.8,63.3,61.2(碳水化合物碳),33.2(3C),33.1(2C),33.0(2C)(CH异丁酸酯),26.4(4C),18.7,18.6(3C),18.5(5C),18.4(2C),18.3(2C),18.2。
MALDI-TOF MS：[M+Na]+计算值：1093.53。测定值：1093.31。
6’-OH-异丁酸蔗糖(蔗糖七异丁酸酯)(3)
将6’-TBDPS-异丁酸蔗糖(2)(14.8g，13.8mmol)溶解于干THF(80mL)中。小心地逐滴添加乙酸(12mL，0.21mol)。然后冷却反应混合物，并且在10分钟-15分钟内通过注射器添加1.0M TBAF的THF溶液(83mL，83mmol)。让反应在30分钟内加热到室温，之后将其温热到40℃并且在该温度下搅拌过夜。然后，TLC(己烷：乙酸乙酯3:1)显示反应完成(rf积：0.2)。将反应混合物冷却至室温，并且先添加己烷(300mL)再添加软化水(300mL)。将混合物搅拌10分钟，之后倒入分液漏斗中。收集有机相并且用己烷(2×300mL)萃取水相。将合并的有机相用HCl(水溶液)(500mL，pH＝2)洗涤，随后用磷酸盐缓冲液(3×300mL，pH＝6.8)洗涤。在硅藻土上浓缩有机相，然后通过干柱纯化(EtOAc的己烷溶液，2％增量-4％增量)对其进行纯化，得到产物。产率5.1g(89.5％)。质地：透明油。1H-NMR(400MHz，氯仿-d)：δ5.68-5.39(m,4H),5.18(t,J＝10.4Hz,1H),4.94(dd,J＝10.4,3.6Hz,1H),4.36-4.14(m,3H),4.10-3.93(m,3H),3.84(dd,J＝12.9,2.8Hz,1H),3.60(dd,J＝12.9,3.6Hz,1H),2.69-2.24(m,7H),1.34-0.99(m,42H)。
13C-NMR(101MHz，氯仿-d)：δ176.8,176.3(2C),176.1,176.0,175.9,175.2,102.8,90.2,81.4,75.6,72.5,70.0,69.5,69.1,67.2,64.0,60.8,60.7,34.0(4C),33.9(2C),33.8,19.2,19.1,19.0(4C),18.9(5C),18.8(2C),18.5。MALDI-TOF MS：[M+Na]+计算值：855.41。测定值：855.20。
6’-(花青7.5)-异丁酸蔗糖(蔗糖七异丁酸酯Cy 7.5)(4)
将6’-OH-异丁酸蔗糖(3)(14mg，0.017mmol)溶解于干DCM(3mL)中。然后，添加花青7.5NHS酯(15mg，0.019mmol)，之后添加三乙胺(10μL，0.072mmol)。将反应在室温下搅拌2天。然后，TLC(己烷：乙酸乙酯3:1)显示完全转化。真空浓缩有机相，将化合物再溶解在甲醇(2mL)中并且通过制备型HPLC(柱：Xterra C8。洗脱剂体系：A：0.1％TFA的水溶液。B：乙腈，0.1％TFA。梯度：15分钟内75-100％B)纯化。产率：15.2mg(62％)。质地：绿色粉末。1H-NMR(800MHz，DMSO-d6)：δ8.24(dd,J＝11.5,8.5Hz,2H),8.09-8.02(m,4H),7.84-7.63(m,6H),7.53-7.47(m,2H),6.19(dd,J＝26.1,14.0Hz,2H),5.62(d,J＝3.6Hz,1H),5.50(d,J＝7.4Hz,1H),5.40-5.31(m,2H),5.10-5.06(m,1H),4.93-4.85(m,2H),4.33-4.01(m,8H),3.86(t,J＝6.8Hz,1H),3.76-3.74(m,2H),2.93(q,J＝6.7Hz,1H),2.59-2.53(m,10H),2.47-2.30(m,3H),2.07(s,3H),1.94(br s,6H),1.89-1.85(m,2H),1.80-1.74(m,2H),1.66-1.34(m,8H),1.27-0.83(m,42H)。
MALDI-TOF MS：[M+H]+计算值：1464.78。测定值：1464.73。
结论：
总之，以高产率和纯度形成了产物SSIB-Cy7.5。
实施例4：SSIB-Cy7.5标记物制剂的制备
在当前实施例中，将NIR染料SSIB-Cy7.5溶解于基于LOIB或SAIB的标记物制剂中。
方法：
SAIB标记物制剂的制备：将SAIB加热到70℃，并且将7g的SAIB倒入玻璃小瓶中。将1g的xSAIB和2g的EtOH与SAIB混合并且超声处理30分钟以获得透明且均匀的SAIB制剂(SAIB:xSAIB:EtOH 70:10:20)。
LOIB标记物制剂的制备：将7g的LOIB称量到玻璃小瓶中。将1g的xSAIB和2g的EtOH与SAIB混合并且超声处理30分钟以获得透明且均匀的LOIB制剂(LOIB:xSAIB:EtOH 70:10:20)。
SSIB-CY7.5的添加：在EtOH中制备2mg/ml的SSIB-CY7.5储备溶液。之后，将0.1mlSSIB-Cy7.5储备溶液移取到玻璃小瓶中，并且在55℃和柔和N2流下干燥。添加2g的SAIB或LOIB制剂，并且将溶液超声处理6小时以获得0.01％重量/重量的最终染料浓度。通过连续稀释制备包含0.01％、0.006％、0.003％、0.001％,0.0006％、0.0003％、0.0001％或0.00001％SSIB-Cy7.5的制剂。
D&C violet 2(D&Cv2)的添加：制备LOIB标记物中的0.01％(重量/重量％)SSIB-Cy7.5和0.1％(重量/重量％)blue D&C violet 2以便在动物中测试。简而言之，将1mg D&Cviolet 2混合在1g的SSIB-CY7.5-LOIB标记物溶液(LOIB:xSAIB:EtOH:SSIB-Cy7.5 70:10:20:0.01)中并且对溶液超声处理30分钟。
结果：
制备了基于LOIB或SAIB的NIR标记物制剂，其包含10％重量/重量xSAIB、20％EtOH和0.00001％-0.01％重量/重量SSIB-Cy7.5。该制剂是透明且均匀的并且可在5℃下储存超过6个月而不会发生沉淀或外观变化。包含0.1％重量/重量D&C violet 2的制剂呈深蓝色并且被制备用于动物测试。
结论：
总之，可制备透明且均匀的NIR标记物制剂，其包含新型NIR染料SSIB-Cy7.5。
实施例5：PC1、PC2和PC3标记物制剂的制备
在当前实施例中，将NIR染料PC1、PC2和PC3配制在标记物制剂中。
方法：
SAIB标记物制剂的制备：将SAIB加热到70℃，并且将7g的SAIB倒入玻璃小瓶中。将1g的xSAIB和2g的EtOH与SAIB混合并且超声处理30分钟以获得透明且均匀的SAIB:xSAIB:EtOH制剂(SAIB:xSAIB:EtOH70:10:20)。将8g的SAIB倒入玻璃小瓶中。将2g的苯甲醇(BA)与SAIB混合并且超声处理30分钟以获得透明且均匀的SAIB:BA制剂(SAIB:BA 80:20)。
具有染料的SAIB标记物制剂的制备：
PC1：将PC1溶解于氯仿中的溶液(50μL-500μL，1mg/mL)移取到玻璃小瓶中，并且在室温和氮气流下蒸发氯仿。随后，将1g的标记物制剂(SAIB:xSAIB:乙醇70:10:20)添加到小瓶中以实现0.005-0.05％重量/重量的PC1浓度。将所得混合物在70℃下超声处理15分钟，然后进行涡旋。
PC2：将1mg的PC2称量到玻璃小瓶中。添加1g的SAIB标记物制剂，并且将溶液在55℃下超声处理6小时，之后在55℃下磁力搅拌16小时，以获得0.1％重量/重量的最终染料浓度。
PC3：将PC3溶解于氯仿中的溶液(50μL-500μL，1mg/mL)移取到玻璃小瓶中，并且在室温和氮气流下蒸发氯仿。随后，将1g标记物制剂(SAIB:BA 80:20)添加到小瓶中以实现0.005％-0.05％的PC3浓度。将所得混合物在70℃下超声处理15分钟，然后进行涡旋。
通过使用标记物溶液连续稀释、之后剧烈搅拌来产生包含不同染料含量的制剂。
结论：
总之，所有三种酞菁染料成功溶解于包含SAIB的标记物制剂中。
实施例6：PC1、PC2和PC3 NIR染料的光谱表征。
在当前实施例中，研究了酞菁基NIR染料PC1、PC2和PC3在溶解于甲苯中和标记物溶液中时的吸光度和荧光。
方法：
有机溶剂中的PC染料的制备：通过简单混合来制备甲苯中的所有PC染料的储备溶液(1mg/mL)，并且将这些储备溶液进一步稀释到合适的浓度以用于吸收和荧光测量。在甲苯中制备每种染料的三个浓度并将其用于荧光光谱的记录，并且为吸光度制备一个染料浓度。
标记物制剂中的PC染料的制备：所有组成均按重量百分比或重量比来表示。如实施例5中所述的那样制备包含SAIB(70％)、xSAIB(10％)和EtOH(20％)或者SAIB(80％)和苯甲醇(BA)(20％)的标记物制剂。
如实施例5中所述的那样制备基于SAIB:xSAIB:乙醇70:10:20的PC1标记物溶液。进一步用SAIB:xSAIB:乙醇70:10:20将PC1标记物溶液稀释到合适的浓度以用于吸收(0.001％重量/重量)和荧光测量(0.005％重量/重量)。
如实施例5中所述的那样制备基于SAIB:xSAIB:乙醇70:10:20的PC2标记物溶液。进一步用SAIB:xSAIB:乙醇70:10:20将PC2标记物溶液稀释到合适的浓度以用于吸收(0.001％重量/重量)和荧光测量(0.001％重量/重量)。
如实施例5中所述的那样制备基于SAIB:BA 80:20的PC3标记物溶液。进一步用SAIB:BA 80:20将PC3标记物溶液稀释到合适的浓度以用于吸收(0.01％重量/重量)和荧光测量(0.005％重量/重量)。
荧光发射测量：将每种标记物制剂(1.0mL)转移到石英比色杯(Helma，10mm光路)，并且通过荧光光谱仪(OLIS DM 45)使用26nm的激发/发射带宽和0.2秒的积分时间来收集荧光光谱。650nm的激发波长用于甲苯和标记物制剂中的PC1。对于PC2而言，700nm的激发波长用于甲苯和标记物制剂中的该染料，而800nm的激发波长用于甲苯中的PC3并且750nm的激发波长用于标记物制剂中的PC3。
紫外可见光吸光度测量：将每种溶液(0.2mL)移取到96孔板中，并且由多模式微板读数器(
Figure BDA0002841420130000471
帝肯公司(Tecan))使用3.5nm的带宽来记录紫外可见光谱(400nm-1000nm)。
结果：
研究了这三种酞菁染料PC1、PC2和PC3的吸光度和荧光并且结果在图1中给出。
结论：
总之，已发现PC1在700nm-800nm范围内发荧光并且吸收600nm-700nm的光。在甲苯中，PC2显示以790nm为中心的更尖锐的荧光带，并且肩部趋向于更高的波长。在标记物制剂中，PC2显示以790nm为中心的窄发射峰。在甲苯中，PC2吸收650nm-800nm范围内的光，并且在782nm处具有尖峰。当PC2嵌入在SAIB:xSAIB:EtOH 70:10:20制剂中时，观察到PC2的更宽吸收带。在甲苯中，PC3在850nm-1100nm范围内发荧光并且在700nm-900nm范围内吸收光。当溶解于SAIB:BA 80:20中时，PC3显示比溶解于甲苯中的PC3更宽的吸收峰和发射峰。所有三种PC染料都显示荧光发射强度对荧光团浓度的依赖性，这指示自淬灭。
实施例7：酞菁的荧光自淬灭分析
为了鉴别具有最高荧光强度的最亮标记物制剂，研究了PC2染料的自淬灭。通过紫外可见光、使用比色杯在90°下收集的荧光以及经由表面板读数器收集的表面荧光来研究自淬灭。
方法：
如实施例5中所述的那样制备具有组成SAIB:x-SAIB:EtOH 70:10:20且包含不同PC2水平的制剂。
通过荧光计得出的荧光发射：简而言之，记录包含0.01％、0.006％、0.003％、0.001％、0.0006％、0.0003％、0.0001％或0.00001％PC2染料的标记物制剂样品的荧光发射强度，例如将1.2mL的PC2制剂移取到石英比色杯(Helma 10.00mm)中，并且使用荧光光谱仪(OLIS SLM8000，美国)记录780nm至830nm的荧光发射。使用768nm的激发波长、45s的扫描时间和8nm的狭缝宽度来记录发射光谱。
表面荧光成像：使用体外NIR成像系统(Odyssey FC，美国Licor公司)来研究随PC2染料浓度而变化的凝胶样品的表面荧光。将具有不同PC2染料浓度的70μL凝胶样品移取到10孔标本玻璃板(赛默科技公司(Thermo Scientific)，10孔，6.7mm)中，并且使用800nm通道设置(785nm激发，125μm分辨率)来记录荧光。随后将带样品的10孔标本玻璃板置于55℃的真空烘箱中过夜以去除EtOH。在EtOH去除之后，将样品冷却到室温并且再次测量荧光。
结果：
使用标准90°比色杯测量并经由表面荧光成像来研究酞菁染料PC2的荧光自淬灭，并且结果在图2中给出。
结论：
总之，已发现在标准比色杯中和表面荧光测定法中，配制于SAIB:x-SAIB:EtOH70:10:20中的酞菁染料PC2的荧光强度均取决于染料浓度。最大强度和最低自淬灭度在标准发射荧光中被确定为0.001％重量/重量，并且在表面荧光中被确定为0.01％重量/重量。已发现自淬灭不取决于EtOH释放，即标记物在EtOH外排前后具有相同荧光强度。
实施例8：SSIB-Cy7.5染料的光谱表征
将新型NIR染料SSIB-Cy7.5配制于基于SAIB或LOIB的标记物中并且通过荧光或吸光度来表征。此外，研究了随基于SAIB的标记物中的染料浓度而变化的荧光发射。
方法：
根据实施例4制备包含SSIB-Cy7.5的标记物制剂SAIB:xSAIB:EtOH和LOIB:xSAIB:EtOH:D&Cv2。
荧光光谱：对于SAIB:xSAIB:EtOH SSIB-Cy7.5制剂而言，将1mL样品移取到石英比色杯(Helma 10.00mm)中，并且使用荧光光谱仪(OLIS SLM8000，美国)来记录780nm至900nm的荧光发射。使用768nm的激发波长、45s的扫描时间和8mm的狭缝宽度来记录发射光谱。对于LOIB:xSAIB:EtOH SSIB-Cy7.5制剂而言，将1mL样品移取到石英比色杯(Helma 10.00mm)中，并且使用荧光光谱仪(OLIS DM45，美国)以26nm的激发/发射带宽和0.2秒的积分时间记录800nm至1100nm的荧光发射。采用768nm的激发波长。
使用多模式微板读数器(瑞典帝肯公司(Tecan，Sweden))来记录SSIB-Cy7.5标记物样品的紫外可见光谱，例如将0.2mL的SSIB-Cy7.5制剂和0.05mL的含D&Cv2的SSIB-Cy7.5制剂移取到96孔板中，并且测量550nm至1000nm的紫外可见光谱。
结果：
制备了包含SSIB-Cy7.5的荧光标记物并且对其进行了光谱表征。结果在图5中给出。SAIB:xSAIB:EtOH 70:10:20中的SSIB-Cy7.5的荧光发射显示发射强度的染料浓度依赖性变化和峰值强度从804向844的逐渐转变。当SSIB-Cy7.5的浓度增加时，发射强度也增加直至0.003％重量/重量，之后便减小，这指示染料自淬灭。LOIB:xSAIB:EtOH:D&Cv2的紫外可见光分析显示590nm和803nm处的吸收峰，这分别对应于来自0.1％重量/重量D&Cv2染料和0.01％重量/重量SSIB-Cy7.5染料的吸收。以845nm为中心的宽发射峰由LOIB:xSAIB:EtOH:D&Cv2中的0.01％重量/重量SSIB-Cy7.5确定。
结论：
总之，SSIB-Cy7.5成功地配制于LOIB和SAIB标记物制剂中，并且显示荧光强度和峰位对染料浓度的依赖性。
实施例9：PC2从标记物的体外浸出
在将标记物注射在水性介质或组织中后，EtOH从标记物扩散，这可引起染料的浸出。通过以下方式在体外研究了该现象：将包含高量(0.1％重量/重量)PC2的标记物制剂注射到磷酸盐缓冲溶液中。之后通过紫外可见光谱法检测染料从标记物的浸出。
方法：
如实施例4-5中所述的那样制备包含0.1％重量/重量PC2的标记物制剂SAIB:xSAIB:EtOH 70:10:20并且将其用于浸出实验。
PC2染料从标记物的体外浸出：通过以下方式在体外研究了PC2染料从标记物的释放：将300μL的PC2标记物制剂(0.1％～1mg/ml)注射到5mL的磷酸盐缓冲盐水(PBS，5mM，150mM NaCl，pH 7.0)中。之后将样品在37℃下避光储存，并且在1、3、6小时和1、2、4、6天之后通过紫外可见光谱法监测染料释放。使用Nanodrop 2000c(美国赛默科技公司(Thermoscientific，US))分光光度计在石英比色杯中记录0.5ml PBS释放缓冲液的600nm至850nm的紫外可见光谱。由于PC2在缓冲液中的低溶解度，无法获得缓冲液中的PC的标准曲线。制备PC2在乙腈中的溶液(0.05mg/mL)，并且使用PBS缓冲液将其稀释到0.006mg/mL的浓度，该浓度对应于PC2在PBS中的10％释放率。
结果：
制备了包含SAIB:xSAIB:EtOH 70:10:20和PC2染料的制剂，并且通过紫外可见光谱(图3)确定了释放介质中的PC2。
在6天内确定了释放介质的吸光度没有任何变化，这指示染料完全保留在所形成的标记物中。基于所加入的10％标准品(图3)得出，释放了小于1％的PC2染料。后一结果可能低于1％，但因当前基线噪声水平而无法分辨。
结论：
总之，在实验的6天时间范围内未检测到PC2从标记物的泄漏。
实施例10：因铜螯合引起的PC2的荧光淬灭
这些酞菁染料是螯合剂并可与金属阳离子配位，并且螯合物的电子特性的变化可引起染料的荧光和吸光度的变化。
方法：
如实施例4-5中所述的那样制备包含0.001％重量/重量PC2的标记物制剂SAIB:xSAIB:EtOH 70:10:20。
铜淬灭样品：制备CuCl2·2H2O在乙醇中的溶液(0.005mg/mL)并且将其转移到玻璃小瓶(0、44、87、131、218或436μL)。通过在使用氮气流的情况下加热到55℃来蒸发每个小瓶中的乙醇。将PC2标记物溶液(1.2mL，0.001％)添加到装有不同量CuCl2的每个小瓶，之后每个小瓶中的Cu2+/PC2的摩尔比率分别为0、1:10、1:5、3:10、1:2和1:1。在55℃下磁力搅拌所得混合物2小时。
使用多模式微板读数器(瑞典帝肯公司(Tecan，Sweden))来记录PC2标记物样品的紫外可见光谱，例如将0.2mL的PC2制剂移取到96孔板中，并且测量550nm至1000nm的紫外可见光谱。
获得每种混合物的荧光发射光谱。简而言之，将每种标记物溶液(1.2mL)转移到石英比色杯并且在768nm的激发波长、45秒的扫描时间和8mm的狭缝宽度下记录780nm-830nm波长范围内的荧光发射光谱。
结果与结论：
基于图4中给出的数据，推断出铜被PC2螯合，并且PC2的荧光强度在铜结合后降低。需要1:1摩尔比率的染料和铜才能完全淬灭PC2染料。
实施例11：用64Cu对酞菁类染料的放射性标记
如实施例10中所证实，酞菁类染料(PC1、PC2和PC3)是金属螯合剂，其中铜淬灭PC2的荧光发射。在该实施例中，用64Cu2+对包含PC2的标记物制剂进行放射性标记，之后通过放射-TLC来定量该标记物制剂。
方法：
64Cu产生：通过电镀64Ni靶的质子辐照来在配备有光束线的PETtrace回旋加速器(通用电气医疗公司(GE Healthcare))上产生64Cu，然后通过水性氯化氢(HCl)介质中的阴离子交换色谱法来纯化。64Cu最终在HCl水溶液(1.0M)中获得，并且通过在氩气流下蒸发HCl水溶液来分离。干64CuCl2用于对标记物进行放射性标记。
标记物的放射性标记：将包含PC2的标记物SAIB:xSAIB:EtOH(70:10:20)(750μL，0.01％或0.001％)或不含PC2的标记物(750μL)添加到玻璃小瓶中的干64CuCl2(150MBq)。在55℃下磁力搅拌所得混合物2小时。
放射-TLC表征：将少量每种放射性标记标记物称量到玻璃小瓶中并且溶解于乙腈中达到约10mg/mL的浓度。利用放射-TLC(珀金埃尔默公司(Perkin-Elmer)，MiniGitaStar，配有β检测器GMC探针)，通过将1μL点样到TLC板(默克公司(Merck)，硅胶60F254)上来分析所得溶液。使用氯仿:甲醇:mili-Q水:乙酸70:25:4:1(体积/体积)作为洗脱剂来使TLC板显色。已知在使用这些TLC条件时非络合的64Cu停留在原点。
结果：
用64Cu对标记物SAIB:xSAIB:EtOH:PC2(70:10:20:0.01)进行放射性标记，并且使用放射-TLC来研究络合物形成。数据在图8中给出。通过将所获得的TLC保留因子(Rf＝0.9-1.0)与非放射性的化学结构相同的参考化合物进行比较来确认64Cu-PC2的形成。不含PC2的标记物中的64Cu的Rf保留在原点(Rf＝0)。
结论：
总之，PC2易于通过SAIB:xSAIB:EtOH:PC2(70:10:20:0.01)与干64CuCl2的直接混合来与64Cu络合。在标记物制剂中存在0.01％重量/重量PC2的情况下，>99％的64Cu随该络合物移动到TLC板上的溶剂前沿。
实施例12：64Cu标记的标记物的体外释放率和转移效率
研究了64Cu从放射性标记的PC2 SAIB:xSAIB:EtOH 70:10:20标记物的转移效率和体外释放率。包含作为游离64Cu2+的清除剂的EDTA和作为所释放的PC2染料的清除剂的脂质体的等渗TRIS缓冲液用作体外释放介质。
方法：
标记物制备：如实施例5中所述的那样制备包含PC2的放射性标记的SAIB:xSAIB:EtOH 70:10:20标记物(100μL，0.01％或0.001％)和不含PC2的对照标记物(100μL)。
隐形脂质体的制备：通过以下方式产生隐形脂质体(HSPLC:Chol:DSPE-PEG2k 3:1:1重量/重量)：借助于1小时的超声处理，用等渗TRIS缓冲液在65℃下水化商业隐形脂质混合物，然后用配备有200nm聚碳酸酯过滤器的微型挤出机来定型。脂质体尺寸为142.4±1.6nm，PDI为0.19±0.006。使用ICP-MS来确定脂质浓度并且进一步通过ISO-TRIS将脂质体稀释到5mM的最终浓度。
体外释放测定法：之后通过25G针将放射性标记的标记物注射到装有释放介质(4.0mL)的玻璃小瓶中，该释放介质包含TRIS(10mM，150mM NaCl，pH 7.8)缓冲的EDTA(1.0mM)和隐形脂质体(5.0mM脂质)。在剂量校准器(康美生公司(Comecer)，VDC-505)上测量注射到释放缓冲液中的每种标记物的放射性。随时间变化(1小时、3小时、6小时、1天、2天、4天和6天)取出等分试样(15μL-1000μL)，并且将其更换为等量的释放介质。6天后，取出所有释放介质并且使用乙醇(1.0mL)溶解剩余的标记物。取出所得溶液的等分试样(250μL)以便定量。随后将所有样品等分试样与LSC混合液(Ultima Gold)混合，并且通过液体闪烁(HIDEX，300SL光谱仪)以2keV-850keV的能量范围进行分析。为64Cu制定校准曲线(20Bq-800Bq)，该校准曲线在所需的浓度范围内是线性的(r2>0.999)。
转移效率：转移效率测量已在样品中溶解的总活性的分数。通过活性浓度的确定来确定单独制剂的转移效率，即，将100μL样品转移到玻璃小瓶，并且通过剂量校准器(康美生公司(Comecer)，VDC-505)来确定活性。
结果：
成功制备了标记物并对其进行了放射性标记，并且确定了体外释放率和转移效率。结果报告于图9中。
用64Cu对包含0、0.001或0.01％重量/重量PC2的SAIB:xSAIB:EtOH70:10:20标记物制剂进行了放射性标记，并且随着PC2染料浓度增加，观察到转移效率也增加，这确认了铜被PC2螯合。在不存在PC2(0％重量/重量)的情况下，67％的64Cu溶解于标记物溶液中，这指示了铜对富氧标记物成分SAIB、xSAIB和EtOH的亲和力。
在体外释放测定法中观察到这些标记物之间的显著差异，其中不含PC2(不含螯合剂)的标记物显示迅速突发，在数小时内释放80％的活性。包含0.001％或0.01％重量/重量PC2的标记物分别表现出小于2％或小于0.4％的有限释放。后一结果确认PC2和铜形成螯合物，因为正如预期，更高的染料/螯合剂浓度会引起标记物中的更高放射性核素保留率。
结论：
总之，64Cu可易于以高转移效率(>80％)和低体外释放度(<2％)对包含PC2的标记物进行放射性标记。
实施例13：使用标记物LOIB:xSAIB:EtOH:D&Cv2:SSIB-Cy7.5的NIR引导外科手术。
使用NIR图像引导研究了作为大鼠和猪模型中的外科手术标记物的制剂LOIB:xSAIB:EtOH:D&Cv2:SSIB-Cy7.5。
方法：
如实施例4中所述的那样制备标记物制剂LOIB:xSAIB:EtOH:D&Cv2:SSIB-Cy7.570:10:20:0.1:0.01。
大鼠模型:通过静脉注射过量戊巴比妥(Euthanimal Vet，400mg/ml，丹麦赫斯霍尔姆(
Figure BDA0002841420130000541
Denmark)的Scanvet公司)来对Wistar雄性大鼠(体重400g)施以安乐死，并且使用1ml注射器和23G注射针在右大腿和一个睾丸中肌内注射50μL标记物制剂。使用NIR相机(Fluobeam800，法国格勒诺布尔(Grenoble，France)的Fluoptics公司)来评价标记物的荧光，并且进行外科手术。
猪模型：通过静脉注射过量戊巴比妥(Euthanimal Vet，400mg/ml，丹麦赫斯霍尔姆(
Figure BDA0002841420130000542
Denmark)的Scanvet公司)来对45kg标准品种猪施以安乐死，并且通过穿过胸壁的切口来打开胸腔。打开切面伤口并且使用大Wickers创口牵开器使切面伤口保持开放(图7A)。以三个深度从肺的轴向侧注射标记物以使用NIR相机(Fluobeam 800，800nm配置，法国格勒诺布尔(Grenoble，France)的Fluoptics公司)来提供有关荧光发射方面的标记物性能的成像数据。
结果：
成功注射了LOIB:xSAIB:EtOH:D&Cv2:SSIB-Cy7.5标记物并且通过NIR相机在大鼠的大腿和睾丸中(图6)和猪肺组织中(图7)鉴别出了这些标记物。在大鼠模型中，标记物在外科手术期间(图6A)或在沿外周嵌入在组织中时(图6C)因D&Cv2染料而可见，但在使用NIR相机可视化时更加明显(图6B和图6D)。在猪模型中，可在多达约1cm的组织深度处鉴别出标记物，但发射光在最深组织中愈发衰减(图7D，左标记物)。另外，可经由外周/表面嵌入标记物的blue D&Cv2染料在视觉上鉴别出LOIB:xSAIB:EtOH:D&Cv2:SSIB-Cy7.5(图7C，右标记物)。
结论：
总之，SSIB-Cy7.5染料实现了LOIB:xSAIB:EtOH:D&Cv2制剂的NIR成像，从而允许定位组织内的标记物。
实施例14：鼠模型中的标记物的体内PET/NIR/CT成像
制备64Cu放射性标记的SAIB:xSAIB:EtOH:PC2 70:10:20:0.01标记物并且将其皮下注射于8只小鼠的侧腹。之后使用IVIS扫描仪(珀金埃尔默公司(Perkin Elmer))对这些动物进行PET/CT和荧光(FLI)2D成像。将数据编制为图10中的定量量度和图11中的记录图像。
方法：
如实施例10中所述的那样制备64Cu放射性标记的SAIB:xSAIB:EtOH:PC2 70:10:20:0.01标记物。在注射时，这些标记物具有35MBq/ml的活性。
研究设置：在8只小鼠(NMRI/Taconic)的右侧腹皮下注射50μL(1.75MBq)标记物以便随时间推移进行荧光团的IVIS成像和64Cu的PET成像。在注射后1小时、4小时、24小时和48小时对所有八只小鼠进行PET/CT和IVIS扫描，并且在2周、3周和4周后对三只小鼠进行IVIS扫描。在PET/CT扫描后对五只小鼠施以安乐死，之后收集器官并且在γ计数器(Wizard2，珀金埃尔默公司(Perkin Elmer))孔计数器上计数120秒。
PET程序：使用七氟烷对小鼠施行麻醉，将小鼠放在受热床上以供扫描，用CT进行扫描，并且在MicroPET Focus 120(美国宾夕法尼亚州莫尔文的西门子医疗系统公司(Siemens Medical Solutions，Malvern，PA，USA))上采集后续PET数据。体素大小为0.866×0.866×0.796mm3，并且在中心视场中，分辨率为1.4mm半峰全宽(fwhm)。64Cu的PET方案对1小时和4小时时间点采用5分钟发射时间，对24小时时间点采用10分钟发射时间，此外对48小时扫描采用20分钟发射时间。使用最大后验(MAP)重建算法来重建数据。为进行活性的解剖定位，使用专用小动物成像系统(NanoScan microSPECT/CT，匈牙利布达佩斯(Budapest，Hungary)的Mediso公司)采集CT图像。在数据重建之后，使用Inveon软件(西门子公司(Siemens))来融合PET和CT图像。对发射扫描的随机计数和死区时间进行校正。使用PET和CT图像来鉴别示踪剂摄取区域并且生成单独地应用于每个扫描的感兴趣区域(ROI)。在凝胶、肝和肾周围绘制感兴趣区域，并且计算％ID/凝胶或％ID/g。
IVIS程序：使用小动物生物发光和荧光扫描仪(IVIS，Lumina XR，美国卡利珀生命科学公司(Caliper Life Sciences，USA))执行荧光成像。使用异氟烷对小鼠施行麻醉，将小鼠放在受热板上以供扫描，并且进行荧光(FLI)扫描。采用2的分箱、最大120秒的暴露时间以及Ex：745nm和Em：810nm-875nm的激发波长和发射波长。
孔计数：在最后PET扫描时间(48h)之后，对五只小鼠施以安乐死并且收集器官以进行生物分布的孔计数。孔计数方案由每个器官样品120秒计数组成，并且结果以平均值％注射剂量/g(％ID/g)±SEM给出。
标记物体积：通过基于250HU的CT造影截断值的自动分割程序来获得标记物体积。
结果：
总的来说，已发现标记物中的活性浓度在最开始48小时内增加7.5％，并且小于1％积聚在肝中(图10A)。PET图像还证实活性的主要部分存在于标记物体积中(图11)。已发现标记物体积在最开始48小时期间减小11％(图10B)，这是EtOH从标记物外排引起的。体积减小还解释了单位体积的标记物活性浓度的增加。此外，孔计数数据(图10D)与所获得的基于PET的生物分布相符，尽管在标记物中发现了甚至更高的活性浓度。
已发现标记物中的PC2发出的NIR荧光强度在4周内是近似恒定的，在24小时和48小时时间点略有增加(图10C)。后一结果可通过仪器性能或动物在扫描仪中的定位的波动来解释，并且不被视为NIR发射强度的实际变化。FLI图像还示出了标记物在4周内发出的恒定NIR荧光强度(图11)，这指示光漂白并未随时间推移改变标记物的性能。
已发现标记物的CT造影(图11)在最开始48小时内是恒定的，并且标记物清晰可见，其具有等于骨性结构的造影水平。
结论：
总之，64Cu放射性标记的SAIB:xSAIB:EtOH:PC2 70:10:20:0.01标记物在PET/CT和NIR中可见，并且在所有图像模式中均显示PC2染料和64Cu活性的位置、强度和保留方面的高稳定性。
实施例15：使用离子载体对包含SSIB-Cy7.5的NIR标记物的64Cu放射性标记。
在当前实施例中，通过使用另选策略对嵌入非螯合荧光团的NIR标记物进行放射性标记，证实了当前平台技术的通用性。在该程序中，使用疏水性螯合剂8-羟基-喹啉(8HQ)由64Cu对标记物LOIB:xSAIB:EtOH:D&Cv2:SSIB-Cy7.5(70:10:20:0.01:0.01)进行放射性标记，从而形成在PET/CT/NIR中可见、具有颜色且肉眼可见的标记物，并且该标记物形成在外科手术中可扪及的固体。
方法：
标记物制剂制备：如实施例4中所述的那样制备LOIB:xSAIB:EtOH:D&Cv2:SSIB-Cy7.5(70:10:20:0.1:0.01)标记物制剂。
64Cu制备：如实施例10中所述的那样制备[64Cu]CuCl2。
标记物的放射性标记：将8HQ在乙醇中的溶液(200μL，500μM)和纯乙醇(300μL)与干[64Cu]CuCl2(300MBq)混合并且在室温、400rpm下搅拌18小时。使用氩气流在50℃下蒸发乙醇溶剂20分钟。然后将1mL的标记物制剂(LOIB:xSAIB:EtOH:D&Cv2:SSIB-Cy7.5 70:10:20:0.1:0.01)添加到64Cu(8HQ)干膜，之后将制剂在50℃、400rpm下搅拌2小时。将放射性标记的标记物制剂(660μL)转移到新的玻璃小瓶，并且通过剂量校准器(康美生公司(Comecer)，VDC-505)来测量放射性。添加非放射性的凝胶制剂(1.5mL)以将制剂稀释到20MBq/mL。通过进一步在50℃、400rpm下搅拌20分钟并涡旋来使最终制剂均质化。
动物模型：用20MBq 64Cu(8HQ)/mL对具有组成LOIB:xSAIB:EtOH:D&Cv2:SSIB-Cy7.5 70:10:20:0.1:0.01的标记物进行放射性标记。使用七氟烷对一组四只雌性Balb/CCT26小鼠施行麻醉。剪掉小鼠的右侧腹并在无菌条件下准备以用于皮下注射，并且向每只小鼠皮下注射50μL的凝胶制剂(20MBq/mL)，这对应于1MBq/小鼠的活性剂量水平。
在专用小动物PET/CT扫描仪(Inveon，MicroPET Focus 120(美国宾夕法尼亚州莫尔文的西门子医疗系统公司(Siemens Medical Solutions，Malvern，30PA，USA)))上采集PET数据。体素大小为0.866×0.866×0.796mm3，并且在中心视场中，分辨率为1.4mm半峰全宽(fwhm)。在凝胶注射后10分钟采集PET扫描，并且在注射后1小时、17小时和42小时再次采集PET扫描。使用最大后验(MAP)重建算法来重建数据。为进行活性的解剖定位，使用MicroCAT II 35系统(美国宾夕法尼亚州莫尔文的西门子医疗系统公司(Siemens MedicalSolutions，Malvern，PA，USA))采集CT图像。在数据重建之后，使用Inveon软件(西门子公司(Siemens))来融合PET和CT图像。对发射扫描的随机计数和死区时间进行校正。使用PET和CT图像来鉴别示踪剂摄取区域并且生成单独地应用于每个扫描的感兴趣区域(ROI)。在凝胶周围以及肝和肾的边界内绘制感兴趣区域，并且计算％ID/凝胶或％ID/g。
标记物体积：通过基于250HU的CT造影截断值的自动分割程序来获得标记物体积。
FLI图像：在注射后18小时和44小时使用实施例14中所述的设置来对两只小鼠进行FLI成像。随后对来自标记物的总通量进行积分并且在图12中给出。
NIR相机图像：使用NIR相机(Fluobeam，800nm配置，Fluoptics公司)来采集NIR图像。
结果：
收集PET/CT/NIR数据并且结果在图12中给出。已成功地用被8HQ络合的64Cu对LOIB:xSAIB:EtOH:D&Cv2:SSIB-Cy7.5 70:10:20:0.1:0.01标记物制剂进行放射性标记。剪掉4只雌性Balb/C小鼠的右侧腹并在无菌条件下准备以用于皮下注射。皮下注射标记物并且记录随时间变化的PET/CT图像。在初始扫描时间(10分钟)，在凝胶中恢复90％的总活性，42h后逐渐降低到81％(图12A)。随着时间推移，观察到一小部分64Cu积聚在肝和脾中，但这两个器官中存在小于1.2％ID/g。已发现荧光强度在注射后18小时和44小时是恒定的，并且体积在整个实验过程中减小8％。
结论：
总之，8HQ用作将64Cu嵌入标记物中的疏水性离子载体。在42小时期间观察到小于10％的活性降低，使得肝和脾中的积聚最少。
实施例16：使用离子载体对包含SSIB-Cy7.5的NIR标记物的放射性碘标记。
在当前实施例中，通过使用另选策略对嵌入非螯合荧光团的NIR标记物进行放射性标记，证实了当前平台技术的通用性。在该程序中，使用先前描述的SAIB-TMS底物由125I对标记物LOIB:xSAIB:EtOH:D&Cv2:SSIB-Cy7.5(70:10:20:0.01:0.01)进行放射性标记(Schaarup-Jensen等人，用于非扪及性乳腺病变的放射性定位的可注射碘-125标记的组织标记物(Injectable iodine-125labeled tissue marker for radioactivelocalization of non-palpable breast lesions)，《生物材料学报》(ActaBiomaterialia)，第65卷，2018年，第197页-202页)，从而形成在SPECT/CT/NIR中可见、具有颜色且肉眼可见的标记物，并且该标记物形成在外科手术中可扪及的固体。
方法：
在庚烷：EtOAc(6:4)中运行TLC并且用KMnO4染液显色。SAIB-TMS以Rf＝0.6洗脱并且[125I]SAIB-I略低。在Cyclone Plus储磷系统(珀金埃尔默公司(Perkin Elmer))上分析放射-TLC。在Veenstra仪器公司(Veenstra Instruments)剂量校准器VDC-505上测量已使用由珀金埃尔默公司(Perkin-Elmer)给出的I-125规范预先校准的标准化4mL玻璃小瓶中的放射性。
放射性碘化：将Tl(CF3COO)3(10.2mg)溶解于乙腈(2.30mL)与三氟乙酸(1.50mL)的混合物中。将该溶液的等分试样(380μL)转移到HPLC小瓶(Tl(CF3COO)3：1.1mg，1.8μmol)。然后向小瓶中添加SAIB-TMS的乙腈溶液(120μL，1.2μmol)。将该溶液在室温下搅拌2小时。然后向该混合物中添加[125I]NaI的10-5MNaOH水溶液(30μL，96.5MBq)。在室温下搅拌43分钟之后，添加NaI(18μL，3.6μmol)，之后在室温下搅拌60分钟。
Figure BDA0002841420130000601
说明SAIB-TMS的放射性碘化的方案
后处理：向反应混合物中添加水(500μL)。之后在已用乙醇(2×5mL)和水(3×5mL)预先洗涤的SEP-PEAK C18 Plus小柱上捕获产物。用DTPA水溶液(3×1mL，50mM，pH 7.0)、水(3×10mL)和25％(体积/体积)乙醇的水溶液(2×2mL)洗涤反应容器和小柱。随后在乙醇(3×1mL)中洗脱产物。乙醇的两个初始级分(2×1mL)包含大部分产物。在这两个级分中通过放射-TLC测得放射化学纯度为90.6％(级分10，51.6MBq)和92.6％(级分11，30.0MBq)。通过TLC分析该产物并且发现该产物是化学纯的，且通过与非放射性的SAIB-I的Rf进行比较而确认了放射性标记的产物的种类。合并这两个级分，并添加500μL额外乙醇以冲洗到容器中。测得放射性产率为83.4MBq(RCY：86％)。
标记物的制剂：从合并的产物中取出乙醇(2.5mL)中的2.2mL(73MBq)级分，将其放入玻璃小瓶中在40℃和氩气流下蒸干74分钟。向干燥残余物中添加1.8mL LOIB:xSAIB:EtOH:D&Cv2:SSIB-Cy7.5标记物溶液，之后在室温下磁力搅拌30分钟。由此得到成品标记物制剂。
放射性的体外保留：将大约3×100μL的包含放射性标记的凝胶溶液转移到装有杜氏磷酸盐缓冲盐水(3.0mL)的玻璃小瓶。在若干时间点，取出2mL介质并且更换为2mL新鲜介质。在该次更换后测量小瓶中剩下的放射性并将其示于表1中。在最后显示的测量点(X)中，取出全部介质并更换为新鲜介质。这在最后10天测量之后立即进行。也测量了取出的介质等分试样中的放射性并将其示于表3中。
动物模型：剪掉雌性NMRI小鼠或12周龄雌性Balb/C小鼠的右侧腹并在无菌条件下准备以用于标记物的皮下注射。在注射标记物之后，执行SPECT/CT扫描和荧光成像。
SPECT/CT扫描：使用专用小动物SPECT/CT扫描仪(NanoScan，匈牙利布达佩斯(Budapest，Hungary)的Mediso公司)来执行注射了125I-放射性标记的LOIB:xSAIB:EtOH:D&Cv2:SSIB-Cy7.5标记物的小鼠的microSPECT/CT扫描。作为注射了标记物的区域内的单个视场(FOV)来执行SPECT扫描。使用微型针孔准直器来执行扫描并且对所有扫描采集90秒的20次投影。
在SPECT/CT图像上，使用可商购获得的软件(Vivo-quant 3.5，美国马萨诸塞州波士顿的inviCRO公司(inviCRO LCC.，Boston，MA.，USA))来构建人工感兴趣体积(VOI)。为扫描点计算衰变校正的125I-活性以确定标记物中的125I保留。
FLI图像：使用小动物荧光和生物发光成像(FLI)及X射线系统(IVIS Lumina XR，美国卡利珀生命科学公司(Caliper Life Sciences，USA))，采用实施例14中所述的设置来执行标记物的荧光成像。FLI/X射线成像(ex/em，光，10cm FOV)在注射当天执行并且在注射标记物后三周内每周执行一次。记录对应放射照片和光图像。通过手动构建为凝胶面积三倍的ROI并且记录所构建的ROI中的总通量(计数/秒)来评价图像的发射产率。
结果：
表3：随时间变化而在标记物中保留的125I以及介质中的125I释放率。
Figure BDA0002841420130000611
Figure BDA0002841420130000621
在标记物中观察到放射性的优异保留，并且在测量的第一天期间测得凝胶中的放射性降至约95％，到达缓慢下降的平台。在10天温育后的最终测量点(X)中，其中仅测量了标记物中的放射性，保留率为95.5±0.5％(n＝3)。保留的放射性的初始下降可归因于突发释放，但由于其不为释放的介质中的放射性所反映，因此初始观察到的下降可能是在乙醇释放并且凝胶沉降时凝胶的几何形状改变的结果。在监测的初始天期间，在取出的介质中观察到仅0.17±0.08％(n＝3)的释放率，并且在连续10天内缓慢而稳定的增加到总共约1％释放率。
结论：
总之，这些数据强调了该LOIB:xSAIB:EtOH:D&Cv2:SSIB-Cy7.5标记物体系中的极高程度的I-125放射性保留。
此外，SPECT/CT和FLI/X射线图像(图13)确认了125I放射性标记的LOIB:xSAIB:EtOH:D&Cv2:SSIB-Cy7.5标记物在3周时间段内对于染料和125I活性的位置、强度和保留是高度稳定的。

Claims (31)

1.一种溶液，所述溶液包含：
a.非水溶性碳水化合物，
b.荧光染料，和
c.具有-2至2范围内的logP的有机溶剂。
2.根据权利要求1所述的溶液，其中所述荧光染料具有高于2的logP，从而在水性条件下提供所述荧光染料在所述溶液中的保留。
3.根据前述权利要求中任一项所述的溶液，其中在水性条件下5小时后释放小于10％的所述荧光染料，诸如小于5％。
4.根据前述权利要求中任一项所述的溶液，其中所述荧光染料是近红外(NIR)造影剂。
5.根据前述权利要求中任一项所述的溶液，其中NIR造影剂选自酞菁、萘酞菁、卟吩、蒽菁和花青染料。
6.根据前述权利要求中任一项所述的溶液，其中NIR造影剂是酞菁，诸如PC1、PC2和/或PC3。
7.根据前述权利要求中任一项所述的溶液，其中所述荧光染料缀合至选自以下的非水溶性碳水化合物：SAIB、SSIB和LOIB。
8.根据权利要求1所述的溶液，其中所述非水溶性碳水化合物包括选自以下的二糖：麦芽糖、海藻糖、乳糖和蔗糖，其中一个或多个羟基被官能化而使得所述碳水化合物呈非水溶性。
9.根据前述权利要求中任一项所述的溶液，其中所述非水溶性碳水化合物包含被官能化而形成C2-C7酯的一个或多个羟基。
10.根据前述权利要求中任一项所述的溶液，其中被官能化而形成C2-C7酯的羟基的数量为n、n-1、n-2、n-3、n-4或n-5，其中n为所述碳水化合物的羟基的总数。
11.根据前述权利要求中任一项所述的溶液，其中通过所述碳水化合物的羟基与C2-C7烷酰基的羰基之间的键合来形成所述C2-C7酯。
12.根据前述权利要求中任一项所述的溶液，其中所述C2-C7烷酰基选自乙酰基、丙酰基、异丁酰基和苯甲酰基。
13.根据前述权利要求中任一项所述的溶液，其中所述非水溶性碳水化合物选自麦芽糖八异丁酸酯(MOIB)、蔗糖二乙酸六异丁酸酯(SAIB)、蔗糖八异丁酸酯(SOIB)、乳糖八异丁酸酯(LOIB)和海藻糖八异丁酸酯(TOIB)。
14.根据前述权利要求中任一项所述的溶液，其中所述有机溶剂在水性条件下从所述溶液向外扩散，从而提供凝胶、玻璃、半固体、固体、晶体或它们的任何组合。
15.根据前述权利要求中任一项所述的溶液，其中粘度在水性条件下增加超过1000厘泊(cP)，诸如超过5000cP，例如超过10000cP，诸如超过50000cP，例如超过100000cP。
16.根据前述权利要求中任一项所述的溶液，其中所述溶液在水性条件下小于5小时，诸如小于4小时，例如小于3小时，诸如小于2小时内凝固。
17.根据前述权利要求中任一项所述的溶液，其中所述水性条件是体内条件。
18.根据前述权利要求中任一项所述的溶液，其中所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、异丁醇、叔丁醇、苯甲醇、碳酸丙烯酯和二甲亚砜。
19.根据前述权利要求中任一项所述的溶液，所述溶液还包含甘油单酯、甘油二酯和/或甘油三酯。
20.根据前述权利要求中任一项所述的溶液，其中所述荧光染料配位至放射性核素。
21.根据前述权利要求中任一项所述的溶液，其中所述放射性核素选自Tc-99m、In-111、Ga-67、Lu-177、Tl-201、Sn-117m、Cu-64、Mn-52、Zr-89、Co-55、Sc-44、Ti-45、Sc-43、Cu-61、As-72、Te-152、F-18、Ga-68、C-11、Nd-140和Te-149。
22.根据前述权利要求中任一项所述的溶液，所述溶液包含Cu-64和PC1、PC2和/或PC3。
23.根据前述权利要求中任一项所述的溶液，所述溶液包含另外的成像剂。
24.根据前述权利要求中任一项所述的溶液，其中所述另外的成像剂选自X射线剂、CT剂、MRI剂、PET剂和SPECT剂。
25.根据前述权利要求中任一项所述的溶液，其中所述另外的成像剂具有根据式(III)的结构，
Figure FDA0002841420120000031
26.根据前述权利要求中任一项所述的溶液用作体内诊断工具。
27.一种体内成像的方法，所述方法包括：
a.向有此需要的个体施用根据前述权利要求中任一项所述的溶液，
b.所述荧光染料的激发，以及
c.所述荧光染料的检测。
28.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过注射和/或涂抹来施用所述溶液。
29.根据前述权利要求中任一项所述的溶液用于体内成像的用途。
30.根据前述权利要求中任一项所述的溶液用作基准标记物的用途。
31.根据前述权利要求中任一项所述的溶液用于引导外科手术的用途。
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