CN112626163B - 一种评价敏感皮肤不适感的细胞学方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种评价敏感皮肤不适感的细胞学方法，包括以下步骤：使用待检物处理细胞，再用刺激物激活细胞，检测荧光信号，对待检物对抗敏感皮肤不适感的效果做出评价。此方法应用面广，可特异性地针对TRPV1的信号通路，且与人体临床皮肤不适感测试的数据趋势一致。TRPV1高表达HaCaT细胞株可模拟敏感性皮肤更容易产生不适感的特点，应用于体外大规模筛选验证植物提取物、各类活性成分的功效。同时此方法成本低、通量高、实验周期短、易于定量，可减少动物实验、人体实验。
Description
技术领域
本发明涉及细胞学检测技术领域，尤其涉及一种评价敏感皮肤不适感的细胞学方法。
背景技术
基于世界各地敏感性皮肤流行病学调查发现，全球有超50％的人为敏感性皮肤，敏感性皮肤严重影响生活质量。敏感性皮肤指对于常规刺激(正常状态不出现异常感觉)出现不适感觉(刺痛、灼痛、疼痛、瘙痒及麻刺感)的一种综合症，该不适感不能被任何皮肤病相关皮损所揭示，皮肤外观可正常或伴有红斑，敏感性皮肤可累及全身任何部位，特别是面部皮肤不适感。
敏感性皮肤的判定或评价，大部分均采用人体测试，使用乳酸、辣椒素等涂抹于面部皮肤，不仅会引发刺痛感、瘙痒感、麻刺感等，还会出现脱屑、红肿等现象。长期使用损坏性的评价方法，更会造成皮肤屏障受损，面部皮肤持续更加敏感。因此，人体测试方法容易对受试者造成面部损伤或心理损伤，干扰受试者的正常生活；此外，皮肤感受的评价，人体测试也以受试者的主观评价为主，无法通过仪器获得精准的定量结果。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的第一方面提供了一种评价敏感皮肤不适感的细胞学方法，包括以下步骤：使用待检物处理细胞，再用刺激物激活细胞，检测荧光信号，对待检物对抗敏感皮肤不适感的效果做出评价。
作为一种优选的技术方案，所述待检物中植物活性成分的浓度为0～10wt％，0除外。
作为一种优选的技术方案，所述细胞为HaCaT细胞。
作为一种优选的技术方案，所述细胞为TRPV1转染HaCaT细胞。
作为一种优选的技术方案，所述刺激物选自乳酸、水杨酸、乙醇酸、苯氧乙醇、辣椒素、烟酰胺、维A醇、视黄醇、视黄酸中的一种或多种的混合。
作为一种优选的技术方案，所述细胞学方法中刺激物激活细胞的阳离子通道。
作为一种优选的技术方案，所述荧光信号为钙离子的荧光信号。
作为一种优选的技术方案，所述评价的标准为：比较含有刺激物的实验组的荧光值与不含有刺激物的空白组的荧光值，荧光值差值大于30，则为具有刺激性。
本发明的第二方面提供了一种如上所述的细胞学方法在植物提取物缓解皮肤不适感的功效评价中的应用。
本发明的第三方面提供了一种如上所述的细胞学方法在化妆品、皮肤医学、生物医药领域的应用。
有益效果：本发明提供了一种评价敏感皮肤不适感的细胞学方法，此方法应用面广，可特异性地针对TRPV1的信号通路，且与人体临床皮肤不适感测试的数据趋势一致。TRPV1高表达HaCaT细胞株可模拟敏感性皮肤更容易产生不适感的特点，应用于体外大规模筛选验证植物提取物、各类活性成分的功效。同时此方法成本低、通量高、实验周期短、易于定量，可减少动物实验、人体实验。
附图说明
为了进一步解释说明本发明中提供的一种评价敏感皮肤不适感的细胞学方法的有益效果，提供了相应的附图，需要指出的是本发明中提供的附图只是所有附图中选出来的个别示例，目的也不是作为对权利要求的限定，所有通过本申请中提供的附图获得的其他相应图谱均应该认为在本申请保护的范围之内。
图1为使用共聚焦显微镜对HaCaT、HaCaT-TRPV1-OE拍照得到的图像。
图2为中性红染色法检测HaCaT、HaCaT-TRPV1-OE细胞数量的检测结果。
图3为HaCaT、HaCaT-TRPV1-OE、HaCaT-TRPV1-NT在辣椒素刺激下TRPV1的表达量的实验结果。
图4为大麻二酚对辣椒素刺激下TRPV1的抑制效果测试。
图5为皱皮木瓜提取物对辣椒素刺激下TRPV1的抑制效果测试。
图6为青皮提取物对辣椒素刺激下TRPV1的抑制效果测试。
图7为橙皮苷对辣椒素刺激下TRPV1的抑制效果测试。
图8为柚皮苷对辣椒素刺激下TRPV1的抑制效果测试。
图9为橘皮苷对辣椒素刺激下TRPV1的抑制效果测试。
图10为青皮提取物对苯氧乙醇刺激下TRPV1的抑制效果测试。
图11为青皮提取物对烟酰胺刺激下TRPV1的抑制效果测试。
图12为青皮提取物对乳酸刺激下TRPV1的抑制效果测试。
图13为皱皮木瓜提取物对乳酸刺激下TRPV1的抑制效果测试。
具体实施方式
结合以下本发明的优选实施方法的详述以及包括的实施例可进一步地理解本发明的内容。除非另有说明，本文中使用的所有技术及科学术语均具有与本申请所属领域普通技术人员的通常理解相同的含义。如果现有技术中披露的具体术语的定义与本申请中提供的任何定义不一致，则以本申请中提供的术语定义为准。
在本文中使用的，除非上下文中明确地另有指示，否则没有限定单复数形式的特征也意在包括复数形式的特征。还应理解的是，如本文所用术语“由…制备”与“包含”同义，“包括”、“包括有”、“具有”、“包含”和/或“包含有”，当在本说明书中使用时表示所陈述的组合物、步骤、方法、制品或装置，但不排除存在或添加一个或多个其它组合物、步骤、方法、制品或装置。此外，当描述本申请的实施方式时，使用“优选的”、“优选地”、“更优选的”等是指，在某些情况下可提供某些有益效果的本发明实施方案。然而，在相同的情况下或其他情况下，其他实施方案也可能是优选的。除此之外，对一个或多个优选实施方案的表述并不暗示其他实施方案不可用，也并非旨在将其他实施方案排除在本发明的范围之外。
为了解决上述问题，本发明的第一方面提供了一种评价敏感皮肤不适感的细胞学方法，包括以下步骤：使用待检物处理细胞，再用刺激物激活细胞，检测荧光信号，对待检物对抗敏感皮肤不适感的效果做出评价。
本发明中所述待检物即待检测的植物活性成分，其可以是从植物原料中提取得到的单一活性成分，也可以是含有植物活性成分的复合物。本发明中的细胞学方法用于评价植物活性成分对抗敏感皮肤不适感，对植物活性成分的种类不作特殊限定。
在一些优选的实施方式中，所述待检物中植物活性成分的浓度为0～10wt％，0除外；进一步优选的，所述待检物中植物活性成分的浓度为0.01～8wt％。本发明采用特定的浓度范围，可使评价结果与临床数据更为接近。
从评价方法与人体表皮试验的一致性角度考虑，在一些优选的实施方式中，所述细胞为HaCaT细胞(人永生化角质形成细胞)；为了提高用于测试的细胞对刺激物的敏感性，进一步优选的，所述细胞为TRPV1转染HaCaT细胞。
本发明中所述TRPV1是一种钙离子通道蛋白，该受体与刺激物结合后可以激活细胞内的瞬态感受器电位阳离子通道，进而引发痛觉的传递和调制，使皮肤产生不适感。
本发明中所述TRPV1转染HaCaT细胞是指稳定、高表达TRPV1的HaCaT细胞株中的细胞，其构建方法可为本领域技术人员熟知的任何一种，例如将人TRPV1 mRNA序列克隆入pCDH质粒，获得pCDH-TRPV1重组质粒，再将充足质粒转染HaCaT细胞，通过单克隆挑选法得到稳定、高表达TRPV1的HaCaT细胞株；该细胞株也可通过市售得到，例如由Invitrogen公司购入。本发明中的HaCaT细胞为正常人来源的表皮层角质形成细胞，其作为表皮层的主要细胞组成，与皮肤科学高度相关；HaCaT细胞本身就有一定量的TRPV1表达，在皮肤不适感的产生中，角质形成细胞TRPV1的表达较高，且较易激活，通过外源性转染TRPV1至HaCaT细胞，提高细胞对刺激物的敏感性，使评价结果更为精准，与人体测试保持高度一致。
在一些优选的实施方式中，所述刺激物选自乳酸、水杨酸、乙醇酸、苯氧乙醇、辣椒素、烟酰胺、维A醇、视黄醇、视黄酸中的一种或多种的混合；从保持与人体测试一致的角度考虑，进一步优选的，所述刺激物选自乳酸、水杨酸、乙醇酸、苯氧乙醇、烟酰胺、维A醇、视黄醇、视黄酸中的一种或多种的混合。
本发明中所述刺激物为化妆品中常用的制备原料，根据其自身性质可选择性地具有美白淡斑、防腐、抗皱等功效，这类物质可能会对皮肤产生刺激，引起疼痛、刺痛、麻刺、瘙痒等不适感。在化妆品研发过程中，化妆品配方一方面要保留制备原料原有的功效，另一方面要通过不同原料之间的相互作用降低刺激性原料的不良反应，然而配方实际的刺激性难以通过非动物实验或非人体试验的方式得知，甚至对刺激性定量。
在一些优选的实施方式中，所述细胞学方法中刺激物激活细胞的阳离子通道；进一步优选的，所述阳离子通道为钙离子通道。
在一些优选的实施方式中，所述荧光信号为钙离子的荧光信号。
本发明中所述荧光信号的测定方法可为本领域技术人员熟知的任何一种，例如使用钙离子染色剂处理细胞，再使用化学发光酶标仪对荧光信号进行测定。本发明中采用钙内流-荧光探针Fluo-8，配合FlexStation仪器定量检测。
在一些优选的实施方式中，所述评价的标准为：比较含有刺激物的实验组的荧光值与不含有刺激物的空白组的荧光值，荧光值差值大于30，则为具有刺激性。
在一些进一步优选的实施方式中，所述荧光值差值与刺激性大小呈正相关。
本发明的第二方面提供了一种上述细胞学方法在植物提取物缓解皮肤不适感的功效评价中的应用。
本发明的第三方面提供了一种上述细胞学方法在化妆品、皮肤医学、生物医药领域的应用。
实施例
下面通过实施例对本发明进行具体描述。有必要在此指出的是，以下实施例只用于对本发明作进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的专业技术人员根据上述本发明的内容做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1TRPV1高表达细胞株的构建方法
合成含2个酶切位点(EcoRI/BamHI)的人TRPV1 mRNA序列GenBank:AY131289.1，将其克隆入pCDH质粒，获得pCDH-TRPV1重组质粒。将pCDH质粒或pCDH-TRPV1质粒转染入HaCaT细胞，通过单克隆挑选法和实时荧光定量PCR对TRPV1的表达量进行检测，获得稳定高表达TRPV1的HaCaT细胞株(HaCaT-TRPV1-OE)或空白细胞株(HaCaT-TRPV1-NT、HaCaT)。在TRPV1高表达细胞株的构建中，所用到的仪器或试剂见表1。本发明中的TRPV1高表达HaCaT细胞株购自Invitrogen公司。
表1
使用共聚焦显微镜对HaCaT、HaCaT-TRPV1-OE进行拍照，如图1所示，蓝色荧光代表细胞核，红色荧光代表TRPV1，在高表达细胞株(HaCaT-TRPV1-OE)里，TRPV1的表达量更高。
利用中性红染色法检测HaCaT、HaCaT-TRPV1-OE细胞数量，如图2所示，高表达细胞株(HaCaT-TRPV1-OE)，在同样浓度的辣椒素(20μM CAP)刺激下，HaCaT-TRPV1-OE的细胞数量更少、间隙更大，说明其对外界刺激更敏感、更不耐受。
采用钙内流-荧光探针Fluo-8测试TRPV1的表达量，如图3所示，同样浓度的辣椒素(4μM CAP)刺激下，与空白细胞株(HaCaT-TRPV1-NT、HaCaT)相比，高表达细胞株(HaCaT-TRPV1-OE)的细胞荧光信号更强，说明其对外界刺激更敏感、更不耐受，可模拟皮肤不适感的产生。
实施例2基于TRPV1高表达细胞株的刺激性评价方法
本例中主要所用试剂耗材、仪器设备详见表2。
表2
取对数期生长的细胞，弃去培养液，用PBS液(磷酸缓冲盐溶液)清洗2次，加入0.25wt％胰酶，37℃放置5min，DMEM完全培养液终止消化，1000rpm离心3min，用DMEM完全培养液重悬细胞，进行计数，调节细胞浓度为2～2.5×105/ml，每孔100μl加入96孔板中。细胞培养24h后，弃培养液，每孔加入50μl新鲜DMEM完全培养液，加入25μl的25μMFluo 8-AM，室温放置30min。上机检测(FlexStation 3)时，每孔再加入25μl的刺激物，检测Ca2+荧光信号。不同刺激物的最终测试浓度见表3，测试结果见表4，不同刺激物、不同浓度处理下，荧光值有一定的差异。以配方应用中的常用浓度、且较易引发皮肤不适感的浓度作为参照，可评估出高表达细胞株上评价方法的判定标准：设不加刺激物的未处理组相比，荧光值差值大于30以上为具有刺激性，差值越大，刺激越强，部分差值结果见表5。
表3
| 刺激物 | 浓度1 | 浓度2 | 浓度3 | 浓度4 | 浓度5 |
| 苯氧乙醇 | 0.0wt％ | 0.3wt％ | 0.5wt％ | 1.0wt％ | - |
| DL-乳酸 | 0.0wt％ | 0.5wt％ | 2.0wt％ | 4.0wt％ | 8.0wt％ |
| 辣椒素 | 1.25μM | 2.5μM | 5μM | 10μM | 20μM |
| 水杨酸 | 0.0wt％ | 0.5wt％ | 1.0wt％ | 2.0wt％ | 4.0wt％ |
| 视黄酸 | 0.05wt％ | 0.10wt％ | 0.20wt％ | 0.25wt％ | 0.30wt％ |
| 羟基乙酸 | 0.31wt％ | 0.63wt％ | 1.25wt％ | 2.50wt％ | 5.00wt％ |
| 烟酰胺 | 0.31wt％ | 0.63wt％ | 1.25wt％ | 2.50wt％ | 5.00wt％ |
表4
表5
| 刺激物 | 浓度 | 荧光值 | 荧光值差值 |
| 未处理组 | - | 20.74 | 0 |
| 水杨酸 | 1wt％ | 66.28 | 45.53 |
| 视黄酸 | 0.2wt％ | 76.05 | 55.31 |
| 羟基乙酸 | 1.25wt％ | 60.43 | 39.69 |
| 烟酰胺 | 1.25wt％ | 135.94 | 115.19 |
| 苯氧乙醇 | 0.5wt％ | 81.37 | 60.63 |
| DL-乳酸 | 2wt％ | 69.13 | 48.39 |
| 辣椒素 | 5μM | 105.61 | 84.87 |
实施例3评价敏感皮肤不适感的细胞学方法
所述评价敏感皮肤不适感的细胞学方法包括以下步骤：取对数期生长的细胞，弃去培养液，用PBS液(磷酸缓冲盐溶液)清洗2次，加入0.25wt％胰酶，37℃放置5min，DMEM完全培养液终止消化，1000rpm离心3min，用DMEM完全培养液重悬细胞，进行计数，调节细胞浓度为2～2.5×105/ml，每孔100μl加入96孔板中。细胞培养24h后，弃培养液，每孔加入50μl新鲜DMEM完全培养液，加入25μl不同浓度的待检物(包括阴性对照组、阳性对照组、模型组、受试物组)，混匀，加入25μl的25μMFluo 8-AM，室温放置30min。上机检测(FlexStation 3)时，除阴性对照外，每孔加入25μl的刺激物，检测Ca2+荧光信号。检测结束后，显微镜观察细胞形态和细胞单层的完整性，记录细胞的变化，判断是否有细胞毒性。该方法中主要所用试剂耗材、仪器设备详见表2。
依照上述方法，选用辣椒素作为刺激物，进行植物活性成分的筛选评价。不同植物来源的活性成分具有不同的抑制效果，其中大麻二酚(CBD，测试结果见图4)、皱皮木瓜提取物(测试结果见图5)、青皮提取物(GREAF，购自上海珈叶实业有限公司，商品名为悦肤宁Calmnerv CR，测试结果见图6)均具有剂量依赖性的抑制效果，而青皮提取物里的代表性活性单体橙皮苷(测试结果见图7)、柚皮苷(测试结果见图8)、橘皮苷(测试结果见图9)等单一活性成分，均在1mg/ml的浓度下才有较强抑制效果。因此，此评价方法可用于定量筛选活性成分对皮肤不适感模型-TRPV1抑制的效果。
依照上述方法，选用苯氧乙醇、烟酰胺、乳酸分别作为刺激物，青皮提取物作为待检物，进行植物活性成分的筛选评价，测试结果如图10～12所示。
依照上述方法，选用乳酸作为刺激物，皱皮木瓜提取物作为待检物，进行植物活性成分的筛选评价，测试结果如图13所示。
综上，青皮提取物、皱皮木瓜提取物对不同刺激物诱导的TRPV1均有相似的抑制效果。
实施例4细胞学方法与人体测试方法的比较
选择20-28例敏感性皮肤受试者，于脸颊或鼻唇沟部位，涂抹5％浓度的乳酸，2min后涂抹0.5％-2％不同浓度的青皮提取物、皱皮木瓜提取物，开始计时，并评价受试者5min之内的主观感受(刺痛感、麻刺感、痒感)的变化，进行评分。其中：无任何感觉记为0分，有任一种轻微感觉记为1分，有任一种中度感觉记为2分，有任一种强度感觉记为3分，结果见表6。
表6
| 处理组 | 0min | 2.5min | 5min |
| 5％乳酸 | 2.32 | 3.15 | 3.50 |
| 5％乳酸+0.5％青皮提取物 | 2.55 | 1.18 | 0.91 |
| 5％乳酸+1％青皮提取物 | 2.29 | 0.95 | 0.73 |
| 5％乳酸+2％青皮提取物 | 2.41 | 0.72 | 0.45 |
| 5％乳酸+0.5％皱皮木瓜提取物 | 2.34 | 1.27 | 1.10 |
| 5％乳酸+2％皱皮木瓜提取物 | 2.42 | 0.88 | 0.53 |
由上述测试结果可以得知，本发明提供的一种评价敏感皮肤不适感的细胞学方法与人体测试的结果相近，具有一致性，使用该细胞学方法能够避免对受试者造成损伤，同时实验周期短且更为客观，便于得到精准的定量结果，在生物医药、化妆品等领域具有广阔的应用前景。
前述的实例仅是说明性的，用于解释本发明所述方法的一些特征。所附的权利要求旨在要求可以设想的尽可能广的范围，且本文所呈现的实施例仅是根据所有可能的实施例的组合的选择的实施方式的说明。因此，申请人的用意是所附的权利要求不被说明本发明的特征的示例的选择限制。在权利要求中所用的一些数值范围也包括了在其之内的子范围，这些范围中的变化也应在可能的情况下解释为被所附的权利要求覆盖。
Claims (2)
1.一种细胞学方法在评价植物提取物缓解皮肤不适感的功效评价中的应用，所述方法为非疾病的诊断方法，其特征在于，包括以下步骤：使用待检物处理细胞，再用刺激物激活细胞，检测荧光信号，对待检物对抗敏感皮肤不适感的效果做出评价；所述细胞为高表达TRPV1的HaCaT细胞株；所述高表达TRPV1的HaCaT细胞株为pCDH-TRPV1质粒转染的的体外培养的HaCaT细胞，所述pCDH-TRPV1质粒的构建方法为将合成的含2个酶切位点EcoRI/BamHI的人TRPV1 mRNA序列GenBank: AY131289.1克隆入pCDH质粒；所述荧光信号为钙离子的荧光信号；所述评价的标准为：采用钙内流-荧光探针Fluo-8，配合FlexStation仪器定量检测，比较含有刺激物的实验组的荧光信号的荧光值与不含有刺激物的空白组的荧光信号的荧光值，荧光值差值大于30，则为具有刺激性；
所述待检物为植物提取物，其中植物活性成分的浓度为0～10wt%，0除外；
所述刺激物选自乳酸、水杨酸、乙醇酸、苯氧乙醇、辣椒素、烟酰胺、维A醇、视黄醇、视黄酸中的一种或多种的混合。
2.如权利要求1所述的细胞学方法在评价植物提取物缓解皮肤不适感的功效评价中的应用，其特征在于，所述细胞学方法中刺激物激活细胞的阳离子通道。
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