CN112604003A - 一种基于纳米银材料的抗肿瘤组合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于纳米银材料的抗肿瘤组合物及其应用，所述抗肿瘤组合物包括A药和B药，A药为减毒沙门氏菌，B药为唾液酸修饰的纳米银。本发明将A药和B药联合使用可用于制备治疗肿瘤的药物。本发明抗肿瘤组合物中的减毒沙门氏菌靶向定植于肿瘤部位，唾液酸修饰的纳米银靶向中性粒细胞，在沙门氏菌的招募作用下实现向肿瘤部位的高效靶向递送；到达肿瘤部位的纳米银通过直接杀伤肿瘤细胞、清除中性粒细胞增强沙门氏菌的疗效，并通过清除沙门氏菌提升细菌治疗的生物安全性。本发明抗肿瘤组合物可解决临床应用沙门氏菌的关键瓶颈问题，实现基于沙门氏菌的高效安全的肿瘤治疗。

Description

一种基于纳米银材料的抗肿瘤组合物及其应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种基于纳米银材料的抗肿瘤组合物及其应用。
背景技术
早在19世纪90年代，外科医生Coley利用灭活的链球菌和粘质沙雷氏菌治疗肿瘤，在临床上取得了显著的疗效，开创了肿瘤治疗的新方向和免疫治疗的先河。但由于机制不明确、感染风险高以及化疗和放疗的同期兴起，细菌疗法逐渐淡出了研究者们的视线。鉴于现有肿瘤疗法的诸多不足，并且随着近年来对免疫学认识的不断加深以及合成生物学技术的发展，基于细菌的肿瘤疗法重新焕发生机，激起了研究者们的广泛兴趣。
在诸多可用于治疗肿瘤的细菌中，沙门氏菌由于多种不可替代的优势而备受关注：(1)对肿瘤区域具有天然的靶向性，可选择性地定植于肿瘤低氧区，在肿瘤内的累积浓度可达到正常组织的千倍以上；(2)基因组已鉴定完成，可实现工程化改造，如减毒以提高安全性、荧光标记用于体内实时监测等；(3)治疗机理多样性，可通过与肿瘤细胞竞争营养、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制血管生成、激活免疫系统等多种机制发挥抗肿瘤效应，已在动物水平展现出显著的抗肿瘤效果。
鉴于上述优势，沙门氏菌得以快速走向临床。然而，在临床试验中并未发现沙门氏菌在肿瘤部位的显著定植和明显的肿瘤消退，患者并未受益。机制研究表明，沙门氏菌招募的中性粒细胞是限制其疗效的关键因素。此外，使用细菌可能引起患者的严重感染，存在较高的安全性风险。因此，设计组合物增强沙门氏菌的抗肿瘤疗效同时降低感染风险对于沙门氏菌的规模化临床使用具有重要意义。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种可同时增强沙门氏菌抗肿瘤疗效和降低沙门氏菌感染风险的组合物，从而实现基于沙门氏菌的高效安全的肿瘤治疗。
为了实现上述目的，本发明提供了一种基于纳米银材料的抗肿瘤组合物，其特征在于，包括A药和B药，所述A药为减毒沙门氏菌，所述B药为唾液酸修饰的纳米银。
上述的用于抗肿瘤组合物，进一步的，所述唾液酸修饰的纳米银包括唾液酸修饰的亲水性聚合物和纳米银单质；所述唾液酸修饰的亲水聚合物为唾液酸通过酰胺键修饰在亲水性聚合物链上；所述亲水性聚合物为氨基和巯基修饰的亲水性聚合物，其中，巯基修饰基于亲水性聚合物进行硫辛酸衍生化反应得到；所述唾液酸修饰的亲水性聚合物中的巯基与纳米银单质之间的Ag-S键键合，形成于纳米银单质表面。
上述的抗肿瘤组合物，进一步的，所述亲水性聚合物为聚乙二醇、聚(2-乙基-2-噁唑啉)、聚乙烯醇、合成多肽、聚N-(2’-羟基)丙基甲基丙烯酰胺、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺-N-甘氨酰甘氨酸基甲基丙烯酰胺共聚物、聚甲基丙烯酸-2-羟乙酯、2-苯氧乙基丙烯酸酯中的至少一种。
上述的抗肿瘤组合物，进一步的，所述纳米银单质通过柠檬酸钠还原法制备得到。
上述的抗肿瘤组合物，进一步的，所述A药的剂量为5×106～1×108CFU/kg，所述B药的剂量为0.1～0.8nmol/kg。
基于一个总的技术构思，本发明还提供了上述用于治疗肿瘤的组合物在制备治疗肿瘤药物中的应用。
上述的应用，进一步的，所述治疗肿瘤的药物为治疗黑色素瘤、乳腺癌、胰腺癌、浆细胞瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、非小细胞肺癌、结直肠癌和恶性胶质瘤等实体瘤中的一种或多种的药物。
上述的应用，进一步的，所述应用的方法为：先注射减毒沙门氏菌，48h后注射唾液酸修饰的纳米银。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种抗肿瘤组合物——减毒沙门氏菌与唾液酸修饰的纳米银的组合物。减毒沙门氏菌靶向定植于肿瘤部位，唾液酸修饰的纳米银靶向中性粒细胞，在沙门氏菌的招募作用下实现向肿瘤部位的高效靶向递送；到达肿瘤部位的纳米银通过直接杀伤肿瘤细胞、清除中性粒细胞增强沙门氏菌的疗效，并通过清除沙门氏菌提升细菌治疗的生物安全性，降低感染风险。本发明抗肿瘤组合物可解决临床应用沙门氏菌的关键瓶颈问题，实现基于沙门氏菌的高效安全的肿瘤治疗。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1中SA、LA-PEG-NH2、LA-PEG-SA的核磁共振氢谱图。
图2为本发明实施例1中SP-AgNPs的透射电镜图。
图3为本发明实施例1中AgNPs、SP-AgNPs的电位图。
图4为本发明实施例1中AgNPs、SP-AgNPs的紫外吸收图谱。
图5为本发明实施例1中SP-AgNPs在10％FBS、DMEM完全培养基中的粒径变化图。
图6为本发明实施例2中中性粒细胞和B16F10细胞对PEG-AgNPs或SP-AgNPs的细胞摄取荧光成像图。
图7为本发明实施例3中SP-AgNPs与B16F10细胞孵育48h后的细胞存活率结果图。
图8为本发明实施例4中SP-AgNPs对S.t-ΔpGlux生长的抑制率。
图9为本发明实施例5中B16F10荷瘤小鼠注射S.t-ΔpGlux不同时间后的小动物活体成像图。
图10为本发明实施例6中B16F10荷瘤小鼠注射S.t-ΔpGlux不同时间后肿瘤组织CD11b和Ly6G的免疫荧光图像。
图11为本发明实施例7中各组小鼠肿瘤组织中的Ag含量结果图。
图12为本发明实施例8中经不同处理后小鼠的肿瘤体积变化曲线和肿瘤实物图。
图13为本发明实施例8中经不同处理后小鼠的生存曲线。
图14为本发明实施例8中经不同处理后小鼠肿瘤组织的H&E染色结果。
图15为本发明实施例8中经不同处理后小鼠肿瘤组织的CD11b和Ly6G的免疫荧光图像。
图16为本发明实施例9中各组小鼠在给药期间的相对体重变化。
图17为本发明实施例9中各组小鼠心、肝、脾、肺、肾的病理切片分析。
图18为本发明实施例9中各组小鼠肿瘤、肝和脾中的菌落计数。
具体实施方式
为了更清楚地阐述本发明的技术内容，在此结合具体实施例予以详细说明，显然，所列举的实施例只是本技术方案的优选实施方案，不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
实施例1
一种抗肿瘤组合物，包括减毒沙门氏菌和唾液酸修饰的纳米银。其中唾液酸修饰的纳米银(SP-AgNPs)，包括唾液酸(SA)和硫辛酸聚乙二醇(LA-PEG-NH2)通过酰胺反应形成唾液酸修饰的聚乙二醇(LA-PEG-SA)，再通过Ag-S键将此聚合物修饰于柠檬酸钠还原法制备的纳米银(AgNPs)表面。
本实施例的唾液酸修饰的纳米银(SP-AgNPs)采用以下方法制备得到：
(1)将85.9mg SA、63.9mg EDC·HCl、38.4mg NHS溶于5.6mL DMSO，于室温搅拌2h活化SA的羧基。将200mg LA-PEG-NH2溶于2mL DMSO，加入到上述反应液中，继续反应24h。反应结束后，将反应液转移至透析袋内(MWCO＝3500)，置于超纯水中透析48h。收集透析袋内液体，冷冻干燥后即得白色固体LA-PEG-SA。
(2)向390.8mL水中依次加入1.2mL浓度为100mM的柠檬酸钠水溶液、4mL新鲜配制的浓度为100mM的NaBH4水溶液，置于冰浴条件下搅拌。向其中快速加入4mL浓度为10mM的AgNO3水溶液，于冰浴条件下反应30min后，高速离心(20000rpm，30min)收集AgNPs。
(3)将上述收集的AgNPs重新分散于50mL水中，向其中加入22mL浓度为10mg/mL的LA-PEG-SA水溶液，室温避光搅拌24h，高速离心(20000rpm，30min)即得SP-AgNPs。
实验例：
(1)核磁共振氢谱：分别将SA、LA-PEG-NH2、LA-PEG-SA溶于氘代DMSO，以四甲基硅烷(TMS)为内标，采用核磁共振氢谱仪分析。图1为SA、LA-PEG-NH2、LA-PEG-SA的氢谱图，从图中可知：LA-PEG-SA具有SA和LA-PEG-NH2的全部特征峰，证明LA-PEG-SA的成功合成。
(2)形态：观察SP-AgNPs的形态，形态的检测方法：样品滴加在覆盖碳膜的400目铜网上，置于干燥器中，待其自然干燥后置于透射电镜Titan G2-F20下观察。图2为SP-AgNPs的透射电镜图，从图中可知：本发明的SP-AgNPs粒子呈球形，分布较为均匀，粒径约15nm。
(3)电位：分别检测AgNPs和SP-AgNPs的电位，测量方法为：取样品溶液置于Marlven Nano ZS仪器，测定池温度设定为25℃，每个样品平行操作3份。图3为AgNPs、SP-AgNPs的电位图，从图的结果可知：AgNPs的电位为-16.1mV，而SP-AgNPs的电位升至-2.81mV，证明AgNPs表面LA-PEG-SA的成功修饰。
(4)紫外光谱：分别对AgNPs和SP-AgNPs进行紫外光谱扫描，以蒸馏水为空白对照。图4为AgNPs、SP-AgNPs的紫外吸收图谱，从图中可知：AgNPs和SP-AgNPs均在约400nm处有吸收峰，且峰形无明显改变，证明本发明的SP-AgNPs在制备的过程中未发生聚集。
(5)稳定性检测：将SP-AgNPs分别置于10％胎牛血清(FBS)和含10％FBS的DMEM完全培养基中37℃孵育，在不同时间点测定二者的粒径。图5为SP-AgNPs在10％FBS、DMEM完全培养基中的粒径变化图，从图中可知：SP-AgNPs在两种介质中36h内粒径均无显著性变化，表明SP-AgNPs的稳定性良好。
实施例2
考察实施例1的SP-AgNPs对中性粒细胞和B16F10细胞的靶向作用，具体步骤为：
(1)制备异硫氰酸荧光素(FITC)标记的PEG-AgNPs和SP-AgNPs。具体步骤为：
按照实施例1中的方法得到AgNPs并重新分散于水中。向其中加入20mL浓度为10mg/mL的LA-PEG-SA(或LA-PEG-NH2)水溶液和2mL浓度为10mg/mL的LA-PEG-FITC水溶液，室温避光搅拌24h，高速离心(20000rpm，30min)即得FITC标记的PEG-AgNPs或SP-AgNPs(FITC-PEG-AgNPs、FITC-SP-AgNPs)。
(2)取小鼠外周血，利用小鼠外周血中性粒细胞分离液试剂盒分离其中的中性粒细胞，用适量含10％FBS的1640完全培养基稀释为2×104个/mL的细胞悬液，每孔0.5mL接种于24孔板，总共接种4个孔。同时取对数生长的B16F10细胞(小鼠黑色素瘤细胞，购自中南大学湘雅医学实验中心)，消化计数，用适量含10％FBS的DMEM完全培养基稀释为2×104个/mL的细胞悬液，每孔0.5mL接种于24孔板，总共接种4个孔。贴壁培养12h后吸弃培基，PBS润洗3次。
(3)各孔分别加入PBS、FITC-PEG-AgNPs、FITC-SP-AgNPs、anti-L-selectin(1∶1000)+FITC-SP-AgNPs，于37℃孵育2h后弃培养液，PBS润洗3次。
(4)每孔加入0.5mL 4％多聚甲醛避光固定20min，弃上清，PBS洗涤3次。
(5)每孔加入0.5mL 1μg/mL DAPI，避光染核10min，弃上清，PBS洗涤3次，采用激光共聚焦显微镜观察各孔荧光强弱。
图6为中性粒细胞和B16F10细胞的细胞摄取荧光成像图。其中，中性粒细胞和B16F10细胞分别与PEG-AgNPs和SP-AgNPs共孵育2h或经anti-L-selectin预处理后再与SP-AgNPs孵育2h，通过激光共聚焦显微镜观察。蓝色荧光为DAPI，代表细胞核，用于细胞定位；绿色荧光为FITC，代表PEG-AgNPs和SP-AgNPs；Merged为两个通道的叠加。标尺＝20μm。
从图中可知：中性粒细胞和B16F10细胞与PEG-AgNPs孵育2h，细胞内基本无荧光，而当与SP-AgNPs孵育时，细胞内有明显的绿色荧光，表明SP-AgNPs被细胞摄取。然而，经anti-L-selectin预处理后，其绿色荧光显著减弱。结果表明，SA修饰可增加AgNPs对中性粒细胞和B16F10细胞的靶向性，该过程由细胞表面的L-selectin介导。
实施例3
考察实施例1的SP-AgNPs对B16F10细胞的细胞毒性，具体步骤为：
(1)取胰酶消化对数生长的B16F10细胞，用含10％FBS的DMEM培养基稀释成密度为5×104个/mL的细胞悬液，以每孔100μL接种于96孔培养板中。在二氧化碳培养箱内(37℃、5％CO2、饱和湿度)培养12h后移弃培养液。
(2)每孔加入100μL用培养基稀释至不同浓度的SP-AgNPs(浓度以AgNPs计，分别为0.21、0.42、0.84、2.1、4.2nM)，同一浓度做6个复孔，孵育48h后吸弃培养液，PBS润洗3次。
(3)每孔加入100μL MTT溶液(0.5mg/mL)，孵育4h后吸弃上清。
(4)每孔加入100μL DMSO，置摇床上低速振摇10min使结晶溶解完全，用酶标仪测定各孔在490nm波长处的吸光值(OD)。
图7为SP-AgNPs与B16F10细胞孵育48h后用MTT法测定的细胞存活率结果。从图中可以看出，本发明的SP-AgNPs对B16F10细胞的细胞毒性呈现剂量依赖性。进一步计算得出其IC50值为1.9nM。
从毒性实验的结果可知：本发明实施例1的SP-AgNPs可抑制B16F10细胞的增殖，并促进其凋亡，这说明本发明的SP-AgNPs具有一定的体外抗肿瘤活性。
实施例4
考察实施例1的SP-AgNPs的体外抗菌活性，具体步骤为：
(1)将减毒沙门氏菌S.t-ΔpGlux(对沙门氏菌菌株ATCC14028s进行减毒和生物发光改造，构建减毒沙门氏菌阳性发光菌落(减毒沙门氏菌S.t-ΔpGlux)，具体构建方法参考文献Jian-qiang Chen，Yue-fu Zhan，Wei Wang，Sheng-nan Jiang，and Xiang-yingLi.The engineered Salmonella typhimurium inhibits tumorigenesis in advancedglioma.Onco Targets Ther.2015；8：2555-2563.)置于LB肉汤培养基中37℃、220rpm振荡培养。用生理盐水将其稀释至2×104CFU/mL。
(2)向其中加入不同浓度的SP-AgNPs(0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0nM)后，分别涂布于固体LB琼脂平板上，于37℃培养。
(3)培养24h后，对琼脂平板上的菌落进行计数。
图8为通过菌落计数得到的SP-AgNPs对S.t-ΔpGlux生长的抑制率。从图中可见，SP-AgNPs对S.t-ΔpGlux生长的抑制同样呈现剂量依赖性。进一步计算得出其IC50值为0.074nM，表明SP-AgNPs具有较强的抗菌活性。
实施例5
考察S.t-ΔpGlux的肿瘤靶向性，具体步骤为：
(1)小鼠黑色素瘤模型的构建：将对数生长期、状态良好的B16F10细胞用胰酶消化，离心收集，用PBS洗2次后重悬于PBS，调整密度为2×106个/mL。然后用酒精对BALB/c小鼠的皮肤进行消毒，将肿瘤细胞悬液接种于小鼠皮下(0.1mL/只)。
(2)待小鼠肿瘤体积长至150mm3时，给小鼠尾静脉注射0.2mL S.t-ΔpGlux悬液(5×106CFU/只)，分别于注射后0h和72h采用小动物活体成像技术监测S.t-ΔpGlux的体内分布。
图9为B16F10荷瘤小鼠注射S.t-ΔpGlux不同时间后的小动物活体成像图。从图中可见，S.t-ΔpGlux注射后主要蓄积于肿瘤部位，证明S.t-ΔpGlux具有较强的肿瘤靶向性。
实施例6
考察S.t-ΔpGlux对中性粒细胞的招募作用，具体步骤为：
(1)按照实施例5构建小鼠黑色素瘤模型和注射S.t-ΔpGlux，分别于注射后0h和72h取小鼠肿瘤，置于多聚甲醛中固定24h，石蜡包埋并切片。
(2)经脱蜡和再水化后，加入CD11b和Ly6G抗体于4℃孵育过夜，PBS洗3次。
(3)加入荧光标记的二抗，37℃孵育30min，PBS洗3次。
(4)加入1μg/mL DAPI，避光染核10min，PBS洗3次。通过荧光显微镜观察。
图10为B16F10荷瘤小鼠注射S.t-ΔpGlux不同时间后肿瘤组织CD11b和Ly6G的免疫荧光图像，标尺＝100μm。从图中可见，与注射S.t-ΔpGlux后0h相比，注射后72h肿瘤组织的CD11b和Ly6G的荧光均显著增强，证明靶向定植于肿瘤部位的S.t-ΔpGlux可大量招募中性粒细胞至肿瘤部位。
实施例7
考察中性粒细胞介导的SP-AgNPs的肿瘤靶向递送，具体步骤为：
(1)按照实施例5构建小鼠黑色素瘤模型和注射S.t-ΔpGlux，其余组注射生理盐水。
(2)在注射后24h给小鼠尾静脉注射anti-Gr-1抗体(50μg)或生理盐水。
(3)在注射后48h给小鼠尾静脉注射PEG-AgNPs或SP-AgNPs(以AgNPs计，0.25nmol/kg)。
(4)在注射后96h收集小鼠肿瘤，王水消解，通过ICP-MS测定其中的Ag含量。
图11为各组小鼠肿瘤组织中的Ag含量。从图中可以看出，与未注射S.t-ΔpGlux的组相比，注射S.t-ΔpGlux后SP-AgNPs在肿瘤中的蓄积量明显增加，PEG-AgNPs无明显变化，而当预注射anti-Gr-1抗体耗竭中性粒细胞后，SP-AgNPs在肿瘤中的蓄积量显著降低，由此证明S.t-ΔpGlux招募的中性粒细胞可介导SP-AgNPs的肿瘤高效靶向递送。
实施例8
一种实施例1的抗肿瘤组合物在制备治疗肿瘤药物中的应用，其应用方法为：先注射减毒沙门氏菌，48h后注射唾液酸修饰的纳米银。考察该组合物的体内抗肿瘤效果，具体步骤为：
按照实施例5的方法构建小鼠黑色素瘤模型，待小鼠肿瘤长至200mm3左右时，将小鼠随机分成5组，分别尾静脉注射PBS(G1)、SP-AgNPs(G2)、S.t-ΔpGlux(G3)、S.t-ΔpGlux+SP-AgNPs(G4)、S.t-ΔpGlux+anti-Gr-1(G5)(S.t-ΔpGlux5×106CFU/只，SP-AgNPs0.25nmol/kg，anti-Gr-1 50μg/只)，其中SP-AgNPs或anti-Gr-1均于注射S.t-ΔpGlux48h后给予。每天用游标卡尺测量小鼠肿瘤的体积至第12天，通过各组肿瘤的体积变化、肿瘤组织H&E染色比较各组抗肿瘤效果。肿瘤体积计算公式：V＝长×宽2/2。此外，绘制小鼠生存曲线，并按照实施例6的方法考察经不同处理后肿瘤组织中性粒细胞的浸润情况。
图12为经不同处理后小鼠的肿瘤体积变化曲线和肿瘤实物图。从图中可以看出，SP-AgNPs具有一定的抗肿瘤活性，S.t-ΔpGlux较之活性较强，可明显抑制肿瘤的生长，而当S.t-ΔpGlux与SP-AgNPs或anti-Gr-1联用时，肿瘤的生长可完全被抑制。
图13为经不同处理后小鼠的生存曲线。从图中可以看出，PBS组、SP-AgNPs组和S.t-ΔpGlux组的小鼠均在16d内死亡，S.t-ΔpGlux+anti-Gr-1组的小鼠20d的生存率为40％，而S.t-ΔpGlux+SP-AgNPs组的小鼠全部存活，生存率增至100％，说明本发明的用于治疗肿瘤的组合物可延长小鼠的生存期。
图14为经不同处理后小鼠肿瘤组织的H&E染色结果，标尺＝50μm。从图中可以看出，与其他三组相比，S.t-ΔpGlux+SP-AgNPs组和S.t-ΔpGlux+anti-Gr-1组均出现明显的肿瘤组织坏死，肿瘤细胞减少，细胞核固缩甚至消失。
图15为经不同处理后小鼠肿瘤组织的CD11b和Ly6G的免疫荧光图像，标尺＝50μm。从图中可以看出，与PBS组和SP-AgNPs组相比，S.t-ΔpGlux组出现大量的中性粒细胞浸润，而当与SP-AgNPs或anti-Gr-1联用时，肿瘤部位中性粒细胞的数量明显减少。
以上结果共同说明，通过SP-AgNPs或anti-Gr-1清除肿瘤部位的中性粒细胞，可显著抑制肿瘤的生长，延长小鼠的生存期，增强减毒沙门氏菌S.t-ΔpGlux的抗肿瘤疗效。
实施例9
一种实施例1抗肿瘤组合物在制备治疗肿瘤药物中的应用，其应用方法为：先注射减毒沙门氏菌，48h后注射唾液酸修饰的纳米银。考察该组合物的体内安全性，具体步骤为：
按照实施例8的方法处理小鼠，在给药期间记录小鼠的体重变化；在给药第12天后，取小鼠的心、肝、脾、肺、肾，用生理盐水洗涤，滤纸吸干水分，4％多聚甲醛固定24h后，将其石蜡包埋、切片、H&E染色，利用光学显微镜观察病理改变；同时无菌收集小鼠的肿瘤、肝和脾，匀浆后稀释涂布于LB琼脂平板上，37℃培养24h后进行菌落计数。
图16为各组小鼠在给药期间的相对体重变化。从图中可见，S.t-ΔpGlux+anti-Gr-1组小鼠的体重在给药期间明显减轻，S.t-ΔpGlux+SP-AgNPs组小鼠虽在给药初期也出现体重下降，但后期逐渐恢复。
图17为各组小鼠心、肝、脾、肺、肾的病理切片分析，标尺＝5μm。S.t-ΔpGlux+SP-AgNPs组小鼠各器官均未见明显病理改变，而S.t-ΔpGlux+anti-Gr-1组小鼠的肝和脾可见明显出血。
图18为各组小鼠肿瘤、肝和脾中的菌落计数。从图中可以看出，与单独注射S.t-ΔpGlux相比，同时注射anti-Gr-1可显著增加S.t-ΔpGlux在肿瘤和各器官中的分布，而当同时注射SP-AgNPs时，S.t-ΔpGlux在肿瘤和各器官中的分布显著降低。
以上结果共同说明，与anti-Gr-1相比，由于SP-AgNPs可选择性的清除肿瘤部位的中性粒细胞且同时具有较强的抗菌活性，本发明用于治疗肿瘤的组合物可提高S.t-ΔpGlux的生物安全性，降低感染的风险。
以上所述实施例，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明的技术范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (8)

1.一一种基于纳米银材料的抗肿瘤组合物，，其特征在于，，包括A药和B药，，所述A药为减毒沙门氏菌，，所述B药为唾液酸修饰的纳米银。
2.根据权利要求1所述的用于抗肿瘤组合物，，其特征在于，，所述唾液酸修饰的纳米银包括唾液酸修饰的亲水性聚合物和纳米银单质；；
所述唾液酸修饰的亲水聚合物为唾液酸通过酰胺键修饰在亲水性聚合物链上；；所述亲水性聚合物为氨基和巯基修饰的亲水性聚合物，，其中，，巯基修饰基于亲水性聚合物进行硫辛酸衍生化反应得到；；
所述唾液酸修饰的亲水性聚合物中的巯基与纳米银单质之间的Ag--S键键合，，形成于纳米银单质表面。
3.根据权利要求2所述的抗肿瘤组合物，，其特征在于，，所述亲水性聚合物为聚乙二醇、、聚(2--乙基--2--噁唑啉)、、聚乙烯醇、、合成多肽、、聚N--(2”--羟基)丙基甲基丙烯酰胺、、N--(2--羟丙基)甲基丙烯酰胺--N--甘氨酰甘氨酸基甲基丙烯酰胺共聚物、、聚甲基丙烯酸--2--羟乙酯、、2--苯氧乙基丙烯酸酯中的至少一一种。
4.根据权利要求2所述的抗肿瘤组合物，，其特征在于，，所述纳米银单质通过柠檬酸钠还原法制备得到。
5.根据权利要求1所述的抗肿瘤组合物，，其特征在于，，所述A药的剂量为5×106～～1×108CFU/kg，，所述B药的剂量为0..1～～0..8nmol/kg。
6.一一种权利要求1至5中任一一项所述的抗肿瘤组合物在制备治疗肿瘤药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，，其特征在于，，所述治疗肿瘤的药物为治疗黑色素瘤、、乳腺癌、、胰腺癌、、浆细胞瘤、、多发性骨髓瘤、、卵巢癌、、非小细胞肺癌、、结直肠癌和恶性胶质瘤等实体瘤中的一一种或多种的药物。
8.根据权利要求7所述的应用，，其特征在于，，所述应用的方法为：：先注射减毒沙门氏菌，，48h后注射唾液酸修饰的纳米银。
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