CN112617201B - 一种lf/dha-spi/dha微聚集体的应用 - Google Patents
一种lf/dha-spi/dha微聚集体的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112617201B CN112617201B CN202011525401.0A CN202011525401A CN112617201B CN 112617201 B CN112617201 B CN 112617201B CN 202011525401 A CN202011525401 A CN 202011525401A CN 112617201 B CN112617201 B CN 112617201B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- dha
- spi
- emulsion
- digestion
- micro
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 29
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 claims abstract description 11
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 claims abstract description 11
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 claims description 100
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 23
- 238000010008 shearing Methods 0.000 claims description 19
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 claims description 18
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 claims description 18
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 claims description 18
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 claims description 17
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 15
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 claims description 8
- 238000005303 weighing Methods 0.000 claims description 8
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 7
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 claims description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 4
- 230000008961 swelling Effects 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 abstract description 93
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 abstract description 24
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 9
- 235000013305 food Nutrition 0.000 abstract description 9
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 abstract description 8
- 238000010276 construction Methods 0.000 abstract description 3
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 abstract description 3
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 abstract description 3
- MBMBGCFOFBJSGT-KUBAVDMBSA-N docosahexaenoic acid Natural products CC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCC(O)=O MBMBGCFOFBJSGT-KUBAVDMBSA-N 0.000 description 169
- 235000020669 docosahexaenoic acid Nutrition 0.000 description 167
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 24
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 21
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 20
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 20
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 19
- 238000011160 research Methods 0.000 description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 description 13
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 210000004051 gastric juice Anatomy 0.000 description 10
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 10
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 7
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 7
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 7
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 7
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 7
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 6
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 6
- 230000013777 protein digestion Effects 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 5
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 5
- 239000001045 blue dye Substances 0.000 description 4
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 4
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 4
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 4
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- SHXOKQKTZJXHHR-UHFFFAOYSA-N n,n-diethyl-5-iminobenzo[a]phenoxazin-9-amine;hydrochloride Chemical compound [Cl-].C1=CC=C2C3=NC4=CC=C(N(CC)CC)C=C4OC3=CC(=[NH2+])C2=C1 SHXOKQKTZJXHHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VOFUROIFQGPCGE-UHFFFAOYSA-N nile red Chemical compound C1=CC=C2C3=NC4=CC=C(N(CC)CC)C=C4OC3=CC(=O)C2=C1 VOFUROIFQGPCGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 3
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 3
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 3
- 239000003833 bile salt Substances 0.000 description 3
- 229940093761 bile salts Drugs 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 235000021588 free fatty acids Nutrition 0.000 description 3
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 3
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 2
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 2
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 2
- 229940090949 docosahexaenoic acid Drugs 0.000 description 2
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 2
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 2
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 2
- 235000013350 formula milk Nutrition 0.000 description 2
- 235000013376 functional food Nutrition 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 239000004519 grease Substances 0.000 description 2
- -1 heat Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 2
- 239000011229 interlayer Substances 0.000 description 2
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 2
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 2
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 2
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 2
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 2
- 238000003921 particle size analysis Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 2
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 241000978750 Havardia Species 0.000 description 1
- 102000010445 Lactoferrin Human genes 0.000 description 1
- 108010063045 Lactoferrin Proteins 0.000 description 1
- 108010073771 Soybean Proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005314 correlation function Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 235000019621 digestibility Nutrition 0.000 description 1
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 238000005189 flocculation Methods 0.000 description 1
- 230000016615 flocculation Effects 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000007661 gastrointestinal function Effects 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- CSSYQJWUGATIHM-IKGCZBKSSA-N l-phenylalanyl-l-lysyl-l-cysteinyl-l-arginyl-l-arginyl-l-tryptophyl-l-glutaminyl-l-tryptophyl-l-arginyl-l-methionyl-l-lysyl-l-lysyl-l-leucylglycyl-l-alanyl-l-prolyl-l-seryl-l-isoleucyl-l-threonyl-l-cysteinyl-l-valyl-l-arginyl-l-arginyl-l-alanyl-l-phenylal Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 CSSYQJWUGATIHM-IKGCZBKSSA-N 0.000 description 1
- 229940078795 lactoferrin Drugs 0.000 description 1
- 235000021242 lactoferrin Nutrition 0.000 description 1
- 230000020958 lipid digestion Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 238000010951 particle size reduction Methods 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000007065 protein hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 229940071440 soy protein isolate Drugs 0.000 description 1
- 235000019710 soybean protein Nutrition 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000004206 stomach function Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 208000019553 vascular disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
- 238000000733 zeta-potential measurement Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
- A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
- A23L33/115—Fatty acids or derivatives thereof; Fats or oils
- A23L33/12—Fatty acids or derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L29/00—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof
- A23L29/03—Organic compounds
- A23L29/045—Organic compounds containing nitrogen as heteroatom
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
- A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Mycology (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
Abstract
本发明公开了一种LF/DHA‑SPI/DHA微聚集体在婴幼儿及胃肠道脆弱人群食品中的应用，本申请围绕异型聚集效应，构建具有良好DHA体外模拟消化特性的微聚集体，探索DHA微聚集体的有效构建途径，提高DHA体外模拟消化，应用上为DHA稳态化提供全新的解决手段，从而为其应用提供指导作用。
Description
技术领域
本发明属于DHA乳状液微聚集体，具体涉及一种LF/DHA-SPI/DHA微聚集体的应用。
背景技术
二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic acid，DHA）具有预防血管疾病和免疫调节等功能，在功能性食品、婴幼儿配方奶粉中广泛应用。但其结构具有六个双键，在光、氧气和热及金属离子等条件下容易氧化，在应用中受到限制。DHA具有重要的生理功能，但在加工和储藏中DHA易氧化会造成产品品质破坏，DHA理化学稳定性及其消化吸收特性有待提高。实现功能因子稳态化与提高其消化吸收率，成为提高功能性食品品质的关键。采用新型稳态化递送载体技术，提高产品中功能性油脂稳定性与消化吸收性，对于保障食品营养安全生产具有重要意义。
婴幼儿由于肠胃功能发育不完善，其食品中添加了很多营养物质，包括DHA等，某些肠胃受过损伤或者经过手术后的人群，肠胃功能十分脆弱，需要补充营养，但是对于其添加的营养物质是否能够消化，是否可以提高其利用率，国内外做了很多研究。
异型聚集效应基于异型微滴间静电相互作用，形成微聚集体，其具有特定刚性的三维网状结构，可改善乳液特性。目前针对异型聚集，构建乳状液微聚集体，未见有添加到肠道脆弱人群食品中，也未见有提高DHA体外模拟消化的报道。面临的问题是提高DHA体外模拟消化，提高脂肪酸释放，进而提升DHA生物利用率。异型聚集体可应用于包埋功能性油脂的理化稳定性研究，但LF/DHA-SPI/DHA微聚集体消化吸收的研究尚不明确。因此有必要考察LF和SPI异型聚集构建的DHA微聚集体消化释放过程。
发明内容
基于异型聚集效应，本专利申请构建了DHA微聚集体递送系统。基于研究DHA微聚集体体外模拟消化特性，旨在改善DHA的体外模拟脂肪酸释放率，提高其生物利用率，从而对其应用有了指导作用。
体外模拟消化可用于研究脂质在口、胃及小肠阶段对乳剂脂质消化特性的研究。口、胃和小肠阶段均可影响脂质在胃肠道的消化特性。目前，异型聚集效应的研究主要集中于物理化学稳定特性的研究和微聚集体流变学特性的影响，微聚集体可用于功能性因子的稳态化，但目前对于异型聚集构建形成微聚集体消化特性的研究还较少，同时，微聚集体对功能因子体外消化特性的改善并不明确，因此研究LF/DHA-SPI/DHA微聚集体消化特性研究具有重要意义。
本发明提供一种LF/DHA-SPI/DHA微聚集体在婴幼儿及胃肠道脆弱人群食品中的应用。本专利申请围绕异型聚集效应，构建具有良好DHA体外模拟消化特性的微聚集体，探索DHA微聚集体的有效构建途径，提高DHA体外模拟消化，应用上为DHA稳态化提供全新的解决手段。从而为其应用提供指导作用。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种LF/DHA-SPI/DHA微聚集体在婴幼儿及胃肠道脆弱人群食品中的应用。
优选地，所述LF/DHA-SPI/DHA微聚集体的制备方法，包括以下步骤：
（1）制备LF/DHA乳状液；
（2）制备SPI/DHA乳状液；
（3）制备LF/DHA-SPI/DHA微聚集体，将步骤（1）制备的LF/DHA乳状液与和步骤（2）制备的SPI/DHA乳状液异型聚集制成LF/DHA-SPI/DHA微聚集体。
优选地，所述步骤（1）中制备LF/DHA乳状液的方法为：准确称取LF粉末，溶于1 mM的pH 6.0磷酸盐缓冲溶液，在40 ℃搅拌2 h，并过夜溶胀，制成LF溶液；准确称取藻油DHA作为油相；高速剪切均质仪19000 rmp粗剪切3 min，剪切过程中加入DHA油相，获得LF/DHA粗乳液；LF/DHA粗乳状液微射流，均质压力为50 MPa，均质3次，得到LF/DHA乳状液。
优选地，LF溶液的浓度为1-5 wt %，油相与LF溶液的质量比为1:9。
优选地，所述步骤（2）中制备SPI/DHA乳状液的方法为：准确称取SPI粉末，溶于1mM的pH 6.0的磷酸盐缓冲溶液，在50 ℃搅拌2 h，并过夜溶胀，制成SPI溶液；准确称量一定量的藻油DHA作为油相；高速剪切均质仪19000 rmp粗剪切3 min，剪切过程中加入DHA油相，制备得到SPI/DHA的粗乳液；SPI/DHA粗乳状液通过微射流，均质压力为50 MPa，均质3次，进一步均质得到SPI/DHA乳状液。
优选地，其特征在于，SPI溶液的浓度为1-2 wt%，油相与SPI溶液的质量比为1:9。
优选地，所述步骤（3）中制备LF/DHA乳状液与SPI/DHA乳状液的质量比为1-9:9-1。
更优选地，所述步骤（3）中制备LF/DHA乳状液与SPI/DHA乳状液的质量比为1:1。
体外模拟消化过程：
在体外模拟消化实验前，将样品用1 mM pH 6.0 磷酸缓冲液稀释5倍，微滴中的油相浓度为2 %，稀释后备用。
口腔消化模拟阶段：40 mL稀释后LF/DHA-SPI/DHA微聚集体加入40 mL口腔模拟液，调节pH为6.8，温度37 °C，振荡频率为100 rpm，振荡10 min。
胃消化模拟阶段：取40 mL口腔消化后样品加入40 mL模拟胃液，调节pH至2.5，温度37 °C、摇床振荡频率为100 rpm，振荡2 h。
小肠消化模拟阶段：取胃消化后的样品60 g，调节pH至7.0。然后加入3 mL模拟肠液，7 mL胆盐（53.6 mg/mL），5 mL脂肪酶（24 mg/mL），使用pH滴定仪，恒定pH 7.0自动滴定。
体外模拟消化微观结构分析：
通过共聚焦显微镜观察乳状液微结构。蛋白质用尼罗蓝A染色，藻油DHA油相用尼罗红染色，用1 mM 磷酸盐缓冲液稀释5倍后进行观测。尼罗红（检测波长为590 nm，激发波长为488 nm）和尼罗蓝A（检测波长为650 nm，激发波长为637 nm）。使用10目镜在60倍放大（油浸）下进行成像，使用软件物理放大16倍。每个样品重复观察3次。
胃阶段蛋白质消化分析：
15% SDS-PAGE 凝胶配制、分离胶配置，将配好的浓缩胶溶液倒入到分离胶上层，加满整个玻璃板夹层。插入梳子。室温放置30 min，待浓缩胶凝固。
样品处理：取40 μL蛋白样品加入10 μL 4 X loading buffer中，100 ℃加热10min。上样：将10 X running buffer 稀释成1 X，加满电泳槽的内槽和外槽。取5 μg蛋白样品加入到胶孔中。设置电压300 V，跑胶30 min。将胶取出，浸泡在考马斯亮蓝染液中，微波炉加热煮沸1 min。倒掉考马斯亮蓝染液，用清水清洗胶两次。将胶加入到清水中，微波炉加热1 min脱色。将胶取出放入清水中，震荡过夜。将胶取出，放置在凝胶成像仪中，拍照。
脂肪酸释放率的测定：
样品经过口腔、胃消化后，使用自动恒 pH 滴定仪，模拟小肠消化阶段，pH值恒为7.0，通过获得的NaOH消耗量计算脂肪酸释放率。
有益效果
本发明提供了一种LF/DHA-SPI/DHA微聚集体的应用，通过制备方法制备的微聚集体，能够显著提高了DHA的体外模拟消化特性，有效解决了DHA应用于食品时生物利用率低的问题。本发明通过利用LF/DHA-SPI/DHA微聚集体提高DHA体外模拟消化利用率。本发明的LF/DHA-SPI/DHA微聚集体中DHA体外模拟消化利用率明显高于纯DHA、传统DHA乳状液的脂肪酸释放率，且LF/DHA-SPI/DHA微聚集体制备方法操作简单，条件可控，易于生产。
通过研究LF/DHA乳液、SPI/DHA乳液、LF/DHA-SPI/DHA微聚集体在体外模拟消化各阶段中平均粒径、Zeta-电位、微观结构、蛋白质消化以及脂肪酸释放率表明：
（1）LF/DHA-SPI/DHA形成的微聚集体可以在一定程度上促进蛋白质在胃液阶段的消化。
（2）LF/DHA乳液、SPI/DHA乳液、LF/DHA-SPI/DHA微聚集体在口腔、胃的消化阶段对DHA在小肠阶段的消化有一定的影响。
（3）LF/DHA-SPI/DHA微聚集体可以提高DHA游离脂肪酸释放率。将为今后微聚集体的消化特性研究提供相关的参考和理论基础，为在婴幼儿及胃肠道脆弱人群食品中的应用提供了方向。
附图说明
图1为LF/DHA-SPI/DHA微聚集体制备过程；
图2为LF/DHA-SPI/DHA微聚集体消化阶段的粒径变化；
图3为LF/DHA-SPI/DHA微聚集体消化阶段的zeta-电位变化；
图4为LF/DHA-SPI/DHA微聚集体不同消化阶段的微观结构图；
图5为LF/DHA-SPI/DHA微聚集体蛋白凝胶的电泳图谱；
图6为LF/DHA-SPI/DHA微聚集体小肠消化阶段的脂肪酸释放率变化。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
1材料与仪器
1.1 实验材料与试剂
材料及试剂见表1。
表1 实验材料及试剂表
1.2实验仪器
实验仪器见表2。
表2 实验仪器表
Table Instruments and facilities
2研究内容
制备理化稳定性最佳的LF/DHA小微滴-SPI/DHA小微滴微聚集体。利用体外模拟消化，研究微聚集体在口腔、胃和小肠阶段微聚集体消化特性，测定微聚集体的粒径、Zeta-电位、微观结构、胃阶段蛋白质消化和DHA脂肪酸释放率，研究微聚集体在消化阶段的变化以及微聚集体的消化特性。
3实验方法
3.1乳状液制备
3.1.1乳状液的制备
3.1.1.1LF/DHA乳状液的制备
准确称取LF粉末（1 wt%、2 wt%、3 wt%、4 wt%、5 wt%），溶于1 mM磷酸盐缓冲溶液（pH 6.0）中，在40 ℃搅拌2 h，并过夜溶胀。在实验前，将溶液溶解在40 ℃水浴中30 min以确保乳铁蛋白充分溶解，并制备得到不同LF浓度的LF/DHA乳液。准确称取藻油DHA（10%，w/w）作为油相。高速剪切均质仪19000 rmp粗剪切3 min，剪切过程中缓慢加入DHA油相，确保粗剪切乳液更均一，获得LF/DHA粗乳液。LF/DHA粗乳状液微射流，均质压力为50 MPa，均质3次，进一步均质的到LF/DHA乳状液。
3.1.2乳状液的制备
3.1.2.1SPI/DHA乳状液的制备
准确称取SPI粉末（1 wt%、1.25 wt%、1.5 wt%、1.75 wt%、2 wt%），溶于1mM的磷酸盐缓冲溶液，pH 6.0，在50 ℃搅拌2 h，并过夜溶胀。实验前，50 ℃水浴中溶解30 min，确保SPI充分溶解，并制备出不同SPI浓度的SPI溶液。准确称量一定量的藻油DHA（10%，w/w）作为油相。高速剪切均质仪19000 rmp粗剪切3 min，剪切过程中缓慢加入DHA油相，确保粗剪切的乳液更均一，制备得到SPI/DHA的粗乳液。SPI/DHA粗乳状液通过微射流，均质压力为50MPa，均质3次，进一步均质得到SPI/DHA乳状液。
3.1.3 LF/DHA-SPI/DHA微聚集体的制备
取3.5 wt%带正电LF/DHA乳液、1.5 wt%带负电SPI/DHA乳液，按不同比例均匀混合均匀（0:10，1:9，2:8，3:7，4:6，5:5，6:4，7:3，8:2，9:1，10:0；w/w），形成11组不同比例的LF/DHA-SPI/DHA微聚集体。微聚集体混合模拟过程如图1。
3.2体外模拟消化过程
在体外模拟消化实验前，将样品用 1 mM pH 6.0 磷酸缓冲液稀释 5 倍使微滴中的油浓度为 2 %，稀释后备用。口腔消化模拟阶段：40 mL稀释后乳液加入40 mL口腔模拟液，调节pH为6.8，温度37 °C，振荡频率为100 rpm，振荡10 min。胃消化模拟阶段：取40 mL口腔消化后样品加入40 mL模拟胃液，调节pH至2.5，温度37 °C、摇床振荡频率为100 rpm，振荡 2 h。小肠消化模拟阶段：取胃消化后的样品 60 g，调节pH至7.0。然后加入3 mL模拟肠液、7 mL胆盐（53.6 mg/mL）、和5 mL脂肪酶 （24 mg/mL），随后使用pH滴定仪，恒定pH 7.0自动滴定。
3.3评价方法
3.3.1粒径分析
测定乳状液的粒径，采用纳米激光粒度仪。基于动态光散射进行分析，测量粒子散射光强度的相关函数。为减少多重光散射对测量误差的影响，样品在粒径测定前用pH 6.0、1 mM磷酸盐缓冲液稀释400倍。取样品加入比色皿放入样品槽中，运行测定方法，折射率比为1.45，测试温度25 ℃，重复测定3次，结果以平均值表示。
电位分析
采用激光粒度仪测量乳状液样品。基于动态光散射原理，通过测定外加电场下颗粒的电泳速度，求出Zeta-电位值。在测定前，为了减少多重光散射对测量误差的影响，用pH6.0、缓冲液1 mM磷酸盐稀释400倍。将样品加入专用电位测定样品槽中，运行测定方法，Zeta-电位，折射率比为1.45，测试温度25 ℃，重复测定3次。
3.3.3体外模拟消化微观结构分析
通过共聚焦显微镜观察乳状液微结构。蛋白质用尼罗蓝A染色，藻油DHA油相用尼罗红染色，用1 mM 磷酸盐缓冲液稀释5倍后进行观测。尼罗红（检测波长为590 nm，激发波长为488 nm）和尼罗蓝A（检测波长为650 nm，激发波长为637 nm）。使用10目镜在60倍放大（油浸）下进行成像，使用软件物理放大16倍。每个样品重复观察3次。
3.3.4胃阶段蛋白质消化分析
15% SDS-PAGE 凝胶配制、分离胶配置，将配好的浓缩胶溶液倒入到分离胶上层，加满整个玻璃板夹层。插入梳子。室温放置30 min，待浓缩胶凝固。
样品处理：取40 μL蛋白样品加入10 μL 4 X loading buffer中，100 ℃加热10min。上样：将10 X running buffer 稀释成1 X，加满电泳槽的内槽和外槽。取5 μg蛋白样品加入到胶孔中。设置电压300 V，跑胶30 min。将胶取出，浸泡在考马斯亮蓝染液中，微波炉加热煮沸1 min。倒掉考马斯亮蓝染液，用清水清洗胶两次。将胶加入到清水中，微波炉加热1 min脱色。将胶取出放入清水中，震荡过夜。将胶取出，放置在凝胶成像仪中，拍照。
3.3.5脂肪酸释放率的测定
样品经过口腔、胃消化后，使用自动恒 pH 滴定仪，模拟小肠消化阶段，pH值恒为7.0，通过获得的NaOH消耗量计算脂肪酸释放率。
4结果与讨论
4.1 DHA微聚集体体外消化过程粒径分析
LF/DHA乳液、SPI/DHA乳液、LF/DHA-SPI/DHA微聚集体口腔消化阶段的平均粒径变化如图 2 所示。口腔模拟消化后，LF/DHA、SPI/DHA乳状液平均粒径没有发生明显的变化，微聚集体经过口腔模拟消化之后的粒径明显低于初始阶段的粒径，一些研究者结果表明口腔阶段消化后平均粒径增大，蛋白质分子易发生聚集絮凝现象，分析LF/DHA、SPI/DHA乳液、LF/DHA-SPI/DHA微聚集体口腔阶段平均粒径降低可能因为测定粒径的稀释过程分散蛋白分子的絮凝。微观结构表明口腔阶段消化后存在聚集现象。
胃模拟消化后，LF/DHA、SPI/DHA乳液、LF/DHA-SPI/DHA微聚集体平均粒径增加，胃阶段平均粒径增加可能因为pH 和离子强度改变导致静电排斥的减弱、胃蛋白酶对蛋白的水解作用。同时，微聚集体经过胃消化之后粒径明显小于SPI/DHA乳状液和LF/DHA乳状液粒径，推测胃消化阶段LF/DHA-SPI/DHA微聚集体被胃蛋白酶水解更彻底。
经过小肠模拟消化后LF/DHA、SPI/DHA乳液、LF/DHA-SPI/DHA微聚集体平均粒径减小，表明在小肠阶段LF/DHA、SPI/DHA乳液、LF/DHA-SPI/DHA微聚集体均完成消化。
4.2DHA微聚集体体外消化过程Zeta-电位分析
LF/DHA、SPI/DHA乳液、LF/DHA-SPI/DHA微聚集体消化阶段的Zeta-电位变化如图3所示。结果表明，SPI/DHA乳状液样品有相对较高的负电荷，是因为pH高于等电点。LF/DHA乳状液初始样品有相对较高的正电荷，是因为pH低于LF的等电点。口腔模拟消化后，LF/DHA的Zeta-电位由正变为负、微聚集体Zeta-电位变负以及SPI/DHA负电荷变少可能是因为体系的pH增加为6.8、粘蛋白分子与微滴表面的相互作用。
LF/DHA、SPI/DHA乳液、LF/DHA-SPI/DHA微聚集体胃模拟消化后，Zeta-电位均变为正值，这是由于胃模拟消化阶段pH 2.5明显低于LF/DHA、SPI/DHA乳液、LF/DHA-SPI/DHA微聚集体等电点。小肠模拟消化后，LF/DHA、SPI/DHA乳液、LF/DHA-SPI/DHA微聚集体的Zeta-电位均变为负值，这可能是由于小肠消化产物含有阴离子游离脂肪酸、胆盐等的影响。
4.3DHA微聚集体体外消化过程微观结构分析
LF/DHA乳液、SPI/DHA乳液和LF/DHA-SPI/DHA微聚集体不同消化阶段的微观结构如图4所示。在初始阶段微观结构与粒径结果相符。口腔消化后所有乳状液样品都发生不同程度的聚集，口腔模拟液中粘蛋白的存在可以导致微滴的聚集。
胃消化后的微观结构可以看出乳液颗粒变大，乳液的整体结构被破坏，这可能是由于胃蛋白酶分解蛋白质产生的物质，胃液阶段使得LF/DHA乳液、SPI/DHA乳液和LF/DHA-SPI/DHA微聚集体蛋白从界面分离，SPI和LF从界面上分离出来消化成纤维状。不同样品不同的微观结构差异可能是由于SPI和LF不同的消化程度。有研究表明，不同样品配方奶粉中蛋白质的消化率会有很大差别。微聚集经过胃消化后平均粒径小，微观结构聚集小，可能由于LF和SPI两者带相同电荷以及微聚集体整体部分，存在静电排斥，与胃蛋白酶接触充分，在胃阶段水解充分。
小肠体外模拟消化后，LF/DHA乳液、SPI/DHA乳液和LF/DHA-SPI/DHA微聚集体大颗粒物质基本消失，LF/DHA和SPI/DHA乳液存在少许不均匀的大颗粒。表明乳液在小肠阶段充分的消化吸收，有研究结果表明，蛋白质只有少数在胃进行了消化，大部分在小肠中进行消化吸收。微观结构表明微聚集体在小肠阶段的消化吸收更好。
4.4 DHA微聚集体体外消化蛋白质消化分析
测定胃消化阶段后蛋白质的分子量，通过蛋白质凝胶电泳，实验结果表明。LF/DHA乳液口腔消化后存在LF（80 KDa）条带，而经过胃液消化后，此部分条带消失，小分子量条带增多，表明LF在胃液阶段被胃蛋白酶水解。SPI/DHA乳液口腔后蛋白条带集中于15 kDa-35kDa，对SPI进行凝胶电泳分析，大豆分离蛋白条带分子量在20 KDa和30-43 KDa。胃蛋白酶选择性主要作用于大豆分离蛋白11S。LF/DHA在胃液消化阶段，大分子条带分解更彻底。观察微聚集体的电泳结果表明，经过胃液消化后，LF/DHA-SPI/DHA微聚集体在胃液阶段消化蛋白质消化程度高于LF/DHA乳液和SPI/DHA乳液。与LF/DHA-SPI/DHA微聚集体胃液消化后粒径减小一致。同时，进一步解释小肠消化阶段异型聚集体的脂肪酸释放率高可能与胃阶段蛋白被水解更充分，有助于小肠阶段油脂的消化。
4.5体外模拟消化游离脂肪酸释放率分析
小肠是脂肪消化的主要场所，小肠消化阶段LF/DHA乳液、SPI/DHA乳液和LF/DHA-SPI/DHA微聚集体的脂肪酸释放率如图6所示。由图6可知，在消化的前25 min脂肪酸释放率快，脂肪酸释放速率微聚集体＞LF/DHA乳状液＞SPI/DHA乳状液。经小肠消化消化2 h后最终脂肪酸释放率排序为聚集体乳状液>LF/DHA乳状液>SPI/DHA乳状液。实验结果表明微聚集体在一定程度上促进了DHA的消化，分析原因微聚集体在胃液阶段，被胃蛋白酶水解更多，蛋白质在此阶段消化更充分，小肠阶段脂肪酶能更好的吸附到DHA表面，从而在一定程度上促进脂肪酸的释放率。脂肪的消化吸收受口腔和胃阶段消化的影响。本研究LF/DHA-SPI/DHA微聚集体可以促进DHA体外消化和脂肪酸的释放，将为今后的研究提供相关的参考和理论基础，为在婴幼儿及胃肠道脆弱人群食品中的应用提供了方向。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (7)
1.一种LF/DHA-SPI/DHA微聚集体在改善 DHA 体外模拟脂肪酸释放率中的应用，其特征在于，所述LF/DHA-SPI/DHA微聚集体的制备方法，包括以下步骤：
（1）制备LF/DHA乳状液；
（2）制备SPI/DHA乳状液；
（3）制备LF/DHA-SPI/DHA微聚集体，将步骤（1）制备的LF/DHA乳状液与和步骤（2）制备的SPI/DHA乳状液异型聚集构建LF/DHA-SPI/DHA微聚集体。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤（1）中制备LF/DHA乳状液的方法为：准确称取LF粉末，溶于1 mM 的pH 6.0磷酸盐缓冲溶液，在40 ℃搅拌2 h，并溶胀过夜，制成LF溶液；准确称取藻油DHA作为油相；高速剪切均质仪19000 rmp粗剪切3 min，剪切过程中加入DHA油相，获得LF/DHA粗乳液；LF/DHA粗乳状液通过微射流，均质压力为50 MPa，均质3次，得到LF/DHA乳状液。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，LF溶液的浓度为1-5wt%，油相与LF溶液的质量比为1:9。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤（2）中制备SPI/DHA乳状液的方法为：准确称取SPI粉末，溶于1 mM的pH 6.0的磷酸盐缓冲溶液，在50 ℃搅拌2 h，并溶胀过夜，制成SPI溶液；准确称量一定量的藻油DHA作为油相；高速剪切均质仪19000 rmp粗剪切3min，剪切过程中加入DHA油相，制备得到SPI/DHA的粗乳液；SPI/DHA粗乳状液通过微射流，均质压力为50 MPa，均质3次，进一步均质得到SPI/DHA乳状液。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，SPI溶液的浓度为1-2wt%，油相与SPI溶液的质量比为1:9。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤（3）中制备LF/DHA乳状液与SPI/DHA乳状液的质量比为1-9:9-1。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤（3）中制备LF/DHA乳状液与SPI/DHA乳状液的质量比为1:1。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011525401.0A CN112617201B (zh) | 2020-12-22 | 2020-12-22 | 一种lf/dha-spi/dha微聚集体的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011525401.0A CN112617201B (zh) | 2020-12-22 | 2020-12-22 | 一种lf/dha-spi/dha微聚集体的应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112617201A CN112617201A (zh) | 2021-04-09 |
| CN112617201B true CN112617201B (zh) | 2023-04-28 |
Family
ID=75320606
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202011525401.0A Active CN112617201B (zh) | 2020-12-22 | 2020-12-22 | 一种lf/dha-spi/dha微聚集体的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112617201B (zh) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106993811B (zh) * | 2016-01-26 | 2021-06-22 | 北京工商大学 | 乳状液微聚集体及其制备方法 |
-
2020
- 2020-12-22 CN CN202011525401.0A patent/CN112617201B/zh active Active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 赵孔华等.婴幼儿腹泻.《全科医师手册》.天津科学技术出版社,2008,(第1版),第191-192页. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN112617201A (zh) | 2021-04-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Zhang et al. | Influence of emulsifier type on gastrointestinal fate of oil-in-water emulsions containing anionic dietary fiber (pectin) | |
| Zhang et al. | Encapsulation of β-carotene in alginate-based hydrogel beads: Impact on physicochemical stability and bioaccessibility | |
| Ding et al. | Effect of interfacial layer number on the storage stability and in vitro digestion of fish oil-loaded multilayer emulsions consisting of gelatin particle and polysaccharides | |
| Geng et al. | Effect of ultrasound and coagulant types on properties of β-carotene bulk emulsion gels stabilized by soy protein | |
| CN104938765B (zh) | 一种高稳定性大豆蛋白乳液的制备方法 | |
| Li et al. | Simple method for fabrication of high internal phase emulsions solely using novel pea protein isolate nanoparticles: Stability of ionic strength and temperature | |
| Dong et al. | Oleogel-based Pickering emulsions stabilized by ovotransferrin–carboxymethyl chitosan nanoparticles for delivery of curcumin | |
| He et al. | The stability and in vitro digestion of curcumin emulsions containing Konjac glucomannan | |
| Kumar et al. | Gelling properties of black soldier fly (Hermetia illucens) larvae protein after ultrasound treatment | |
| WO2021012755A1 (zh) | 一种乳脂肪球及其制备方法 | |
| Wu et al. | Improve the physical and oxidative stability of O/W emulsions by moderate solidification of the oil phase by stearic acid | |
| Dong et al. | Effect of interaction between ovotransferrin fibrils and pectin on properties of oleogel-based Pickering emulsions | |
| Yu et al. | Effects of egg yolk lecithin/milk fat globule membrane material ratio on the structure and stability of oil-in-water emulsions | |
| Zhang et al. | In vitro digestion of solid-in-oil-in-water emulsions for delivery of CaCO3 | |
| CN111529495B (zh) | 一种高胃稳定性蛋白乳液微凝胶颗粒的制备方法 | |
| CN113662183A (zh) | 一种对虾青素具有保护及控释效果的乳液的制备方法 | |
| Ge et al. | Alteration in rheology and microstructure of O/W emulsions using controlled soy protein isolate-polysaccharide aggregation in aqueous phases | |
| CN112617201B (zh) | 一种lf/dha-spi/dha微聚集体的应用 | |
| Xu et al. | Ethanol-tolerant pickering emulsion stabilized by gliadin nanoparticles | |
| Wang et al. | Nanocapsules formed by interactions between chondroitin sulfate and egg white protein for encapsulating hydrophilic ingredients | |
| Wang et al. | Contribution of soybean polysaccharides in digestion of oil-in-water emulsion-based delivery system in an in vitro gastric environment | |
| CN111621032B (zh) | 辛烯基琥珀酸酐修饰的明胶及其制备方法和应用 | |
| Zhong et al. | Phycocyanin-chitosan complex stabilized emulsion: preparation, characteristics, digestibility, and stability | |
| Wang et al. | Structural transformation of egg white protein particles modified by preheating combined with pH-shifting: Mechanism of enhancing heat stability | |
| Hou et al. | Effects of hydrodynamic cavitation at different pH values on the physicochemical properties and aggregation behavior of soybean glycinin |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |