CN112608320B

CN112608320B - 哌啶类化合物及其制备方法和医药用途

Info

Publication number: CN112608320B
Application number: CN202110042959.1A
Authority: CN
Inventors: 温小安; 孙宏斌; 刘锡鹏; 李幸; 周鑫煜; 李明雷; 陈彩萍; 张鸿翰; 孙刚; 陈辉; 戴量; 刘胜杰; 袁浩亮; 许庆龙; 张弦; 韩曦
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2020-01-16
Filing date: 2021-01-13
Publication date: 2023-03-17
Anticipated expiration: 2041-01-13
Also published as: WO2021143792A1; CN112608320A

Abstract

本发明公开了如式(I)所示的哌啶类化合物及其制备方法和医药用途，具体是指哌啶类USP7抑制剂化合物或其药学上可接受的盐或酯或溶剂化物及制备方法和用途，本发明的化合物能抑制USP7酶的活性，同时具有非常好的选择性和成药性，可以用于制备预防或治疗肿瘤疾病或病毒感染性疾病的药物。

Description

哌啶类化合物及其制备方法和医药用途

技术领域

本发明属于医药领域，涉及哌啶类化合物及其制备方法和医药用途，具体涉及哌啶类USP7抑制剂化合物或其药学上可接受的盐或酯或溶剂化物及制备方法和医药用途。

背景技术

泛素特异性蛋白酶(USP)是去泛素化酶家族中最大的一类，其中USP7(也称HAUSP)是最广受关注的去泛素化酶之一。USP7属半胱氨酸蛋白酶，主要位于细胞核内，调控多种细胞进程(如DNA损伤应答、转录、表观遗传的基因表达、免疫反应和病毒感染)相关蛋白的稳定性(DNA Repair 2019,76,30)，与许多疾病的发生发展密切相关。例如，USP7在多种肿瘤细胞中过表达，通过去泛素化作用稳定MDM2蛋白，而MDM2作为p53蛋白的主要负调控因子，不仅直接抑制p53的转录活性，还通过泛素化作用使p53水平降低(Cell,1998,95,5)。将肿瘤细胞中USP7敲除或抑制，可降低MDM2蛋白水平、升高p53水平，进而抑制肿瘤细胞增殖(Mol Cell 2004,6,879；Nature2004,428,6982)。此外，USP7可以通过去泛素化作用稳定Foxp3蛋白，而Foxp3是决定免疫抑制性的调节性T细胞(Treg)分化及功能的关键性转录调控蛋白。敲除或抑制USP7可降低Foxp3蛋白水平，降低肿瘤微环境中Treg细胞的数量和活性，从而减少肿瘤细胞经Treg介导的免疫抑制，进而增加机体的抗肿瘤免疫反应(Immunity2013,39(2):259；Ebiomedicine.2016,13:99)。综上所述，抑制USP7有望成为治疗肿瘤或病毒感染等疾病的新途径。

目前，尚没有任何USP7抑制剂进入临床研究阶段。2018年，Gavory等报道了一系列哌啶类USP7抑制剂(Nat Chem Biol,2018,14(2):118)，其中，Compound 4(CP4)是目前为止已报道的化合物中活性最好的USP7抑制剂之一。然而，Compound 4及其类似物的代谢稳定性很差，这严重影响了其成药性。发表在Eur.J.Med.Chem.(2020,199,112279)的文章报道了一个高选择性的哌啶醇类USP7抑制剂(文章中的化合物L55)，然而，该化合物对人肝微粒体的代谢稳定性也较差(T_1/2＝3.46min)。因此，迫切需要研制活性强且代谢稳定性好的新型的USP7抑制剂。

发明内容

发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一类哌啶类化合物，该哌啶类化合物或其药学上可接受的盐或酯或溶剂化物可以作为USP7抑制剂，活性强且代谢稳定性好。

本发明另一目的是提供所述的哌啶类化合物或其药学上可接受的盐或酯或溶剂化物的制备方法和医药用途。

技术方案：为了实现上述目的，本发明式(I)所示的哌啶类化合物或其药学上可接受的盐或酯或溶剂化物：

Q为如下任意一种的取代或非取代嘧啶酮环；

R¹为取代或非取代的烷基、取代或非取代的环烷基、取代或非取代的杂环烷基、取代或非取代的芳基或取代或非取代的杂环芳基；

R²为H、D、卤素、取代或非取代的烷基或取代或非取代的烯基；或者R²与它所连接到的原子一起形成取代或非取代的环烷烃环、取代或非取代的杂环烷烃环、取代或非取代的环烯烃环或取代或非取代的杂环烯烃环，且R²可在环烷烃中的任意一个或几个碳上取代；

n＝0～8中的任意整数；

R³、R⁴、R⁵和R⁶各自独立地选自：H、D、X、CN、NO₂、NH₂、OX、SX、S(O)X、S(O)₂X、C(O)X、C(O)OH、C(O)OX、OC(O)X、NHX、N(X)₂、C(O)NH₂、C(O)NHX、C(O)N(X)₂、NH(CO)X、NX(CO)X、NH(CO)OX、NX(CO)OX、NH(CO)NH₂、NH(CO)NHX、NH(CO)N(X)₂、NX(CO)NHX、NX(CO)N(X)₂、SO₂NH₂、SO₂NHX、SO₂N(X)₂、NHSO₂X、NXSO₂X、NHSO₂NHX、NHSO₂N(X)₂、NXSO₂NHX、NXSO₂N(X)₂、C(O)NHNOH、C(O)NHNOX、C(O)NHSO₂X或卤素；或者，R³和R⁴与它们所连接到的原子一起形成取代或非取代的环烷烃环、取代或非取代的杂环烷烃环或取代或非取代的杂环烯烃环；或者，R⁵和R⁶与它们所连接到的原子一起形成取代或非取代的杂芳环、取代或非取代的杂环烷烃环或取代或非取代的杂环烯烃环；

Y为H、D、X、OH、SH、CN、NO₂、NH₂、C(O)OX、卤素、OX、NHX或NXX；或者，Y和R³或R⁴与它们所连接到的原子一起形成取代或非取代的环烷烃环、取代或非取代的杂环烷烃环或取代或非取代的杂环烯烃环；

X为H、卤素、取代或非取代的烷基、取代或非取代的烯基、取代或非取代的炔基、取代或非取代的环烷基、取代或非取代的环烯基、取代或非取代的环炔基、取代或非取代的杂环烷基、取代或非取代的杂环烯基、取代或非取代的杂环炔基、取代或非取代的芳基或取代或非取代的杂环芳基。

在某些优选的实施方案中，本发明的哌啶类化合物是如下式(II)或式(III)所示的化合物或其药学上可接受的盐或酯或溶剂化物：

R⁵和R⁶独立地选自：H、D、取代或非取代的烷基、取代或非取代的环烷基、取代或非取代的杂环烷基、取代或非取代的芳基或取代或非取代的杂环芳基；

R⁷、R⁸和R⁹各自独立地选自：H、卤素、三氟甲基、三氟甲氧基、烷基、环烷基、烷基磺酰基、CN、NO₂、NH₂、OH、C(O)OR^a、C(O)NHR^a、C(O)NHOH、NH(CO)R^a、取代或非取代的杂芳环、取代或非取代的杂环烷烃环、取代或非取代的烯烃环或取代或非取代的杂环烯烃环，其中，R^a为H、烷基或环烷基；

或者，R⁷、R⁸和R⁹中的任意两个与它们所连接到的原子一起形成取代或非取代的杂芳环、取代或非取代的杂环烷烃环或取代或非取代的杂环烯烃环；

R¹⁰为H、D、卤素、三氟甲基、三氟甲氧基、烷基、环烷基、三氟甲基、三氟甲氧基、烷基、环烷基、烷基磺酰基、CN、NO₂、CH₂NHR、CH₂NHCHO、CH₂NHAc、CH₂NHBoc或CH₂NHOH，其中，R为H、烷基或环烷基。

在某些优选的实施方案中，本发明的式(II)或式(III)所示的哌啶类化合物或其药学上可接受的盐或酯或溶剂化物：

R⁵和R⁶各自独立地选自：H、取代或非取代的烷基、取代或非取代的环烷基；

R⁷和R⁸各自独立地选自：H、卤素、三氟甲基、三氟甲氧基、烷基、环烷基、烷基磺酰基；

R⁹为取代或非取代的吡唑环、噁二唑环、咪唑环、异噁唑环、噁唑环、噻唑环、噻二唑环、噻吩环、吡啶环、嘧啶环、呋喃环、三唑环、吡咯环或四唑环；

R¹⁰为H、卤素、CH₂NHR、CH₂NHCHO、CH₂NHAc、CH₂NHBoc或CH₂NHOH，其中，R为H、烷基或环烷基。

在本发明的式(II)和式(III)化合物中，尤其是当R⁹为取代或非取代的吡唑环、噁二唑环、咪唑环、异噁唑环、噁唑环、噻唑环、噻二唑环、噻吩环、吡啶环、嘧啶环、呋喃环、三唑环、吡咯环或四唑环时，化合物对人肝微粒体的代谢稳定性比现有报道的哌啶类USP7抑制剂(如文献Nat Chem Biol,2018,14(2):118和Eur.J.Med.Chem.2020,199,112279)相比有了极为显著的提升，同时，化合物的USP7抑制活性也得到改善。

在某些优选的实施方案中，本发明的哌啶类化合物是如下表1中的任一化合物或其药学上可接受的盐或酯或溶剂化物：

表1本发明的部分化合物

本发明的化合物也可作为药用盐。该盐可为下列酸中的至少一种的酸盐：半乳糖二酸、D-葡糖醛酸、甘油磷酸、马尿酸、羟乙磺酸、乳糖酸、马来酸、1,5-萘二磺酸、萘-2-磺酸、新戊酸、对苯二甲酸、硫氰酸、胆酸、正十二烷基硫酸、苯磺酸、柠檬酸、D-葡萄糖，乙醇酸、乳酸、苹果酸、丙二酸、扁桃酸、磷酸、丙酸、盐酸、硫酸、酒石酸、琥珀酸、甲酸、氢碘酸、氢溴酸、甲烷磺酸、烟酸、硝酸、乳清酸、草酸、苦味酸、L-焦谷氨酸、糖精酸、水杨酸、龙胆酸、对甲苯磺酸、戊酸、棕榈酸、葵二酸、硬脂酸、月桂酸、乙酸、己二酸、碳酸、4-苯磺酸、乙烷二磺酸、乙基琥珀酸、富马酸、3-羟基萘-2-甲酸、1-羟基萘-2-甲酸、油酸、十一碳烯酸、抗坏血酸、樟脑酸、樟脑磺酸、二氯乙酸、乙烷磺酸。另一方面，该盐也可以是本发明的化合物与金属(包括钠、钾、钙等)离子或药学上可接受的胺(包括乙二胺、氨丁三醇等)或铵离子形成的盐。

本发明提供式(I)～(III)所示的哌啶类化合物或其药学上可接受的盐或酯或溶剂化物在制备USP7抑制剂中的用途。本发明人发现，式(I)～(III)所示的哌啶类化合物是选择性的USP7抑制剂。尤其令人惊喜的是，与文献(Nat Chem Biol,2018,14(2):118)报道的哌啶类USP7抑制剂(如Compound 4)或者文献(Eur.J.Med.Chem.2020,199,112279)报道的哌啶类USP7抑制剂(如L55)相比，本发明的哌啶类USP7抑制剂在代谢稳定性方面有极为显著的提升，因而具有更好的成药性。

本发明还提供式(I)～(III)所示的哌啶类化合物或其药学上可接受的盐或酯或溶剂化物在制备预防或治疗肿瘤疾病或病毒感染性疾病的药物中的用途。

所述的肿瘤疾病包括但不限于：骨癌、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴细胞系白血病、慢性淋巴细胞系白血病、骨髓增生性疾病、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、血管瘤、肉芽瘤、黄瘤、脑膜肉瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、室管膜瘤、生殖细胞瘤(松果体瘤)、多形性成胶质细胞瘤、少突神经胶质细胞瘤、神经鞘瘤、成视网膜细胞瘤、纤维神经瘤、肉瘤、食道癌、胃癌、胰腺癌、大肠癌、结肠癌、直肠癌、肾癌、前列腺癌、淋巴癌、睾丸癌、间质细胞癌、肺癌、肝癌、皮肤癌、噁性黑素瘤和基底细胞癌等。

所述的病毒感染性疾病包括但不限于以下病毒引起的感染性疾病：RNA病毒，如流感病毒等。DNA病毒，如乙肝病毒、疱疹病毒等。

在某些实施方案中，本发明的化合物可与一种或多种其他类型的预防或治疗上述疾病的药物联合使用，包括但不限于以下几种联合用药的情形：

可选择与本发明的化合物联合使用的其他类型的预防或治疗药物可以是一种或多种抗癌药物，包括烷化剂(如顺铂、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、苯达莫司汀、雌莫司汀、塞替哌、亚胺醌、白消安、二溴甘露醇、环己亚硝、卡氮芥、嘧啶亚硝脲、甲环亚硝脲、甲氮咪胺、甲基苄肼等)、抗代谢药(如氟尿嘧啶、阿糖胞苷、呋氟尿嘧啶、双呋氟尿嘧啶、巯嘌呤、磺巯嘌呤钠、硫唑嘌呤、硫鸟嘌呤、甲氨蝶呤等)、抗肿瘤抗生素(如丝裂霉素C、博来霉素、放线菌素D、光神霉素、柔红霉素、阿霉素、色霉素A3、恩霉素、新制癌素、抗癌霉素、素道霉素等)、天然抗癌药(如长春新碱、秋水仙碱、喜树碱、羟基喜树碱、斑蝥素、靛玉红等)、激素药物(如泼尼松、氢化泼尼松、氢化可的松、地塞米松、己烯雌酚、溴乙酰己烷雌酚、丙酸睾丸酮、甲睾酮、苯丙酸诺龙、萘氧啶、三苯氧胺等)、免疫治疗剂(如PD-1抑制剂nivolumab和pembrolizumab等；PD-L1抑制剂atezolizumab、durvalumab和avelumab等；CTLA-4抑制剂Ipilimumab等；其他免疫检查点抑制剂；细胞治疗剂等免疫治疗药物)、抗体药物缀合物(如Kadcyla等)、激酶抑制剂(如SHP-2抑制剂、B-RAF抑制剂、MEK抑制剂和Btk抑制剂等)、IDO抑制剂(如Epacadostat)等。

本发明还提供一种预防或治疗肿瘤疾病或病毒感染性疾病的药物组合物，其含有治疗有效量的式(I)～(III)所示的任一哌啶类化合物或其药学上可接受的盐或酯或溶剂化物和药学上可接受的载体。可任意混合的载体根据剂型、给药形式等可以改变。载体的例子包括赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂、香味剂、着色剂和甜味剂等。所述药物组合物可以是胶囊剂、散剂、片剂、颗粒剂、丸剂、注射剂、糖浆剂、口服液、吸入剂、软膏剂、栓剂和贴剂等制剂学上常规的制剂形式。

本发明的哌啶类化合物的制备可参照如下合成路线进行：

或

合成过程为：哌啶化合物与卤代化合物在碱介导下发生亲核取代反应，或与醛在还原剂介导下发生还原胺化反应。具体合成步骤参考实施例。

有益效果：

(1)本发明的哌啶类化合物或其药学上可接受的盐或酯或溶剂化物对USP7酶活性具有很强的抑制性，且具有非常好的选择性，因而可用于制备预防或治疗USP7介导的疾病的药物，所述USP7介导的疾病包括：肿瘤疾病或病毒感染性疾病等。

(2)本发明独特的结构设计使得化合物不仅对USP7抑制活性有了显著地改善，更重要的是其对人肝微粒体的代谢稳定有了极为显著的提升，与现有哌啶类USP7抑制剂相比具有更好的成药性。

(3)本发明的哌啶类化合物或其药学上可接受的盐或酯或溶剂化物结构简单，设计巧妙，原料便宜易得，合成工艺安全、环保，易于规模化生产。

附图说明

图1是化合物I-74与USP7催化域蛋白的X-射线共晶结构图；

图2是小鼠结肠癌细胞(MC38)皮下植瘤模型经化合物I-74处理后肿瘤体积随时间变化的折线图；

图3是小鼠结肠癌细胞(MC38)皮下植瘤模型经化合物I-74处理后皮下肿瘤标本直观图；

图4是小鼠结肠癌细胞(MC38)皮下植瘤模型经化合物I-74处理后小鼠体重随时间变化的折线图；

图5是文献(Nat Chem Biol,2018,14(2):118)报道的哌啶类USP7抑制Compound 4(CP4)和Compound 5的化学结构图。

具体实施方式

下面通过实施例具体说明本发明的内容。在本发明中，以下所述的实施例是为了更好的阐述本发明，并不是用来限制本发明的范围。在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。

实施例1

5-((1-苄基-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-1-(4-氟苯基)-1,5-二氢-4H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮(I-1)

向4-氟苯肼盐酸盐(20g,0.123mol)和乙氧基亚甲基丙二腈(16.1g,0.132mol)的乙醇(200mL)溶液中加入三乙胺(200mL)，将反应液加热回流10h，TLC检测反应完毕。将反应液自然冷却至室温，用布氏漏斗过滤，滤饼用二氯甲烷洗涤，滤液减压浓缩，残留物用乙醇重结晶，得化合物A1的黄色固体(16.4g,产率66％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ7.77(s,1H),7.58–7.45(m,2H),7.36(t,J＝8.7Hz,2H),6.67(s,2H).ESI-MS:m/z 203.1[M+H]⁺。

将化合物A1(100mg,0.495mmol)置于0℃的浓硫酸(1.1mL)中，所得混合物在室温搅拌3h。反应完毕后，将反应液在冰水浴下用10％碳酸钾水溶液调pH至8～9，用二氯甲烷(5mL×3)萃取。合并有机相，用饱和氯化钠水溶液(10mL)洗涤，无水硫酸钠干燥。减压蒸除溶剂，残留物经硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇＝20:1)，得化合物A2的黄色固体(88mg,产率75％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ7.89(s,1H),7.64-7.53(m,2H),7.36(t,J＝8.8Hz,2H),6.37(s,2H).ESI-MS:m/z 221.1[M+H]⁺。

将化合物A2(5g,22.7mmol)溶于乙酸酐(120mL)，加入原甲酸三乙酯(120mL)，所得混合液加热回流3h，TLC检测反应完毕。将反应液自然冷却至室温，减压蒸除溶剂，所得棕色固体经乙醇重结晶得化合物A3的淡黄色固体(16.4g,产率66％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ12.47(s,1H),8.33(s,1H),8.19(s,1H),8.06(dd,J＝8.9,4.9Hz,2H),7.42(t,J＝8.8Hz,2H).ESI-MS:m/z231.1[M+H]⁺。

将化合物A3(1.3g,5.65mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(50mL)，依次加入碳酸铯(5.52g,16.95mmol)和1-氧杂-6-氮杂-螺[2,5]辛-6-甲酸叔丁基酯(1.21g,5.71mmol)，所得混合液在80℃下搅拌8h。向反应体系加水(100mL)稀释，用乙酸乙酯(20mL×3)萃取。有机相合并，分别用水(100mL×3)洗涤、饱和氯化钠水溶液(50mL)洗涤，无水硫酸钠干燥。减压蒸除溶剂，残留物经硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇＝200:1)纯化，得化合物A4的白色固体(800mg,产率33％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.35(s,1H),8.33(s,1H),8.13-8.00(m,2H),7.41(t,J＝8.8Hz,2H),4.88(s,1H),4.02(s,2H),3.73-3.56(m,2H),3.14-2.92(m,2H),1.55-1.42(m,2H),1.42-1.30(m,11H).ESI-MS:m/z 466.2[M+Na]⁺。

将化合物A4(800mg,1.8mmol)溶于二氯甲烷(20mL)，加入三氟乙酸(4.8mL)，室温搅拌过夜。将反应液减压浓缩，得三氟乙酸盐形式的化合物A5粗品。ESI-MS:m/z 344.2[M+H]⁺。

取化合物A5粗品(88mg,0.2mmol)溶于无水N,N-二甲基甲酰胺(2.5mL)，依次加入碳酸钾(102mg,0.74mmol)和溴苄(36μL,0.3mmol)，室温搅拌3h。向反应混合物中加入水(10mL)，用乙酸乙酯萃取(10mL×3)。合并有机相，用水(5mL×3)和饱和氯化钠水溶液(5mL)洗涤，无水硫酸钠干燥。减压蒸除溶剂，残留物经硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇＝10:1)纯化，得化合物I-1的棕色固体(27mg,产率32％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.42-8.24(m,2H),8.18-7.99(m,2H),7.54-7.08(m,7H),4.61(s,1H),4.03(s,2H),3.44(s,2H),2.49-2.37(m,2H),2.39-2.17(m,2H),1.75-1.54(m,2H),1.51-1.32(m,2H).ESI-MS:m/z 434.2[M+H]⁺。

实施例2

5-((1-(2-氟苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-1-(4-氟苯基)-1,5-二氢-4H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮(I-2)

参照实施例1的方法，用化合物A5与2-氟苄溴反应，制得化合物I-2(白色固体，产率53％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.35(s,1H),8.33(s,1H),8.11-8.01(m,2H),7.48-7.36(m,3H),7.35-7.25(m,1H),7.20-7.09(m,2H),4.65(s,1H),4.01(s,2H),3.58-3.45(m,2H),2.39-2.25(m,2H),1.65-1.54(m,2H),1.41-1.33(m,2H).ESI-MS:m/z 452.2[M+H]⁺。

实施例3

5-((1-(2-氯苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-1-(4-氟苯基)-1,5-二氢-4H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮(I-3)

参照实施例1的方法，用化合物A5与2-氯苄溴反应，制得化合物I-3(白色固体，产率48％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.36(s,1H),8.34(s,1H),8.14-8.00(m,2H),7.54-7.37(m,4H),7.37-7.20(m,2H),4.69(s,1H),4.03(s,2H),3.55(s,2H),2.62-2.52(m,2H),2.43-2.30(m,2H),1.69-1.54(m,2H),1.47-1.34(m,2H).ESI-MS:m/z 468.2[M+H]⁺。

实施例4

5-((1-(2-溴苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-1-(4-氟苯基)-1,5-二氢-4H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮(I-4)

参照实施例1的方法制，用化合物A5与2-溴苄溴反应，得化合物I-4(白色固体，产率41％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.46-8.24(m,2H),8.19-7.94(m,2H),7.65-7.53(m,1H),7.53-7.26(m,4H),7.27-7.10(m,1H),4.68(s,1H),4.03(s,2H),3.52(s,2H),2.61-2.53(m,2H),2.45-2.27(m,2H),1.75-1.52(m,2H),1.49-1.31(m,2H).ESI-MS:m/z 512.2[M+H]⁺.

实施例5

5-((1-(2-硝基苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-1-(4-氟苯基)-1,5-二氢-4H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮(I-5)

参照实施例1的方法，用化合物A5与2-硝基苄溴反应，制得化合物I-5(白色固体，产率40％)。1H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.35(s,1H),8.33(s,1H),8.13-8.00(m,2H),7.88-7.79(m,1H),7.70-7.57(m,2H),7.57-7.36(m,3H),4.67(s,1H),4.00(s,2H),3.71(s,2H),2.47-2.21(m,4H),1.64-1.44(m,2H),1.42-1.27(m,2H).ESI-MS:m/z 479.2[M+H]⁺。

实施例6

2-((4-((1-(4-氟苯基)-4-氧-1,4-二氢-5H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-5-基)甲基)-4-羟基-1-基)甲基)苯甲腈(I-6)

参照实施例1的方法，用化合物A5与2-氰基苄溴反应，制得化合物I-6(白色固体，产率45％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.44-8.26(m,2H),8.14-7.99(m,2H),7.84-7.75(m,1H),7.73-7.62(m,1H),7.62-7.53(m,1H),7.51-7.33(m,3H),4.72(s,1H),4.02(s,2H),3.65(s,2H),2.62-2.52(m,2H),2.45-2.29(m,2H),1.68-1.50(m,2H),1.49-1.33(m,2H).ESI-MS:m/z 459.2[M+H]⁺。

实施例7

1-(4-氟苯基)-5-((4-羟基-1-(2-甲基苄基)哌啶-4-基)甲基)-1,5-二氢-4H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮(I-7)

参照实施例1的方法，用化合物A5与2-甲基苄溴反应，制得化合物I-7(白色固体，产率32％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.54-8.24(m,2H),8.22-7.93(m,2H),7.54-7.36(m,2H),7.30-7.05(m,4H),4.68(s,1H),4.03(s,2H),3.40(s,2H),2.39-2.23(m,4H),1.71-1.51(m,2H),1.51-1.27(m,2H).ESI-MS:m/z 448.2[M+H]⁺。

实施例8

2-((4-((1-(4-氟苯基)-4-氧-1,4-二氢-5H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-5-基)甲基)-4-羟基哌啶-甲基-1-基)甲基)苯甲酸甲酯(I-8)

参照实施例1的方法制，用化合物A5与2-溴甲基苯甲酸甲酯反应，制得化合物I-8(白色固体，产率57％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.32(d,J＝5.4Hz,2H),8.05(dd,J＝8.8,4.9Hz,2H),7.55(d,J＝7.4Hz,1H),7.49-7.26(m,5H),4.65(s,1H),3.98(s,2H),3.77(s,3H),3.62(s,2H),2.43-2.31(m,2H),2.25(t,J＝9.8Hz,2H),1.50(t,J＝9.8Hz,2H),1.40-1.26(m,2H).ESI-MS:m/z 492.2[M+H]⁺。

实施例9

1-(4-氟苯基)-5-((4-羟基-1-(吡啶-2-基甲基)哌啶-4-基)甲基)-1,5-二氢-4H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮(I-9)

参照实施例1的方法，用化合物A5与2-溴甲基吡啶反应，制得化合物I-9(白色固体，产率27％)。1H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.54-8.40(m,1H),8.40-8.28(m,2H),8.16-7.95(m,2H),7.85-7.64(m,1H),7.52-7.32(m,3H),7.28-7.15(m,1H),4.66(s,1H),4.01(s,2H),3.57(s,2H),2.64-2.50(m,2H),2.44-2.24(m,2H),1.72-1.51(m,2H),1.47-1.28(m,2H).ESI-MS:m/z 435.2[M+H]⁺。

实施例10

5-((1-(3-氯苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-1(4-氟苯基)-1,5-二氢-4H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮(I-10)

参照实施例1的方法，用化合物A5与3-氯苄溴反应，制得化合物I-10(白色固体，产率65％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.35(s,1H),8.34(s,1H),8.13-7.99(m,2H),7.50-7.21(m,6H),4.66(s,1H),4.02(s,2H),3.47(s,2H),2.49-2.45(m,2H),2.36-2.22(m,2H),1.68-1.53(m,2H),1.46-1.33(m,2H).ESI-MS:m/z 468.1[M+H]⁺。

实施例11

1-(4-氟苯基)-5-((4-羟基-1-(3-硝基苄基)哌啶-4-基)甲基)-1,5-二氢-4H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮(I-11)

参照实施例1的方法，用化合物A5与3-硝基苄溴反应，制得化合物I-11(白色固体，产率44％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.34(s,2H),8.22-8.02(m,4H),7.76(d,J＝7.4Hz,1H),7.62(t,J＝7.8Hz,1H),7.42(t,J＝8.7Hz,2H),4.68(s,1H),4.03(s,2H),3.61(s,2H),2.60-2.51(m,2H),2.44-2.23(m,2H),1.74-1.54(m,2H),1.50-1.36(m,2H).

ESI-MS:m/z 479.2[M+H]⁺。

实施例12

3-((4-((1-(4-氟苯基)-4-氧-1,4-二氢-5H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-5-基)甲基)-4-羟基哌啶-1-基)甲基)苯甲酸甲酯(I-12)

参照实施例1的方法，用化合物A5与3-溴甲基苯甲酸甲酯反应，制得化合物I-12(白色固体，产率63％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.33(d,J＝3.5Hz,2H),8.05(dd,J＝8.8,4.9Hz,2H),7.88(s,1H),7.82(d,J＝7.4Hz,1H),7.55(d,J＝7.2Hz,1H),7.50-7.32(m,3H),4.65(s,1H),4.01(s,2H),3.84(s,3H),3.51(s,2H),2.49(s,2H),2.30(d,J＝9.8Hz,2H),1.57(d,J＝9.6Hz,2H),1.47-1.28(m,2H).ESI-MS:m/z 492.3[M+H]⁺。

实施例13

1-(4-氟苯基)-5-((4-羟基-1-(吡啶-3-基甲基)哌啶-4-基)甲基)-1,5-二氢-4H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮(I-13)

参照实施例1的方法，用化合物A5与3-溴甲基吡啶反应，制得化合物I-13(白色固体，产率54％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.54-8.40(m,2H),8.37-8.27(m,2H),8.14-7.98(m,2H),7.77-7.62(m,1H),7.51-7.22(m,3H),4.66(s,1H),4.00(s,2H),3.47(s,2H),2.60-2.49(m,2H),2.38-2.19(m,2H),1.70-1.49(m,2H),1.48-1.28(m,2H).ESI-MS:m/z 435.2[M+H]⁺。

实施例14

5-((1-(4-氟苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-1-(4-氟苯基)-1,5-二氢-4H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮(I-14)

参照实施例1的方法，用化合物A5与4-氟苄溴反应，制得化合物I-14(白色固体，产率58％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.35(s,1H),8.34(s,1H),8.13-8.01(m,2H),7.50-7.37(m,2H),7.38-7.24(m,2H),7.19-7.06(m,2H),4.66(s,1H),4.02(s,2H),3.44(s,2H),2.49-2.44(m,2H),2.33-2.19(m,2H),1.71-1.50(m,2H),1.48-1.30(m,2H).ESI-MS:m/z 452.3[M+H]⁺。

实施例15

5-((1-(4-氯苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-1-(4-氟苯基)-1,5-二氢-4H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮(I-15)

参照实施例1的方法，用化合物A5与4-氯苄溴反应，制得化合物I-15(白色固体，产率39％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.47-8.25(m,2H),8.18-7.95(m,2H),7.68-7.20(m,6H),4.67(s,1H),4.03(s,2H),3.44(s,2H),2.49-2.41(m,2H),2.36-2.16(m,2H),1.72-1.52(m,2H),1.47-1.31(m,2H).ESI-MS:m/z 468.2[M+H]⁺。

实施例16

5-((1-(4-溴苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-1-(4-氟苯基)-1,5-二氢-4H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮(I-16)

参照实施例1的方法，用化合物A5与4-溴苄溴反应，制得化合物I-16(白色固体，产率72％)。1H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.35(s,1H),8.33(s,1H),8.13-8.01(m,2H),7.54-7.37(m,4H),7.31-7.21(m,2H),4.65(s,1H),4.02(s,2H),3.43(s,2H),2.49-2.42(m,2H),2.34-2.19(m,2H),1.65-1.51(m,2H),1.44-1.35(m,2H).ESI-MS:m/z 512.2[M+H]⁺。

实施例17

1-(4-氟苯基)-5-((4-羟基-1-(4-硝基苄基)哌啶-4-基)甲基)-1,5-二氢-4H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮(I-17)

参照实施例1的方法，用化合物A5与4-硝基苄溴反应，制得化合物I-17(白色固体，产率51％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.35(d,J＝3.5Hz,2H),8.18(d,J＝8.4Hz,2H),8.07(dd,J＝8.8,4.9Hz,2H),7.59(d,J＝8.4Hz,2H),7.42(t,J＝8.8Hz,2H),4.69(s,1H),4.03(s,2H),3.60(s,2H),2.57-2.51(m,2H),2.33(t,J＝10.2Hz,2H),1.63(t,J＝10.1Hz,2H),1.41(d,J＝12.9Hz,2H).ESI-MS:m/z 479.2[M+H]⁺。

实施例18

4-((4-((1-(4-氟苯基)-4-氧-1,4-二氢-5H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-5-基)甲基)-4-羟基-1-基)甲基)苯甲腈(I-18)

参照实施例1的方法，用化合物A5与4-氰基苄溴反应，制得化合物I-18(白色固体，产率22％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.36(s,1H),8.34(s,1H),8.15-8.01(m,2H),7.85-7.70(m,2H),7.58-7.34(m,4H),4.68(s,1H),4.02(s,2H),3.55(s,2H),2.64-2.52(m,2H),2.40-2.23(m,2H),1.69-1.51(m,2H),1.50-1.31(m,2H).ESI-MS:m/z 459.2[M+H]⁺。

实施例19

1-(4-氟苯基)-5-((4-羟基-1-(4-甲基苄基)哌啶-4-基)甲基)-1,5-二氢-4H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮(I-19)

参照实施例1的方法，用化合物A5与4-甲基苄溴反应，制得化合物I-19(白色固体，产率60％)。1H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.35(s,1H),8.34(s,1H),8.15-7.99(m,2H),7.74-7.65(m,1H),7.49-7.34(m,2H),7.24-7.03(m,3H),4.64(s,1H),4.01(s,2H),3.41(s,2H),2.49-2.42(m,2H),2.38-2.12(m,5H),1.65-1.54(m,2H),1.43-1.35(m,2H).ESI-MS:m/z448.2[M+H]⁺。

实施例20

4-((4-((1-(4-氟苯基)-4-氧-1,4-二氢-5H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-5-基)甲基)-4-羟基哌啶-1-基)甲基)苯甲酸甲酯(I-20)

参照实施例1的方法制，用化合物A5与4-溴甲基苯甲酸甲酯反应，得化合物I-20(白色固体，产率57％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.33(d,J＝2.5Hz,2H),8.05(dd,J＝8.6,4.8Hz,2H),7.89(d,J＝7.8Hz,2H),7.49-7.31(m,4H),4.65(s,1H),4.01(s,2H),3.82(s,3H),3.52(s,2H),2.49(s,2H),2.29(t,J＝9.9Hz,2H),1.60(t,J＝10.1Hz,2H),1.47-1.30(m,2H).ESI-MS:m/z 492.3[M+H]⁺。

实施例21

1-(4-氟苯基)-5-((4-羟基-1-(吡啶-4-基甲基)哌啶-4-基)甲基)-1,5-二氢-4H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮(I-21)

参照实施例1的方法制，用化合物A5与4-溴甲基吡啶反应，得化合物I-21(白色固体，产率61％)。1H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.59-8.43(m,2H),8.42-8.29(m,2H),8.17-8.01(m,2H),7.50-7.37(m,2H),7.37-7.26(m,2H),4.69(s,1H),4.03(s,2H),3.50(s,2H),2.58-2.51(m,2H),2.40-2.22(m,2H),1.73-1.54(m,2H),1.50-1.32(m,2H).ESI-MS:m/z 435.2[M+H]⁺。

实施例22

1-(4-氟苯基)-5-((4-羟基-1-(4-(甲基磺酰基)苄基)哌啶-4-基)甲基)-1,5-二氢-4H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮(I-22)

参照实施例1的方法，用化合物A5与4-甲磺酰基苄溴反应，制得化合物I-22(白色固体，产率74％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.35(s,1H),8.34(s,1H),8.12-8.00(m,2H),7.92-7.79(m,2H),7.62-7.50(m,2H),7.48-7.36(m,2H),4.68(s,1H),4.03(s,2H),3.57(s,2H),3.19(s,3H),2.51(s,2H),2.40-2.22(m,2H),1.75-1.53(m,2H),1.52-1.32(m,2H).ESI-MS:m/z 512.3[M+H]⁺。

实施例23

1-(4-氟苯基)-5-((4-羟基-1-(4-(三氟甲基)苄基)哌啶-4-基)甲基)-1,5-二氢-4H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮(I-23)

参照实施例1的方法，用化合物A5与4-三氟甲基苄溴反应，制得化合物I-23(白色固体，产率36％)。1H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.35(s,1H),8.34(s,1H),8.14-8.01(m,2H),7.74-7.62(m,2H),7.58-7.48(m,2H),7.48-7.35(m,2H),4.67(s,1H),4.03(s,2H),3.56(s,2H),2.49-2.44(m,2H),2.42-2.17(m,2H),1.72-1.51(m,2H),1.51-1.32(m,2H).ESI-MS:m/z 502.2[M+H]⁺。

实施例24

1-(4-氟苯基)-5-((4-羟基-1-(4-(三氟甲氧基)苄基)哌啶-4-基)甲基)-1,5-二氢-4H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮(I-24)

参照实施例1的方法，用化合物A5与4-三氟甲氧基苄溴反应，制得化合物I-24(白色固体，产率48％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.43-8.26(m,2H),8.15-7.94(m,2H),7.58-7.17(m,6H),4.71(s,1H),4.04(s,2H),3.49(s,1H),3.31(s,1H),2.49-2.38(m,2H),2.40-2.15(m,2H),1.72-1.53(m,2H),1.53-1.33(m,2H).ESI-MS:m/z 518.2[M+H]⁺。

实施例25

5-((1-([1,1'-联苯]-4-基甲基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-1-(4-氟苯基)-1,5-二氢-4H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮(I-25)

参照实施例1的方法，用化合物A5与4-溴甲基联苯反应，制得化合物I-25(白色固体，产率53％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.36(s,1H),8.35(s,1H),8.15-8.00(m,2H),7.73-7.54(m,4H),7.52-7.22(m,7H),4.67(s,1H),4.03(s,2H),3.51(s,2H),2.63-2.52(m,2H),2.42-2.21(m,2H),1.72-1.53(m,2H),1.50-1.33(m,2H).ESI-MS:m/z 510.3[M+H]⁺。

实施例26

5-((1-(3,5-二(三氟甲基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-1-(4-氟苯基)-1,5-二氢-4H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮(I-26)

参照实施例1的方法，用化合物A5与3,5-二(三氟甲基)苄溴反应，制得化合物I-26(白色固体，产率46％)。1H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.35(s,1H),8.34(s,1H),8.11-8.03(m,2H),8.02-7.95(m,3H),7.47-7.38(m,2H),4.68(s,1H),4.04(s,2H),3.68(s,2H),2.59-2.52(m,2H),2.41-2.28(m,2H),1.72-1.55(m,2H),1.48-1.35(m,2H).ESI-MS:m/z 570.2[M+H]⁺。

实施例27

5-((1-(2,6-二氟苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-1-(4-氟苯基)-1,5-二氢-4H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮(I-27)

参照实施例1的方法，用化合物A5与2,6-二氟苄溴反应，制得化合物I-27(白色固体，产率73％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.35(s,1H),8.32(s,1H),8.14-8.01(m,2H),7.53-7.28(m,3H),7.16-7.00(m,2H),4.63(s,1H),3.99(s,2H),3.56(s,2H),2.49-2.45(m,2H),2.44-2.19(m,2H),1.66-1.46(m,2H),1.46-1.31(m,2H).ESI-MS:m/z 470.3[M+H]⁺。

实施例28

5-((1-(2-氯-4-氟苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-1-(4-氟苯基)-1,5-二氢-4H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮(I-28)

参照实施例1的方法，用化合物A5与2-氯-4-氟苄溴反应，制得化合物I-28(白色固体，产率46％)。1H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.36(s,1H),8.34(s,1H),8.14-7.98(m,2H),7.77-7.32(m,4H),7.27-7.12(m,1H),4.69(s,1H),4.03(s,2H),3.51(s,2H),2.61-2.51(m,2H),2.43-2.28(m,2H),1.66-1.54(m,2H),1.44-1.34(m,2H).ESI-MS:m/z 486.2[M+H]⁺。

实施例29

5-((1-(4-溴-2-氯苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-1-(4-氟苯基)-1,5-二氢-4H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮(I-29)

参照实施例1的方法，用化合物A5与2-氯-4-溴苄溴反应，制得化合物I-29(白色固体，产率40％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.36(s,1H),8.34(s,1H),8.13-8.00(m,2H),7.74-7.62(m,1H),7.58-7.49(m,1H),7.49-7.36(m,3H),4.70(s,1H),4.03(s,2H),3.51(s,2H),2.62-2.52(m,2H),2.44-2.22(m,2H),1.74-1.52(m,2H),1.53-1.33(m,2H).ESI-MS:m/z 546.1[M+H]⁺。

实施例30

5-((1-(2,4-二氯苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-1-(4-氟苯基)-1,5-二氢-4H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮(I-30)

参照实施例1的方法，用化合物A5与2,4-二氯苄溴反应，制得化合物I-30(白色固体，产率47％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.45-8.26(m,2H),8.16-7.96(m,2H),7.67-7.26(m,5H),4.69(s,1H),4.04(s,2H),3.53(s,2H),2.61-2.51(m,2H),2.45-2.25(m,2H),1.77-1.53(m,2H),1.53-1.33(m,2H).ESI-MS:m/z 502.2[M+H]⁺。

实施例31

5-((1-(2,6-二氯苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-1-(4-氟苯基)-1,5-二氢-4H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮(I-31)

参照实施例1的方法，用化合物A5与2,6-二氯苄溴反应，制得化合物I-31(白色固体，产率42％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.34(d,J＝6.9Hz,2H),8.07(dd,J＝8.8,4.9Hz,2H),7.50-7.26(m,5H),4.69(s,1H),4.00(s,2H),3.66(s,2H),2.50-2.36(m,4H),1.62-1.44(m,2H),1.43-1.31(m,2H).ESI-MS:m/z 502.2[M+H]⁺。

实施例32

3-氯-4-((4-((1-(4-氟苯基)-4-氧-1,4-二氢-5H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-5-基)甲基)-4-羟基哌啶-1-基)甲基)苯甲酸甲酯(I-32)

参照实施例1的方法，用化合物A5与3-氯-4-溴甲基苯甲酸甲酯反应，制得化合物I-32(白色固体，产率50％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.35(d,J＝3.0Hz,2H),8.07(dd,J＝8.7,4.8Hz,2H),7.99-7.85(m,2H),7.66(d,J＝8.3Hz,1H),7.42(t,J＝8.7Hz,2H),4.71(s,1H),4.03(s,2H),3.86(s,3H),3.61(s,2H),2.62-2.52(m,2H),2.45-2.33(m,2H),1.73-1.55(m,2H),1.49-1.35(m,2H).ESI-MS:m/z 526.2[M+H]⁺。

实施例33

5-氯-2-((4-((1-(4-氟苯基)-4-氧-1,4-二氢-5H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-5-基)甲基)-4-羟基哌啶-1-基)甲基)苯甲腈(I-33)

参照实施例1的方法，用化合物A5与2-氰基-4-氯苄溴反应，制得化合物I-33(白色固体，产率44％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.35(s,1H),8.34(s,1H),8.12-8.02(m,2H),8.01-7.95(m,1H),7.78-7.70(m,1H),7.62-7.56(m,1H),7.47-7.37(m,2H),4.70(s,1H),4.02(s,2H),3.61(s,2H),2.57-2.51(m,2H),2.44-2.32(m,2H),1.68-1.50(m,2H),1.48-1.32(m,2H).ESI-MS:m/z 515.2[M+Na]⁺。

实施例34

5-((1-(4-氯-2-(三氟甲基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-1-(4-氟苯基)-1,5-二氢-4H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮(I-34)

参照实施例1的方法，用化合物A5与2-氟甲基-4-氯苄溴反应，制得化合物I-34(白色固体，产率86％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.35(d,J＝3.7Hz,2H),8.17-7.99(m,2H),7.86-7.78(m,1H),7.78-7.68(m,2H),7.42(t,J＝8.7Hz,2H),4.71(s,1H),4.03(s,2H),3.58(s,2H),2.56-2.50(m,2H),2.40-2.21(m,2H),1.76-1.52(m,2H),1.50-1.32(m,2H).ESI-MS:m/z 536.2[M+H]⁺。

实施例35

5-((1-(2-溴-4-硝基苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-1-(4-氟苯基)-1,5-二氢-4H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮(I-35)

参照实施例1的方法，用化合物A5与2-溴-4-硝基苄溴反应，制得化合物I-35(白色固体，产率47％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.34(s,1H),8.31(s,1H),8.11-8.00(m,3H),7.88-7.80(m,1H),7.60-7.53(m,1H),7.47-7.35(m,2H),4.66(s,1H),3.98(s,2H),3.64(s,2H),2.43-2.22(m,4H),1.57-1.42(m,2H),1.37-1.25(m,2H).ESI-MS:m/z 557.1[M+H]⁺。

实施例36

3-溴-4-((4-((1-(4-氟苯基)-4-氧-1,4-二氢-5H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-5-基)甲基)-4-羟基哌啶-1-基)甲基)苯甲腈(I-36)

参照实施例1的方法，用化合物A5与2-溴-4-氰基苄溴反应，制得化合物I-36(白色固体，产率64％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.34(s,2H),8.14(s,1H),8.12-7.99(m,2H),7.85(d,J＝7.8Hz,1H),7.67(d,J＝7.8Hz,1H),7.42(t,J＝8.3Hz,2H),4.71(s,1H),4.03(s,2H),3.58(s,2H),2.61-2.51(m,2H),2.46-2.30(m,2H),1.73-1.53(m,2H),1.51-1.34(m,2H).ESI-MS:m/z 537.2 539.2[M+H]⁺。

实施例37

2-(2-氯苯基)-2-(4-((1-(4-氟苯基)-4-氧-1,4-二氢-5H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-5-基)甲基)-4-羟基哌啶-1-基)乙酸甲酯(I-37)

参照实施例1的方法，用化合物A5与2-氯-2-(2-氯苯基)乙酸甲酯反应，制得化合物I-37(白色固体，产率57％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.34(d,J＝5.5Hz,2H),8.07(dd,J＝9.0,4.9Hz,2H),7.58(d,J＝7.3Hz,1H),7.50-7.28(m,5H),4.70(s,1H),4.58(s,1H),4.02(s,2H),3.62(s,3H),2.67-2.57(m,1H),2.48-2.35(m,3H),1.72-1.50(m,2H),1.50-1.32(m,2H).ESI-MS:m/z 548.2[M+Na]⁺。

实施例38

5-((1-二苯甲基-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-1-(4-氟苯基)-1,5-二氢-4H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮(I-38)

参照实施例1的方法，用化合物A5与二苯氯甲烷反应，制得化合物I-38(白色固体，产率35％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.31(s,2H),8.04(s,2H),7.38(s,6H),7.32-7.20(m,4H),7.20-7.04(m,2H),4.63(s,1H),4.30(s,1H),4.01(s,2H),2.47-2.37(m,2H),2.32-2.03(m,2H),1.79-1.51(m,2H),1.50-1.26(m,2H).ESI-MS:m/z 532.3[M+Na]⁺。

实施例39

1-(4-氟苯基)-5-((4-羟基-1-(噻唑-2-基)哌啶-4-基)甲基)-1,5-二氢-4H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮(I-39)

参照实施例49的方法，用化合物A5与2-溴噻唑反应，制得化合物I-39(白色固体，产率16％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.36(d,J＝2.6Hz,2H),8.18-7.99(m,2H),7.42(t,J＝8.8Hz,2H),7.13(d,J＝3.6Hz,1H),6.80(d,J＝3.6Hz,1H),5.00(s,1H),4.06(s,2H),3.77-3.59(m,2H),3.28(t,J＝10.8Hz,2H),1.68(t,J＝10.2Hz,2H),1.60-1.43(m,2H).ESI-MS:m/z 449.2[M+Na]⁺。

实施例40

2-(4-((1-(4-氟苯基)-4-氧-1,4-二氢-5H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-5-基)甲基)-4-羟基哌啶-1-基)噻唑-4-羧酸乙酯(I-40)

参照实施例49的方法，用化合物A5与2-溴噻唑-4-甲酸乙酯反应，制得化合物I-40(白色固体，产率18％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.35(d,J＝1.8Hz,2H),8.06(dd,J＝8.7,4.8Hz,2H),7.65(s,1H),7.41(t,J＝8.7Hz,2H),5.01(s,1H),4.21(q,J＝7.0Hz,2H),4.06(s,2H),3.68(d,J＝12.6Hz,2H),1.68(t,J＝10.2Hz,2H),1.58-1.41(m,2H),1.25(t,J＝7.0Hz,3H).ESI-MS:m/z 521.2[M+Na]⁺.

实施例41

1-(4-氟苯基)-5-((4-羟基-1-(2-氧-2-苯乙基)哌啶-4-基)甲基)-1,5-二氢-4H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮(I-41)

参照实施例1的方法，用化合物A5与2-溴苯乙酮反应，制得化合物I-41(白色固体，产率52％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.42-8.25(m,2H),8.12-7.98(m,2H),7.63-7.17(m,7H),4.66(s,1H),4.02(s,2H),3.43(s,2H),2.47-2.40(m,2H),2.36-2.12(m,2H),1.71-1.51(m,2H),1.48-1.28(m,2H).ESI-MS:m/z 462.2[M+H]⁺。

实施例42

3-氯-4-((4-((1-(4-氟苯基)-4-氧-1,4-二氢-5H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-5-基)甲基)-4-羟基哌啶-1-基)甲基)苯甲腈(I-42)

参照实施例1的方法，用化合物A5与2-氯-4-氰基苄溴反应，制得化合物I-42(白色固体，产率43％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.34(d,J＝3.5Hz,2H),8.13-7.94(m,3H),7.80(d,J＝8.0Hz,1H),7.68(d,J＝8.0Hz,1H),7.41(t,J＝8.8Hz,2H),4.71(s,1H),4.02(s,2H),3.60(s,2H),2.57-2.50(m,2H),2.38(t,J＝10.0Hz,2H),1.63(t,J＝10.1Hz,2H),1.41(d,J＝12.9Hz,2H).ESI-MS:m/z 515.2[M+Na]⁺。

实施例43

3-氯-4-((4-((1-(4-氟苯基)-4-氧-1,4-二氢-5H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-5-基)甲基)-4-羟基哌啶-1-基)甲基)苯甲酸甲酯(I-43)

参照实施例1的方法，用化合物A5与3-氯-4-溴甲基苯甲酸乙酯反应，制得化合物I-43(白色固体，产率58％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.34(d,J＝3.6Hz,2H),8.06(dd,J＝9.1,4.9Hz,2H),7.95-7.82(m,2H),7.65(d,J＝8.4Hz,1H),7.41(t,J＝8.8Hz,2H),4.70(s,1H),4.31(q,J＝7.1Hz,2H),4.03(s,2H),3.60(s,2H),2.54(d,J＝11.5Hz,2H),2.38(t,J＝10.1Hz,2H),1.63(t,J＝10.4Hz,2H),1.41(d,J＝13.1Hz,2H),1.31(t,J＝7.1Hz,3H).ESI-MS:m/z 562.2[M+Na]⁺。

实施例44

3-氯-4-((4-((1-(4-氟苯基)-4-氧-1,4-二氢-5H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-5-基)甲基)-4-羟基哌啶-1-基)甲基)苯甲酸(I-44)

将化合物I-32(50mg,0.095mmol)溶于甲醇(2mL)中，加入50％的羟胺水溶液(2mL)，混合物在封管中90℃加热5h，减压浓缩反应液，残留物经硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇＝5:1)纯化，得化合物I-44的白色固体(35mg，产率73％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.35(d,J＝3.4Hz,2H),8.06(dd,J＝9.0,4.8Hz,2H),7.89(s,1H),7.82(d,J＝7.9Hz,1H),7.50-7.33(m,3H),4.76(s,1H),4.03(s,2H),3.54(s,2H),2.60-2.51(m,2H),2.42-2.22(m,2H),1.73-1.52(m,2H),1.48-1.33(m,2H).ESI-MS:m/z 512.2[M+H]⁺。

实施例45

3-氟-4-((4-((1-(4-氟苯基)-4-氧-1,4-二氢-5H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-5-基)甲基)-4-羟基哌啶-1-基)甲基)苯甲酸甲酯(I-45)

参照实施例1的方法，用化合物A5与3-氟-4-溴甲基苯甲酸甲酯反应，制得化合物I-45(白色固体，产率32％)。1H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.36(s,1H),8.34(s,1H),8.17-8.00(m,2H),7.87-7.72(m,1H),7.74-7.54(m,2H),7.51-7.31(m,2H),4.68(s,1H),4.02(s,2H),3.86(s,3H),3.58(s,2H),2.63-2.52(m,2H),2.42-2.19(m,2H),1.72-1.54(m,2H),1.48-1.31(m,2H).ESI-MS:m/z 510.2[M+H]⁺。

实施例46

3-溴-4-((4-(1-(4-氟苯基)-4-氧-1,4-二氢-5H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-5-基)甲基)-4-羟基哌啶-1-基)甲基)苯甲酸甲酯(I-46)

参照实施例1的方法，用化合物A5与3-溴-4-溴甲基苯甲酸甲酯反应，制得化合物I-46(白色固体，产率49％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.36(s,1H),8.35(s,1H),8.13-8.03(m,3H),7.99-7.92(m,1H),7.69-7.62(m,1H),7.48-7.37(m,2H),4.72(s,1H),4.04(s,2H),3.86(s,3H),3.59(s,2H),2.65-2.54(m,2H),2.45-2.32(m,2H),1.73-1.57(m,2H),1.50-1.35(m,2H).ESI-MS:m/z 570.1[M+H]⁺。

实施例47

4-(-(4-((3-溴-2-甲基-7-氧-2,7-二氢-6H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-6-基)甲基)-4-羟基哌啶-1-基)甲基)-3-氯苯甲酸甲酯(I-50)

4-((4-((3-(4-(((叔丁氧基羰基)氨基)甲基)苯基)-2-甲基-7-氧-2,7-二氢-6H-吡唑并[4,3-]d]嘧啶-6-基)甲基)-4-羟基哌啶-1-基)甲基)-3-氯苯甲酸甲酯(I-51)

4-((3-(4-(氨甲基)苯基)-2-甲基-7-氧-2,7-二氢-6H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-6-基)甲基)-1-(2-氯-4-(甲氧基羰基)苄基)-4-羟基哌啶二三氟乙酸盐(I-52)

将4-硝基-1H-吡唑-3-甲酸甲酯(51.3mg,0.3mmol)和碳酸钾(83mg,0.6mmol)溶解于丙酮(7mL)，加入碘甲烷(37.3μL,0.6mmol)。所得混合溶液70℃加热反应4h，TLC监测，反应完完毕，减压蒸去有机溶剂。残留物中加入水(6mL)，用乙酸乙酯(7mL×3)萃取，合并的有机相用饱和氯化钠水溶液(10mL)洗涤，无水硫酸钠干燥。减压蒸去有机溶剂，残留物经硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝2:1)纯化，得化合物B1的白色固体(15mg,产率27％)。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ8.13(s,1H),4.00(s,3H),3.99(s,3H).ESI-MS:m/z 208.0[M+Na]⁺。

将化合物B1(2.54g,13.7mmol)溶解于甲醇(50mL)中，加入10％ Pd/C(0.5g)，所得混合物在氢气环境下室温搅拌过夜。TLC监测反应完毕，反应液经硅藻土抽滤，滤液减压浓缩，得化合物B2的紫色固体(2.06g,粗品产率97％)，该粗品不经纯化直接投下一步反应。ESI-MS:m/z 178.1[M+Na]⁺。

将化合物B2的粗品(1.96g,12.6mmol)溶解于N,N-二异丙基乙胺(10.7mL)和甲醇(10.7mL)中，向混合液中分批慢慢加入醋酸甲脒(1.45g,13.9mmol)，所得溶液110℃反应1h。TLC监测反应完完毕，将反应液温度降至室温，体系中有白色固体析出。过滤收集固体，滤饼经乙醚洗涤，减压干燥得化合物B3(1.77g,产率94％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ11.85(s,1H),8.31(s,1H),7.77(s,1H),4.08(s,3H).ESI-MS:m/z 173.0[M+Na]⁺。

将化合物B3(3.24g,21.6mmol)置于封管内，加入乙酸(21.6mL)和液溴(3.34mL,64.7mmol)，95℃条件下搅拌反应24h。TLC监测反应完毕，加入饱和硫代硫酸钠溶液(50mL)，有固体析出。过滤收集固体，滤饼经水洗涤，真空干燥得合物B4的黄色固体(1.81g,产率36％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ12.00(s,1H),7.84(d,J＝2.1Hz,1H),4.07(s,3H).ESI-MS:m/z 251.0 253.0[M+Na]⁺。

将化合物B4(45mg,0.2mmol)和1-氧杂-6-氮杂螺[2-4]辛烷-6-羧酸叔丁酯(84mg,0.4mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(5mL)，加入碳酸铯(72mg,0.22mmol)，于80℃搅拌反应。TLC监测反应进程，待原料转化完全后，向反应液中加饱和氯化铵(3mL)，乙酸乙酯(8mL×3)萃取。合并有机相，用饱和氯化钠水溶液(20mL×2)洗涤，无水硫酸钠干燥。减压蒸去有机溶剂，残留物经硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇＝50:1)纯化，得化合物B5的白色固体(65mg,产率74％)。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ7.90(s,1H),4.11(s,3H),4.13-3.99(m,2H),3.93-3.77(m,2H),3.26-3.06(m,2H),1.68-1.52(m,4H),1.46(s,9H).ESI-MS:m/z464.1,466.1[M+Na]⁺。

将化合物B5(900mg,2.04mmol)溶于二氯甲烷(7mL)中，冰浴条件下缓慢滴加三氟乙酸(3.3mL)，此时溶液呈澄清透明状。将反应液自然升至室温，并搅拌过夜。TLC监测原料转化完全后，减压蒸去有机溶剂和三氟乙酸，得三氟乙酸盐形式的化合物B6粗品。ESI-MS:m/z 342.1[M+H]⁺。

将化合物B6参照实施例1的最后一步反应及操作，制得化合物I-50(白色固体，产率32％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.03(s,1H),7.98-7.84(m,2H),7.65(d,J＝8.4Hz,1H),4.66(s,1H),4.06(s,3H),3.96(s,2H),3.85(s,3H),3.59(s,2H),2.59-2.50(m,2H),2.43-2.29(m,2H),1.65-1.52(m,2H),1.46-1.33(m,2H).ESI-MS:m/z 524.3[M+H]⁺。

将化合物I-50(164mg,0.31mmol)、(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苄基)氨基甲酸叔丁酯(120mg,0.36mmol)、四(三苯基膦)钯(11mg,0.0093mmol)和碳酸钾(128mg,0.93mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(3mL)中，氩气保护条件下110℃加热反应16h。向反应液中加入冰水(9mL),乙酸乙酯(10mL×3)萃取。合并的有机相，用水(10mL)洗两次，无水硫酸钠干燥。减压蒸除有机溶剂，残留物经硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇＝20:1)纯化,得化合物I-51的白色固体(141mg,产率60％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.00(s,1H),7.98-7.85(m,2H),7.76-7.59(m,3H),7.54-7.35(m,3H),4.67(s,1H),4.22(d,J＝5.9Hz,2H),4.10(s,3H),4.00(s,2H),3.87(s,3H),3.62(s,2H),2.66-2.52(m,2H),2.40(t,J＝10.1Hz,2H),1.63(t,J＝10.0Hz,2H),1.42(s,9H).ESI-MS:m/z 651.4[M+H]⁺。

将化合物I-51(59mg,0.091mmol)溶于二氯甲烷(4mL)中，加入三氟乙酸(0.4mL)，室温搅拌3h。减压蒸除反应液的有机溶剂，加入乙酸乙酯(1.5mL)打浆，过滤，得三氟乙酸盐形式的化合物I-52白色固体(56mg，产率78.8％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ9.69(s,1H),8.34(s,3H),8.12-7.94(m,3H),7.92-7.82(m,1H),7.77(d,J＝7.6Hz,2H),7.66(d,J＝7.7Hz,2H),5.32(s,1H),4.54(s,2H),4.14(s,2H),4.12(s,3H),4.04(s,2H),3.89(s,3H),2.63-2.50(m,2H),1.96-1.80(m,2H),1.77-1.55(m,2H),1.35-1.20(m,2H).ESI-MS:m/z551.3[M+H]⁺。

实施例48

3-氟-4-((4-((1-(4-氟苯基)-4-氧-1,4-二氢-5H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-5-基)甲基)-4-羟基哌啶-1-基)甲基)苯甲酸(I-53)

参照实施例44的方法，将化合物I-45水解，得化合物I-53的白色固体(45mg，产率63％)。ESI-MS:m/z 496.2[M+H]⁺。

实施例49

1-(4-氟苯基)-5-((4-羟基-1-(吡啶-2-基)哌啶-4-基)甲基)-1,5-二氢-4H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮(I-54)

将化合物A5(88mg,0.2mmol)、2-溴吡啶(21μL,0.22mmol)和碳酸钾(102mg,0.74mmol)置于DMF(2mL)中，加热至120℃搅拌反应20h。将反应液冷却至室温后，向其中加入水(10mL)，用乙酸乙酯萃取(10mL×3)，合并有机层，用饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩滤液，残余物经干法硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝1:1)纯化，得化合物I-54的白色固体(37mg，产率34％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.42-8.32(m,2H),8.12-8.04(m,3H),7.54-7.37(m,3H),6.86-6.79(m,1H),6.61-6.53(m,1H),4.90(s,1H),4.05(s,2H),4.00-3.90(m,2H),3.26-3.16(m,2H),1.64-1.53(m,2H),1.48-1.39(m,2H).ESI-MS:m/z 443.1[M+Na]⁺。

实施例50

1-(4-氟苯基)-5-((4-羟基-1-(嘧啶-2-基)哌啶-4-基)甲基)-1,5-二氢-4H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮(I-55)

参照实施例49的方法，用化合物A5与2-溴嘧啶反应，制得化合物I-55(白色固体，产率34％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.42-8.30(m,4H),8.15-8.00(m,2H),7.51-7.35(m,2H),6.62-6.54(m,1H),4.96(s,1H),4.37-4.26(m,2H),4.06(s,2H),3.29-3.23(m,2H),1.64-1.37(m,4H).ESI-MS:m/z 422.2[M+H]⁺。

实施例51

1-(4-氟苯基)-5-((4-羟基-1-(喹啉-2-基)哌啶-4-基)甲基)-1,5-二氢-4H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮(I-56)

参照实施例49的方法，用化合物A5与2-溴喹啉反应，制得化合物I-56(白色固体，产率39％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.38(s,1H),8.37(s,1H),8.14-8.05(m,2H),8.04-7.97(m,1H),7.72-7.65(m,1H),7.59-7.49(m,2H),7.50-7.38(m,2H),7.30-7.15(m,2H),4.96(s,1H),4.31-4.14(m,2H),4.06(s,2H),3.46-3.33(m,2H),1.75-1.56(m,2H),1.56-1.41(m,2H).ESI-MS:m/z 471.2[M+H]⁺。

实施例52

1-(4-氟苯基)-5-((1-(3-氟吡啶-2-基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-1,5-二氢-4H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮(I-57)

参照实施例49的方法，用化合物A5与2-溴-3-氟吡啶反应，制得化合物I-57(白色固体，产率39％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.45-8.30(m,2H),8.16-7.93(m,3H),7.54-7.33(m,3H),6.91-6.77(m,1H),4.91(s,1H),4.06(s,2H),3.80-3.63(m,2H),3.27-3.15(m,2H),1.77-1.62(m,2H),1.55-1.43(m,2H).ESI-MS:m/z 439.1[M+H]⁺。

实施例53

5-((1-(3-氯吡啶-2-基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-1-(4-氟苯基)-1,5-二氢-4H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮(I-58)

参照实施例49的方法，用化合物A5与2-溴-3-氯吡啶反应，制得化合物I-58(白色固体，产率36％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.46-8.31(m,2H),8.24-8.15(m,1H),8.15-8.01(m,2H),7.81-7.71(m,1H),7.51-7.36(m,2H),7.03-6.89(m,1H),4.87(s,1H),4.08(s,2H),3.57-3.40(m,2H),3.22-3.04(m,2H),1.86-1.66(m,2H),1.60-1.44(m,2H).ESI-MS:m/z 455.1[M+H]⁺。

实施例54

5-((1-(3-溴吡啶-2-基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-1-(4-氟苯基)-1,5-二氢-4H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮(I-59)

参照实施例49的方法，用化合物A5与2,3-二溴吡啶反应，制得化合物I-59(白色固体，产率48％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.38(s,1H),8.37(s,1H),8.27-8.18(m,1H),8.14-8.02(m,2H),7.98-7.89(m,1H),7.48-7.38(m,2H),6.95-6.84(m,1H),4.87(s,1H),4.10(s,2H),3.51-3.38(m,2H),3.16-3.00(m,2H),1.86-1.65(m,2H),1.62-1.48(m,2H).ESI-MS:m/z 455.1[M+Na]⁺。

实施例55

1-(4-氟苯基)-5-((4-羟基-1-(3-碘吡啶-2-基)哌啶-4-基)甲基)-1,5-二氢-4H-吡唑并[3,4d]嘧啶-4-酮(I-60)

参照实施例49的方法，用化合物A5与2-溴-3-碘吡啶反应，制得化合物I-60(白色固体，产率55％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.41-8.35(m,2H),8.29-8.22(m,1H),8.19-8.12(m,1H),8.12-8.04(m,2H),7.50-7.36(m,2H),6.81-6.71(m,1H),4.86(s,1H),4.10(s,2H),3.41-3.31(m,2H),3.14-2.98(m,2H),1.88-1.68(m,2H),1.64-1.45(m,2H).ESI-MS:m/z 547.2[M+H]⁺。

实施例56

2-(4-((1-(4-氟苯基)-4-氧-1,4-二氢-5H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-5-基)甲基)-4-羟基-1-基)烟腈(I-61)

参照实施例49的方法，用化合物A5与2-溴-3-氰基吡啶反应，制得化合物I-61(白色固体，产率48％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.44-8.32(m,3H),8.14-7.98(m,3H),7.50-7.38(m,2H),6.93-6.84(m,1H),4.98(s,1H),4.09(s,2H),4.04-3.91(m,2H),3.42-3.33(m,2H),1.82-1.65(m,2H),1.61-1.44(m,2H).ESI-MS:m/z 468.1[M+Na]⁺。

实施例57

1-(4-氟苯基)-5-((4-羟基-1-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)哌啶-4-基)甲基)-1,5-二氢-4H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-酮(I-62)

参照实施例49的方法，用化合物A5与2-溴-3-三氟甲基吡啶反应，制得化合物I-62(白色固体，产率40％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.43-8.32(m,2H),8.14-8.01(m,2H),7.79-7.65(m,1H),7.53-7.38(m,2H),7.20-7.07(m,1H),7.04-6.93(m,1H),4.97(s,1H),4.06(s,2H),4.05-3.96(m,2H),3.29-3.18(m,2H),1.70-1.56(m,2H),1.53-1.38(m,2H).ESI-MS:m/z 511.1[M+Na]⁺。

实施例58

2-(4-((1-(4-氟苯基)-4-氧-1,4-二氢-5H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-5-基)甲基)-4-羟基-1-基)烟碱醛(I-63)

参照实施例49的方法，用化合物A5与2-溴烟醛反应，制得化合物I-63(白色固体，产率49％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ9.92(s,1H),8.44-8.33(m,3H),8.14-7.97(m,3H),7.51-7.32(m,2H),7.05-6.89(m,1H),4.95(s,1H),4.09(s,2H),3.70-3.51(m,2H),3.43-3.32(m,2H),1.88-1.68(m,2H),1.57-1.38(m,2H).ESI-MS:m/z 471.1[M+Na]⁺。

实施例59

6-(4-((1-(4-氟苯基)-4-氧-1,4-二氢-5H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-5-基)甲基)-4-羟基-1-基)吡啶甲醛(I-64)

参照实施例49的方法，用化合物A5与6-溴吡啶-2-甲醛反应，制得化合物I-64(白色固体，产率19％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ9.79(s,1H),8.38(s,1H),8.37(s,1H),8.15-8.02(m,2H),7.79-7.65(m,1H),7.49-7.37(m,2H),7.22-7.09(m,2H),4.97(s,1H),4.19-4.00(m,4H),3.42-3.31(m,2H),1.71-1.54(m,2H),1.54-1.36(m,2H).ESI-MS:m/z 471.2[M+Na]⁺。

实施例60

4-((4-((3-(4-(乙酰氨基甲基)苯基)-2-甲基-7-氧-2,7-二氢-6H-吡唑[4,3-d]嘧啶-6-基)甲基)-4-羟基哌啶-1-基)甲基)-3-氯苯甲酸甲酯(I-65)

参照实施例47中化合物I-51的合成方法，将其中的(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苄基)氨基甲酸叔丁酯替换成N-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)苄基)乙酰胺，制得化合物I-65(白色固体，产率65％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.41(t,J＝5.8Hz,1H),7.99(s,1H),7.89(d,J＝4.8Hz,2H),7.80-7.60(m,3H),7.43(d,J＝8.1Hz,2H),4.65(s,1H),4.33(d,J＝5.9Hz,2H),4.08(s,3H),3.98(s,2H),3.85(s,3H),3.60(s,2H),2.63-2.52(m,2H),2.45-2.32(m,2H),1.89(s,3H),1.73-1.55(m,2H),1.51-1.34(m,2H).ESI-MS:m/z593.2[M+H]⁺。

实施例61

(4-(6-((1-(2-氯-4-环丙基苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-7-氧代-6,7-二氢-2H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-3-基)苄基)氨基甲酸叔丁酯(I-66)

取3-溴-6-((4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑[4,3-d]嘧啶-7-酮盐酸盐(100mg，0.265mmol)分散于1,4-二氧六环(3mL)中，先后加入(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苄基)氨基甲酸叔丁酯(106mg，0.318mmol)、四(三苯基膦)钯(10mg，0.00795mmol)和1M磷酸钾(0.53mL，0.53mmol)。于封管中冻抽三次，氩气氛围下110℃加热30h。再次加入(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)苄基)氨基甲酸叔丁酯(62mg，0.1855mmol)，继续加热26h。TLC(二氯甲烷/甲醇/氨水＝80滴:10滴:1滴)监测反应完毕(注：此产物在水相中溶解度好)。硅藻土过滤，旋蒸除去溶剂，干法上样，柱层析纯化(二氯甲烷/甲醇/氨水＝100:10:1)得化合物B28的白色固体(70mg，产率56％)。¹HNMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.01(s,1H),7.67(d,J＝7.6Hz,2H),7.54-7.35(m,3H),4.70(s,1H),4.23(d,J＝5.0Hz,2H),4.10(s,3H),3.98(s,2H),2.74(s,4H),1.63-1.28(m,13H).ESI-MS:m/z 469.3[M+H]⁺。

称取2-氯-4-溴苯甲醛(330mg，1.5mmol)溶于甲苯(6.8mL)中，分别加入环丙基苯硼酸(167mg，1.95mmol)、磷酸钾(1.114g，5.25mmol)、醋酸钯(17mg，0.075mmol)、三苯基膦(39mg，0.15mmol)和水(340μL)。混合物于100℃下加热12h，TLC监测反应完毕，加入水(14mL)，以乙酸乙酯(14mL)萃取三次，饱和氯化钠水溶液(15mL)洗涤有机相1次，无水硫酸钠干燥。干法上样，柱层析纯化(石油醚/乙酸乙酯＝100:1)得化合物B29的无色油状物(45mg，产率16％)。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ10.41(s,1H),7.82(d,J＝8.1Hz,1H),7.12(d,J＝1.4Hz,1H),7.05(d,J＝8.2Hz,1H),2.03-1.85(m,1H),1.18-1.09(m,2H),0.87-0.79(m,2H)。

称取化合物B28(35mg，0.07475mmol)溶于甲醇(4mL)，加入化合物B29(17mg，0.0897mmol)，室温搅拌0.5h，加入腈基硼氢化钠(40mg，0.4484mmol)室温搅拌3天，反应液减压旋蒸除去溶剂，干法上样，柱层析纯化(二氯甲烷/甲醇＝20:1)得化合物I-66的白色固体(产率72％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ9.25(s,1H),7.99(s,1H),7.65(d,J＝7.6Hz,2H),7.59-7.30(m,3H),7.26-6.83(m,2H),4.22(d,J＝5.2Hz,2H),4.09(s,3H),4.06-3.91(m,2H),3.17(d,J＝3.8Hz,2H),2.49-2.20(m,2H),2.03-1.82(m,1H),1.79-1.51(m,2H),1.37(s,9H),1.28-1.12(m,2H),1.06-0.88(m,2H),0.77-0.61(m,2H).ESI-MS:m/z 633.4[M+H]⁺。

实施例62

(4-(6-((1-(2-氯-4-(甲氧基甲基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-7-氧-6,7-二氢-2H-吡唑[4,3-d]嘧啶-3-基)苄基)氨基甲酸叔丁酯(I-67)

(4-(6-((1-(2-氯-4-(甲基磺酰基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-7-氧-6,7-二氢-2H-吡唑[4,3-d]嘧啶-3-基)苄基)氨基甲酸叔丁酯(I-68)

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-(2-氯-4-(甲基磺酰基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(I-69)

将四氢铝锂(97mg,2.56mmol)置于四氢呋喃(5mL)中，氮气保护下置于冰浴中冷却。2-氯-4-(甲磺酰基)苯甲酸(500mg,2.13mmol)用无水THF(5mL)溶解后，逐滴滴入四氢铝锂中，冰浴冷却下搅拌至反应完毕。加入冰水(100μL)和氢氧化钠(200mg)，搅拌5min，再加入水(300μL)，搅拌10min，经硅藻土过滤，甲醇冲洗滤饼。减压旋蒸掉滤液中的溶剂，加入水(10mL)，用乙酸乙酯(10mL×3)萃取，合并的有机相依次经水(10mL)和饱和氯化钠水溶液(10mL)洗涤、无水硫酸钠干燥。干法上样，经硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇＝200:1)得化合物B7的淡黄色固体(250mg，产率53％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ7.90(d,J＝7.8Hz,2H),7.80(d,J＝7.9Hz,1H),5.63(t,J＝5.3Hz,1H),4.62(d,J＝4.9Hz,2H),3.25(s,3H).

将化合物B7(20mg,0.1mmol)溶于无水乙醚(4mL)中，冰浴下逐滴加入三溴化磷(18μL,0.187mmol)，冰水浴冷却下搅拌至反应完毕，加水3mL，用乙醚(4mL×3次)萃取，有机相经饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥。旋蒸除去溶剂，得化合物B8的无色油状物(32mg)。

将四氢铝锂(10mg,0.254mmol)加入到THF(5mL)中，氩气保护，冰浴下向其中滴入4-溴-3-氯苯甲酸(50mg,0.212mmol)的THF溶液，室温搅拌4h，依次加入水(16μL)、NaOH(32mg)和水(48μL)，冰浴下搅拌1h，经硅藻土抽滤，滤液减压旋蒸除去溶剂，得化合物B9。

化合物B9(0.212mmol)溶于DMF(3.5mL)，冰浴下向其中加入60％ NaH(10mg,0.254mmol)，再滴入碘甲烷(26μL,0.424mmol)，室温搅拌1h，向反应液中加入水(10mL)，以乙酸乙酯(10mL×3)萃取，合并的有机相以饱和氯化钠水溶液(10mL)洗涤，干法上样，经200-300目硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝100:1)得化合物B10(28mg)，两步产率57％。

在三颈瓶中加入搅拌子，装好温度计，并充氩气保护。将化合物B10(84mg,0.359mmol)溶于无水THF(4mL)后加入反应瓶中，降温至-80℃，滴加正丁基锂(158μL,0.395mmol)，使内温不高于-70℃，搅拌1h。-70℃条件下缓慢滴加无水DMF(31μL,0.395mmol)，再于-50℃下搅拌2h。滴加饱和氯化钠水溶液(3mL)淬灭反应，以乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥。干法上样，经硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝50:1)得化合物B11的无色油状物(20mg，产率30％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ10.30(s,1H),7.85(d,J＝7.9Hz,1H),7.53(s,1H),7.45(d,J＝7.5Hz,1H),4.50(s,2H),3.33(d,J＝1.2Hz,3H).ESI-MS:m/z183.0[M-H]⁺。

化合物B11(431mg,2.34mmol)溶于CH₃OH(6mL)，冰浴下加硼氢化钠(115mg,3.04mmol)，室温搅拌4h，冰浴下加水淬灭，以乙酸乙酯萃取(10mL×3)，合并的有机相用饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，减压旋蒸除去溶剂得化合物B12的无色油状物(170mg，产率39％)。

化合物B12(170mg,0.914mmol)溶于DCM(4mL)，加三苯基膦(288mg,1.1mmol)，冰浴下分批加四溴化碳(364mg,1.1mmol)，冰浴下搅拌30分钟，反应液制砂，经硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝100:1)纯化得化合物B13的无色油状物。

参照实施例47中化合物I-51的合成方法，用化合物B8与B6反应制得化合物I-67。白色固体，产率60％。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.04(s,1H),7.70(d,J＝8.0Hz,2H),7.58-7.23(m,6H),4.66(s,1H,OH),4.43(s,2H),4.25(d,J＝6.0Hz,2H),4.13(s,3H),4.02(s,2H),3.57(s,2H),3.34(s,3H),2.71-2.55(m,2H),2.49-2.28(m,2H),1.72-1.55(m,2H),1.53-1.35(m,11H).ESI-MS:m/z 659.3[M+Na]⁺。

参照实施例47中化合物I-51的合成方法，用化合物B13与B6反应制得化合物I-68。白色固体，产率77％。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.04(s,1H),7.98(s,1H),7.92(d,J＝8.2Hz,1H),7.82(d,J＝8.0Hz,1H),7.70(d,J＝8.0Hz,2H),7.57-7.36(m,3H),4.70(s,1H),4.26(d,J＝6.0Hz,2H),4.13(s,3H),4.04(s,2H),3.67(s,2H),3.30(s,3H),2.68-2.56(m,2H),2.45(m,2H),1.67(m,2H),1.54-1.33(m,11H).ESI-MS:m/z 671.3[M+H]⁺。

将化合物I-68(30mg，0.0448mmol)溶于DCM(3mL)中，冰浴下滴加2滴15％的盐酸乙醇溶液。搅拌20min后，将体系移入室温搅拌1.5h，TLC检测反应完毕，减压旋蒸除去溶剂得黄色固体，加乙酸乙酯1.5mL，搅拌2h，过滤得化合物I-69的白色固体27mg，产率93％。¹HNMR(300MHz,CDCl₃)δ10.89(s,1H),8.56(s,3H),8.25(d,J＝8.1Hz,1H),8.17-8.06(m,2H),8.00(d,J＝8.1Hz,1H),7.74(dd,J＝19.5,8.2Hz,4H),4.55(s,2H),4.12(m,5H),4.06(s,2H),3.43-3.16(m,7H),2.09(m,2H),1.64(m,2H).ESI-MS:m/z 571.3[M-2HCl+H]⁺。

实施例63

N-(4-((4-((3-(4-(氨基甲基)苯基)-2-甲基-7-氧-2,7-二氢-6H-吡唑[4,3-d]嘧啶-6-基)甲基)-4-羟基哌啶-1-基)甲基)-3-氯苯基)乙酰胺二盐酸盐(I-70)

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-(2-氯-4-(1H-吡唑-1-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(I-71)

4-((4-((3-(4-(氨基甲基)苯基)-2-甲基-7-氧-2,7-二氢-6H-吡唑[4,3-d]嘧啶-6-基)甲基)-4-羟基哌啶-1-基)甲基)-3,5-二氯苯甲酸甲酯二三氟乙酸盐(I-76)

3-((4-((3-(4-(氨基甲基)苯基)-2-甲基-7-氧-2,7-二氢-6H-吡唑[4,3-d]嘧啶-6-基)甲基)-4-羟基哌啶-1-基)甲基)-4-氯苯甲酸甲酯二三氟乙酸盐(I-78)

上述化合物的中间体制备路线如下所示：

将4-氨基-2-氯苯甲腈(1.06g,，6.947mmol)放入三颈瓶中，用氮气球对瓶内气体置换三次得到氮气保护的氛围。以注射器注入无水THF(11.58mL)，缓慢滴加DIBAL-H(1.5M，11.58mL)溶液。滴加完完毕后，室温搅拌2h，TLC检测原料反应完完毕后，将体系温度降至-10℃，缓缓滴加甲醇(2.08mL)，室温搅拌2h。逐滴滴加饱和酒石酸钾钠溶液，45℃下搅拌10min，以叔丁基甲基醚萃取三次，合并的有机相以饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸镁干燥。干法上样，柱层析纯化(石油醚/乙酸乙酯＝3:1)得化合物B16的黄色固体(514mg，产率48％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ9.97(s,1H),7.58(d,J＝8.5Hz,1H),6.73-6.48(m,4H)。

将B16用乙酰氯在吡啶存在下进行乙酰化，制得化合物B17。白色固体，产率45％。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ10.50(s,1H),10.20(s,1H),7.96(d,J＝1.4Hz,1H),7.83(d,J＝8.6Hz,1H),7.58(d,J＝8.5Hz,1H),2.11(s,3H).

将化合物B17(283mg，1.436mmol)完全溶于无水THF中，冰浴下分批加NaBH₄(55mg，1.436mmol)，体系自然升温，反应1h，有白色固体产生。加水(20mL)，用乙酸乙酯(10mL)萃取3次，合并的有机相以饱和氯化钠水溶液洗涤1次，无水硫酸钠干燥，减压旋蒸除去溶剂得白色固体。将所得白色固体溶于DCM(20mL)和THF(3mL)的混合溶液中，冰浴下，缓慢滴加三溴化磷，搅拌1h后，体系变为澄清溶液。继续反应2h，加水(30mL)，以DCM(20mL)萃取三次，合并的有机相用饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥。减压旋蒸除去溶剂得化合物B18的白色固体(330mg，产率89％)。所得固体不经纯化直接投下一步。

参考化合物B18的合成得到化合物B19。白色固体，两步产率81％。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ7.95(d,J＝2.2Hz,1H),7.85(d,J＝1.8Hz,1H),7.77(s,1H),7.63(dd,J＝8.4,1.9Hz,1H),7.55(d,J＝8.4Hz,1H),6.53(s,1H),4.66(s,2H).

3,5-二氯-4-甲基苯甲酸(1g，4.88mmol)溶于甲醇(13.5mL)中，冰浴下缓慢滴加二氯亚砜，溶液有白色固体生成，低温搅拌30min，将体系移至室温反应过夜，体系变为澄清溶液。减压旋蒸除去溶剂后，加水(20mL)，以乙酸乙酯(20mL)萃取三次，合并的有机相依次用饱和碳酸氢钠、饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥。减压旋蒸除去溶剂得油状物(1.105g)。将所得油状物溶于四氯化碳(9mL)，加入NBS(1.03g，5.78mmol)、AIBN(394mg，2.4mmol)，体系于80℃下加热6h。使用硅藻土过滤反应液，DCM洗涤滤饼，滤液减压旋蒸除去溶剂后干法上样，经硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝100:1)纯化得化合物B20的白色固体(1.34g，产率94％)。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ8.00(s,2H),4.77(s,2H),3.96(s,3H)。

参考化合物B20的合成方法得到化合物B21的无色油状物，所得化合物不经纯化直接投下一步。

参照实施例62中化合物I-69的合成方法，用化合物B18代替其中的化合物B8，制得化合物I-70。淡黄色固体，产率94％。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ10.64-10.45(m,1H),8.59(s,3H),8.09(s,1H),7.96(s,1H),7.91-7.65(m,5H),7.54(d,J＝8.3Hz,1H),4.35(s,2H),4.12(s,5H),4.05(s,2H),3.38-3.05(m,4H),2.08(s,3H),1.74-1.55(m,2H),1.41-1.33(m,2H).ESI-MS:m/z 550.3[M-2HCl+H]⁺。

参照实施例62中化合物I-69的合成方法，用化合物B19代替其中的化合物B8，制得化合物I-71。白色固体，产率87.7％。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ10.80(s,1H),8.71-8.65(m,1H),8.61(s,3H),8.15-8.03(m,3H),8.00-7.92(m,1H),7.85-7.65(m,5H),6.60(s,1H),4.45(s,2H),4.11(s,5H),4.06(s,2H),3.35-3.12(m,4H),2.19-2.00(m,2H),1.72-1.57(m,2H).ESI-MS:m/z 561.3[M-2HCl+H]⁺。

参照实施例62中化合物I-69的合成方法，用化合物B20代替其中的化合物B8，制得化合物I-76。白色固体，产率86％。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ10.00(s,1H),8.75-8.47(m,3H),8.10(s,1H),8.01(s,2H),7.77(d,J＝8.1Hz,2H),7.71(d,J＝8.2Hz,2H),5.49(s,1H),4.59(s,2H),4.17-4.09(m,5H),4.08-4.03(m,2H),3.91(s,3H),3.60-3.23(m,4H),2.20-2.00(m,2H),1.66(m,2H).ESI-MS:m/z 585.2[M-2TFA+H]⁺。

参照实施例62中化合物I-69的合成方法，用化合物B21代替其中的化合物B8，制得化合物I-78。白色固体，产率92％。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ9.76(s,1H),8.37(d,J＝14.9Hz,4H),8.03(s,2H),7.76(t,J＝8.2Hz,3H),7.67(d,J＝8.0Hz,2H),4.56(s,2H),4.16(d,J＝5.3Hz,2H),4.12(s,3H),4.04(s,2H),3.89(s,3H),2.56-2.47(m,2H),1.92(m,2H),1.65(m,2H),1.32-1.17(m,2H).ESI-MS:m/z551.2[M-2TFA+H]⁺。

实施例64

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-(2-氯-4-羟基苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑[4,3-d]嘧啶-7-酮二三氟乙酸盐(I-72)

4-((4-((3-(4-(氨基甲基)苯基)-2-甲基-7-氧-2,7-二氢-6H-吡唑[4,3-d]嘧啶-6-基)甲基)-4-羟基哌啶-1-基)甲基)-3-羟基苯甲酸甲酯二三氟乙酸盐(I-79)

取化合物B16(200mg，0.439mmol)分散于甲醇(12mL)中，加入碳酸氢钠(55mg，0.659mmol)，室温搅拌5h。加入化合物B22(235mg，0.659mmol)和腈基硼氢化钠(55mg，0.878mmol)，室温搅拌过夜后，再加入腈基硼氢化钠(55mg，0.878mmol)，继续搅拌5h。TLC监测反应，将反应液减压旋蒸除去溶剂后干法上样，柱层析纯化(二氯甲烷/甲醇＝10：1)得化合物B24的白色固体(88mg，产率42％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ9.73(s,1H),8.05(s,1H),7.23(s,1H),6.76(m,2H),4.63(s,1H),4.08(s,3H),3.96(s,2H),3.53-3.36(s,2H),2.41-2.16(m,2H),1.72-1.46(m,2H),1.46-1.27(m,2H).ESI-MS:m/z 482.1[M+H]⁺。

参考化合物B24的合成方法，将化合物B22替换成B-23，得到化合物B25。红棕色固体，产率41％。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.05(s,1H),7.36(dd,J＝7.8,1.4Hz,1H),7.31-7.16(m,2H),4.75(s,1H),4.06(d,J＝9.8Hz,3H),3.99(s,2H),3.82(s,3H),3.70(s,2H),2.71-2.55(m,2H),2.41(t,J＝10.2Hz,2H),1.63(t,J＝10.3Hz,2H),1.54-1.38(m,2H).ESI-MS:m/z 506.1[M+H]⁺。

参照实施例47中化合物I-52的合成方法，用化合物B24制得化合物I-72。白色固体，产率56％。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ10.46(s,1H),9.33(s,1H),8.36(s,3H),8.02(s,1H),7.78(d,J＝8.0Hz,2H),7.67(d,J＝8.0Hz,2H),7.47(d,J＝8.4Hz,1H),6.95(s,1H),6.85(d,J＝8.2Hz,1H),5.32(s,1H),4.33(s,2H),4.16(s,2H),4.12(s,3H),4.04(s,2H),3.34-3.06(m,4H),1.97-1.80(m,2H),1.80-1.55(m,2H).ESI-MS:m/z 509.2[M-2TFA+H]⁺。

参照实施例47中化合物I-52的合成方法，用化合物B25制得化合物I-79。淡黄色固体，产率86％。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ10.84(s,1H),9.45(s,1H),8.39(s,3H),8.01(s,1H),7.78(d,J＝7.9Hz,2H),7.67(d,J＝8.0Hz,2H),7.58-7.40(m,3H),5.31(s,1H),4.30(s,2H),4.16(s,2H),4.12(s,3H),4.08-3.98(m,2H),3.85(s,3H),3.52-3.34(m,2H),3.20-3.01(m,2H),1.97-1.80(m,2H),1.80-1.50(m,2H).ESI-MS:m/z 533.2[M-2TFA+H]⁺。

实施例65

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-(2-氯-4-环丙基苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑[4,3-d]嘧啶-7-酮二三氟乙酸盐(I-73)

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-(2-氯-4-(二甲氨基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(I-75)

4-((4-((3-(4-(氨基甲基)苯基)-2-甲基-7-氧-2,7-二氢-6H-吡唑[4,3-d]嘧啶-6-基)甲基)-4-羟基哌啶-1-基)甲基)-3-氯-5-氟苯甲酸甲酯二盐酸盐(I-77)

参考化合物B20的合成方法，用3-氯-4-氟苯甲酸制得化合物B30。淡黄色固体，产率83％。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ7.85(s,1H),7.65(d,J＝8.6Hz,1H),7.31(dd,J＝8.1,1.9Hz,1H),3.96(s,3H)。

称取化合物B30(123mg，0.705mmol)溶于无水THF中，使用氩气球充换气三次，使体系保持氩气环境。降温至-78℃，缓慢滴加2N的LDA(423μL，0.845mmol)，控制温度不超过-65℃搅拌1h。-78℃下逐滴滴加无水DMF，低温反应至原料消失。加入饱和氯化铵溶液(12mL)搅拌10min，加入水(6mL)，乙酸乙酯(10mL)萃取三次，饱和氯化钠水溶液洗涤有机相一次。干法上样，柱层析纯化(石油醚/乙酸乙酯＝100:1)得化合物B31的淡黄色固体(70mg，产率46％)。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ10.49(s,1H),7.95(s,1H),7.74(d,J＝10.3Hz,1H),3.99(s,3H)。

参考化合物I-66的合成方法制得化合物B34。白色固体，产率78％。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.05-7.92(m,1H),7.81(s,1H),7.76-7.59(m,3H),7.55-7.34(m,3H),4.63(s,1H),4.22(d,J＝5.7Hz,2H),4.09(s,3H),3.96(s,2H),3.88(s,3H),3.63(s,2H),2.51-2.35(m,4H),1.61-1.46(m,2H),1.46-1.28(m,11H)。

参考化合物I-66的合成合成方法制得化合物B35。白色固体，产率99％。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ9.06(s,1H),7.99(s,1H),7.66(d,J＝8.0Hz,2H),7.52-7.34(m,3H),6.85-6.68(m,2H),4.22(d,J＝6.0Hz,2H),4.10(s,3H),4.02(s,2H),3.31(s,4H),3.17(d,J＝3.7Hz,2H),2.94(s,6H),1.87(s,2H),1.64(s,2H),1.41(s,9H).ESI-MS:m/z 636.4[M+H]⁺。

参照实施例47中化合物I-52的合成方法制得化合物I-73。白色固体，产率98％。¹HNMR(300MHz,DMSO-d₆)δ9.53(s,1H),8.39(s,3H),8.02(s,1H),7.78(d,J＝8.0Hz,2H),7.67(d,J＝8.1Hz,2H),7.62-7.48(m,1H),7.30(s,1H),7.15(d,J＝8.0Hz,1H),4.40(s,2H),4.28-4.08(m,5H),4.03(s,2H),3.44-3.04(m,4H),2.06-1.80(m,3H),1.78-1.57(m,2H),1.09-0.93(m,2H),0.82-0.64(m,2H).ESI-MS:m/z 533.3[M-2TFA+H]⁺。

参照实施例62中化合物I-69的合成方法制得化合物I-75。白色固体，产率22％。¹HNMR(300MHz,DMSO-d₆)δ10.41(s,1H),8.63(s,3H),8.12(s,1H),7.76(q,J＝8.2Hz,4H),7.62(d,J＝8.3Hz,1H),6.84-6.63(m,2H),5.45(s,1H),4.27(s,2H),4.14(s,5H),4.06(s,2H),3.34-3.20(m,2H),3.14-3.01(m,2H),2.96(s,6H),2.13-1.94(m,2H),1.73-1.53(m,2H).ESI-MS:m/z 536.4[M+H]⁺。

参照实施例62中化合物I-69的合成方法制得化合物I-77。白色固体，产率78％。¹HNMR(300MHz,DMSO-d₆)δ10.57(s,1H),8.65(s,3H),8.11(s,1H),7.92(s,1H),7.83(d,J＝9.2Hz,1H),7.74(q,J＝7.9Hz,4H),5.51(s,1H,OH),4.48(s,2H),4.12(s,5H),4.05(s,2H),3.90(s,3H),3.51-3.34(m,4H),2.18-1.98(m,2H),1.75-1.51(m,2H)。

实施例66

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-(2-氯-4-(1,2,4-噁二唑-3-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(I-74)

(4-(6-((1-(2-氟-4-(1,2,4-噁二唑-3-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-7-氧-6,7-二氢-2H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-3-基)苄基)氨基甲酸叔丁酯(I-102)

(4-(6-((1-(2-氯-4-(1,2,4-噁二唑-3-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-7-氧-6,7-二氢-2H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-3-基)苄基)氨基甲酸叔丁酯(I-103)

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-(2-氯-4-(1,2,4-噁二唑-3-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(I-193)

称取2-氯-4-甲基苯甲腈(40mg，2.6mmol)溶于乙醇(8mL)，加入三乙胺(550μL，4mmol)、盐酸羟胺(364mg，5.2mmol)，所得溶液80℃加热3h，TLC监测原料反应完毕，减压旋蒸除去溶剂，加入原甲酸三乙酯(9mL)和2滴三氟乙酸，80℃加热3.5h，减压旋除溶剂，干法上样，柱层析纯化(石油醚/乙酸乙酯＝50:1)得化合物B36的白色固体(469mg，产率93％)。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ8.78(s,1H),8.15(s,1H),7.94(d,J＝7.9Hz,1H),7.39(d,J＝7.9Hz,1H),2.48(s,3H)。

参照实施例63中化合物B20的合成方法，将化合物B36溴代制得化合物B37。白色固体，产率39％。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ9.81(s,1H),8.06(s,1H),8.01(d,J＝8.0Hz,1H),7.83(d,J＝7.9Hz,1H),4.81(s,2H)。

参照实施例1中化合物I-1合成方法的最后一步，用化合物B37与B28反应，制得化合物I-103。白色固体，产率78％。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ9.75(s,1H),8.01(s,2H),7.72(d,J＝8.3Hz,1H),7.67(d,J＝7.9Hz,2H),7.49(s,1H),7.43(d,J＝7.9Hz,2H),4.68(s,1H),4.22(d,J＝5.8Hz,2H),4.09(d,J＝6.3Hz,3H),4.01(s,2H),3.63(s,2H),2.65-2.54(m,2H),2.42(t,J＝10.0Hz,2H),1.64(t,J＝9.9Hz,2H),1.54-1.27(m,11H).ESI-MS:m/z661.3[M+H]⁺。

按照上述类似步骤，制得化合物I-102。白色固体，产率41.2％。¹H NMR(300MHz,DMSO)δ9.74(s,1H),7.99(s,1H),7.88(d,J＝7.9Hz,1H),7.75(d,J＝10.3Hz,1H),7.66(d,J＝8.1Hz,2H),7.45(t,J＝9.5Hz,3H),4.63(s,1H),4.22(d,J＝5.9Hz,2H),4.09(s,3H),3.99(s,2H),3.62(s,2H),2.53(s,2H),2.37(s,2H),1.61(s,2H),1.48-1.31(m,11H).ESI-MS:m/z 645.4[M+H]⁺。

参照实施例62中化合物I-69的合成方法，将化合物I-103脱去Boc，制得化合物I-74。白色固体，产率57％。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ10.96(s,1H),9.83(s,1H),8.63(s,3H),8.34-7.97(m,4H),7.74(q,J＝8.2Hz,4H),5.49(s,1H,OH),4.53(s,2H),4.12(s,5H),4.07(s,2H),3.34-3.11(m,4H),2.21-2.00(m,2H),1.65(m,2H).ESI-MS:m/z 561.2[M-2HCl+H]⁺。

参照实施例62中化合物I-69的合成方法，将化合物I-102脱去Boc，制得化合物I-193。白色固体，产率80.1％。1H NMR(300MHz,DMSO)δ10.84(s,1H),9.82(s,1H),8.57(s,3H),8.08(s,1H),8.02-7.87(m,3H),7.77(d,J＝8.2Hz,2H),7.71(d,J＝8.3Hz,2H),4.43(s,2H),4.12(s,5H),4.05(s,2H),3.29(s,2H),3.16(d,J＝11.8Hz,2H),2.05(t,J＝11.5Hz,2H),1.64(d,J＝13.9Hz,2H).ESI-MS:m/z545.3[M-2HCl+H]⁺。

实施例67

(4-(6-((1-(2-氟-4-(噁唑-5-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-7-氧-6,7-二氢-2H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-3-基)苄基)氨基甲酸叔丁酯(I-96)

(4-(6-((1-(2-氯-4-(噁唑-5-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-7-氧-6,7-二氢-2H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-3-基)苄基)氨基甲酸叔丁酯(I-97)

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-(2-氟-4-(噁唑-5-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(I-187)

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-(2-氯-4-(噁唑-5-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(I-188)

称取3-氯-4-甲基苯甲醛(500mg，3.234mmol)、对甲基磺酰甲基异腈(TosMIC)(758mg，3.881mmol)、碳酸钾(536mg，3.881mmol)溶于甲醇(8mL)中，70℃反应8h，TLC监测反应完，减压蒸除溶剂，残余物经硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝30:1)纯化，得到化合物C2的白色固体(569mg，产率91％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.43(s,1H),7.76(d,J＝1.8Hz,1H),7.73(s,1H),7.57(dd,J＝7.9,1.8Hz,1H),7.43(d,J＝7.9Hz,1H),2.34(s,3H)。

采用类似方法制得化合物C1的白色固体(571mg，产率75％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.45(s,1H),7.72(s,1H),7.51(d,J＝11.7Hz,1H),7.45(s,1H),7.39(t,J＝7.8Hz,1H),2.26(s,3H)。

参照实施例63中化合物B20的合成方法制得化合物C3的白色固体(277mg，产率64％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.51(d,J＝1.2Hz,1H),7.83(d,J＝1.2Hz,1H),7.70-7.51(m,3H),4.73(s,2H)。

参照实施例63中化合物B20的合成方法制得化合物C4的白色固体(211mg，产率75％)。

参照实施例47中化合物I-50的合成方法制得化合物I-96的白色固体(126mg，59％)。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ7.92(s,1H),7.85(s,1H),7.55(d,J＝7.9Hz,2H),7.47(d,J＝6.8Hz,3H),7.42(d,J＝1.5Hz,1H),7.36(s,1H),7.32(d,J＝10.6Hz,1H),4.94(s,1H),4.40(d,J＝6.2Hz,2H),4.14(m,5H),3.64(s,2H),2.71(d,2H),2.48(d,J＝11.0Hz,2H),1.79(d,J＝12.3Hz,2H),1.48(m,J＝1.0Hz,11H).ESI-MS:m/z 644.3[M+H]⁺。

参照实施例47中化合物I-50的合成方法制得化合物I-97的白色固体(100mg，产率74％)。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ7.94(s,1H),7.89(s,1H),7.66(d,J＝1.5Hz,1H),7.60-7.53(m,4H),7.49(d,J＝7.9Hz,2H),7.38(s,1H),4.96(s,1H),4.41(s,J＝6.2Hz,2H),4.16(s,3H),4.14(s,2H),3.67(s,2H),2.74(d,J＝11.6Hz,2H),2.50(d,J＝11.2Hz,2H),1.82(d,J＝10.6Hz,2H),1.50(s,11H).ESI-MS:m/z660.5[M+H]⁺。

参照实施例62中化合物I-69的合成方法制得化合物I-187(77mg，产率61％)。¹HNMR(300MHz,DMSO-d₆)δ10.76(s,1H),8.71-8.38(m,4H),8.07(d,J＝5.2Hz,1H),7.93-7.84(m,2H),7.81-7.62(m,6H),5.38(s,1H),4.36(d,J＝4.8Hz,2H),4.13(m,J＝4.6Hz,5H),4.05(s,2H),3.28(d,J＝12.4Hz,2H),3.12(d,J＝11.7Hz,2H),2.04(d,J＝13.3Hz,2H),1.64(d,J＝13.9Hz,2H).ESI-MS:m/z 544.3[M-2HCl+H]⁺。

参照实施例62中化合物I-69的合成方法制得化合物I-188(68mg，产率76％)。¹HNMR(300MHz,DMSO-d₆)δ10.71(s,1H),8.56(d,J＝5.9Hz,4H),8.09(d,J＝4.4Hz,1H),8.03(d,J＝8.2Hz,1H),7.96(dd,J＝7.2,1.7Hz,1H),7.93(d,J＝4.1Hz,1H),7.83-7.67(m,5H),4.46(d,J＝4.9Hz,2H),4.13(m,J＝4.7Hz,5H),4.05(s,2H),3.38-3.13(m,4H),2.07(d,J＝13.1Hz,2H),1.64(d,J＝14.0Hz,2H).ESI-MS:m/z 560.5[M-2HCl+H]⁺。

实施例68

(4-(6-((1-(2-氟-4-(异噁唑-3-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-7-氧-6,7-二氢-2H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-3-基)苄基)氨基甲酸叔丁酯(I-92)

(4-(6-((1-(2-氯-4-(异噁唑-3-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-7-氧-6,7-二氢-2H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-3-基)苄基)氨基甲酸叔丁酯(I-93)

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-(2-氟-4-(异噁唑-3-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(I-183)

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-(2-氯-4-(异噁唑-3-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(I-184)

称取3-氯-4-甲基苯甲醛(1g，6.469mmol)、盐酸羟胺(NH₂OH HCl)(584mg，8.409mmol)、碳酸钠(514mg，8.409mmol)置于乙醇(15mL)中，90℃反应8h，TLC监测反应完，减压旋蒸除去溶剂，加水(20mL)溶解残余物，用乙酸乙酯(6mL×3)萃取，饱和氯化钠水溶液(20mL)洗涤，无水硫酸钠干燥。减压蒸除溶剂，残余物溶于氯仿(15mL)，加入N-氯代丁二酰亚胺(NCS)(864mg，6.469mmol)、吡啶(催化量)，所得溶液室温搅拌8h。反应完毕后，减压蒸除溶剂，残余物经硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝40:1)，得到化合物C6的白色固体(987mg，产率75％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ12.50(s,1H),7.75(d,J＝1.9Hz,1H),7.66(dd,J＝8.0,1.9Hz,1H),7.46(d,J＝8.1Hz,1H),3.57(s,1H),2.37(s,3H)。

参考化合物C6的合成方法制得化合物C5的白色固体(1.856g，产率92％)。

称取C6(987mg，4.837mmol)、乙炔基三甲基硅烷(1mL，7.256mmol)溶于氯仿(15mL)中，0℃下加入三乙胺(1.7mL，12.093mmol)，所得溶液于55℃反应8h，TLC监测原料反应完，减压旋蒸除去溶剂，残余物经硅胶柱层析(石油醚)，得到C8(616mg，产率78％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ7.93(d,J＝1.8Hz,1H),7.77(dd,J＝7.9,1.8Hz,1H),7.49(d,J＝8.0Hz,1H),7.38(d,J＝2.3Hz,1H),2.38(s,3H),0.36(s,J＝2.8Hz,9H)。

参考化合物C8的合成方法制得化合物C7的白色固体(1.86g，产率85％)。

称取C8(616mg，2.317mmol)、氟化铯(4.5g，29mmol)分散于乙醇(15mL)中，室温反应10h，TLC监测反应完毕，减压旋蒸除去溶剂，残余物经硅胶柱层析(石油醚)，得到C10(521mg，产率85％)。

参考化合物C10的合成方法制得化合物C9的白色固体(602mg，产率47％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ9.02(t,J＝1.9Hz,1H),7.68(dd,J＝5.7,1.8Hz,1H),7.65(d,J＝2.3Hz,1H),7.44(s,1H),7.18(d,J＝1.8Hz,1H),2.30(d,J＝2.1Hz,3H)。

参照实施例63中化合物B20的合成方法制得化合物C11的白色固体(198mg，产率76％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ9.06(d,J＝1.7Hz,1H),7.86-7.60(m,3H),7.23(d,J＝1.7Hz,1H),4.76(s,2H)。

参照实施例63中化合物B20的合成方法制得化合物C12的白色固体(74mg，产率51％)。

参照实施例47中化合物I-50的合成方法制得化合物I-92的白色固体(70mg，产率73％)。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ8.49(d,J＝1.7Hz,1H),7.87(s,1H),7.54(dd,J＝18.3,5.5Hz,7H),6.66(d,J＝1.7Hz,1H),4.97(s,1H),4.41(s,J＝6.1Hz,2H),4.14(m,J＝9.0Hz,5H),3.66(s,2H),2.74(d,J＝11.5Hz,2H),2.47(d,J＝11.1Hz,2H),1.89-1.75(d,2H),1.63(d,J＝13.2Hz,2H),1.50(s,9H).ESI-MS:m/z644.3[M+H]⁺。

参照实施例47中化合物I-50的合成方法制得化合物I-93的白色固体(113mg，产率65％)。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ8.47(d,J＝1.7Hz,1H),7.87(s,1H),7.82(d,J＝1.8Hz,1H),7.70(dd,J＝8.0,1.7Hz,1H),7.62-7.52(m,3H),7.47(d,J＝8.1Hz,2H),6.65(d,J＝1.7Hz,1H),4.95(s,1H),4.39(s,J＝6.1Hz,2H),4.13(m,5H),3.67(s,2H),2.72(d,J＝11.8Hz,2H),2.48(d,J＝11.2Hz,2H),1.80(d,J＝10.0Hz,2H),1.60(d,2H),1.48(s,9H).ESI-MS:m/z 660.4[M+H]⁺。

参照实施例62中化合物I-69的合成方法制得化合物I-183的白色固体(58mg，产率63％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ10.66(s,1H),9.10(s,1H),8.63-8.41(m,3H),8.07(s,1H),7.96-7.84(m,3H),7.83-7.66(m,4H),7.29(s,1H),5.42(s,J＝17.4Hz,1H),4.41(s,J＝4.9Hz,2H),4.13(m,J＝4.4Hz,5H),4.05(s,2H),3.29(d,2H),3.14(d,J＝11.9Hz,2H),2.01(d,J＝11.9Hz,2H),1.64(d,J＝14.5Hz,2H).ESI-MS:m/z 544.3[M-2HCl+H]⁺。

参照实施例62中化合物I-69的合成方法制得化合物I-184。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ10.68(s,1H),9.09(d,J＝1.8Hz,1H),8.55(s,3H),8.16-8.04(m,3H),8.00(s,1H),7.84-7.64(m,4H),7.31(t,J＝1.9Hz,1H),5.43(s,1H),4.49(s,J＝4.7Hz,2H),4.18-4.08(m,5H),4.05(s,2H),3.30(m,4H),2.07(d,J＝13.4Hz,2H),1.64(d,J＝14.1Hz,2H).ESI-MS:m/z 560.4[M-2HCl+H]⁺。

实施例69

(4-(6-((1-(2-氟-4-(噁唑-2-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-7-氧-6,7-二氢-2H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-3-基)苄基)氨基甲酸叔丁酯(I-94)

(4-(6-((1-(2-氯-4-(噁唑-2-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-7-氧-6,7-二氢-2H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-3-基)苄基)氨基甲酸叔丁酯(I-95)

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-(2-氟-4-(噁唑-2-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(I-185)

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-(2-氯-4-(噁唑-2-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(I-186)

称取3-氯-4-甲基苯甲酸(2g,11.7mmol)溶于无水二氯甲烷(20mL)，加入1滴N,N-二甲基甲酰胺，逐滴加入草酰氯(3.0g,2.0mL)，所得溶液室温反应0.5h，TLC监测原料反应完，减压旋蒸除去溶剂，加入无水二氯甲烷(10mL)溶解，0℃下将此溶液逐滴加入乙醇胺(859mg，846μL)、三乙胺(2.7g，3.1mL)、二氯甲烷(6mL)的混合溶液中，所得溶液室温反应12h。反应完毕后，向反应体系加水(15mL)稀释，用二氯甲烷(6mL×3)萃取。有机相合并，用饱和氯化钠水溶液(15mL)洗涤，无水硫酸钠干燥。减压蒸除溶剂，残余物经硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇＝40:1)，得化合物C14的白色固体(2.1g，产率85％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.49(t,J＝5.6Hz,1H),7.90(d,J＝1.8Hz,1H),7.73(dd,J＝7.9,1.8Hz,1H),7.44(d,J＝7.9Hz,1H),4.71(t,J＝5.6Hz,1H),3.51(q,J＝6.0Hz,2H),3.32(q,J＝6.0Hz,2H),2.37(s,3H)。

将化合物C14(500mg,2.347mmol)溶解于无水二氯甲烷(15mL)中，0℃下分批加入戴斯-马丁试剂(DMP)(1.5g,3.52mmol)，所得混合物在室温反应8h。反应完毕后，向反应体系加入饱和硫代硫酸钠水溶液(20mL)洗涤，所得有机相用饱和碳酸氢钠水溶液(20mL×3)洗涤。减压蒸除溶剂，残余物经硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇＝100:1)，得化合物C16的黄色油状液体(410mg,产率82％)。

将化合物C16(360mg,1.7mmol)溶解于氧氯化磷(8mL)中，所得混合物在100℃搅拌4h。反应完毕，将反应液滴加入冰水中，加入饱和碳酸氢钠水溶液调pH至8～9，用乙酸乙酯(8mL×3)萃取。合并有机相，用饱和氯化钠水溶液(20mL)洗涤，无水硫酸钠干燥。减压蒸除溶剂，残余物经硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝500:1)，得化合物C18的淡黄色固体(90mg,产率27％)。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ8.03(d,J＝1.8Hz,1H),7.83(dd,J＝8.0,1.8Hz,1H),7.69(s,1H),7.31(d,J＝7.9Hz,1H),7.24(d,J＝10.4Hz,1H),2.42(s,3H)。

参照实施例63中化合物B20的合成方法制得化合物C20的白色固体(180mg,产率79％)。

参照实施例47中由B6制备化合物I-50的合成方法，用化合物C20与B28反应，制得化合物I-95的白色固体(140mg,产率76％)。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ8.04(d,J＝1.7Hz,1H),7.94-7.85(m,2H),7.72(s,1H),7.63-7.52(m,3H),7.47(d,J＝8.0Hz,2H),7.25(d,J＝8.2Hz,2H),4.96(s,1H),4.96(s,1H),4.39(s,J＝6.2Hz,2H),4.1

3(m,J＝3.7Hz,5H),3.67(s,2H),2.72(d,J＝11.6Hz,2H),2.58-2.43(d,2H),1.90-1.75(m,4H),1.48(s,9H).ESI-MS:m/z 660.4[M+H]⁺。

参照实施例62中化合物I-69的合成方法，将化合物I-95脱除Boc，制得化合物I-186的白色固体(100mg,产率71％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ10.68(s,1H),8.56(s,3H),8.33(s,1H),8.19-7.96(m,4H),7.84-7.63(m,4H),7.47(s,1H),5.76(s,1H),4.50(d,J＝4.8Hz,2H),4.13(m,J＝4.7Hz,5H),4.06(s,2H),3.44-3.09(m,4H),2.07(d,J＝13.3Hz,2H),1.64(d,J＝14.1Hz,2H).ESI-MS:m/z560.4[M-2HCl+H]⁺。

参考化合物C14的合成方法制得化合物C13的白色固体(1.052g,产率85％)。¹HNMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.44(t,J＝5.6Hz,1H),7.75-7.52(m,2H),7.37(t,J＝7.9Hz,1H),4.71(t,J＝5.6Hz,1H),3.51(q,J＝6.0Hz,2H),3.32(q,J＝6.2Hz,2H),2.28(d,J＝2.0Hz,3H)。

参考化合物C16的合成方法制得化合物C15的黄色油状液体(743mg,产率71％)。

参考化合物C18的合成方法制得化合物C17的淡黄色固体(389mg,产率32％)。¹HNMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.23(d,J＝0.9Hz,1H),7.72(dd,J＝7.9,1.7Hz,1H),7.66(dd,J＝10.4,1.7Hz,1H),7.46(t,J＝7.9Hz,1H),7.39(d,J＝1.0Hz,1H),2.30(d,J＝2.1Hz,3H)。

参照实施例63中化合物B20的合成方法制得化合物C19的白色固体(99mg,产率39％)。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ7.83(dd,J＝8.0,1.7Hz,1H),7.75(dd,J＝10.4,1.7Hz,2H),7.49(t,J＝7.8Hz,1H),7.26(d,J＝3.3Hz,1H),4.54(s,2H)。

参照实施例47中由B6制备化合物I-50的合成方法，用化合物C19与B28反应，制得化合物I-94的白色固体(98mg,产率65％)。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ7.87(s,1H),7.82(d,J＝8.0Hz,1H),7.75-7.68(m,2H),7.60-7.53(m,2H),7.49(q,J＝5.4,4.9Hz,3H),7.25(d,J＝4.0Hz,1H),4.96(s,1H),4.41(s,J＝5.6Hz,2H),4.15(s,J＝3.1Hz,2H),4.12(s,3H),3.66(s,2H),2.73(d,J＝11.1Hz,2H),2.46(d,J＝11.4Hz,2H),1.92-1.75(d,2H),1.61(d,2H),1.49(s,9H).ESI-MS:m/z644.3[M+H]⁺。

参照实施例62中化合物I-69的合成方法，将化合物I-94脱除Boc，制得化合物I-185的白色固体(63mg,产率68％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ10.88(s,1H),8.59(s,3H),8.32(s,1H),8.08(d,J＝5.6Hz,1H),7.97-7.65(m,7H),7.47(s,1H),5.31(s,1H),4.40(s,J＝4.6Hz,2H),4.12(m,5H),4.05(s,2H),3.29(d,J＝12.7Hz,2H),3.14(d,J＝11.4Hz,2H),2.12-1.96(d,2H),1.64(d,J＝13.8Hz,2H).ESI-MS:m/z 544.3[M-2HCl+H]⁺。

实施例70

(4-(6-((1-(2-氟-4-(吡咯烷基-1-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-7-氧-6,7-二氢-2H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-3-基)苄基)氨基甲酸叔丁酯(I-80)

(4-(6-((1-(2-氯-4-(吡咯烷基-1-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-7-氧-6,7-二氢-2H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-3-基)苄基)氨基甲酸叔丁酯(I-81)

(4-(6-((1-(2-氟-4-(哌啶-1-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-7-氧-6,7-二氢-2H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-3-基)苄基)氨基甲酸叔丁酯(I-82)

(4-(6-((1-(2-氯-4-(哌啶-1-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-7-氧-6,7-二氢-2H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-3-基)苄基)氨基甲酸叔丁酯(I-83)

(4-(6-((1-(2-氟-4-吗啉代苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-7-氧-6,7-二氢-2H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-3-基)苄基)氨基甲酸叔丁酯(I-84)

(4-(6-((1-(2-氯-4-吗啉代苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-7-氧-6,7-二氢-2H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-3-基)苄基)氨基甲酸叔丁酯(I-85)

(4-(6-((1-(4-(1,1-二氧化硫代吗啉代)苄基)-2-氟苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-7-氧-6,7-二氢-2H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-3-基)苄基)氨基甲酸叔丁酯(I-86)

(4-(6-((1-(2-氯-4-(1,1-二氧化硫代吗啉代)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-7-氧-6,7-二氢-2H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-3-基)苄基)氨基甲酸叔丁酯(I-87)

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-(2-氟-4-(吡咯烷-1-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(I-172)

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-(2-氯-4-(吡咯烷-1-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(I-173)

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-(2-氟-4-(哌啶-1-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(I-174)

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-(2-氯-4-(哌啶-1-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(I-175)

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-(((1-(2-氟-4-吗啉代苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(I-176)

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-(2-氯-4-吗啉代苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(I-177)

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-(4-(1,1-二氧化硫代吗啉代)-2-氟苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(I-178)

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-(4-(1,1-二氧化硫代吗啉代)-2-氯苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(I-179)

称取4-溴-2-氟-苯甲醛(406mg,2mmol)、四氢吡咯(0.335ml,4mmol)、碳酸铯(1.3g,4mmol)、三(二亚苄基丙酮)二钯(Pd₂(dba)₃)(92mg,0.1mmol)、1,1'-联萘-2,2'-双二苯膦(BINAP)(125mg,0.2mmol)于甲苯(5mL)中，氩气保护条件下90℃加热反应4h，TLC监测反应完毕，反应液经硅藻土抽滤，滤液减压蒸去有机溶剂，残余物经硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝80:1)纯化，得到C21的黄色固体(188mg,46％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ9.88(s,1H),7.59(t,J＝8.6Hz,1H),6.41(dd,J＝36.1,11.8Hz,2H),1.96(t,J＝5.9Hz,3H)。

称取C21(50mg,0.26mmol)、B28(90mg,0.19mmol)溶于二氯甲烷(5mL)中，冰浴下分批加入三乙酰氧基硼氢化钠(STAB)(204mg,0.96mmol)，室温下反应4h，TLC监测反应完成，减压蒸去有机溶剂，残余物经硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇＝20:1)纯化，得到I-80的淡黄色固体(53mg,74％)。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ7.87(s,1H),7.53(d,J＝7.8Hz,2H),7.46(d,J＝7.9Hz,2H),7.32(d,J＝8.8Hz,1H),6.32(dd,J＝8.7,2.3Hz,1H),6.19(dd,J＝13.3,2.4Hz,1H),5.17(s,1H),4.39(d,J＝6.2Hz,2H),4.16(s,2H),4.11(s,3H),3.99(s,2H),3.27(m,J＝6.4Hz,4H),3.16(d,J＝11.9Hz,2H),2.95(d,J＝11.7Hz,2H),2.15(d,J＝13.6Hz,2H),2.04(m,4H),1.72(d,J＝14.0Hz,2H),1.48(s,9H).ESI-MS:m/z 662.4[M+H]⁺。

参照实施例62中化合物I-69的合成方法，将化合物I-80脱Boc，制得化合物I-172的淡灰色固体(23mg,产率44％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ10.35(s,1H),8.59(s,3H),8.09(s,1H),7.74(q,J＝8.1Hz,4H),7.40(t,J＝8.7Hz,1H),6.49-6.27(m,2H),4.14-4.06(m,9H),3.22(m,J＝10.6,8.4Hz,6H),2.99(d,J＝11.5Hz,2H),1.95(m,J＝5.4Hz,6H),1.62(d,J＝14.0Hz,2H).ESI-MS:m/z 546.2[M+H]⁺。

参考化合物C21的合成方法制得化合物C22的淡黄色固体(363mg,产率83％)。¹HNMR(300MHz,CDCl₃)δ10.18(s,1H),7.79(dd,J＝9.5,3.3Hz,1H),6.45(dd,J＝6.4,2.6Hz,2H),3.36(ddt,J＝7.8,6.1,2.8Hz,4H),2.05(ddt,J＝3.4Hz,4H)。

参考化合物C21的合成方法制得化合物C23的淡黄色油状液体(350mg,产率49％)。¹HNMR(300MHz,CDCl₃)δ10.04(s,1H),7.71(d,J＝8.8Hz,1H),6.53(dd,J＝8.8,2.4Hz,1H),6.38(d,J＝2.4Hz,1H),3.41-3.31(m,4H),3.09-3.00(m,4H),1.62-1.53(m,2H)。

参考化合物C21的合成方法制得化合物C24的黄色油状液体(400mg,产率51％)。¹HNMR(300MHz,CDCl₃)δ10.21(s,1H),7.81(d,J＝9.5Hz,1H),6.78(dq,J＝4.8,2.7Hz,2H),3.61-3.20(m,4H),1.70(m,J＝3.1,2.4Hz,6H)。

参考化合物C21的合成方法制得化合物C25的红色油状液体(280mg,产率38％)。¹HNMR(300MHz,CDCl₃)δ10.11(s,1H),7.75(t,J＝8.6Hz,1H),6.68(dd,J＝8.9,2.4Hz,1H),6.48(dd,J＝14.3,2.4Hz,1H),3.85(dd,J＝6.0,3.9Hz,4H),3.35(dd,J＝6.2,3.8Hz,4H)。

参考化合物C21的合成方法制得化合物C26的淡黄色固体(300mg,产率66％)。¹HNMR(300MHz,CDCl₃)δ10.26(s,1H),7.85(d,J＝9.5Hz,1H),6.81(dq,J＝5.7,2.6Hz,2H),3.86(dd,J＝6.0,3.9Hz,4H),3.36(dd,J＝6.0,3.9Hz,4H)。

参考化合物C21的合成方法制得化合物C27的淡黄色固体(291mg,产率49％)。¹HNMR(300MHz,DMSO-d₆)δ9.96(d,J＝2.4Hz,1H),7.86-7.53(m,1H),7.19-6.75(m,2H),3.99(dd,J＝6.8,3.7Hz,4H),3.16(dd,J＝7.5,3.7Hz,4H)。

参考化合物C21的合成方法制得化合物C28的淡黄色固体(408mg,产率63％)。¹HNMR(300MHz,DMSO-d₆)δ10.41-9.62(m,1H),7.91-7.54(m,1H),7.13(m,J＝16.0,7.1,2.8Hz,2H),3.99(d,J＝3.4Hz,4H),3.16(d,J＝3.3Hz,4H)。

参考化合物I-80的合成方法，将其中的C21替换成C22，制得化合物I-81的淡黄色固体(18mg,产率53％)。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ7.86(s,1H),7.53(d,J＝7.9Hz,2H),7.48-7.40(m,3H),6.52-6.41(m,2H),5.11(d,J＝7.4Hz,1H),4.38(d,J＝6.1Hz,2H),4.15(s,2H),4.11(s,3H),4.01(s,2H),3.24(d,J＝6.3Hz,4H),3.10(d,J＝11.7Hz,2H),2.91(t,J＝11.6Hz,2H),2.08(d,J＝12.9Hz,2H),2.03(s,4H),1.68(d,J＝13.5Hz,2H),1.47(s,9H).ESI-MS:m/z 646.4[M+H]⁺。

参考化合物I-80的合成方法，将其中的C21替换成C23，制得化合物I-82的淡黄色固体(74mg,产率46％)。ESI-MS:m/z 660.4[M+H]⁺。

参考化合物I-80的合成方法，将其中的C21替换成C24，制得化合物I-83的淡黄色固体(65mg,产率41％)。ESI-MS:m/z 676.4[M+H]⁺。

参考化合物I-80的合成方法，将其中的C21替换成C25，制得化合物I-84的淡黄色固体(60mg,产率37.5％)。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ7.88(s,1H),7.55(d,J＝7.9Hz,2H),7.47(d,J＝8.0Hz,2H),7.37(t,J＝8.7Hz,1H),6.72(d,J＝8.4Hz,1H),6.56(d,J＝13.2Hz,1H),4.96(s,1H),4.40(d,J＝6.2Hz,2H),4.24(s,2H),4.14(s,3H),4.02(s,2H),3.83(d,J＝5.1Hz,4H),3.22(m,J＝5.5Hz,8H),2.19(d,2H),1.81(d,J＝14.0Hz,2H),1.48(s,9H).ESI-MS:m/z 662.4[M+H]⁺。

参考化合物I-80的合成方法，将其中的C21替换成C26，制得化合物I-85的淡黄色固体(57mg,34％)。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ7.91(s,1H),7.57(d,J＝7.9Hz,2H),7.49(d,J＝7.8Hz,3H),6.88(d,J＝7.6Hz,2H),4.97(s,1H),4.42(d,J＝6.1Hz,2H),4.26(s,2H),4.14(m,J＝13.5Hz,5H),3.85(d,J＝5.0Hz,4H),3.22(m,J＝4.9Hz,8H),1.81(m,J＝14.2Hz,4H),1.50(s,9H).ESI-MS:m/z 678.4[M+H]⁺。

参考化合物I-80的合成方法，将其中的C21替换成C27，制得化合物I-86的淡黄色固体(48mg,产率34％)。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ7.88(d,J＝5.2Hz,1H),7.55(t,J＝6.7Hz,2H),7.47(dd,J＝8.1,5.5Hz,2H),7.29(s,1H),6.68(dd,J＝7.4,4.5Hz,1H),6.58(dd,J＝12.7,4.7Hz,1H),5.08(s,1H),4.42(d,J＝6.5Hz,2H),4.15(t,J＝6.3Hz,5H),3.87(dd,J＝12.7,5.2Hz,6H),3.10(q,J＝5.3Hz,4H),3.01(s,2H),2.79(s,2H),2.00(s,2H),1.70(d,J＝13.0Hz,2H),1.49(d,J＝5.5Hz,9H).ESI-MS:m/z 710.4[M+H]⁺。

参考化合物I-80的合成方法，将其中的C21替换成C28，制得化合物I-87的淡黄色固体(53mg,产率35％)。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ7.87(s,1H),7.55(d,J＝7.9Hz,2H),7.47(d,J＝8.3Hz,3H),6.87(d,J＝2.5Hz,1H),6.79(d,J＝8.8Hz,1H),4.98(s,1H),4.40(d,J＝6.1Hz,2H),4.14(m,5H),3.86(d,J＝6.3Hz,4H),3.75(s,2H),3.10(t,J＝5.4Hz,4H),2.86(d,J＝10.8Hz,2H),2.64(s,2H),1.91(t,J＝12.0Hz,2H),1.64(d,J＝13.5Hz,2H),1.48(s,9H).ESI-MS:m/z 726.4[M+H]⁺。

参照实施例62中化合物I-69的合成方法，将I-81脱Boc，制得化合物I-173的淡灰色固体(18mg,产率14％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ10.08(s,1H),8.54(s,3H),8.08(s,1H),7.86-7.65(m,4H),7.58(dd,J＝19.6,8.3Hz,1H),6.68-6.50(m,2H),5.10(bs,1H),4.27(s,2H),4.13(s,5H),4.05(s,2H),3.26(s,6H),3.09(d,J＝12.2Hz,2H),2.10-1.84(m,6H),1.63(d,J＝14.0Hz,2H).ESI-MS:m/z562.4[M-2HCl+H]⁺.

参照实施例62中化合物I-69的合成方法，将I-82脱Boc，制得化合物I-174的白色固体。ESI-MS:m/z 560.3[M-2HCl+H]⁺。

参照实施例62中化合物I-69的合成方法，将I-83脱Boc，制得化合物I-175的白色固体(50mg,产率76％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ10.58(s,1H),8.65(s,3H),8.12(s,1H),7.74(dt,J＝17.9,8.9Hz,5H),7.10(s,2H),4.29(s,2H),4.13(s,5H),4.06(s,2H),3.25(d,J＝24.7Hz,6H),3.13(t,J＝11.7Hz,2H),2.02(d,J＝13.5Hz,2H),1.61(s,8H).ESI-MS:m/z576.4[M-2HCl+H]⁺。

参照实施例62中化合物I-69的合成方法，将I-84脱Boc，制得化合物I-176的白色固体(34mg,产率56％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ10.67(s,1H),8.64(s,3H),8.10(s,1H),7.74(q,J＝7.9Hz,4H),7.55(m,1H),6.83(q,J＝6.0,5.2Hz,2H),4.18(s,2H),4.12(m,5H),4.04(s,2H),3.71(s,4H),3.20(d,J＝6.3Hz,6H),3.01(d,J＝11.8Hz,2H),2.01(t,J＝13.4Hz,2H),1.62(d,J＝14.0Hz,2H).ESI-MS:m/z 562.4[M-2HCl+H]⁺。

参照实施例62中化合物I-69的合成方法，将I-85脱Boc，制得化合物I-177的白色固体(44mg,产率42％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ10.67(s,1H),8.66(s,3H),8.11(s,1H),7.73(dt,J＝14.4,7.9Hz,5H),7.00(d,J＝15.2Hz,2H),4.27(d,J＝4.7Hz,2H),4.11(m,5H),4.05(s,2H),3.71(d,J＝4.7Hz,4H),3.20(m,6H),3.09(d,J＝12.3Hz,2H),2.02(d,J＝13.5Hz,2H),1.62(d,J＝14.0Hz,2H).ESI-MS:m/z 578.4[M-2HCl+H]⁺。

参照实施例62中化合物I-69的合成方法，将I-86脱Boc，制得化合物I-178的淡灰色固体(41mg,产率53％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ10.39(s,1H),8.55(s,3H),8.08(s,1H),7.86-7.67(m,4H),7.53(t,J＝8.7Hz,1H),6.96(t,J＝12.9Hz,2H),5.39(s,1H),4.21(s,2H),4.13(m,J＝3.8Hz,5H),4.04(s,2H),3.88(m,4H),3.23(d,J＝12.3Hz,2H),3.07(m,J＝25.4Hz,6H),1.99(d,J＝14.1Hz,2H),1.63(d,J＝13.9Hz,2H).ESI-MS:m/z 610.2[M-2HCl+H]⁺。

参照实施例62中化合物I-69的合成方法，将I-87脱Boc，制得化合物I-179的淡灰色固体(45mg,产率46％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ10.30(s,1H),8.54(s,3H),8.08(d,J＝4.5Hz,1H),7.86-7.56(m,5H),7.19(d,J＝2.5Hz,1H),7.14-7.01(m,1H),5.39(s,1H),4.30(s,2H),4.12(m,5H),4.05(s,2H),3.88(m,J＝5.9Hz,4H),3.23(s,2H),3.12(m,J＝6.2Hz,6H),2.02(d,J＝13.6Hz,2H),1.63(d,J＝13.8Hz,2H).ESI-MS:m/z 626.2[M-2HCl+H]⁺。

实施例71

中间体6-氨基苯并[d][1,3]二噁唑-5-甲醛(D2)的制备

将化合物D1(1g,5.12mmol)溶于乙醇(10mL)和水(10mL)混合溶剂，加入还原铁粉(2g,25.62mmol)和氯化铵(1.4g,25.62mmol)。加完毕，将体系移至油浴中，80℃条件下反应6h。反应结束后，抽滤得滤液，减压蒸除溶剂，残余物经硅胶柱层析(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝10：1)纯化，得化合物D2的黄色固体(476mg,产率56％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ9.54(s,1H),7.26(s,2H),7.00(s,1H),6.32(s,1H),5.97(s,2H)。

实施例72

中间体6-氯苯并[d][1,3]二噁唑-5-甲醛(D3)的制备

将化合物D2(440mg,2.66mmol)置于反应瓶中，加入浓盐酸(10mL)，在冰浴下，滴入亚硝酸钠(272mg,4.00mmol)的水溶液(4mL)，搅拌1h后，在冰浴下滴入氯化铜(1.1g,10.64mmol)的浓盐酸溶液(1mL)，加完毕，将体系移至油浴中，80℃条件下反应10h。反应结束后，加入水(50mL)，用乙酸乙酯萃取(50mL×4)，用饱和氯化钠水溶液洗涤(50mL×3)，无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂，残余物经硅胶柱层析(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝80：1)纯化，得化合物D3的白色固体(383mg,产率78％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ10.18(s,1H),7.29(d,J＝1.6Hz,2H),6.22(s,2H)。

实施例73

中间体1-(二丁氧基甲基)-2-硝基苯(D12)的制备

中间体1-(二丁氧基甲基)-4-氟-2-硝基苯(D15)的制备

中间体1-(二丁氧基甲基)-4-氯-2-硝基苯(D18)的制备

将化合物D11(5g，33.1mmol)溶于甲苯，加入对甲苯磺酸(p-TsOH)(20mg，0.01mmol)和正丁醇(6.20g，82.78mmol)，搭Dean-Stark装置，将体系移入油浴中，加热至回流反应20h。反应结束后，减压蒸除溶剂，残余物中加入乙酸乙酯(100mL)，用饱和碳酸氢钠溶液洗涤(50mL×3)，无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂，得化合物D12的粗品，不经纯化直接投下一步反应。

参照化合物D12的合成方法，制得化合物D15和D18。

实施例74

中间体1H-吲哚-7-甲醛(D13)的制备

中间体4-氟-1H-吲哚-7-甲醛(D16)的制备

中间体4-氯-1H-吲哚-7-甲醛(D19)的制备

将实施例73制得的化合物D12的粗品置于三颈瓶中，氩气保护，换气三次。加入无水四氢呋喃(20mL)，在-45℃条件下缓慢滴入1N乙烯基溴化镁的四氢呋喃溶液(6mL,6mmol)反应1h，升至室温搅拌过夜。反应结束后，加入1N HCl(20mL)淬灭反应，搅拌1h后，用乙酸乙酯萃取(50mL×4)，用饱和氯化钠水溶液洗涤(50mL x 3)，无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂，残余物经硅胶柱层析(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝50：1)纯化，得化合物D13的黄色固体(200mg，产率44％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ11.60(s,1H),10.15(s,1H),7.96(d,J＝7.8Hz,1H),7.76(d,J＝7.3Hz,1H),7.41(dd,J＝9.4,6.6Hz,1H),7.25(t,J＝7.6Hz,1H),6.61(d,J＝1.9Hz,1H).

参照化合物D13的合成方法，制得化合物D16和D19。

实施例75

中间体1-甲基-1H-吲哚-7-甲醛(D21)的制备

将氢化钠(60％,110.4mg,2.76mmol)置于史莱克管中，氩气保护，换气三次，缓慢滴入D20(200.4mg,1.38mmol)的无水DMF(5ml)溶液，搅拌30分钟后，加入碘甲烷(102μL,1.66mmol)，室温搅拌12h。反应结束后，加水(50mL),用乙酸乙酯萃取(50mL×4)，用饱和氯化钠水溶液洗涤(50mL×3)，无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂，残余物经硅胶柱层析(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝50：1)纯化，得化合物D21的黄色固体(178mg，产率81％)。

实施例76

(4-(6-((1-(2-氟-4-(1H-吡唑-1-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-7-氧-6,7-二氢-2H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-3-基)苄基)氨基甲酸叔丁酯(Ⅰ-90)

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-(2-氟-4-(1H-吡唑-1-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(Ⅰ-182)

将化合物2-氟-4-碘甲苯(354.05mg,1.5mmol)、咪唑(153.18mg,2.25mmol)、反式-N,N'-二甲基-1,2-环己二胺(90.04mg,0.633mmol)、碘化亚铜(57mg,0.3mmol)、碳酸钾(414mg,3mmol)溶于无水二氧六环(7mL)中，氩气保护条件下110℃加热反应16h。反应结束后，直接向反应液中加入硅胶拌样，减压蒸除溶剂，干法上样品柱层析(石油醚/乙酸乙酯的＝6:1)纯化得化合物E1的微黄色固体(260mg，产率98.5％)。

参照实施例63中化合物B20的合成方法，将化合物E1溴代，制得化合物E2。白色固体，产率69.78％。

将化合物E2(46mg,0.18mmol)、B28(70mg，0.15mmol)、无水碳酸钾(41.4mg，0.3mmol)溶于乙腈(5mL)，室温搅拌2h，TLC监测反应完毕后，反应体系加入硅胶减压旋蒸除去溶剂，经硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇＝20：1)得化合物Ⅰ-90(67.27mg)。白色固体，产率73.22％。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ7.92(d,J＝2.4Hz,1H),7.87(s,1H),7.73(s,1H),7.57(d,J＝8.1Hz,2H),7.52-7.41(m,5H),7.28(s,1H),6.48(d,J＝1.8Hz,1H),4.97(s,1H),4.40(s,2H),4.15(s,3H),4.12(s,2H),3.64(s,2H),2.71(s,2H),2.46(t,J＝9.9Hz,2H),1.83(d,J＝12.2Hz,2H),1.60(d,2H),1.49(s,9H).ESI-MS:m/z 643.4[M+H]⁺。

将化合物Ⅰ-90(67.27mg，0.105mmol)溶于2ml二氯甲烷中，室温下缓慢滴加氯化氢的乙酸乙酯饱和溶液，体系逐渐析出白色固体，室温搅拌2h，减压蒸出溶剂和过量的氯化氢，残余物用二氯甲烷打浆得化合物Ⅰ-182(54mg)。白色固体，产率84.1％。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ10.88(d,J＝82.1Hz,1H),8.64(s,1H),8.57(s,3H),8.09(s,1H),7.87(dd,J＝24.6,15.4Hz,4H),7.77(d,J＝8.2Hz,2H),7.71(d,J＝8.1Hz,2H),6.61(s,1H),4.42(d,J＝35.1Hz,2H),4.12(s,5H),4.05(s,2H),3.29(d,J＝11.8Hz,2H),3.12(d,J＝11.3Hz,2H),2.04(t,J＝12.7Hz,2H),1.64(d,J＝13.3Hz,2H).ESI-MS:m/z 543.3[M-2HCl+H]⁺。

实施例77

(4-(6-((1-(2-氟-4-(1H-咪唑-1-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-7-氧-6,7-二氢-2H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-3-基)苄基)氨基甲酸叔丁酯(Ⅰ-88)

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-(2-氟-4-(1H-咪唑-1-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(Ⅰ-180)

将3-氟-4-醛基苯硼酸(500mg,3.0mmol)、咪唑(405mg,6mmol)、醋酸铜(730mg,6mmol)置于无水二氯甲烷(10ml)中，加入四甲基亚乙基二胺(TMEDA)(893μL,6mmol)。所得混合溶液在室温下反应8h。TLC监测反应完毕，加入乙酸乙酯10ml稀释，稀释的反应液经硅藻土抽滤，滤液减压浓缩，残余物经硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝1:2)纯化，得化合物E3的白色固体(325mg,产率57％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ10.19(s,1H),8.52(s,1H),8.03-7.85(m,3H),7.79(d,J＝2.1Hz,1H),7.17(d,J＝1.4Hz,1H)。

将化合物E3(41.99mg，0.221mmol)、化合物B28(80mg，0.17mmol)溶于无水二氯甲烷(4mL)，冰水浴下搅拌0.5h，分批缓慢加入三乙酰氧基硼氢化钠(180mg，0.85mmol)，自然升至室温搅拌过夜，TLC监测反应完毕后，减压旋蒸除去溶剂，干法上样，柱层析纯化(二氯甲烷/甲醇＝20:1)得化合物I-88(白色固体，产率68.6％)。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ7.88(s,3H),7.46(m,J＝21.4,8.0Hz,5H),7.21-7.07(m,2H),5.10(s,1H),4.37(s,2H),4.17(s,2H),4.09(s,3H),4.00(s,2H),2.96(m,4H),2.13(m,2H),1.76(m,J＝13.1Hz,2H),1.45(s,9H)。

参照实施例76的方法，将化合物I-88脱Boc，制得化合物Ⅰ-180。白色固体，产率84.1％。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ11.34(s,1H),9.85(s,1H),8.61(s,3H),8.38(s,1H),8.13(m,J＝8.3Hz,2H),8.02(m,J＝10.4Hz,1H),7.95(s,1H),7.86(m,J＝8.4Hz,1H),7.75(dd,J＝17.0,8.3Hz,4H),4.42(s,2H),4.12(m,5H),4.06(s,2H),3.26(m,2H),3.16(m,2H),2.10(s,2H),1.73-1.59(m,2H)。ESI-MS:m/z 543.3[M-2HCl+H]⁺。

实施例78

采用Suzuki偶联反应合成中间体E4-E39

将化合物2-氟-4-溴苯甲醛(203.01mg,1mmol)、3,5-二甲基异噁唑-4-硼酸(169mg,0.12mmol)、四(三苯基膦)钯(57.78mg,0.05mmol)和碳酸钾(276mg,2mmol)溶于甲苯/乙醇/水(3mL/1mL/0.5mL)的混合溶剂中，氩气保护条件下95℃加热反应15h，TLC监测原料反应完毕后，向反应液中加入硅胶，减压旋蒸除去溶剂,柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝200:1)纯化得化合物E4的白色固体(166mg,产率75.72％)。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ10.41(s,1H),7.97(t,J＝7.7Hz,1H),7.20(d,J＝8.0Hz,1H),7.11(dd,J＝11.1,1.4Hz,1H),2.49(s,3H),2.34(s,3H)。采用类似方法合成中间体E5-E39。(备注：中间体E4-E39分别用于合成对应的化合物Ⅰ-189～Ⅰ-192、Ⅰ-196-～Ⅰ-199、Ⅰ-202、Ⅰ-203、Ⅰ-210～Ⅰ-215、Ⅰ-217～Ⅰ-236，具体操作步骤参见对应化合物的实施例。)

采用Suzuki偶联反应合成中间体E40-E49：

将化合物3-氟-4-醛基苯硼酸(201.52mg,1.2mmol)、5-溴噻唑(164.02mg,1mmol)、四(三苯基膦)钯(57.78mg,0.05mmol)和碳酸钾(276mg,2mmol)溶于1,4-二氧六环/水(3mL/0.5mL)的混合溶剂中，氩气保护条件下95℃加热反应16h，TLC监测原料反应完后，向反应液中加入硅胶，减压旋蒸除去溶剂，柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝15:1)纯化得化合物E40的白色固体(180mg,产率86.95％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ10.21(s,1H),9.24(s,1H),8.60(s,1H),7.95-7.83(m,2H),7.71(d,J＝8.0Hz,1H)。采用类以方法合成中间体E41-E49。(备注：中间体E41-E49分别用于合成对应的化合物Ⅰ-200、Ⅰ-201、Ⅰ-204～Ⅰ-209、Ⅰ-216和Ⅰ-246，具体操作步骤参见对应化合物的实施例)

采用Suzuki偶联反应合成中间体E50-E58：

将化合物2-氟-4-溴苯甲醛(203.01mg,1mmol)、呋喃-2-硼酸频哪醇酯(194.04mg,1.2mmol)、四(三苯基膦)钯(57.78mg,0.05mmol)和碳酸钾(276mg,2mmol)溶于甲苯：乙醇：水(3mL：1mL：0.5mL)的混合溶剂中，氩气保护条件下95℃加热反应10h，TLC监测原料反应完完毕后，向反应液中加入硅胶减压旋蒸除去溶剂,柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝15:1)纯化得化合物E50的白色固体(180mg,产率86.95％)。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ10.35(s,1H),7.90(t,J＝7.7Hz,1H),7.57(t,J＝5.8Hz,2H),7.47(dd,J＝11.6,1.2Hz,1H),6.88(d,J＝3.4Hz,1H),6.57(dd,J＝3.4,1.8Hz,1H)。采用类似方法合成中间体E51-E58。(备注：中间体E50-E58分别用于合成对应的化合物Ⅰ-237～Ⅰ-245，具体操作步骤参见对应化合物的实施例)

实施例79

中间体化合物5-(溴甲基)苯并[c][1,2,5]噁二唑(E65)的合成

取化合物E59(3.71g，30mmol)溶于浓硫酸(30mL)中，冰浴下滴加发烟硝酸(1.4mL)。搅拌反应约3h，将反应液倒入100mL冰水中，有淡黄色固体析出，抽滤，得淡黄色色固体化合物E60(3.0g，产率60％)。

取化合物E60(3.0g，17.74mmol)溶于二甲基亚砜(50mL)中，缓慢加入NaN₃(1.5g，23.07mmol)。室温搅拌反应约1h，将反应液倒入50mL水中，有固体析出，抽滤，得淡黄绿色固体化合物E61(3.1g，产率91％)。

取化合物E61(1.5g，7.8mmol)溶于甲苯(20mL)中，油浴加热110℃。约5h后停止加热，减压蒸除溶剂，得暗黄色固体化合物E62(1.2g)。

取化合物E62(1.2g，7.3mmol)溶于乙醇(20mL)中，加入三苯基膦(1.5g，5.7mmol)，油浴加热70℃。约1h后停止加热，减压蒸除溶剂，残余物经硅胶柱层析(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝15：1)纯化，得淡黄色固体化合物E63(883mg，两步产率76％)。

取化合物E63(883mg，5.96mmol)溶于甲醇(3mL)和四氢呋喃(1mL)中，冰浴下缓慢加入硼氢化钠(250mg，6.57mmol)，搅拌反应约1h，减压蒸除溶剂，加入乙酸乙酯(25mL)稀释，用水(10mL×3)和饱和氯化钠水溶液(10mL×2)洗涤，无水硫酸钠干燥。减压蒸除溶剂，得淡黄色固体化合物E64(890mg，产率99％)。

取化合物E64(890mg，5.93mmol)和三苯基膦(3.2g，12.16mmol)溶于无水四氢呋喃(30mL)中，于冰浴下缓慢加入四溴化碳(4g，12.06mmol)，室温下反应约4h。减压蒸除溶剂，用二氯甲烷(30mL)稀释后经硅藻土抽滤，母液经硅胶柱层析(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝10：1)纯化，得淡黄色固体化合物E65(752mg，产率60％)。(备注：中间体E65用于合成化合物Ⅰ-249，具体操作见其对应的实施例)

实施例80

中间体化合物5-(溴甲基)苯并[c][1,2,5]噻二唑(E68)和4-(溴甲基)苯并[c][1,2,5]噻二唑(E69)的合成

取化合物E66(2.26g)溶于DCM(60mL)中，加入三乙胺(Et₃N，10.3mL)，室温搅拌至固体完全溶解，冰浴下缓慢滴加二氯亚砜(SOCl₂，2.7mL)，油浴加热至45℃反应7h后停止加热，减压蒸除溶剂，加入水(70mL)，用1N盐酸调pH至1，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取，无水硫酸钠干燥。减压蒸除溶剂，残余物经硅胶柱层析(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝10：1)纯化，得黄色油状化合物E67(2.4g，产率91％)。

取化合物E67(1.54g)溶于二氯甲烷(50mL)，加入N-溴代琥珀酰亚胺(NBS，2.2g)和偶氮二异丁腈(AIBN，85mg)，50℃加热回流反应12h，减压蒸除溶剂，残余物经硅胶柱层析(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝100：1)纯化，得白色固体化合物E68(977mg，产率64％)。

参照化合物E68的合成方法制得化合物E69。

实施例81

中间体化合物7-氯-2-(氯甲基)噻吩并[3,2-b]吡啶(E73)的合成

取化合物E70(5.08g，30mmol)溶于无水四氢呋喃(50mL)，充氩气保护，-78℃下缓慢滴加正丁基锂(15.6mL，39mmol)，保持-78℃搅拌反应1h，缓慢滴加无水N’,N-二甲基甲酰胺(7.63mL,99mmol),保持-78℃搅拌反应2h后自然升至室温，搅拌过夜，加入1M盐酸(130mL)，抽滤析出的固体，红外干燥得E71的白色固体(4.32g，产率73％)。

参照实施例62中B12的合成方法，用化合物E71制得化合物E72。白色固体，产率84.4％。

将化合物E72(4.08g，20.51mmol)溶于无水二氯甲烷(50mL)，冰水浴下缓慢滴加二氯亚砜(4.5mL，61.5mmol)，自然升至室温搅拌反应3h，TLC监测反应完毕，减压旋蒸除去溶剂得E73的白色固体(4.41g，产率98.2％)。

实施例82

(4-(6-((1-(((1H-吲哚-6-基)甲基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-7-氧-6,7-二氢-2H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-3-基)苄基)氨基甲酸叔丁酯(Ⅰ-165)

参照实施例77中化合物Ⅰ-88的合成方法，将吲哚-6-甲醛与化合物B28反应，制得化合物Ⅰ-165。微粉色固体，产率71.7％。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ9.51(s,1H),8.02(s,1H),7.65(s,1H),7.53(d,J＝7.9Hz,1H),7.44(s,2H),7.37(d,J＝7.3Hz,2H),7.08(s,1H),7.00(d,J＝7.4Hz,1H),6.45(m,1H),5.16(s,1H),4.33(s,2H),4.12(s,2H),4.03(s,3H),3.97(s,2H),3.03(m,2H),2.88(m,2H),2.03(m,2H),1.75(m,2H),1.47(s,9H).ESI-MS:598.4[M+H]⁺。

实施例83

(4-(6-((1-(((1H-吲哚-7-基)甲基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-7-氧-6,7-二氢-2H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-3-基)苄基)氨基甲酸叔丁酯(Ⅰ-166)

参照实施例77中化合物Ⅰ-88的合成方法，将化合物D13与化合物B28反应，制得化合物Ⅰ-166，白色固体，产率78.2％。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ9.97(s,1H),7.88(s,1H),7.56(m,3H),7.45(m,2H),7.07-6.93(m,2H),6.54(s,1H),4.94(s,1H),4.36(d,J＝5.8Hz,2H),4.13(m,5H),3.94(s,2H),2.78(m,2H),2.48(m,2H),1.87(m,2H),1.63(m,2H),1.48(s,9H).ESI-MS:598.5[M+H]⁺。

实施例84

(4-(6-((4-羟基-1-((1-甲基-1H-吲哚-7-基)甲基)哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-7-氧-6,7-二氢-2H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-3-基)苄基)氨基甲酸叔丁酯(Ⅰ-167)

参照实施例77中化合物Ⅰ-88的合成方法，将D21与化合物B28反应，制得化合物Ⅰ-167，白色固体，产率66.4％。ESI-MS:512.3[M+H]⁺。

实施例85

(4-(6-((1-((4-氯-1H-吲哚-7-基)甲基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-7-氧-6,7-二氢-2H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-3-基)苄基)氨基甲酸叔丁酯(Ⅰ-168)

参照实施例77中化合物Ⅰ-88的合成方法，将化合物D19与化合物B28反应，制得化合物Ⅰ-168，白色固体，产率75.3％。ESI-MS:532.2[M+H]⁺。

实施例86

(4-(6-((1-((4-氟-1H-吲哚-7-基)甲基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-7-氧-6,7-二氢-2H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-3-基)苄基)氨基甲酸叔丁酯(Ⅰ-169)

参照实施例77中化合物Ⅰ-88的合成方法，将化合物D16与化合物B28反应，制得化合物Ⅰ-169，白色固体，产率69％。ESI-MS:516.2[M+H]⁺。

实施例87

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-(2-氯-4-(1H-咪唑-1-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(Ⅰ-181)

参照实施例77，将其中的中间体E3替换成2-氯-4-(1H-咪唑-1-基)苯甲醛，制得化合物Ⅰ-181的白色固体。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ11.33(s,1H),9.86(s,1H),8.63(s,3H),8.40(s,1H),8.31(d,J＝8.6Hz,1H),8.21(s,1H),8.14(s,1H),8.04-7.90(m,2H),7.75(dd,J＝15.8,7.9Hz,4H),4.52(s,2H),4.12(s,5H),4.07(s,2H),3.26(m,4H),2.14(m,2H),1.65(d,J＝13.7Hz,2H)。ESI-MS:m/z559.3[M-2HCl+H]⁺。

实施例88

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-(4-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-2-氟苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(Ⅰ-189)

参照实施例77，将其中的中间体E3替换成中间体E4，制得化合物Ⅰ-189的白色固体。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ10.68(s,1H),8.54(s,3H),8.08(s,1H),7.86(t,J＝8.0Hz,1H),7.77(d,J＝8.0Hz,2H),7.71(d,J＝8.2Hz,2H),7.39(dd,J＝19.0,9.2Hz,2H),4.37(s,2H),4.19(d,J＝40.7Hz,5H),4.06(s,2H),3.30(d,J＝10.4Hz,2H),3.14(d,J＝10.9Hz,2H),2.45(s,3H),2.27(s,3H),2.01(d,J＝14.5Hz,2H),1.65(d,J＝13.5Hz,2H)。ESI-MS:m/z 572.3[M-2HCl+H]⁺。

实施例89

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-(2-氯-4-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(Ⅰ-190)

参照实施例77，将其中的中间体E3替换成中间体E5，制得化合物Ⅰ-190的白色固体。¹H NMR(300MHz,d₆-DMSO)δ10.66(s,1H),8.56(s,3H),8.10(s,1H),8.02(m,1H),7.78(d,J＝8.1Hz,2H),7.71(d,J＝8.3Hz,2H),7.64(d,J＝7.6Hz,1H),7.50(d,J＝8.1Hz,1H),5.56-5.23(m,1H),4.46(s,2H),4.12(m,5H),4.06(s,2H),3.30(s,2H),3.22(m,2H),2.44(m,3H),2.26(m,3H),2.08(m,2H),1.65(m,2H)。ESI-MS:m/z 588.3[M-2HCl+H]⁺。

实施例90

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-(2-氟-4-(异噁唑-4-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2，6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(Ⅰ-191)

参照实施例77，将其中的中间体E3替换成中间体E6，制得化合物Ⅰ-191的白色固体。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ9.61(s,1H),9.28(s,1H),8.09(s,1H),7.87(d,J＝7.9Hz,1H),7.72(dt,J＝18.8,8.7Hz,6H),4.34(d,J＝4.6Hz,2H),4.12(s,5H),4.05(s,2H),3.27(d,J＝12.6Hz,2H),3.11(d,J＝11.5Hz,2H),2.05(t,J＝14.0Hz,2H),1.63(d,J＝14.0Hz,2H).ESI-MS:m/z 544.6[M-2HCl+H]⁺。

实施例91

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-(2-氯-4-(异噁唑-4-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(Ⅰ-192)

参照实施例77，将其中的中间体E3替换成中间体E7，制得化合物Ⅰ-192的白色固体。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ9.63(s,1H),9.30(s,1H),8.08(s,1H),8.07-7.94(m,2H),7.82(d,J＝8.2Hz,1H),7.77(d,J＝8.0Hz,2H),7.70(d,J＝8.1Hz,2H),4.49-4.40(m,2H),4.12(s,5H),4.05(s,2H),3.27(d,4H),2.04(d,J＝13.5Hz,2H),1.63(d,J＝13.9Hz,2H)。ESI-MS:m/z 561.1[M-2HCl+H]⁺。

实施例92

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-(2-氟-4-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(Ⅰ-194)

参照实施例66中化合物B36合成方法的step(1)，用3-氟-4-甲基苯甲腈制得化合物E74的白色固体，产率95％。

称取化合物E74(300mg)溶于3mL的乙酸酐中，139℃加热回流6h，TLC监测反应完毕，向体系中加入水(100mL)，充分搅拌析出固体，抽滤，滤饼用水充分洗涤，60℃烘干得E75的白色固体(260mg，产率75.8％)。

参照实施例63中化合物B20的合成方法，用化合物E75制得化合物E76的白色固体，产率69％。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ8.14(s,1H),7.97(d,J＝7.8Hz,1H),7.57(d,J＝8.0Hz,1H),4.64(s,2H),2.68(s,3H)。

参照实施例76，将其中的化合物E2替换成化合物E76，制得化合物Ⅰ-194的白色固体。ESI-MS:m/z 559.3[M-2HCl+H]⁺。

实施例93

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-(2-氯-4-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(Ⅰ-195)

参照化合物Ⅰ-194的合成方法，将其中的3-氟-4-甲基苯甲腈替换成3-氯-4-甲基苯甲腈，制得化合物Ⅰ-195的白色固体。ESI-MS:m/z 575.3[M-2HCl+H]⁺。

实施例94

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-(4-(环戊-1-烯-1-基)-2-氟苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(Ⅰ-196)

参照实施例77，将其中的中间体E3替换成中间体E8，制得化合物Ⅰ-196的白色固体。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ10.74(s,1H),8.59(s,3H),8.08(s,1H),7.70(m,5H),7.50-7.09(m,3H),6.48(s,1H),5.42(s,1H),4.30(s,2H),4.08(m,5H),3.83(m,2H),3.22(m,3H),3.09(m,2H),2.65(s,2H),1.92(m,5H),1.78-1.54(m,2H)。ESI-MS:m/z 543.3[M-2HCl+H]⁺。

实施例95

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-(2-氯-4-(环戊-1-烯-1-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(Ⅰ-197)

参照实施例77，将其中的中间体E3替换成中间体E9，制得化合物Ⅰ-197的白色固体。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ10.63(s,1H),8.58(s,3H),8.09(s,1H),7.89(m,1H),7.77(d,J＝8.3Hz,2H),7.71(d,J＝8.2Hz,2H),7.61(m,1H),7.54(m,1H),6.50(s,1H),4.41(m,2H),4.12(s,5H),4.05(s,2H),3.42-3.06(m,5H),2.66(m,2H),2.15-1.84(m,5H),1.63(m,2H).。ESI-MS:m/z 559.3[M-2HCl+H]⁺。

实施例96

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-(2-氟-4-(噻唑-5-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(Ⅰ-200)

参照实施例77，将其中的中间体E3替换成中间体E40，制得化合物Ⅰ-200的白色固体。¹H NMR(300MHz,D2O)δ9.09(s,1H),8.17(s,1H),7.94(s,1H),7.61-7.42(m,7H),4.35(s,2H),4.21(s,2H),4.11(s,2H),3.98(s,3H),3.45(m2H),3.25(m 2H),1.99(m,2H),1.79(m,2H).。ESI-MS:m/z 560.4[M-2HCl+H]⁺。

实施例97

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-(2-氯-4-(噻唑-5-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(Ⅰ-201)

参照实施例77，将其中的中间体E3替换成中间体E41，制得化合物Ⅰ-201的白色固体。ESI-MS:m/z 576.3[M-2HCl+H]⁺。

实施例98

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-(2-氟-4-(噻唑-2-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(Ⅰ-202)

参照实施例77，将其中的中间体E3替换成中间体E12，制得化合物Ⅰ-202的白色固体。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ10.73(s,1H),8.55(s,3H),8.08(s,1H),7.99(m,1H),7.89(m,4H),7.74(m,4H),5.40(s,1H),4.40(m,2H),4.09(m,7H),3.31-3.22(m,2H),3.15(m,2H),2.04(m,2H),1.64(m,2H).。ESI-MS:m/z560.3[M-2HCl+H]⁺。

实施例99

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-(2-氟-4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(Ⅰ-204)

参照实施例77，将其中的中间体E3替换成中间体E42，制得化合物Ⅰ-204的白色固体。¹H NMR(300MHz,D₂O)δ9.33(s,1H),7.97(s,1H),7.59(m,5H),7.38(m,2H),4.40(s,2H),4.23(s,2H),4.14(s,2H),4.02(s,3H),3.46(m,2H),3.28(m,2H),2.46(s,3H),2.01(m,2H),1.82(m,2H).。ESI-MS:m/z 574.3[M-2HCl+H]⁺。

实施例100

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-(2-氯-4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(Ⅰ-205)

参照实施例77，将其中的中间体E3替换成中间体E43，制得化合物Ⅰ-205的白色固体。ESI-MS:m/z 590.3[M-2HCl+H]⁺。

实施例101

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-(2-氟-4-(2-甲基噻唑-4-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(Ⅰ-206)

参照实施例77，将其中的中间体E3替换成中间体E44，制得化合物Ⅰ-206的白色固体。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ10.72(s,1H),8.58(s,3H),8.17(s,1H),8.09(s,1H),7.79(m,7H),4.35(s,2H),4.18(m,5H),4.05(s,2H),3.28(m,2H),3.12(m,2H),2.73(s,3H),2.03(m,2H),1.64(m,2H)。ESI-MS:574.3m/z[M-2HCl+H]⁺。

实施例102

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-(2-氯-4-(2-甲基噻唑-4-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(Ⅰ-207)

参照实施例77，将其中的中间体E3替换成中间体E45，制得化合物Ⅰ-207的白色固体。ESI-MS:m/z 590.3[M-2HCl+H]⁺。

实施例103

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-(2-氟-4-(2-甲基噻唑-5-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(Ⅰ-208)

参照实施例77，将其中的中间体E3替换成中间体E46，制得化合物Ⅰ-208的白色固体。¹H NMR(300MHz,D2O)δ8.00(s,1H),7.94(s,1H),7.57(m,5H),7.40(m,2H),4.35(s,2H),4.22(s,2H),4.11(s,2H),3.99(s,3H),3.46(m,2H),3.25(m,2H),2.71(s,3H),1.99(m,2H),1.79(m,2H)。ESI-MS:m/z 574.3[M-2HCl+H]⁺。

实施例104

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-(2-氯-4-(2-甲基噻唑-5-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(Ⅰ-209)

参照实施例77，将其中的中间体E3替换成中间体E47，制得化合物Ⅰ-209的白色固体。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ10.69(s,1H),8.56(s,3H),8.24(s,1H),8.09(s,1H),7.97(m,1H),7.87(m,1H),7.81-7.67(m,5H),4.45(s,2H),4.23(s,2H),4.12(s,3H),4.05(s,2H),3.24(m,4H),2.70(s,3H),2.07(m,2H),1.63(m,2H).ESI-MS:m/z 590.3[M-2HCl+H]⁺。

实施例105

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-(((1-(2-氟-4-(1,2,4-噻二唑-5-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(Ⅰ-210)

参照实施例77，将其中的中间体E3替换成中间体E14，制得化合物Ⅰ-210的白色固体。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ10.93(s,1H),9.05(s,1H),8.57(s,3H),8.11-8.00(m,4H),7.74(m,4H),4.44(s,2H),4.12(m,5H),4.05(s,2H),3.31(m,2H),3.16(m,2H),2.13-1.99(m,2H),1.64(m,2H).。ESI-MS:m/z 561.3[M-2HCl+H]⁺。

实施例106

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-(((1-(2-氟-4-(1-甲基-1H-吡唑-5-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(Ⅰ-212)

参照实施例77，将其中的中间体E3替换成中间体E16，制得化合物Ⅰ-212的白色固体。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ10.90(s,1H),8.59(s,3H),8.10(s,1H),7.79(m,5H),7.54(m,3H),6.53(s,1H),4.39(s,2H),4.09(m,7H),3.90(s,3H),3.32(m,2H),3.16(m,2H),2.06(m,2H),1.65(m,2H)。ESI-MS:m/z 557.4[M-2HCl+H]⁺。

实施例107

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-(((1-(2-氯-4-(1-甲基-1H-吡唑-5-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(Ⅰ-213)

参照实施例77，将其中的中间体E3替换成中间体E17，制得化合物Ⅰ-213的白色固体。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ10.98(d,J＝73.4Hz,1H),8.60(s,3H),8.17-8.04(m,2H),7.77(m,3H),7.72(m,2H),7.65(m,1H),7.51(m,1H),6.54(m,1H),4.49(s,2H),4.19(m,5H),4.07(s,2H),3.91(s,3H),3.43-3.11(m,4H),2.09(m,2H),1.65(m,2H)。ESI-MS:m/z 573.3[M-2HCl+H]⁺。

实施例108

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-(((1-(2-氟-4-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(Ⅰ-214)

参照实施例77，将其中的中间体E3替换成中间体E18，制得化合物Ⅰ-214的白色固体。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ10.74(s,1H),8.60(s,3H),8.28(s,1H),8.09(s,1H),7.98(s,1H),7.86-7.69(m,5H),7.52(m,2H),4.08(m,9H),3.87(s,3H),3.29(m,2H),3.11(m,2H),2.04(m,2H),1.64(m,2H)。ESI-MS:m/z 557.4[M-2HCl+H]⁺。

实施例109

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-(((1-(2-氯-4-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(Ⅰ-215)

参照实施例77，将其中的中间体E3替换成中间体E19，制得化合物Ⅰ-215的白色固体。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ10.83(d,J＝60.8Hz,1H),8.62(s,3H),8.31(s,1H),8.11(s,1H),8.01(s,1H),7.92(m,1H),7.83-7.69(m,5H),7.65(m,1H),4.46(s,2H),4.27-4.03(m,7H),3.87(s,3H),3.40–3.09(m,4H),2.07(m,2H),1.63(m,2H)。ESI-MS:m/z 573.3[M-2HCl+H]⁺。

实施例110

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-(((1-(2-氟-4-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(Ⅰ-216)

参照实施例77，将其中的中间体E3替换成中间体E48，制得化合物Ⅰ-216的白色固体。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ11.27(s,1H),8.58(s,3H),8.20-8.07(m,2H),7.94-7.83(m,3H),7.74(m,5H),4.46(s,2H),4.12(m,5H),4.06(s,2H),3.91(s,3H),3.23(m,4H),2.10(m,2H),1.66(m,2H)。ESI-MS:m/z 557.4[M-2HCl+H]⁺。

实施例111

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-(2-氟-4-(噻吩-2-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(Ⅰ-217)

参照实施例77，将其中的中间体E3替换成中间体E20，制得化合物Ⅰ-217的白色固体。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ10.68(s,1H),8.56(s,3H),8.08(s,1H),7.87-7.52(m,9H),7.23-7.13(m,1H),4.34(s,2H),4.12(m,5H),4.05(s,2H),3.28(m,2H),3.11(m,2H),2.01(m,2H),1.63(m,2H)。ESI-MS:m/z 559.3[M-2HCl+H]⁺。

实施例112

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-(2-氯-4-(噻吩-2-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(Ⅰ-218)

参照实施例77，将其中的中间体E3替换成中间体E21，制得化合物Ⅰ-218的白色固体。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ10.65(s,1H),8.57(s,3H),8.09(s,1H),8.00-7.91(m,1H),7.86(m,1H),7.72(m,6H),7.20(m,1H),4.44(s,2H),4.12(m,5H),4.05(s,2H),3.40-3.10(m,4H),2.07(m,2H),1.64(m,2H)。ESI-MS:m/z575.3[M-2HCl+H]⁺。

实施例113

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-(2-氟-4-(噻吩-3-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(Ⅰ-219)

参照实施例77，将其中的中间体E3替换成中间体E22，制得化合物Ⅰ-219的白色固体。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ10.72(s,1H),8.56(s,3H),8.10(m,2H),7.74(m,9H),4.35(m,2H),4.12(m,5H),4.05(s,2H),3.31(m,2H),3.13(m,2H),2.01(m,2H),1.64(m,2H).。ESI-MS:m/z 559.3[M-2HCl+H]⁺。

实施例114

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-(2-氯-4-(噻吩-3-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(Ⅰ-220)

参照实施例77，将其中的中间体E3替换成中间体E23，制得化合物Ⅰ-220的白色固体。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ10.43(s,1H),8.51(s,3H),8.12(m,1H),8.08(s,1H),7.96(m,1H),7.91(m,1H),7.83(m,1H),7.77(m,2H),7.70(m,4H),5.40(s,1H),4.45(s,2H),4.12(s,5H),4.05(s,2H),3.33-3.12(m,4H),2.03(m,2H),1.64(m,2H).。ESI-MS:m/z 575.2[M-2HCl+H]⁺。

实施例115

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-(4-(2-氯噻吩-3-基)-2-氟苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(Ⅰ-221)

参照实施例77，将其中的中间体E3替换成中间体E24，制得化合物Ⅰ-221的白色固体。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ10.67(s,1H),8.53(s,3H),8.06(s,1H),7.79(m,5H),7.57(m,3H),7.30(m,1H),5.38(s,1H),4.43(m,2H),4.10(m,5H),4.03(s,2H),3.28(m,2H),3.12(m,2H),2.00(m,2H),1.62(m,2H)。ESI-MS:m/z[M-2HCl+H]⁺。

实施例116

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-(2-氯-4-(2-氯噻吩-3-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(Ⅰ-222)

参照实施例77，将其中的中间体E3替换成中间体E25，制得化合物Ⅰ-222的白色固体。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ10.59(s,1H),8.52(s,3H),8.06(s,1H),7.99(m,1H),7.76(m,3H),7.69(m,3H),7.60(m,1H),7.31(m,1H),4.51(d,J＝33.7Hz,2H),4.17(m,5H),4.05(s,2H),3.36-3.16(m,4H),2.06(m,2H),1.64(m,J＝13.8Hz,2H)。ESI-MS:m/z 609.2[M-2HCl+H]⁺。

实施例117

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-(4-(5-氯噻吩-2-基)-2-氟苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(Ⅰ-223)

参照实施例77，将其中的中间体E3替换成中间体E26，制得化合物Ⅰ-223的白色固体。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ10.67(s,1H),8.53(s,3H),8.05(s,1H),7.82-7.49(m,8H),7.21(s,1H),5.35(s,1H),4.38(d,J＝36.4Hz,2H),4.16(m,5H),4.02(s,2H),3.26(m,2H),3.09(m,2H),2.00(m,2H),1.61(m,2H)。ESI-MS:m/z 593.2[M-2HCl+H]⁺。

实施例118

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-(2-氯-4-(5-氯噻吩-2-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(Ⅰ-224)

参照实施例77，将其中的中间体E3替换成中间体E27，制得化合物Ⅰ-224的白色固体。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ10.72(s,1H),8.54(s,3H),8.06(s,1H),7.95(m,1H),7.81(s,1H),7.71(m,5H),7.57(m,1H),7.19(m,1H),4.47(d,J＝31.7Hz,2H),4.16(m,5H),4.04(s,2H),3.35-3.12(m,4H),2.18-1.95(m,2H),1.63(m,2H)。ESI-MS:m/z 609.2[M-2HCl+H]⁺。

实施例119

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-(2-氟-4-(5-甲基噻吩-2-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(Ⅰ-225)

参照实施例77，将其中的中间体E3替换成中间体E28，制得化合物Ⅰ-225的白色固体。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ10.49(s,1H),8.50(s,3H),8.04(s,1H),7.72(m,5H),7.51(m,3H),6.86(s,1H),5.37(s,1H),4.37(d,J＝35.1Hz,2H),4.10(m,5H),4.02(s,2H),3.26(m,2H),3.10(m,2H),2.48(s,3H),1.99(m,2H),1.61(m,2H)。ESI-MS:m/z[M-2HCl+H]⁺。

实施例120

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-(2-氯-4-(5-甲基噻吩-2-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(Ⅰ-226)

参照实施例77，将其中的中间体E3替换成中间体E29，制得化合物Ⅰ-226的白色固体。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ10.48(s,1H),8.52(s,3H),8.06(s,1H),7.86(m,1H),7.74(m,3H),7.65(m,3H),7.50(m,1H),6.86(m,1H),5.43(s,1H),4.46(d,J＝34.1Hz,2H),4.16(m,5H),4.03(s,2H),3.22(m,4H),2.48(s,3H),2.00(m,2H),1.61(m,2H).。ESI-MS:m/z 589.2[M-2HCl+H]⁺。

实施例121

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-(2-氟-4-(4-甲基噻吩-2-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(Ⅰ-227)

参照实施例77，将其中的中间体E3替换成中间体E30，制得化合物Ⅰ-227的白色固体。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ10.61(s,1H),8.54(s,3H),8.06(s,1H),7.72(m,5H),7.54(m,3H),7.22(s,1H),5.38(s,1H),4.37(d,J＝36.1Hz,2H),4.10(m,5H),4.03(s,2H),3.26(m,2H),3.09(m,2H),2.22(s,3H),1.98(m,2H),1.61(m,2H)。ESI-MS:m/z573.2[M-2HCl+H]⁺。

实施例122

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-(2-氯-4-(4-甲基噻吩-2-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(Ⅰ-228)

参照实施例77，将其中的中间体E3替换成中间体E31，制得化合物Ⅰ-228的白色固体。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ10.51(s,1H),8.53(s,3H),8.06(s,1H),7.88(m,1H),7.83-7.63(m,6H),7.52(s,1H),7.23(s,1H),5.40(s,1H),4.46(d,J＝32.7Hz,2H),4.16(m,5H),4.03(s,2H),3.22(m,4H),2.22(s,3H),2.03(m,2H),1.61(m,2H).。ESI-MS:m/z 589.2[M-2HCl+H]⁺。

实施例123

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-(2-氟-4-(吡啶-4-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(Ⅰ-229)

参照实施例77，将其中的中间体E3替换成中间体E32，制得化合物Ⅰ-229的白色固体。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ11.08(s,1H),8.94(m,2H),8.56(s,3H),8.32(m,2H),8.12-8.00(m,3H),7.95(d,J＝7.7Hz,1H),7.75(m,2H),7.69(m,2H),4.42(m,2H),4.10(m,5H),4.04(s,2H),3.26(m,2H),3.15(m,2H),2.06(m,2H),1.62(m,2H).。ESI-MS:m/z 554.2[M-2HCl+H]⁺。

实施例124

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-(2-氯-4-(吡啶-4-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(Ⅰ-230)

参照实施例77，将其中的中间体E3替换成中间体E33，制得化合物Ⅰ-230的白色固体。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ11.19(s,1H),8.99(d,J＝6.2Hz,2H),8.62(s,3H),8.43(m,2H),8.25(m,2H),8.11(m,2H),7.74(q,J＝8.3Hz,4H),4.54(s,2H),4.09(m,7H),3.28(m,4H),2.13(m,2H),1.65(m,2H)。ESI-MS:m/z570.3[M-2HCl+H]⁺。

实施例125

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-(2-氟-4-(嘧啶-5-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(Ⅰ-231)

参照实施例77，将其中的中间体E3替换成中间体E34，制得化合物Ⅰ-231的白色固体。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ10.95(s,1H),9.24(m,3H),8.58(s,3H),8.08(m,1H),7.94(m,2H),7.79(m,3H),7.71(m,2H),4.51(s,2H),4.12(m,5H),4.05(s,2H),3.30(m,2H),3.14(m,2H),2.05(m,2H),1.65(m,2H)。ESI-MS:m/z 538.3[M-2HCl+H]⁺。

实施例126

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-(2-氯-4-(嘧啶-5-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(Ⅰ-232)

参照实施例77，将其中的中间体E3替换成中间体E35，制得化合物Ⅰ-232的白色固体。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ10.81(s,1H),9.24(m,3H),8.56(s,3H),8.11(m,3H),7.95(m,1H),7.74(dd,J＝19.3,8.2Hz,4H),4.50(s,2H),4.12(m,5H),4.06(s,2H),3.26(m,4H),2.09(m,2H),1.65(m,2H).。ESI-MS:m/z 571.3[M-2HCl+H]⁺。

实施例127

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-(2-氟-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(Ⅰ-233)

参照实施例77，将其中的中间体E3替换成中间体E36，制得化合物Ⅰ-233的白色固体。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ11.18(s,1H),8.84(d,J＝6.0Hz,1H),8.60(m,3H),8.34(s,1H),8.22(d,J＝5.0Hz,1H),8.14-7.93(m,4H),7.74(dd,J＝17.5,8.2Hz,4H),5.49(s,1H),4.49(d,J＝37.3Hz,2H),4.19(m,5H),4.06(s,2H),3.27(m,2H),3.15(m,2H),2.78(s,3H),2.08(m,2H),1.64(m,2H)。ESI-MS:m/z 568.4[M-2HCl+H]⁺。

实施例128

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-(2-氯-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(Ⅰ-234)

参照实施例77，将其中的中间体E3替换成中间体E37，制得化合物Ⅰ-234的浅灰白色固体。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ11.13(s,1H),8.86(d,J＝5.2Hz,1H),8.60(m,3H),8.40(s,1H),8.27(m,3H),8.12(m,2H),7.75(m,4H),4.59(d,J＝34.5Hz,2H),4.27-4.05(m,7H),3.29(m,4H),2.79(s,3H),2.12(m,2H),1.65(m,2H)。ESI-MS:m/z 584.3[M-2HCl+H]⁺。

实施例129

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-(2-氟-4-(呋喃-2-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(Ⅰ-237)

参照实施例77，将其中的中间体E3替换成中间体E50，制得化合物Ⅰ-237的白色固体。1H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ10.67(s,1H),8.57(s,3H),8.08(s,1H),7.83(s,1H),7.77(m,3H),7.71(m,2H),7.64(m,2H),7.17(d,J＝3.3Hz,1H),6.66(d,J＝1.6Hz,1H),5.37(s,1H),4.34(s,2H),4.12(m,5H),4.03(s,2H),3.28(m,2H),3.11(m,2H),2.05(m,2H),1.63(m,2H)。ESI-MS:m/z 543.3[M-2HCl+H]⁺。

实施例130

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-(2-氯-4-(呋喃-2-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(Ⅰ-238)

参照实施例77，将其中的中间体E3替换成中间体E51，制得化合物Ⅰ-238的白色固体。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ10.78(d,J＝71.5Hz,1H),8.59(s,3H),8.10(s,1H),7.99(m,1H),7.88(m,1H),7.84(m 1H),7.77(m,3H),7.71(m,2H),7.20(d,J＝3.4Hz,1H),6.66(s,1H),4.49(d,J＝30.0Hz,2H),4.12(m,5H),4.06(s,2H),3.38-3.14(m,4H),2.05(m,2H),1.64(m,2H)。ESI-MS:m/z 559.3[M-2HCl+H]⁺。

实施例131

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-(4-(呋喃-2-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(Ⅰ-239)

参照实施例77，将其中的中间体E3替换成中间体E52，制得化合物Ⅰ-239的白色固体。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ10.68(s,1H),8.55(s,3H),8.06(s,1H),7.92-7.49(m,9H),7.03(m,1H),6.61(m,1H),4.34(d,J＝39.1Hz,2H),4.15(m,5H),4.02(s,2H),3.28-2.96(m,4H),2.09-1.88(m,2H),1.60(m,2H)。ESI-MS:m/z 525.2[M-2HCl+H]⁺。

实施例132

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-(4-(呋喃-2-基)-2-羟基苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(Ⅰ-240)

参照实施例77，将其中的中间体E3替换成中间体E53，制得化合物Ⅰ-240的白色固体。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ10.50(s,1H),10.14(s,1H),8.58(s,3H),8.08(s,1H),7.77(,2H),7.71(,2H),7.58-7.45(m,1H),7.34-7.14(m,2H),6.93(d,J＝3.3Hz,1H),6.61(s,1H),4.49(s,1H),4.28(d,J＝42.7Hz,2H),4.12(m,5H),4.05(s,2H),3.26(m,2H),3.08(m,2H),1.98(m,2H),1.68(m,2H).。ESI-MS:m/z 541.3[M-2HCl+H]⁺。

实施例133

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-(3-(呋喃-2-基)-2-羟基苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(Ⅰ-241)

参照实施例77，将其中的中间体E3替换成中间体E54，制得化合物Ⅰ-241的浅草绿色固体。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ10.10(s,1H),9.64(s,1H),8.54(s,3H),8.08(s,1H),7.82-7.68(m,6H),7.44(m,1H),7.12-6.95(m,2H),6.62(m,1H),5.40(s,1H),4.47(d,J＝33.5Hz,2H),4.12(m,5H),4.04(s,2H),3.22(m,4H),1.99(m,2H),1.63(m,2H)。ESI-MS:m/z541.2[M-2HCl+H]⁺。

实施例134

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-(4-(呋喃-2-基)-2-甲基苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(Ⅰ-242)

参照实施例77，将其中的中间体E3替换成中间体E55，制得化合物Ⅰ-242的黄绿色固体。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ10.19(s,1H),8.59(s,3H),8.11(s,1H),7.80-7.68(m,6H),7.60(d,J＝6Hz,10H),7.03(m,6H),6.62(m,6H),4.31(s,2H),4.12(s,5H),4.06(s,2H),2.45(m,2H),2.08(m,2H),1.62(m,2H).。ESI-MS:m/z 539.3[M-2HCl+H]⁺。

实施例135

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-(4-(呋喃-2-基)-2,6-二甲基苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(Ⅰ-243)

参照实施例77，将其中的中间体E3替换成中间体E56，制得化合物Ⅰ-243的白色固体。ESI-MS:m/z 553.4[M-2HCl+H]⁺。

实施例136

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-(2-氟-4-(5-(羟甲基)呋喃-2-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(Ⅰ-244)

参照实施例77方法，将E57与B28反应，先制得化合物Ⅰ-154,再脱除Boc保护得到化合物Ⅰ-244的白色固体。ESI-MS:m/z 589.3[M-2HCl+H]⁺。

实施例137

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-(2-氯-4-(5-甲基呋喃-2-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(Ⅰ-245)

参照实施例77，将其中的中间体E3替换成中间体E58，制得化合物Ⅰ-245的白色固体。ESI-MS:m/z 573.2[M-2HCl+H]⁺。

实施例138

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-(((1-(2-氟-4-(5-甲基-1H-吡唑-3-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(Ⅰ-246)

参照实施例77，将其中的中间体E3替换成中间体E49，制得化合物Ⅰ-246的白色固体。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ10.75(s,1H),8.60(s,3H),8.09(s,1H),7.87–7.60(m,7H),6.62(s,1H),4.40(d,J＝37.6Hz,2H),4.18(m,5H),4.05(s,2H),3.28(m,2H),3.11(m,2H),2.28(s,3H),2.02(m,2H),1.63(m,2H)。ESI-MS:m/z 556.3[M-2HCl+H]⁺。

实施例139

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-(2-氯-4-(4-甲基-1H-1,2,3-三唑-1-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-(基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(Ⅰ-247)

中间体D24的合成路线如下：

将化合物2-氯-4-氨基苯腈(5g，32.77mmol)溶于无水四氢呋喃(55mL)中，氮气氛围下缓慢滴加二异丁基氢化铝(54.6mL，81.92mmol)，约0.5h滴加完毕，室温搅拌1h后将反应体系降至-10℃，加入甲醇(9.83mL)，自然升至室温搅拌1h，反应完毕后，加入饱和酒石酸钾钠水溶液(50mL)淬灭反应。用乙酸乙酯(50mL×3)萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂，残余物加入硅胶经柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝2：1)纯化得化合物D22的黄色固体(2.47g，产率48.6％)。

称取化合物D22(50mg，0.322mmol)分散于17％的盐酸(2mL)中，体系降至0℃，缓慢滴加亚硝酸钠(34mg，0.484mmol)水溶液，维持0℃搅拌0.5h，向体系中缓慢滴加叠氮化钠(32mg，0.484mmol)水溶液，继续搅拌2h。反应完毕后，加水(30mL)，用乙酸乙酯(15mL×3)萃取，有机相用饱和碳酸氢钠水溶液(20mL×3)和饱和氯化钠水溶液(20mL×3)洗涤、无水硫酸钠干燥，浓缩残余物经硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝10：1)得D23的黄色固体(54mg，产率93％)。

称取化合物D23(41mg，0.226mmol)、四氢吡咯(16mg，0.226mmol)、丙醛(14.4mg，0.249mmol)加入无水四氢呋喃(2mL)中，体系密封50℃加热搅拌反应12h。反应完毕后，0℃下向体系中加入间氯过氧苯甲酸(59mg，0.339mmol)，自然升至室温搅拌反应1h。反应完毕后，加水(30mL)，用乙酸乙酯(15mL×3)萃取，有机相用饱和碳酸氢钠水溶液(20mL×3)和饱和氯化钠水溶液(20mL×3)洗涤、无水硫酸钠干燥，浓缩残余物经硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝5：1)得D24的黄色固体(34mg，产率69％)。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ10.50(s,1H),8.10(d,J＝8.5Hz,1H),7.98(d,J＝1.9Hz,1H),7.83(s,1H),7.81-7.75(m,1H),2.48(s,3H).

参照实施例77，将其中的中间体E3替换成中间体D24，制得化合物Ⅰ-247的白色固体。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ10.67(s,1H),8.70(s,1H),8.54(s,3H),8.21-7.98(m,4H),7.74(dd,J＝20.6,7.8Hz,4H),4.50(s,2H),4.12(m,5H),4.06(s,2H),3.27(m,4H),2.35(s,3H),2.07(m,2H),1.64(m,2H).ESI-MS:m/z573.2[M-2HCl+H]⁺。

实施例140

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-(2-氯-4-(1-甲基-3-(三氟甲基)-1H-吡唑-5-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-(基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(Ⅰ-248)

参照实施例77，将其中的中间体E3替换成中间体E17A，制得化合物Ⅰ-248的白色固体。ESI-MS:m/z 641.2[M-2HCl+H]⁺。

实施例141

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-(苯并[c][1,2,5]噁二唑-5-基甲基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(Ⅰ-249)

参照实施例76，将其中的中间体E2替换成中间体E65，制得化合物Ⅰ-249的白色固体。¹H NMR(300MHz,D2O)δ8.04(s,1H),7.93(m,2H),7.63-7.47(m,5H),4.42(s,2H),4.21(s,2H),4.12(s,2H),4.00(s,3H),3.44m,2H),3.27(m,2H),2.00(m,2H),1.79(m,2H).。ESI-MS:m/z 501.4[M-2HCl+H]⁺。

实施例142

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-(苯并[c][1,2,5]噻二唑-5-基甲基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(Ⅰ-250)

参照实施例76，将其中的中间体E2替换成中间体E68，制得化合物Ⅰ-250的白色固体。¹H NMR(300MHz,D2O)δ8.11(s,1H),8.02(d,J＝9.1Hz,1H),7.93(s,1H),7.67(d,J＝9.2Hz,1H),7.58(m,4H),4.48(s,2H),4.21(s,2H),4.12(s,2H),4.00(s,3H),3.44(m,2H),3.27(m,2H),1.99(m,2H),1.78(m,2H)。ESI-MS:m/z517.3[M-2HCl+H]⁺。

实施例143

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-(苯并[c][1,2,5]噻二唑-4-基甲基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(Ⅰ-251)

参照实施例76，将其中的中间体E2替换成中间体E69，制得化合物Ⅰ-251的白色固体。¹H NMR(300MHz,D2O)δ8.05(m,1H),7.93(s,1H),7.77(m,1H),7.71-7.64(m,1H),7.57(m,4H),4.77(s,2H),4.21(s,2H),4.12(s,2H),3.99(s,3H),3.36(m,4H),2.00(m,2H),1.76(m,2H)。ESI-MS:m/z 517.3[M-2HCl+H]⁺。

实施例144

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-((7-氯噻吩并[3,2-b]吡啶-2-基)甲基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(Ⅰ-252)

参照实施例76，将其中的中间体E2替换成中间体E73，制得化合物Ⅰ-252的白色固体。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ11.46(s,1H),8.72(d,J＝5.0Hz,1H),8.57(s,3H),8.10(s,1H),8.04(s,1H),7.72(m,5H),6.02(s,1H),4.81(d,J＝37.7Hz,2H),4.18(m,5H),4.07(s,2H),3.39-3.10(m,4H),2.04(m,2H),1.66(m,2H)。ESI-MS:m/z 550.2[M-2HCl+H]⁺。

实施例145

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-(((1-((6-氯苯并[d][1,3]二氧杂-5-基)甲基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(Ⅰ-253)

参照实施例77，将其中的中间体E3替换成中间体D3，制得化合物Ⅰ-253的白色固体。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ10.46(s,1H),8.53(s,3H),8.06(s,1H),7.75(d,J＝7.9Hz,2H),7.69(d,J＝7.8Hz,2H),7.48(s,1H),7.19(s,1H),6.12(s,2H),5.38(s,1H),4.35(d,J＝33.2Hz,2H),4.10(m,5H),4.03(s,2H),3.31-3.09(m,4H),1.99(m,2H),1.60(m,2H).。ESI-MS:m/z 539.2[M-2HCl+H]⁺。

实施例146

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-(((2,3-二氢苯并[b][1,4]二噁英-6-基)甲基]-4-羟基哌啶-4-基]甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(Ⅰ-254)

参照实施例77，将其中的中间体E3替换成1,4-苯并二恶烷-6-甲醛，制得化合物Ⅰ-254的白色固体。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ10.36(s,1H),8.54(s,3H),8.07(s,1H),7.74(dd,J＝20.5,7.7Hz,4H),7.04(m,3H),5.34(s,1H),4.25(m,4H),4.12(m,6H),4.04(s,3H),3.15(m,2H),3.01(m,2H),1.95(m,2H),1.61(m,2H)。ESI-MS:m/z 517.2[M-2HCl+H]⁺。

实施例147

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((4-羟基-1-((4-甲氧基-3,5-二甲基吡啶-2-基)甲基)哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(Ⅰ-255)

参照实施例76，将其中的中间体E2替换成2-氯甲基-3,5-二甲基-4-甲氧基吡啶盐酸盐，制得化合物Ⅰ-255的白色固体。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ10.13(s,1H),8.64(s,3H),8.44(s,1H),8.12(s,1H),7.73(q,J＝8.2Hz,4H),4.55(s,2H),4.10(d,J＝4.3Hz,7H),3.82(s,3H),3.34(s,4H),2.26(d,J＝7.9Hz,6H),2.12-1.97(m,2H),1.65(d,J＝14.0Hz,2H)。ESI-MS:m/z518.3[M-2HCl+H]⁺。

实施例148

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((4-羟基-1-((4-(3-甲氧基丙氧基)-3-甲基吡啶-2-基)甲基)哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(Ⅰ-256)

参照实施例76，将其中的中间体E2替换成2-氯甲基-3-甲基-4-(3-甲氧丙氧基)吡啶盐酸盐，制得化合物Ⅰ-256的白色固体。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.64(d,J＝6.4Hz,4H),8.12(s,1H),7.73(q,J＝8.2Hz,4H),7.41(d,J＝6.3Hz,1H),4.66(s,2H),4.29(t,J＝6.2Hz,2H),4.10(d,J＝5.7Hz,7H),3.49(t,J＝6.1Hz,2H),3.35(d,J＝8.0Hz,4H),2.26(s,3H),2.02(p,J＝6.3Hz,4H),1.66(d,J＝14.0Hz,2H)。ESI-MS:m/z 562.3[M-2HCl+H]⁺。

实施例149

(4-(6-((1-(2-氟-4-(1,2,4-噁二唑-5-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-7-氧-6,7-二氢-2H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-3-基)苄基)氨基甲酸叔丁酯(I-257)

(4-(6-((1-(2-氟-4-(1,2,4-噁二唑-5-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-7-氧-6,7-二氢-2H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-3-基)苄基)氨基甲酸叔丁酯(I-258)

3-(4-(氨基甲基(苯基)-6-(((1-(2-氟-4-(1,2,4-噁二唑-5-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-二盐酸盐(I-261)

3-(4-(氨基甲基(苯基)-6-(((1-(2-氯-4-(1,2,4-噁二唑-5-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-二盐酸盐(I-262)

称取3-氟-4-甲基-苯甲酸(1g,6.49mmol)置于无水二氯甲烷(5mL)中，逐滴加入草酰氯(1.65g,13mmol)和2滴N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，室温反应0.5h，经TLC监测反应完毕，减压蒸除有机溶剂，残余物经无水二氯甲烷(6mL)溶解后，0℃下将此混合液逐滴加入浓氨水(20mL)中，反应液自然升温至室温反应2h，经TLC监测反应完毕，加水(40mL)稀释，以乙酸乙酯(20mL×3)萃取。有机相合并后用饱和氯化钠水溶液(40mL)洗涤，无水硫酸钠干燥。减压蒸除溶剂，残余物经硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝10:1)，得化合物C29的黄色固体(900mg,86％)。

将化合物C29(900mg,5.9mmol)、N,N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛(DMF-DMA)(1.2mL,8.8mmol)置于甲苯(8mL)中，90℃反应4h，经TLC监测反应完毕，减压蒸除有机溶剂，残余物硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝10:1)，得化合物C31的白色固体(614mg,52％)。

将盐酸羟胺(NH₂OH·HCl)(122mg,1.73mmol)置于5N的氢氧化钠溶液(1mL)中，室温下搅拌0.5h，向混合溶液中加入70％的乙酸(5mL)和C31(300mg,1.44mmol)，室温反应0.5h，TLC监测反应完毕，向反应液中加入水(50mL)，室温搅拌0.5h，抽滤漏斗抽滤，滤饼用水洗涤，真空干燥滤饼得化合物C33的白色固体(202mg,产率62％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ10.76(d,J＝2.8Hz,1H),10.16(d,J＝8.1Hz,1H),7.81-7.59(m,2H),7.41(t,J＝7.9Hz,1H),2.30(d,J＝2.1Hz,3H)。

取C33(202mg,1mmol)置于醋酸(4mL)和二氧六环(4mL)的混合溶液中，90℃反应4h，经TLC监测反应完毕，减压蒸除有机溶剂，残余物经硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝20:1)，得到C35的白色固体(93mg,产率50％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ9.13(s,1H),7.97-7.77(m,2H),7.58(t,J＝7.8Hz,1H),2.35(d,J＝2.1Hz,3H)。

参照实施例63中化合物B20的合成方法，用化合物C35制得化合物C37的白色固体(110mg,产率70％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ9.19(d,J＝1.5Hz,1H),8.11-7.93(m,4H),7.83(t,J＝7.7Hz,2H),4.80(s,4H)。

参照实施例76，将其中的中间体E2替换成化合物C37，制得化合物I-257的白色固体(100mg，产率74％)。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ8.51(s,1H),7.94(d,J＝7.9Hz,1H),7.89-7.79(m,2H),7.63(t,J＝7.6Hz,1H),7.57(d,J＝7.9Hz,2H),7.49(d,J＝7.8Hz,2H),4.98(s,1H),4.41(d,J＝6.2Hz,2H),4.14(d,J＝7.5Hz,5H),3.69(s,2H),2.73(d,J＝11.3Hz,2H),2.49(t,J＝11.4Hz,2H),1.75(d,J＝19.6Hz,4H),1.49(s,9H).ESI-MS:m/z 645.3[M+H]⁺。

参照实施例76，将化合物I-257脱Boc，制得化合物I-261的白色固体。ESI-MS:m/z545.2[M-2HCl+H]⁺。

参考化合物C29的合成方法制得化合物C30的淡黄色固体(987mg,99％)。

参考化合物C31的合成方法制得化合物C32的白色固体(446mg,67％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.62(s,1H),8.10(s,1H),7.99(dt,J＝7.9,1.4Hz,1H),7.44(d,J＝7.9Hz,1H),3.21(s,3H),3.15(s,3H),2.39(s,3H)。

参考化合物C33的合成方法制得化合物C34的白色固体。

参考化合物C35的合成方法制得化合物C36的白色固体(117mg,56％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ9.13(s,1H),8.10(d,J＝1.8Hz,1H),7.99(dd,J＝8.0,1.7Hz,1H),7.63(d,J＝8.0Hz,1H),2.44(s,3H)。

参考化合物C37的合成方法制得化合物C38的白色固体。

参照实施例76，将其中的中间体E2替换成化合物C38，制得化合物I-258的白色固体。ESI-MS:m/z 661.1[M+H]⁺。

参照实施例76，将化合物I-258脱Boc，制得化合物I-262的白色固体。ESI-MS:m/z561.3[M-2HCl+H]⁺。

实施例150

(4-(6-(1-(2-氟-4-(2-氧吡咯烷-1-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-7-氧-6,7-二氢-2H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-3-基)苄基)氨基甲酸叔丁酯(I-259)

(4-(6-(1-(2-氯-4-(2-氧吡咯烷-1-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-7-氧-6,7-二氢-2H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-3-基)苄基)氨基甲酸叔丁酯(I-260)

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-(2-氟-4-(2-氧吡咯烷-1-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-二盐酸盐(I-263)

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-(2-氯-4-(2-氧吡咯烷-1-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-二盐酸盐(I-264)

称取4-氨基-2-氯苯甲酸甲酯(4.2g,22.7mmol)置于无水四氢呋喃(100mL)，0℃下分批加入四氢锂铝(LiAlH₄)(1g,25mmol)，自然冷却至室温反应0.5h，经TLC监测反应完毕，向反应液中加入适量乙醚、水和1N氢氧化钠溶液，混合液经硅藻土抽滤，减压将滤液中有机溶剂除去，得到化合物C40的黄色固体(3.387g,产率95％)。

将化合物C40(3.2g,20mmol)、叔丁基二苯基氯硅烷(TBDPSCl)(6.7mL,25.8mmol)、咪唑(1.8g,25.8mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(10mL)中，室温下反应6h，经TLC监测反应完毕，向反应体系加水(100mL)稀释，用乙酸乙酯(30ml×3)萃取。有机相合并，分别用水(100mL×3)洗涤、饱和氯化钠水溶液(50mL×3)洗涤，无水硫酸钠干燥。减压蒸除溶剂，残留物经硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝20:1)纯化，得化合物C42的黄色油状液体(8g,产率73％)。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ7.81-7.60(m,4H),7.50-7.31(m,7H),6.71-6.55(m,2H),4.75(s,2H),3.67(s,2H),1.10(s,9H)。

取化合物C42(379mg,1mmol)、三乙胺(211mg,1.5mmol)置于无水四氢呋喃(6mL)中，0℃下逐滴加入4-氯丁酰氯(211mg,2mmol)，自然升温至室温反应6h，经TLC监测反应完毕，向反应体系加水(20mL)稀释，用乙酸乙酯(8mL×3)萃取。有机相合并，饱和氯化钠水溶液(20mL×3)洗涤，无水硫酸钠干燥。减压蒸除溶剂，残余物用二甲基亚砜(DMSO)溶解，向混合液中加入碳酸钾(276mg,2mmol)，80℃加热反应4h，经TLC监测反应完毕，向反应体系加水(100ml)稀释，用乙酸乙酯(20ml×3)萃取。有机相合并，饱和氯化钠水溶液(50mL×3)洗涤，无水硫酸钠干燥。减压蒸除有机溶剂，残余物经硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝10:1)纯化，得化合物C44的黄色油状液体(218mg,产率49％)。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ7.72(qd,J＝6.0,5.6,3.5Hz,6H),7.59(dd,J＝8.5,2.2Hz,1H),7.50-7.33(m,6H),4.84(s,2H),3.84(t,J＝7.0Hz,2H),2.62(t,J＝8.1Hz,2H),2.27-2.08(m,2H),1.14(s,9H).

取化合物C44(223mg,0.48mmol)溶于无水四氢呋喃(6mL)中，0℃下滴加1mol/L的四丁基氟化铵(TBAF)的四氢呋喃溶液(720μL)，自然升至室温反应6h，TLC监测反应完毕，减压蒸除有机溶剂，残余物用乙酸乙酯(6mL)溶解，分别用水(20mL×3)洗涤、饱和氯化钠水溶液(20mL×3)洗涤，无水硫酸钠干燥。减压蒸除溶剂，残余物经硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝5:1)纯化，得化合物C46的白色固体(80mg,产率78％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ7.85(d,J＝1.9Hz,1H),7.60-7.46(m,2H),5.34(t,J＝5.6Hz,1H),4.52(d,J＝5.6Hz,2H),3.82(t,J＝7.0Hz,2H),2.05(p,J＝7.6Hz,2H).

取化合物C46(80mg,0.35mmol)溶于无水二氯甲烷(5mL)中，0℃下逐滴加入三溴化磷(34μL,0.35mmol)，自然升温至室温反应0.5h，经TLC监测反应完毕，向反应液中加入饱和碳酸氢钠溶液至pH＝7～8，用乙酸乙酯(20ml×3)萃取。有机相合并，饱和氯化钠水溶液(15mL×3)洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸除有机溶剂，得到化合物C48的黄色固体，不经纯化直接投下一步。

参照实施例76，将其中的中间体E2替换成化合物C48，制得化合物I-260的白色固体。ESI-MS:m/z 676.3[M+H]⁺。

参照实施例76，将化合物I-260脱Boc，制得化合物I-264的白色固体。ESI-MS:m/z576.3[M-2HCl+H]⁺。

参照实施例76，将其中的中间体E2替换成化合物C47，制得化合物I-259的白色固体。ESI-MS:m/z 660.3[M+H]⁺。

参照实施例76，将化合物I-259脱Boc，制得化合物I-263的白色固体。ESI-MS:m/z560.3[M-2HCl+H]⁺。

实施例151

(4-(6-((1-(2-氟-4-(5-(三氟甲基)-1,2,4-噁二唑-3-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-7-氧-6,7-二氢-2H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-3-基)苄基)氨基甲酸叔丁酯(Ⅰ-265)

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-(2-氟-4-(5-(三氟甲基)-1,2,4-噁二唑-3-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-(基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(I-267)

称取化合物E74(370mg，2mmol)溶于3mL的吡啶中，搅拌下缓慢滴加三氟乙酸酐(338.3μL，2.42mmol)，75℃加热5h，TLC监测反应完毕，向体系中加入水(100mL)，充分搅拌析出固体，抽滤，滤饼充分水洗后60℃烘干得E77的淡黄色固体(340.8mg，产率64.8％)。

参照实施例63中化合物B20的合成方法，用化合物E77制得化合物E78的白色固体，产率69％。

参照实施例77，将其中的中间体E2替换成中间体E78，制得化合物Ⅰ-265和Ⅰ-267。

化合物Ⅰ-265:白色固体，产率78.2％。ESI-MS:m/z 713.3[M+H]⁺。

化合物Ⅰ-267:白色固体，产率85.2％。ESI-MS:m/z 613.2[M-2HCl+H]⁺。

实施例152

(4-(6-((1-(2-氯-4-(5-(三氟甲基)-1,2,4-噁二唑-3-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-7-氧-6,7-二氢-2H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-3-基)苄基)氨基甲酸叔丁酯(I-266)

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-(2-氟-4-(5-(三氟甲基)-1,2,4-噁二唑-3-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-(基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(I-268)

参照实施例151，将其中的中间体E74替换成3-氯-N'-羟基-4-甲基苯甲脒，制得化合物Ⅰ-266和I-268。

化合物I-266:白色固体，产率73.4％。ESI-MS:m/z 729.3[M+H]⁺。

化合物I-268:白色固体，产率80.7％。ESI-MS:m/z 629.2[M-2HCl+H]⁺。

实施例153

3-(4-(氨基甲基)苯基)-6-((1-(2-氟-4-(1H-四唑-5-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮二盐酸盐(I-269)

冰水浴下，向4-氰基-2-氟苯甲醛(2g,0.013mol)的无水乙醇(25mL)溶液中分批加入硼氢化钠(1.014g，0.026mol)，加毕室温反应。TLC监测反应完成后，减压蒸除溶剂，残留物用水(50mL)稀释，乙酸乙酯(25mL×3)萃取，合并有机相后用饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂后得到化合物E79的淡黄色固体(1.85g，产率91％)。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ7.66(s,1H),7.55–7.45(m,1H),7.35(dd,J＝9.4,1.5Hz,1H),4.85(s,2H),2.28(s,1H)。

将叠氮化钠(0.956g，0.015mol)和氯化铵(0.787g，0.015mol)加入到20mL N,N-二甲基甲酰胺(20mL)中，室温搅拌15min后加入化合物E79(1.85g，0.012mol)，升温至110℃反应。TLC监测反应完成后，将反应液冷却至室温，然后缓慢倒入冰水中，用1N盐酸调pH到3-4，然后用乙酸乙酯萃取，合并有机相，用饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂后得化合物E80的白色固体(1.97g，产率83％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ7.89(dd,J＝7.9,1.6Hz,1H),7.82–7.65(m,2H),5.47(s,1H),4.63(s,2H)。

将化合物E80(0.6g，0.003mol)溶于二氯甲烷(5mL)和N,N-二甲基甲酰胺(1mL)的混合溶剂中，冰水浴下缓慢滴加氯化亚砜(0.476g，0.004mol)，加毕后室温反应。TLC监测反应完成后，将反应液倒入冰水中，用二氯甲烷萃取，合并有机相，用饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂后得化合物E81的淡黄色固体(0.62g，产率94％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ7.84(dt,J＝7.9,1.8Hz,1H),7.80–7.71(m,1H),7.63–7.54(m,1H),4.82(s,2H),1.92(d,J＝1.8Hz,1H)。

参照实施例77，将其中的中间体E3替换成中间体E81，制得化合物E82的油状物。¹HNMR(300MHz,DMSO-d₆)δ7.99(s,1H),7.76(d,J＝7.7Hz,1H),7.67(d,J＝8.1Hz,3H),7.43(d,J＝8.2Hz,3H),4.64(s,1H),4.22(d,J＝6.2Hz,2H),4.10(s,3H),3.98(s,2H),3.54(s,2H),2.92(m,4H),2.38(m,2H),1.58(m,2H),1.42(s,9H)。

参照实施例77，将化合物E82脱Boc，制得化合物I-269的白色固体。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ9.97(s,1H),8.50(s,3H),8.06(s,1H),8.02–7.82(m,3H),7.78(d,J＝7.9Hz,2H),7.70(d,J＝8.1Hz,2H),5.30(s,1H),4.33(s,2H),4.12(m,7H),3.07(m,4H),1.97(m,2H),1.64(m,2H)。

实施例154

N-(4-(6-((1-(2-氯-4-(1,2,4-噁二唑-3-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-7-氧-6,7-二氢-2H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-3-基)苄基)甲酰胺(I-270)

将化合物I-74(63.4mg，0.1mmol)、三乙胺(27.8μL，0.2mmol)、甲酸乙酯(5mL)加入反应瓶中，70℃回流反应6h，TLC监测反应完毕，减压蒸除溶剂，残余物加入硅胶经硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇＝40：1)纯化得I-174的白色固体(20.6mg，产率35％)。ESI-MS:m/z589.20[M+H]⁺。

参照化合物I-270的合成方法，分别利用化合物I-193、I-237、I-238、I-185、I-186、I-200、I-201、I-223～I-228替换化合物I-74，制得对应的化合物I-271～I-285。

实施例155

N-(4-(6-((1-(2-氯-4-(1,2,4-噁二唑-3-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基7-氧-6,7-二氢-2H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-3-基)苄基)乙酰胺(I-286)

将化合物I-74(63.4mg，0.1mmol)和三乙胺(41.7μL，0.3mmol)溶于二氯甲烷(3mL)，室温搅拌0.5h，冰水浴条件下向上述反应液中缓慢加入乙酰氯(7.1μL，0.1mmol)，保持0℃搅拌反应0.5h，TLC监测反应完毕，减压蒸除溶剂，残余物加入硅胶，经硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇＝40：1)纯化得I-286的白色固体(19.3mg，产率32％)。ESI-MS:m/z 603.2[M+H]⁺。

参照化合物I-286的合成方法，分别利用化合物I-193、I-237、I-238、I-185、I-186、I-200、I-201、I-223～I-228替换化合物I-74，制得对应的化合物I-287～I-301。

实施例156

6-((1-(2-氯-4-(1,2,4-噁二唑-3-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-2-甲基-3-(4-((甲基氨基)甲基)苯基)-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮(I-302)

将化合物I-74(30mg,0.047mmol)和碳酸钾(26mg,0.19mmol)置于丙酮(4mL)中，室温搅拌0.5h，逐滴向混合液中加入碘甲烷(8mg,0.057mmol)，室温搅拌4h。TLC监测反应完毕，减压除去溶剂，残余物经硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇＝20:1)纯化，得到I-302的白色固体(26mg,产率64％)。ESI-MS:m/z575.3[M+H]⁺。

参照化合物I-302的合成方法，分别用化合物I-193、I-238、I-237、I-186、I-185、I-188、I-187、I-201、I-200、I-224、I-223、I-226、I-225、I-228、I-227替换化合物I-74，制得对应的化合物I-303～I-317。

实施例157

5-((1-(2-氯-4-(1,2,4-噁二唑-3-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-1-(4-氟苯基)-1,5-二氢-4H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮(I-318)

取化合物A5粗品(88mg,0.2mmol)溶于无水N,N-二甲基甲酰胺(2.5mL)，依次加入无水碳酸钾(102mg,0.74mmol)和B37(81mg,0.3mmol)，室温搅拌3h。经TLC监测反应完毕后，向反应液中加入水(30mL)，用乙酸乙酯(15mL 3)萃取。合并有机相，有机相用水(30mL×3)和饱和氯化钠水溶液(30mL×3)洗涤，无水硫酸钠干燥。减压蒸除溶剂，残余物经硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇＝10:1)纯化，得化合物I-318的棕色固体(27mg,产率32％)。ESI-MS:m/z536.2[M+H]⁺。

参照化合物I-318的合成方法，分别用化合物B39、C20、C19、C4、C5替代B37，与化合物A5反应制得化合物I-319、I-322、I-323、I-324、I-325。

实施例158

5-((1-(2-氯-4-(呋喃-2-基)苄基)-4-羟基哌啶-4-基)甲基)-1-(4-氟苯基)-1,5-二氢-4H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮(I-320)

将化合物A5(88mg，0.2mmol)、N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)(52mg,0.4mmol)溶于无水二氯甲烷(6mL)，室温下搅拌0.5h后，将化合物E51(160mg,0.34mmol)加入上述反应液中，0℃下分批缓慢加入三乙酰氧基硼氢化钠(180mg，0.85mmol)，自然升至室温搅拌过夜，TLC监测反应完毕后，减压蒸除溶剂，经硅胶柱层析纯化(二氯甲烷/甲醇＝20:1)得化合物I-320(白色固体，产率58％)。ESI-MS:m/z 534.2[M+H]⁺。

参照化合物I-320的合成方法，将其中的化合物E51分别替换成化合物E50、E41、E40、E27、E26、E29、E28、E31、E30，制得对应的化合物I-321、I-326、I-327、I-328、I-329、I-330、I-331、I-332、I-333。

实施例159

化合物对USP7酶的体外抑制活性

1.准备工作

配制缓冲液A：用去离子水配制含50mM HEPES、0.5mM EDTA、100mM NaCl、1mMTCEP、0.1mg/mL BSA的缓冲液，并用氢氧化钠溶液调pH至8。

配制缓冲液B：用去离子水配制含50mM HEPES、100mM NaCl、1mM TCEP的缓冲液，并用氢氧化钠溶液调pH至7.5。

配制待测溶液：称取待测化合物适量，用DMSO溶解，并依次稀释2倍，得9个浓度(最高浓度2.5mM)的待测化合物溶液。称取阳性化合物适量，用DMSO溶解，并依次稀释3倍，得9个浓度(最高浓度250μM)的阳性化合物溶液。上述化合物溶液及DMSO(空白对照)均用缓冲液A稀释62.5倍，得待测溶液。

配制USP7蛋白溶液：将商业购买的USP7溶液(10μM,Recombinant Human His6USP7,Boston Biochem,Lot No:01739317A)用缓冲液B稀释到10nM，再用缓冲液A稀释50倍，得到用于测试的USP7蛋白溶液。

配制Ub-Rho溶液：将商业获得的Ub-Rho溶液(250μM，Boston Biochem,Lot No:14933718)用缓冲液A稀释313倍，得到用于测试的Ub-Rho溶液。

2.加样与孵育

向384孔板(Thermo Scientific,Lot No:1207363)的实验孔中加入USP7蛋白溶液(10μL)和待测化合物不同浓度的溶液(5μL)，每个浓度6复孔，所得混合液室温暗处孵育30分钟。再向每个浓度的3个复孔中加入Ub-Rho溶液(5μL)，而另3个复孔中加入缓冲液A(5μL)。加毕，384孔板于37℃暗处孵育2h。阳性对照采用文献(Nat Chem Biol,2018,14(2):118)报道的USP7抑制剂Compound 4(CP4)。

3.读数与计算

用多功能读板仪，在激发波长485nm和发射波长535nm下读取荧光数据。

抑制率％＝[(F_{空白(Ub-Rho)-}F_{空白(缓冲液A)})-(F_{化合物(Ub-Rho)}-F_{化合物(缓冲液A)})]/(F_{空白(Ub-Rho)-}F_{空白(缓冲液A)})×100％。

IC₅₀数值用GraphPad Prism软件计算求得。

4.实验结果

部分化合物对USP7的抑制活性如下表2和表3所示。在表2中，A、B和C分别表示IC₅₀<1μM、1～10μM和>10μM。

表2化合物对USP7酶活性的抑制作用

表3化合物对USP7酶活性的抑制作用

^a化合物浓度为1μM时的抑制率；^b为文献(Nat Chem Biol,2018,14(2):118)报道的USP7抑制剂Compound 4(CP4)(化学结构如图5所示)；ND:not determined。

实验结果表明，本发明的哌啶类化合物对USP7酶活性表现出显著的抑制作用，如化合物I-74(IC₅₀＝10.6nM)、I-185(IC₅₀＝27.3nM)、I-186(IC₅₀＝14.6nM)、I-188(IC₅₀＝20.1nM)、I-200(IC₅₀＝30.4nM)、I-220(IC₅₀＝16.5nM)、I-226(IC₅₀＝45.0nM)、I-227(IC₅₀＝22.4nM)、I-228(IC₅₀＝54.1nM)、I-237(IC₅₀＝51.3nM)和I-238(IC₅₀＝3.8nM)等的IC₅₀值达到了与阳性对照药CP4(IC₅₀＝19.7nM)相当甚至更优的水平，本发明其他化合物效果类似。

实施例160

化合物对多种去泛素化酶的抑制活性评价

本发明的化合物对USP7具有较好的抑制作用，为了测试该类化合物对USP7的选择性，以Ub-Rho为底物测试了化合物I-74在20μM浓度下，作用时间为2h时，对其他多种去泛素化酶(包括UCH-L1、UCH-L5、USP2、USP25、USP28、USP11)的抑制率，测试结果以各去泛素化酶的活力呈现。结果显示，化合物I-74为20μM时，对USP7之外的多种去泛素化酶的活性几乎没有抑制作用(抑制率小于5％)，尤其是对与USP7同源性最高的去泛素化酶USP47也几乎没有抑制作用(抑制率小于5％)，表明化合物I-74对USP7抑制具有较高的选择性。本发明其他化合物也显示了较高的USP7选择性。

实施例161

USP7催化域蛋白与抑制剂I-74复合物共晶的培养、衍射及结构解析

参照文献(Eur.J.Med.Chem.2020,199,112279)方法制备USP7催化域蛋白。将纯化好的USP7催化域蛋白寄送至清华大学结构生物学高精尖创新中心X-射线晶体学平台，委托其进行USP7催化域蛋白与化合物I-74复合物共晶的培养及结构解析。结果显示，蛋白浓度为9mg/ml，蛋白：化合物I-74＝1:1.2，结晶缓冲液为200mM碘化铵，20％w/v聚乙二醇3350时，晶体在培养两天之后出现，形态较好。将晶体捞出，液氮速冻后，带至上海同步辐射光源进行X-射线衍射，收集数据。通过分子置换解析出I-74与USP7催化域蛋白的共晶结构(如图1所示)。

晶体结构解析结果表明，化合物Ⅰ-74除与USP7催化域的Gln351、Gln297、Asp295、Val296、Arg408和Phe409形成氢键作用外，还与His461形成重要氢键作用，并与Phe409、His456及His461具有π-π相互作用，且Ⅰ-74的哌啶环“直立”于结合口袋中。该结合方式与文献(Nat Chem Biol,2018,14(2):118)报道的哌啶类USP7抑制剂的结合方式有很大的不同，例如，文献报道的Compound5(化学结构如图5所示)与USP7催化域的Gln351、Gln297、Asp295、Val296、Arg408和Phe409形成氢键作用，但与His461没有氢键作用，且Compound 5的哌啶环“平伏”于结合口袋中(PDB ID 5N9T)。这表明本发明的哌啶类化合物以全新的方式结合在USP7催化域上。本发明其他化合物也具有类似的结合方式。

实施例162

化合物对人肝微粒体代谢稳定性研究

人肝微粒体代谢稳定性评价是药物研发中临床前评价候选化合物药代动力学性质的重要手段。该部分实验由美迪西普亚医药科技有限公司完成。

实验温孵体系(体积为250μL，n＝3)由肝微粒体、受试物工作溶液和磷酸盐缓冲液组成，将温孵体系于37℃共孵育一个小时，加入NADPH溶液后计时开始，每个时间点以加入终止液终止反应，取样间点为0，5，15，30，60min，共5个点。阴性对照不加NADPH，取样时间点为0、60min。用LC-MS/MS进行分析，通过受试物剩余量的百分率的自然对数与时间作图测得斜率的绝对值k，按以下公式进行计算：T_1/2(半衰期)＝ln2/k＝0.693/k，Clint＝(0.693/T1/2)×(1/微粒体蛋白浓度)×换算系数，微粒体蛋白浓度为0.5mg/mL，换算系数1254.2)。实验结果如表4所示。

表4部分化合物在人肝微粒体中代谢稳定性研究

^aCompound 4为文献(Nat Chem Biol,2018,14(2):118)报道的USP7抑制剂。

^bL55为文献(Eur.J.Med.Chem.2020,199,112279)报道的USP7抑制剂。

实验结果(表4)表明，本发明化合物I-74、I-197、I-219、I-220、I-238等的人肝微粒体代谢稳定性与文献报道的哌啶类USP7抑制剂Compound 4(Nat Chem Biol,2018,14(2):118)和L55(Eur.J.Med.Chem.2020,199,112279)相比均有极显著的提高，表现为半衰期(T_1/2)显著延长，清除率(Clint)显著降低。本发明的其他化合物也具有较好的体外代谢稳定性。这表明本发明的哌啶类化合物具备更好的代谢稳定性，这可降低药物的肝脏首过效应，显示出本发明化合物具备更为良好的药代动力学性质和成药性。

实施例163

化合物在Balb/C小鼠体内的药代动力学研究

该部分实验由美迪西普亚医药科技有限公司完成。

1.实验仪器

超高效液相色谱系统(Waters公司，ACQUITY UPLC)，包括二元溶剂管理器(ACQUITY UPLC Binary Solvent Manager)、样品管理器(ACQUITY UPLC SampleManager)、高通量样品组织管理器(ACQUTIY UPLC Sample Organizer)、高温柱温箱(ACQUITY UPLC Column Heater HT)。质谱仪(TQ6500+，美国应用生物系统公司)，电喷雾离子源(ESI)，串联四极杆质量分析器。微量分析天平(XP26，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；涡旋振荡器(SI-A256，Scientific Industries，Inc.；MULTI-TUBE VORTEXER，Fisher Scientific)；小型台式高速冷冻离心机(5417R，Eppendorf)；超纯水机(Millipore)；移液器(Eppendorf)。数据处理系统为Analyst软件(美国应用生物系统公司，软件版本号1.6.3)。

2.实验试剂

甲醇(Burdick&Jackson，HPLC)，乙腈(Burdick&Jackson，HPLC)，甲酸(J&K)，水为超纯水。

3.溶媒

溶媒：5％ DMSO+10％solutol+85％saline。

实验动物

种属：Balb/C雄性小鼠，SPF级。

来源：动物转移自实验机构动物储备库(999M-018)。

4.动物给药

Balb/C小鼠，按表5进行实验分组。

表5 IV和PO给药动物分组

注：^*在口服给药前，所有动物禁食过夜(10-14小时)，给药4小时后给食。

5.样品采集与处理

经眼眶采血，每个样品采集约0.03mL，肝素钠抗凝，采集后放置冰上

血液样本采集后置于冰上，并于1小时之内离心分离血浆(离心条件：6800g，6分钟，2-8℃)。血浆样本在分析前存放时则放于-80℃冰箱内，血浆样品由实验机构分析部门采用LC-MS/MS进行分析。

采血时间点如下：

口服组：给药后0.25h,0.5h,1h,2h,4h,6h,8h,24h。

静脉组：给药后0.083h,0.25h,0.5h,1h,2h,4h,8h,24h。

6.LC-MS/MS条件

(1)液相条件

A：0.1％甲酸水溶液，B：0.1％甲酸乙腈溶液；柱温：40℃；自动进样器温度：4℃；流速：600μl/min；进样量：5μl。

色谱柱:ACQUITY UPLC BEH C18 1.7μm(50mm×2.10mm)

(2)质谱条件

扫描模式：负离子多反应检测模式；离子源：电喷雾离子源；雾化模式：电喷雾；Q1分辨率：Unit；Q3分辨率：Unit；雾化气(Gas1)：50psi；辅助加热器(Gas2)：50psi；气帘气(CUR)：40psi；碰撞气(CAD)：10；离子源电压(IS)：-4500v；离子源温度(TEM)：500℃。

7.标准曲线和质控样品的配制

400,000ng/mL的工作溶液的制备：取一定量的浓度为823,000ng/mL的化合物I-74储备液，用甲醇稀释成浓度为400,000ng/mL的工作溶液。

标准曲线和质控样品的制备：取一定量的400000ng/mL工作溶液，按照1：39的比例，加入到一定量的空白血浆中，制得浓度为10000ng/mL的血浆样品。取10000ng/mL的血浆样品，用空白血浆依次稀释到5000、1000、500、100、50、10、5ng/mL的标准曲线样品和1000、4000、800、15ng/mL的质控样品。

内标工作液的制备：吸取一定量的浓度为1018,000ng/mL的甲苯磺丁脲内标储备液至一定体积的容量瓶中，用甲醇定容至刻度后混匀，制得浓度为200ng/mL的内标工作液。

8.样品前处理

取50μl血浆样品至1.5ml离心管中，加入250μl内标溶液(空白不加内标补加相同体积的甲醇)，涡旋混匀，14000转/min离心5min，取200μl上清液加入到96孔进样板中，LC-MS/MS进样分析。

9.药物代谢动力学分析

根据药物各组各时间点的平均血药浓度数据，使用药代动力学计算软件Phoenix

7.0非房室模型分别计算供试品的药代动力学参数AUC_0-t、AUC_0-∞、MRT_0-∞、C_max、T_max和T_1/2等参数。此外，生物利用度(F)将通过下面的公式进行计算。

对于浓度低于定量下限的样品，在进行药代动力学参数计算时，在达到C_max以前取样的样品以零值计算，在达到C_max以后取样点样品以无法定量(标注为“BLQ”)计算。

(注：该部分实验由美迪西普亚医药科技有限公司完成)

10.实验结果

如表6所示。小鼠药代动力学数据显示：化合物I-74可口服吸收(小鼠口服生物利用度为10.91％)。本发明的其他化合物也都可口服吸收。这表明本发明的哌啶类化合物具有较好的成药性。

表6本发明化合物I-74在Balb/C小鼠体内的药代动力学参数

实施例164

化合物的体内抗肿瘤活性测试

1.实验仪器

BD Accuri C6流式细胞仪(BD Accuri C6，BD公司)；CytoFLEX多色流式细胞仪(CytoFLEX S，贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司)；电热恒温水槽(DK-8，上海森信实验仪器有限公司)；微量分析天平(XP26，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；涡旋振荡器((SI-A256，Scientific Industries，Inc.；MULTI-TUBE VORTEXER，Fisher Scientific)；CO₂/O₂三气恒温培养箱(3131，Thermo Fisher)；台式低速离心机(TDZ4-WS，cence湘仪离心机仪器有限公司)；台式高速离心机(Micro CL17，Thermo Fisher)；小型台式高速冷冻离心机(5417R，Eppendorf)；超纯水机(Millipore)；移液器(Eppendorf)；Leica全自动脱水机(Leica ASP-300S；Leica Biosystems Division of Leica Microsystems Inc.)；冷冻切片机(Leica CM3050S，Leica Biosystems Division of Leica Microsystems Inc.)

2.实验动物及试剂

C57BL/6小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，8周龄，体重18～22g，雌50只，SPF级；MC38结肠癌细胞(由南京大学模式动物研究所馈赠)，自第3代以后，处于对数生长期；I型胶原酶，索莱宝有限公司；透明质酸酶，索莱宝有限公司；DNA酶I，索莱宝有限公司；小鼠红细胞裂解额液(ACK)，碧云天生物技术有限公司；70μm细胞过滤网，Biosharp公司；40μm细胞过滤网，Biosharp公司；胎牛血清，Biological Industries(BI)；0.25％胰酶(含EDTA)，Biological Industries(BI)；RPMI 1640培养基，Biological Industries(BI)；青链霉素双抗(100×)，Biological Industries(BI)；磷酸盐缓冲液(PBS)，BiologicalIndustries(BI)；F4/80Monoclonal Antibody(BM8)，APC，eBioscience公司；FcR BlockingReagent(mouse)，Miltenyi公司；BD OptiBuild^TM BB700 Rat Anti-Mouse CD86，BD公司；APC anti-mouse CD45 Antibody，Biolegend公司；PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD4Antibody，Biolegend公司；CD11b Monoclonal Antibody(M1/70)，PE，eBioscience公司；APC anti-mouse CD4，Biolegend公司；PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD25，Biolegend公司；FOXP3 Monoclonal Antibody(FJK-16s)，PE，eBioscience公司；Hanks'Balanced SaltSolution(HBSS)，碧云天生物技术有限公司；FITC anti-mouse CD45，Biolegend公司；FITCanti-mouse CD3，Biolegend公司；PE anti-mouse CD8a，Biolegend公司；CD3e MonoclonalAntibody(145-2C11)，PE，eBioscience，公司；PerCP/Cyanine5.5anti-mouse CD8a，Biolegend公司；BD Cytofix/Cytoperm Plus BD Cytofix/Cytoperm Plus Kit(with BDGolgiPlug)，BD公司。

3.试剂配置

(1)RPMI 1640完全培养基：10％FBS，89％基础培养基1640，1％双抗(100×)，即制得完全培养基。

(2)肿瘤组织消化液：I型胶原酶0.5mg/mL，透明质酸酶0.2mg/mL，DNA酶Ⅰ0.02mg/mL，溶解于RPMI 1640完全培养基，充分混匀。

(3)2％HBSS：临用前加入2％FBS，作为流式细胞分析缓冲液。

4.MC38细胞培养与传代

(1)MC38细胞培养：MC38细胞株用RPMI 1640完全培养基培养，在37.0℃恒温、恒湿、5％CO₂的培养箱中培养，2-3d换液一次，细胞长满培养皿90％以上进行传代，采用对数生长期的MC38细胞进行实验。

(2)MC38细胞传代：细胞长满培养皿90％以上时，弃尽培养皿中所有培养基，PBS清洗1～2次，当PBS弃去后，加入1-3mL 0.25％含酚红、含EDTA的胰蛋白酶消化液，在倒置显微镜下观察，当大部分细胞都变圆之后，加入完全培养基或含药培养基停止消化，再将细胞全部从培养皿中吹打起来，1000rpm离心5min，弃去上清液，加入新的培养基，平均分至2-3个新的培养皿中，即完成细胞传代过程。

5.小鼠MC38结直肠癌细胞皮下移植瘤模型的建立

实验前喂养C57BL/6小鼠一周以适应环境，保持室温23～25℃，保持昼夜节律。

肿瘤接种前，捉拿固定好小鼠后，用75％酒精棉片对C57BL/6小鼠的右侧皮下进行消毒，随后在C57BL/6小鼠右侧皮下注射1×10⁶个/100μL的MC38肿瘤细胞浓缩液，由100μLRPMI 1640基础培养基包裹，每只C57BL/6小鼠都按次方法接种肿瘤；注射时应缓慢，小鼠皮下皮肤绷紧，确保肿瘤成圆球状凸起。

每天记录C57BL/6小鼠的体重。接种后，用电子游标卡尺开始测量肿瘤的长径和短径，计算肿瘤的体积。每2日测量一次，肿瘤体积的计算公式：V＝0.5a×b²，a和b分别表示肿瘤的长径和短径。

当肿瘤体积≥50mm³给药。将小鼠随机分组，空白对照组6只，溶媒对照组(0.5％CMC-Na)、化合物I-74(10mg/kg)组、化合物I-74(20mg/kg)组、化合物I-74(50mg/kg)组各8只，称重后给药，给药容量为0.1mL/10g；化合物I74使用0.5％羧甲基纤维素钠(CMC-Na)水溶液充分研磨成混悬液，每日给药1次，总计给药21次；给药后第22天处死动物，剥离皮下肿瘤。

相对肿瘤增殖率T/C(％)的计算公式：T/C＝T_RTV/C_RTV×100％(T_RTV：治疗组RTV；C_RTV：溶剂对照组RTV)。根据测量结果计算出相对肿瘤体积(RTV)，RTV＝Vt/Vo，其中Vo为实验开始时的肿瘤体积，Vt每一次测量时的肿瘤体积。

瘤重抑瘤率的计算公式：瘤重抑瘤率＝(溶媒对照组平均肿瘤质量-各受试药物处理组的肿瘤平均质量/溶媒对照组平均肿瘤质量)×100％

体积抑瘤率的计算公式：体积抑瘤率＝[1-(某组给药结束时平均瘤体积-该组开始给药时平均瘤体积)/(溶媒对照组治疗结束时平均瘤体积-溶媒对照组开始治疗时平均瘤体积)]×100％

6.流式细胞仪检测肿瘤组织浸润的淋巴细胞亚群

(1)肿瘤组织单细胞淋巴液的制备：在超净工作台内的无菌环境下小心剥离小鼠肿瘤组织，称量其重量以后置于平皿中用剪刀剪碎。将剪碎的肿瘤组织转移至离心管内，按照0.27g组织需用10mL肿瘤组织消化液的比例，37℃水浴60min，期间每隔15分钟用滴管吹打混匀1次，经细胞过滤筛过滤后得到肿瘤组织细胞悬液。将细胞悬液置于离心机内离心，；1970rpm、4℃离心5min，结束后弃去上清，留下细胞沉淀。随即加入3-5ml ACK溶液进行红细胞裂解，静置5min后立即加入同体积含血清的RPMI 1640完全培养基，充分混匀后将细胞悬液置于离心机内离心，1970rpm、4℃离心5min。结束后弃去上清，留下细胞沉淀，用适量2％HBSS缓冲液洗涤1遍，计算细胞数量。

(2)Fc受体阻断：直接向1×10⁷个肿瘤组织单细胞悬液中添加2μL正常小鼠或大鼠血清，或者直接向1×10⁷个肿瘤组织单细胞悬液中添加1-5μg抗小鼠CD16/CD32纯化的抗体，或者直接向1×10⁷个肿瘤组织单细胞悬液大鼠抗小鼠血清；在4℃下孵育30min；Fc受体阻断结束后，调整细胞密度为1×10⁶个/100μL。

(3)细胞表面分子染色：先对细胞表面CD45、CD4、CD25、CD3e、CD8a、F4/80、CD86、CD11b进行染色，染色结束后对细胞进行破膜，对胞内转录因子FOXP3进行染色，破膜后需保持细胞内外渗透压平衡。分别吸取1×10⁶个肿瘤组织细胞置于EP管中，用100μL 2％HBSS重悬。每管加入不同荧光标记的流式抗体，充分混匀，4℃避光孵育30min。加入1mL 2％HBSS重悬，1970rpm、4℃离心5min后弃上清。再用1mL 2％HBSS清洗1次。

(4)细胞内因子染色：每个EP管加入250μL Fixation/Permeabilization破膜液，4℃避光孵育20min；用BD Perm/Wash Buffer(1×)洗涤1遍，1970rpm、4℃离心5min，弃去上清后将细胞立即重悬于100μL BD Perm/Wash Buffer(1×)中，该步骤完成速度过慢则影响细胞活性及胞内因子染色。洗涤结束后向每个样品管加入荧光标记的Foxp3抗体，充分混匀，4℃避光孵育30min。用染色结束后，用BD Perm/Wash Buffer(1×)洗涤2遍，1970rpm、4℃离心5min后弃上清后将细胞重悬于100μL BD Perm/Wash Buffer(1×)中。

(5)流式细胞仪检测：染色结束后，24h内上机进行检测。空白管设活细胞门或单个核细胞门；单染管进行补偿调节和细胞收集阳性门设定；FMO对照管设阳性门；共染管为样品管。空白管为Total Events设定500，000～1，000，000；单染管收集活细胞或单个核细胞门内Events设定100，000～250，000；FMO管和共染样品管照管设CD45+门内Events为10，000。

7.实验结果

化合物I-74在小鼠MC38结肠癌细胞皮下植瘤模型中表现出明显的肿瘤生长抑制作用；其中，在每天给药10mg/kg时，其瘤重抑瘤率为46.16％，在每天给药20mg/kg时，其瘤重抑瘤率为58.06％，在每天给药50mg/kg时，其瘤重抑瘤率为48.58％。药效评价指标如表7所示，肿瘤体积变化如图2所示，肿瘤标本大小如图3所示，小鼠体重变化如图4所示。本发明的其他化合物也具有显著的体内抗肿瘤活性。

表7化合物I-74的体内抗肿瘤药效评价指标

化合物I-74在小鼠MC38结肠癌细胞皮下植瘤模型中，可影响肿瘤组织浸润的淋巴细胞比例。化合物I-74可降低调节性T细胞(Treg)的占比，升高CD8⁺T细胞/CD4⁺T细胞的比值，降低Treg/CD8⁺T细胞的比值，降低巨噬细胞

的占比，上调M1型巨噬细胞在

中的比例。以上结果表明化合物I-74在小鼠体内改善了肿瘤微环境中免疫抑制状态，激活杀伤性T细胞介导的抗肿瘤作用，最终抑制体内肿瘤的生长。化合物I-74的免疫学评价指标如表8所示。本发明的其他化合物也可改善肿瘤微环境中免疫抑制状态。

表8化合物I-74的免疫学评价指标

实施例165

化合物对hERG钾离子通道的影响

该部分实验由美迪西普亚医药科技有限公司完成。

1.利用阳性对照品特非那定(Terfenadine)验证方法的可行性

特非那定最终浓度为0.001、0.01、0.1、和1μM，细胞外液中DMSO最终浓度为0.3％。特非那定对hERG电流的抑制作用见表9。本次实验结果表明，阳性对照品Terfenadine对hERG电流抑制作用具有浓度依赖性，其IC₅₀值为0.052μM。这一结果与文献报道(Sci Rep,2013,3(7):2100)的结果相符合，这表明本次试验的结果是稳定可信的。

表9特非那定对hERG电流的抑制作用

2.测试化合物I-74对hERG钾离子通道的影响

化合物I-74的最终检测浓度为0.3、1、3、10和30μM，细胞外液中DMSO最终浓度为0.3％。化合物I-74对hERG电流的抑制作用见表10。

在本实验条件下，化合物I-74在30μM时对hERG电流的平均抑制率为7.55％(N＝2)，故其对hERG电流抑制作用的IC₅₀值大于30μM，表明该化合物的潜在心脏毒副作用很小。本发明的其他化合物作用效果类似。

表10化合物I-74对hERG电流的抑制作用

实施例166

片剂的制备

将化合物I-74(1g)与乳糖(23g)和微晶纤维素(5.7g)用混合机混合。用滚轴压紧机将所得混合物压制成型，值得薄片状压制物料。用锤式粉碎机将所述薄片状压制物料研磨成粉，使所得粉状物料通过20目筛过筛。将一份轻质二氧化硅(0.3g)和硬脂酸镁(0.3g)加入到已过筛的物料中，并混合。所得混合产物用制片机压片，制备片剂。

实施例167

明胶胶囊剂的制备

将化合物I-74(1g)与微晶纤维素(0.35g)和乳糖(0.15g)用水制粒，然后将该颗粒与铰链羧甲基纤维素钠(0.04g)和硬脂酸镁(0.01g)混合。所得混合产物填充明胶胶囊，制备明胶胶囊剂。

此外，可以根据药典2015版常规制剂法，将化合物I-1～I-333赋予不同的药物辅料制成胶囊剂、散剂、颗粒剂、丸剂、注射剂、糖浆剂、口服液、吸入剂、软膏剂、栓剂或贴剂等。