CN102747128A

CN102747128A - Trpv3通道蛋白在筛选用于皮肤病治疗或皮肤护理的药物中的应用

Info

Publication number: CN102747128A
Application number: CN2012101646125A
Authority: CN
Inventors: 王克威; 曹旭
Original assignee: BEIJING HAIWEI PANSHI BIOLOGICAL MEDICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: BEIJING HAIWEI PANSHI BIOLOGICAL MEDICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2012-05-24
Filing date: 2012-05-24
Publication date: 2012-10-24

Abstract

本发明公开了TRPV3通道蛋白在筛选用于皮肤病治疗或皮肤护理的药物中的应用。本发明还公开了筛选用于皮肤病治疗或皮肤护理的药物的方法，研究发现弱酸透过皮肤细胞导致细胞内氢离子浓度升高可以激活皮肤细胞的TRPV3离子通道蛋白的功能。激活TRPV3通道蛋白的功能可以加速皮肤细胞死亡、脱落和角质化形成。本发明构建了表达TRPV3通道蛋白的细胞系，采用酸激活表达TRPV3通道蛋白，使TRPV3通道蛋白处于功能增强状态，进而使用化学试剂或化合物作用于表达TRPV3通道蛋白的细胞，通过对作用后的细胞TRPV3通道功能的检测，筛选出TRPV3的激动开放剂或抑制阻断剂以用于研发护肤产品或治疗皮肤相关疾病的药物。

Description

TRPV3通道蛋白在筛选用于皮肤病治疗或皮肤护理的药物中的应用

技术领域

本发明涉及TRPV3通道蛋白的新用途，特别涉及TRPV3通道蛋白在筛选用于皮肤病治疗或皮肤护理的药物中的应用，本发明还公开了一种筛选用于皮肤病治疗或皮肤护理的药物的方法，使用本发明的方法筛选得到的TRPV3通道的激动开放剂或抑制剂能够用于护肤产品或皮肤相关疾病的治疗药物的研发。

背景技术

瞬时感受器电位（transient receptor potential，TRP）通道是一类在外周和中枢神经系统分布很广泛的阳离子通道蛋白。与经典的由膜电位改变激活或配体（如神经递质等）激活的离子通道不同，TRP通道的激活受到许多种因素的调节，包括渗透压、pH值、机械力，以及一些内、外源性配体和细胞内信号分子^[1]，参与生物体内感觉信息传递如视觉、温度觉、痛觉和触觉等、调节胞内Ca²⁺平衡等多种重要的生理功能。

根据同源性的不同，哺乳动物的TRP离子通道超家族可分为七个亚族，包括TRPA（ANKTM1）、TRPC（TRPC1-7）、TRPM（TRPM1-8）、TRPML（mucolipin）、TRPN（NOMPC）、TRPP（polycystin）和TRPV（TRPV1-6），每个亚族中大多包含3-8个成员。TRP通道具有六次跨膜的α螺旋结构域，N端和C端区域均在胞内，并且具有与电压门控钾离子通道（voltage-gated K⁺channels，Kv）和环核苷酸门控通道（cyclic nucleotide-gated ion channels，CNG）相似的胞内长度和胞外环，由第五和第六跨膜结构域共同构成通道孔区。

TRPV亚家族包括TRPV1-6六个基因，根据系统发生以及这几个基因产物的功能和生物物理特性也可以将它们分为两个亚组：TRPV1、TRPV2、TRPV3和TRPV4通道是非选择性阳离子通道，能够被不同温度激活并具有明确的临界温度感受阈值^[14-18]，因而被称为“热敏感”（thermosensitive）通道；而TRPV5和TRPV6则是Ca²⁺选择性通道，对温度不敏感。

温度敏感的TRPV家族成员广泛分布于神经与非神经组织中，其中TRPV3通道主要表达在皮肤组织中。在小鼠的模型上，带有功能增强的TRPV3突变的老鼠表现出强烈的皮肤炎症和毛发脱落症状，而在TRPV3敲除的老鼠表现出卷曲的毛和胡须。近期我们发现在人类身上功能增强的TRPV3突变会导致一种罕见的遗传性皮肤病—Olmsted Syndrome，表现为手足进行性损毁，秃头症和严重的瘙痒。因此，TRPV3在皮肤中发挥着重要的生理和病生理功能。

皮肤是抵御外界微生物，污染物以及紫外线等不良因素的第一道防线。在正常的生理条件下，皮肤表面的pH值为弱酸性，在5.5左右。pH值的维持对于皮肤角质层的屏障和抵抗病菌感染有重要影响。果酸，又叫羟基酸，是从水果中提取的有机酸，包括葡萄酸，苹果酸，甘醇酸和乳酸等，他们在酸性pH下外用于皮肤可以有效降低角质层细胞的凝结作用，去除皮肤的老化细胞，促进新城代谢，因此在临床和化妆品市场有广泛的应用。这里我们报告在皮肤的生理pH值5.5的条件下，使用果酸足以产生细胞内的酸化从而最大的激活皮肤细胞TRPV3通道，TRPV3是一个钙离子通透的离子通道，他的开放容许大量的细胞外钙离子进入胞内，进而引起钙超载和细胞的凋亡。

因此TRPV3通道是一个重要的皮肤药物的靶点。修饰TRPV3通道的功能筛选化合物可以用于治疗皮肤搔痒症、相关皮肤瘙痒疾病、脱毛发疾病和皮肤角化病。

发明内容

本发明通过研究发现弱酸透过皮肤细胞导致的细胞内氢离子浓度升高可以激活皮肤细胞的TRPV3离子通道蛋白的表达。细胞内酸激活TRPV3通道蛋白可以加速皮肤细胞死亡和角质化形成。于是，本发明构建了表达TRPV3通道蛋白的细胞系，采用酸激活表达TRPV3通道蛋白，使TRPV3通道蛋白处于活化状态，进而使用化学试剂或化合物作用于表达TRPV3通道蛋白的细胞系，通过对作用后的细胞的理化性质进行检测，从而筛选出TRPV3通道蛋白的激动开放剂或抑制剂，进一步的将该筛选得到的化合物用于护肤产品或皮肤相关疾病的药物的研发。

本发明的目的之一在于提供TRPV3通道蛋白在筛选用于皮肤病治疗或皮肤护理的药物中的应用。

在本发明中，优选的，所述的TRPV3通道蛋白的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的目的之二在于提供了一种筛选用于皮肤病治疗或皮肤护理的药物的方法。

本发明的一种筛选用于皮肤病治疗或皮肤护理的药物的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）构建表达TRPV3通道蛋白的真核细胞系；

（2）对步骤（1）得到的细胞系进行培养；

（3）采用酸处理步骤（2）得到的细胞系，从而激活TRPV3通道蛋白的表达；

（4）采用不同种化合物对含有激活后的TRPV3通道蛋白的细胞进行处理；

（5）对处理后的细胞的理化性质进行检测，从而筛选出TRPV3通道蛋白的激动开放剂或抑制剂。

在本发明中，优选的，步骤（1）中所述的细胞系包括人胚胎肾细胞系（HEK-293）以及HaCaT皮肤细胞系。

在本发明中，优选的，步骤（2）中所述的细胞培养是将细胞铺于12mm的圆形盖玻片上，采用24孔板进行培养。

在本发明中，优选的，步骤（3）中所述的酸为果酸，pH值为5.5。

优选的，所述的果酸包括葡萄酸，苹果酸，甘醇酸和乳酸。

更优选的，所述的果酸为甘醇酸。

在本发明的一个具体实施例中，采用100mM甘醇酸在pH 5.5条件下持续作用细胞200秒，激活HEK293细胞中TRPV3通道蛋白的表达。

在本发明中，优选的，步骤（5）中所述的对处理后的细胞的理化性质进行检测包括采用膜片钳技术进行检测及/或采用钙荧光成像系统进行检测。

本发明通过将表达TRPV3通道蛋白的基因构建真核表达载体转染真核细胞，进而诱导表达出有活性的TRPV3通道蛋白，进一步研究发现该通道蛋白能够被酸激活表达，激活后的TRPV3通道蛋白对抑制剂及激动剂更为敏感，当采用化合物对细胞进行处理时，化合物便以激活或抑制的方式作用于TRPV3通道蛋白，通过对处理后的细胞的理化性质进行检测，从而筛选出能够用于皮肤病治疗或皮肤护理的药物。

本发明的一种筛选用于皮肤病治疗或皮肤护理的药物的方法，其操作简单，快捷，筛选实验是在微量筛选系统中完成的，样品用量一般在微克级(μg)，节省了样品资源，同时节省了实验材料，降低了单药筛选成本；采用本发明的方法能够提高药物筛选的效率和结果的准确性，能够实现药物的高通量的筛选。

附图说明

图1A为100mM甘醇酸在pH 5.5条件下激活HEK293中TRPV3通道蛋白表达的电流图；图1B为100mM甘醇酸在pH 5.5条件下激活HaCaT皮肤细胞系中TRPV3通道蛋白表达的电流图；

图2A为甘醇酸通过改变细胞内侧氢离子浓度激活TRPV3通道蛋白表达的电流图；图2B为氢离子激活TRPV3通道蛋白表达的量效曲线；图2C为直接改变细胞外的氢离子对于TRPV3有抑制作用；

图3A为在HEK293细胞系上采用不同的处理后的细胞生长情况；图3B为在HaCaT皮肤细胞系上采用不同的处理后的细胞生长情况。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1构建表达TRPV3通道蛋白的真核细胞系

按照Ensembl网站公布的TRPV3基因序列合成引物，TRPV3 cDNA（cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。）来自北大医院杨勇医生，在上游起始密码之前加入Hind III酶切位点，下游终止密码之后加入BamH I酶切位点，设计的上下游引物为：

上游引物为5’CCC AAGCTTATGAAAGCCCACCCCAAGGAG 3’

下游引物为5’CGCGGATCCCTACACCGAGGTTTCCGGGAA 3’

利用PCR扩增TRPV3目的基因，利用Hind III和BamH I双酶切后，连接进入pcDNA3.1质粒（购买于Invitrogen公司）作为TRPV3的表达载体，转染进入HEK293细胞系。HEK293细胞由UC Davis郑劫教授赠予。利用G418筛选出表达TRPV3的阳性单克隆，扩增后进行功能验证，然后利用蛋白印迹技术证明蛋白的有效表达，利用电生理技术证明蛋白功能。选择能够有效的进行蛋白表达和功能的单克隆细胞为构建成功的表达TRPV3通道蛋白的真核细胞系。

实施例2药物的筛选

1、细胞培养

将实施例1制备得到的转染了TRPV3通道蛋白基因的HEK293细胞培养于含有10%胎牛血清，100U/ml青霉素和链霉素的DMEM培养液中，胰酶消化传代。将细胞铺于12mm的圆形盖玻片上，24孔板培养。

2、酸激活TRPV3通道蛋白的表达

将甘醇酸溶于pH 7.4，含有130mM氯化钠，3mM HEPES的盐溶液中，使得甘醇酸的终浓度为100mM，调节pH为5.5。

利用蠕动泵将细胞培养液替换为上述的含有浓度为100mM甘醇酸的溶液，持续作用细胞200秒，激活HEK293细胞中TRPV3通道蛋白的表达。

3、化合物对含有激活后的TRPV3通道蛋白的细胞进行处理；

将预选化合物，例如苹果酸、柠檬酸或其他果酸、经典的TRPV3激动剂，如2-APB等溶于pH 7.4，含有130mM氯化钠，3mM HEPES的盐溶液中，配制成测试细胞外液，分别利用蠕动泵将含有浓度为100mM的甘醇酸溶液替换为上述的测试细胞外液，灌流细胞上作用200秒，以观察作用后的细胞生长情况。

苹果酸、柠檬酸或其他果酸溶于pH 7.4，含有130mM氯化钠，3mM HEPES的盐溶液中，使得苹果酸、柠檬酸或其他果酸的终浓度为100mM，调节pH为5.5；

经典的TRPV3激动剂2-APB溶于pH 7.4，含有130mM氯化钠，3mM HEPES的盐溶液中，使得2-APB的终浓度为300μM。

4、对处理后的细胞的理化性质进行检测，从而筛选出TRPV3通道蛋白的激动开放剂或抑制剂。

（1）电生理膜片钳测定：

膜片钳技术记录细胞膜电流：膜片钳放大器采用HEKA-EPC10。微电极抛光后，灌充电极内液，控制电阻值在2~4MΩ。记录HEK293细胞所用电极内外液为（mM）：NaCl 130，HEPES 5，EGTA0.3，用NaOH调pH至7.4。微电极与细胞膜形成巨阻封接后，钳制在0mV等待5-10min后开始按照不同的刺激程序进行电流记录。

（2）钙荧光成像检测

弃培养基，加入预热的（37°C）Ringers液洗三遍；加入fluo-3储存液，其终浓度为5μM，同时加入助溶剂F-127，终浓度为0.02%；37°C孵箱闭关孵育30m-60m，避光；预热的（37°C）Ringers洗去fluo-3染料，加入100μL 37°C Ringers液平衡10m；检测程序:baseline 15次扫描，15s暂停，加150nM capsaicin或者100μM 2-APB(TRPV2,3,4)，20次扫描，15s暂停，加入menthol,20次扫描。

5、根据以上测定结果筛选出TRPV3通道蛋白的激动开放剂或抑制剂

测定结果发现采用含有100mM pH 5.5的苹果酸或柠檬酸的测试细胞外液、以及含有300μM的2-APB的测试细胞外液处理表达TRPV3通道蛋白的HEK293细胞和人源皮肤细胞HaCaT均能够明显激活TRPV3通道蛋白和增加细胞膜TRPV3电流（图1所示）；采用钙荧光成像检测发现采用上述化合物处理后的HEK293细胞内钙离子浓度明显升高，且细胞出现不同程度的细胞凋亡现象（图3所示）。

通过以上实施例证明，本发明的方法能够用于筛选TRPV3通道蛋白的激动开放剂或抑制剂，从而为进一步研究皮肤病治疗或皮肤护理的药物提供基础。

试验例1酸激活TRPV3通道蛋白的机制的研究

1、不同pH值的甘醇酸对HEK293中TRPV3通道蛋白的影响

用于培养HEK293细胞的正常细胞外液为130mM氯化钠，3mM HEPES，pH 7.4的盐溶液。测试细胞外液含有100mM甘醇酸，130mM氯化钠，3mM HEPES/MES，利用氢氧化钠调节到目的pH值。在全细胞记录形成后，利用蠕动泵将正常细胞外液替换为不同pH值的测试细胞外液，结果如图1A所示，结果显示pH 5.5的含有100mM甘醇酸的测试细胞外液在作用于细胞后200秒的过程中能够缓慢激活HEK293中TRPV3通道蛋白的电流图而在中性溶液不可以。图1B结果为含有100mM甘醇酸的测试细胞外液在pH 5.5条件下在HaCaT皮肤细胞系上激活TRPV3通道蛋白的电流图。

图2A为表明甘醇酸激活TRPV3的机理在于通过改变细胞内侧氢离子浓度。在pH 5.5的时候可以达到TRPV3的最大开放状态。图2B为氢离子激活TRPV3的量效曲线。图2C为表明直接改变细胞外的氢离子对于TRPV3有抑制作用。

2、采用不同处理方式处理的HEK293细胞系及HaCaT皮肤细胞系后细胞的生长情况

2.1采用不同处理方式处理的HEK293细胞系的生长情况

将HEK 293细胞培养于含有10%胎牛血清，100U/ml青霉素和链霉素的DMEM培养液中，胰酶消化传代。

传代后的HEK 293细胞等份于7个培养皿中，给予相应的处理条件，第一组为转染了荧光蛋白eYFP空载体的对照试验，第二组为转染了荧光蛋白eYFP空载体并给予pH 5.5的含有10mM甘醇酸的测试细胞外液处理的细胞试验，第三组为转染了TRPV3通道但给予正常培养的对照试验，第四组为转染了TRPV3通道并给予含有pH 5.5的10mM甘醇酸的测试细胞外液处理的细胞试验，第五组为转染了TRPV3通道并给予pH 7.4的含有10mM甘醇酸的测试细胞外液处理的细胞试验，第六组为转染了TRPV3通道并给予pH 5.5的含有10mM甘醇酸的测试细胞外液，并加入非特异的TRP通道阻断剂处理的细胞试验，第七组为共转染了TRPV3通道和显性负效应抑制TRPV3通道功能的TRPV3孔区突变（TRPV3-E631K/D641K）的突变体并给予pH 5.5的含有10mM甘醇酸的测试细胞外液处理的细胞试验。

在培养12小时后，取出弃掉培养液后，用PBS溶液洗3遍，室温条件下利用Hoechest和PI双染色。由于Hoechest可以染色所有细胞的核（蓝色）而PI只可以与已经死亡的细胞的核相结合（红色），在显微镜下对培养皿不同视野下进行红色标记的细胞核对蓝色标记的细胞核进行计数统计来得到细胞的死亡百分比。

结果发现，细胞外使用在pH 5.5的环境下可以造成表达TRPV3的细胞大量死亡，同时这样的死亡可以被TRP通道和显性负效应的TRPV3突变体所挽救，结果如图3A所示。

2.2采用不同处理方式处理的HaCaT皮肤细胞系的生长情况

将培养HaCaT细胞等份的传代于4个培养皿中，给予相应的处理条件，第一组为正常培养的对照细胞，第二组为给予pH 5.5的含有10mM甘醇酸的测试细胞外液处理的细胞试验，第三组为pH 5.5的含有10mM甘醇酸的测试细胞外液，并加入非特异的TRP通道阻断剂处理的细胞试验，第四组为共转染了TRPV3通道和显性负效应抑制TRPV3通道功能的TRPV3孔区突变（TRPV3-E631K/D641K）的突变体并给予pH 5.5的含有10mM甘醇酸的测试细胞外液处理的细胞试验。利用同样的Hoechest和PI双染色统计细胞死亡的百分比。

结果发现。在HaCaT皮肤细胞系上，TRPV3参与了甘醇酸在pH 5.5时引起的细胞死亡，结果如图3B所示。

因此，本发明得出果酸通过升高细胞内氢离子继而激活TRPV3通道是引起皮肤细胞脱落的重要基础机制。

Claims

1.TRPV3通道蛋白在筛选用于皮肤病治疗或皮肤护理的药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的TRPV3通道蛋白的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

3.一种筛选用于皮肤病治疗或皮肤护理的药物的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）构建表达TRPV3通道蛋白的真核细胞系；

（2）对步骤（1）得到的细胞系进行细胞培养；

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（1）中所述的细胞系包括人胚胎肾细胞系（HEK-293）以及HaCaT皮肤细胞系。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（2）中所述的细胞培养是将细胞铺于12mm的圆形盖玻片上，采用24孔板进行培养。

6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（3）中所述的酸为果酸，pH值为5.5。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的果酸包括葡萄酸，苹果酸，甘醇酸和乳酸。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的果酸为甘醇酸。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，采用100mM甘醇酸在pH 5.5条件下持续作用细胞200秒，激活HEK293细胞中TRPV3通道蛋白的表达。

10.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（5）中所述的对处理后的细胞的理化性质进行检测包括采用膜片钳技术进行检测及/或采用钙荧光成像系统进行检测。