CN112592887A - 一种精子显微操作制动液及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种精子显微操作制动液及其应用，所述制动液组成为：5～15mg/mL羧甲基纤维素，0.1～1μg/L的17β‑雌二醇，体积浓度10％人血清替代物，溶剂为MOPS缓冲液或HEPES缓冲液。本发明显微操作制动液不仅用于精子制动，还可优选精子，提高了单个精子质量，避免了ICSI人工选择精子的主观性，随机性。缩短了体外操作时间，提高了ICSI效率。

Description

一种精子显微操作制动液及其应用

(一)技术领域

本发明涉及一种精子显微操作制动液及其应用。

(二)背景技术

卵胞浆内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)是一种借助显微操作系统将单个精子注射入卵母细胞胞浆内使其受精的技术。随着人类辅助生殖技术的发展，ICSI体外受精技术得到广泛推广和使用，已成为治疗不孕不育症的主要手段之一，特别是在治疗男性不育症方面具有突出重要的作用。

常规精子选择方法不能满足ICSI体外受精的单个精子选择要求。上游法、密度梯度离心法等常规精子选择方法均为概率选择，最终筛选到是精子集群，而ICSI体外受精则需形态和功能正常的单个精子。

ICSI操作者需要在显微镜下对单个精子进行人工挑选，而人工挑选具有不可避免的缺点：(1)挑选的精子质量受操作者个人经验和主观性影响，随机性大。有些精子表面看似形态活力正常，但其功能仍可能存在某些缺陷或异常，一旦注射入卵母细胞使其受精，势必影响ICSI受精率、胚胎发育潜能和临床结局；(2)花费时间长，而且精子长时间暴露于操作液中，精子功能显著受损。

在ICSI标准操作规程中，人工挑选精子需要精子制动液，常规精子制动液不具有优选精子效果。由于精子具有一定的活动度，为方便操作者进行单个精子选择，降低操作难度，需要在常规精子选择方法处理过的精子群中加入高粘度的精子制动液。常规精子制动液有7％或10％聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone，PVP)等溶液，作用仅是降低精子的运动速度，不能对精子进行筛选。

本发明提供一种含有非牛顿流体羧甲基纤维素(carboxymethyl cellulose,CMC)溶液的显微操作制动液及使用方法。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种精子显微操作制动液及其应用，本发明所述精子显微操作制动液能够快速优选精子，步骤简便，不依赖操作者经验，提高了单个精子质量，缩短了体外操作时间，减少了精子长时间暴露于操作液中的不良影响，提高了ICSI效率。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种精子显微操作制动液，所述制动液组成为：5～15mg/mL羧甲基纤维素(CMC)，0.1～1μg/L的17β-雌二醇(E2)，体积浓度10％人血清替代物(SSS)，溶剂为常规MOPS缓冲液或HEPES缓冲液。

进一步，所述制动液组成为：10mg/mL羧甲基纤维素(CMC)，0.5μg/L的17β-雌二醇(E2)，体积浓度10％人血清替代物(SSS)，溶剂为MOPS缓冲液。

本发明所述17β-雌二醇通过与精子膜上的雌激素受体结合，提高正常精子的穿透和聚集能力，有助于区分正常精子和异常精子。所述精子显微操作制动液中17β-雌二醇以0.5mg/L 17β-雌二醇应用液的形式加入，所述0.5mg/L 17β-雌二醇应用液制备方法为：将17β-雌二醇溶解于二甲基亚砜(DMSO)，制成0.5g/L母液，再用MOPS缓冲液1000倍稀释(以减少DMSO的影响)，得到0.5mg/L 17β-雌二醇应用液。

本发明还提供一种所述精子显微操作制动液在制备精子显微检测条中的应用，所述检测条按如下方法制备：在培养皿中，用精子显微操作制动液制成长条形液滴，依次分为加样区、优选区和收集区，表面覆盖矿物油或石蜡油与空气隔离，于37℃，饱和湿度的培养箱中平衡6小时以上，制成精子显微检测条。

进一步，所述精子显微检测条长20～40mm，宽3～4mm，优选长25mm，宽3mm。

本发明所述加样区占显微检测条总长1/5，是加精子样本区域；优选区占显微检测条总长2/5，是正常精子和异常精子区分区域；收集区占显微检测条总长2/5，是收集正常精子区域。

本发明所述精子显微检测条筛选精子的方法为：将精子悬液加入加样区，在收集区，普通倒置显微镜下挑选呈簇状聚集前行精子。所述精子悬液加入量为精子显微操作制动液体积的1～5％。

本发明所述精子显微操作制动液是指卵胞浆内单精子注射技术规范中(中华医学会生殖医学分会第四届委员会.卵胞浆内单精子注射(ICSI)技术规范[J].生殖医学杂志,2018,27(11)：1043-1047.)用于精子制动的溶液。所述精子显微操作制动液尤其适应于轻、中度少、弱、畸精症患者。本发明所述精子来源于轻、中度少、弱、畸精症患者和精液参数正常生育男性。精液液化后，常规方法处理，包括直接离心洗涤法，上游法或密度梯度离心法等，最后调整精子悬液浓度。将精子悬液加入加样区，由于精子显微操作制动液(非牛顿流体)的粘弹性作用，活力和功能正常精子头尾方向一致的呈簇状聚集前行，经优选区到达收集区，同时活力低下和功能缺陷的异常精子被抑制聚集存在，从而使正常精子与异常精子得以区分。

本发明还提供一种所述精子显微操作制动液在制备卵胞浆内单精子注射试剂中的应用，所述注射试剂由精子显微操作制动液和精子注射液组成，所述精子注射液组成为：15～25mg/mL羧甲基纤维素(CMC)，体积浓度10％人血清替代物(SSS)，溶剂为MOPS或HEPES缓冲液；所述的应用为：将精子显微操作制动液制成精子显微检测条，筛选获得精子；将精子加入精子注射液中，用显微操作注射针于精子尾部中段1/3处进行精子制动，先尾后头吸取制动好的精子(尾部有折痕)移入卵子液滴中完成卵胞浆内单精子注射。

进一步，优选所述精子注射液组成为：20mg/mL羧甲基纤维素(CMC)，体积浓度10％人血清替代物(SSS)，溶剂为MOPS缓冲液。

本发明所述精子显微操作制动液和精子注射液均含有非牛顿流体；所述非牛顿流体的流变行为满足如下幂律方程：

τ＝Kγⁿ(n<1)

(τ为剪切应力，K为稠度系数，γ为剪切速率，n为幂律指数)。

非牛顿流体的粘弹性能够诱导正常精子聚集，提高了单个精子质量。非牛顿流体的粘弹性诱导生理结构和功能正常的精子聚集前行，同时抑制活力低下和功能缺陷的异常精子聚集存在，从而使正常精子与异常精子易于观察区分，避免了人工选择精子的主观性，随机性，也缩短了体外操作时间，减少了精子长时间暴露于操作液中的不良影响，提高了ICSI效率。

非牛顿流体剪切变稀特性能够减弱显微操作注射针在捕获和制动精子时而造成的剪切力。由于非牛顿流体是一种在恒温状态下剪应力与速度梯度不成比例的流体，其剪应力在接受对其造成影响的剪切力时是减弱的。非牛顿流体的这种特性对显微操作是非常有利的。操作者在使用显微操作注射针捕获和吸取精子时，无法避免地会触碰和挤压精子，非牛顿流体能够降低了精子在制动液里的应激损伤。更重要的，在操作者用注射针将精子尾部中段1/3处制动的过程中，非牛顿流体减弱了被制动的精子在剪切力作用下的浮动或者振动，避免了被制动精子的二次损伤。

本发明所述精子显微操作制动液在37℃时粘度为0.03～0.3Pa·s，所述精子注射液在37℃时粘度为0.3～0.6Pa·s。

本发明羧甲基纤维素作为纤维素天然聚合物的衍生物，具有良好的生物相容性，对人体无毒、无害，因来源丰富、价格低廉，在食品、医药、日化用品等许多领域被使用。由于构成纤维素的葡萄糖单元上有三个能被取代的羟基，羧甲基纤维素有各种取代度。取代度大小直接影响羧甲基纤维素的溶解性、稳定性等性能。作为优选的，所述羧甲基纤维素的取代度为0.8～1.2，优选0.95。

本发明要求用于ICSI授精的精子，须经过低-高两种粘度梯度的制动液和注射液分别实现两个目的：第一，利用非牛顿流体粘弹性特性筛选生理结构和功能均为正常的精子，提高了单个精子质量；第二，利用非牛顿流体剪切变稀特性减少精子制动过程中的应激损伤，改善ICSI受精率和胚胎发育潜能。

本发明优选精子方法无需依赖操作者个人经验，避免了人工选择精子的主观性，随机性，解决了目前ICSI技术中人为选择精子的不足问题。同时本发明缩短了配子体外操作时间，提高了ICSI效率。方法简便快捷，结果稳定可靠，将极大有利于在临床推广应用。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：(1)与传统的牛顿流体PVP制动液相比，本发明显微操作制动液不仅用于精子制动，还可优选精子。利用非牛顿流体具有的粘弹性特性诱导活力和生理功能正常的精子聚集，提高了单个精子质量。(2)非牛顿流体在恒温状态下剪切变稀的特性能够减弱显微操作注射针在捕获和制动精子时而造成的剪切力，降低了被制动精子在制动液里的应激损伤，有助于提高体外受精率和胚胎发育潜能。(3)避免了ICSI人工选择精子的主观性，随机性。非牛顿流体的粘弹性特性诱导正常精子聚集，同时抑制活力低下和功能缺陷的异常精子聚集存在，从而使正常精子与异常精子便于区分，不受操作者个人经验和主观性影响。(4)由于本发明的制动液里的正常精子与异常精子易于观察和区分，缩短了体外操作时间，减少了精子长时间暴露于操作液中的不良影响，提高了ICSI效率。

(四)附图说明

图1显微操作皿液滴制作示意图。

图2检测条示意图。

图3不同流体溶液的粘度和剪切速率变化曲线。

图4不同流体中的精子活动特征，刻度代表100μm。(A)对照组，(B)非牛顿流体(本发明)，图中圈出来的表示精子呈簇状聚集在一起滑行。(C)牛顿流体(10％PVP)。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

本发明实施例中羧甲基纤维素(取代度0.95)、17β-雌二醇和聚乙烯吡咯烷酮(PVPK90)均购自德国Merck公司。所述MOPS缓冲液、石蜡油均购自瑞典Vitrolife公司。所述人血清替代物(SSS)、密度梯度离心液(含上层液和下层液)、精子培养液、受精培养液、胚胎培养液均购自美国Irvine公司。

实施例1、一种精子显微操作制动液的配制

1、精子显微操作制动液配制(记为L液)：100mg羧甲基纤维素，1ml的人血清替代物(SSS)，0.5mg/L的17β-雌二醇应用液10μL，溶剂为MOPS缓冲液，定容至10ml。

0.5mg/L 17β-雌二醇应用液的配制：将17β-雌二醇溶解于二甲基亚砜(DMSO)，制成0.5g/L母液，再用MOPS缓冲液1000倍稀释(以减少DMSO的影响)，得到0.5mg/L应用液，然后取10μl应用液，加入上述10ml溶液里，17β-雌二醇的终浓度为0.5μg/L。

精子显微注射液配制(记为H液)：200mg羧甲基纤维素，1ml的人血清替代物(SSS)，溶剂为MOPS缓冲液，定容至10ml。

10％PVP溶液配制：1g聚乙烯吡咯烷酮，1ml人血清替代物(SSS)，溶剂为MOPS缓冲液，定容至10ml。

配制的L液、H液和10％PVP溶液分别经0.22μm滤膜过滤，取滤液备用。

2、使用旋转式粘度计在37℃测定溶液粘度，比较溶液在不同剪切速率下粘度值的流变学性质。

分别以步骤1制备的L液、H液、10％PVP溶液为样品，采用RDV-2型旋转式粘度计(上海精密仪器仪表有限公司)，选用合适的转子连接螺杆，选择转速，然后调整粘度计水平，分别在剪切速率(1/s)为10、20、30、40、50、60的条件下测试各个样品的粘度，结果见图3所示。

如图3所示：10％PVP溶液在不同的剪切速率下具有恒定的粘度值，因此被认为是一种牛顿流体。本发明的H液和L液均随着剪切速率增大，粘度值呈明显下降趋势，表明是非牛顿流体。

实施例2、精子显微操作制动液对正常生育男性精子的优选

参照WHO《人类精液检查与处理实验室手册》第五版的参数标准，选取正常生育男性精液，经密度梯度离心方法处理后得到精子悬液，分成三组：对照组、PVP组和精子制动液组。分别加入精子培养液(对照组)、10％PVP溶液和实施例1制备的精子显微操作制动液(L液)，随后观察精子在不同流体中的流变学行为，并收集精子进行质量评价，包括活力、正常形态学和DNA碎片率比较，具体方法如下：

1、操作皿准备和试剂平衡预热：

精子显微操作制动液组：参照图2，在直径为60mm的显微操作皿中，用实施例1制备的L液20μl，制成长25mm，宽3mm的长条形液滴，依次分为加样区、优选区和收集区。加样区占长条形液滴总长1/5，是加精子样本区域；优选区占总长2/5，是正常精子和异常精子区分区域；收集区占总长2/5，是收集正常精子区域；在长条形液滴表面覆盖石蜡油使其与空气隔离，于37℃，饱和湿度的培养箱中平衡6小时制成精子显微检测条，备用。

精子培养液组：将精子制动液组的L液替换为精子培养液，制成精子显微检测条，其他操作相同。

PVP组：将精子制动液组的L液替换为10％PVP溶液，制成精子显微检测条，其他操作相同。

2、精子悬液制备：参照WHO《人类精液检查与处理实验室手册》第五版的参数标准，选取正常生育男性精液2ml，精液37℃下液化后，加入含密度梯度离心液的离心管中，300×g离心15min，收集沉淀，重悬于2ml精子培养液中，300×g离心5min，除去上清，再用精子培养液重悬沉淀重复离心一次，将沉淀重悬于0.5ml精子培养液中并调整精子浓度为10×10⁶/ml。

3、精子在不同流体中的活动特征：将步骤2制备的精子悬液1μl分别加入步骤1三组显微检测条的加样区，在37℃、饱和湿度的培养箱中孵育15min后，采用尼康倒置显微镜(ECLIPSE Ti)200(10倍目镜×20倍物镜)放大倍数下，在收集区观察精子流变学行为。结果如图4所示：图4中A是对照组精子在精子培养液中的活动特征，单个精子呈无方向性的剧烈翻滚运动。图4中B是精子在本发明的精子显微操作制动液里的行为特征，明显可见3～6个精子头尾方向一致的呈簇状聚集在一起滑行。图4中C是精子在10％PVP中，可见单个精子无方向性的紧贴皿底表面向前滑行。

4、精子活力检测：在收集区取精子样本用计算机辅助精子分析(CASA)系统检测样本活力。测试温度为37℃。10％PVP是目前使用最广泛的显微操作制动液，是一种牛顿流体，比较本发明所述的非牛顿流体显微操作制动液和10％PVP牛顿流体对正常生育男性精子活动参数的影响。结果如表1所示：与牛顿流体相比，本发明组优选的精子平均路径速度(VAP)、曲线速度(VCL)和直线速度(VSL)均显著高于10％PVP制动液组，显示本发明优选的精子中有高比率的活力和功能俱佳的精子，说明本发明非牛顿流体在优选精子方面有显著优势。

表1在不同流体中正常生育男性精子活动参数的比较

注：^a：相对于对照组P<0.05，^a*：相对于牛顿流体(10％PVP)组P<0.05，^b：相对于对照组P<0.05，^b*：相对于牛顿流体(10％PVP)组P<0.05，^c：相对于对照组P<0.05，^c*：相对于牛顿流体(10％PVP)组P<0.05。

5、精子收集：在精子显微检测条的收集区，用显微操作注射针在倒置显微镜200放大倍数下收集精子。需要注意收集精子方法：10％PVP组收集活动的，头、颈、尾形态无异常的精子；本发明精子显微操作制动液组收集头尾方向一致的呈簇状聚集前行精子；对照组由于精子在培养液中是呈无方向性的剧烈翻滚运动，显微镜下无法判断其形态是否异常，因此只收集剧烈活动精子。

6、精子形态学评价和DNA碎片率检测。

精子形态学评价采用Diff-Quik快速染色法。按照试剂盒(深圳市博锐德生物科技有限公司)使用说明书方法，将精子样本均匀涂布于干净的载玻片上，空气干燥，加固定剂(二芳基甲烷)15s，再依次在染液A(嗜酸性氧杂蒽)中10s、染液B(嗜碱性硫氮杂苯)中15s，对玻片染色，流水洗去多余染剂，干燥后油镜下观察和计数染色精子，至少观察200个精子。按照WHO《人类精液检查与处理实验室手册》第五版精子形态学标准计算形态正常精子比率。

精子DNA损伤检测采用精子染色质扩散试验(SCD)方法检测。按照试剂盒(深圳市博锐德生物科技有限公司)使用说明书方法，将精子样本加入37℃熔化的易熔凝胶管，混匀，取混合液于预处理载玻片上，迅速盖上盖片，4℃静置5min，使其凝固。小心移去盖片，将载玻片依次浸入反应液A中7min、反应液B中25min、纯水5min、70％乙醇2min、90％乙醇2min、100％乙醇2min，晾干，再用瑞氏染色。200倍光镜下观察500个精子。大晕环和中晕环表示精子DNA完整无损伤，小晕环、无晕环表示精子DNA损伤，计算精子DNA碎片指数(DFI)，即精子DNA碎片率。精子DNA碎片率(％)＝存在DNA碎片精子数/被观察精子总数×100％，精子DNA完整率(％)＝1-精子DNA碎片率(％)。

结果如表2所示，三组精子正常形态率没有显著差异，但与10％PVP牛顿流体相比，经本发明筛选后获得的精子具有显著低的DNA碎片率，10％PVP牛顿流体中精子碎片指数是三组中最高的(P<0.05)。

表2在不同流体中正常生育男性精子正常形态率和DNA碎片指数的比较

注：^a：相对于对照组P<0.05，^a*：相对于牛顿流体(10％PVP)组P<0.05。

实施例3、精子显微操作制动液对轻度少、弱精症患者精子的优选

参照WHO《人类精液检查与处理实验室手册》第五版的参数标准，选取轻度少、弱精症患者精液，同实施例2方法经密度梯度离心处理后得到精子悬液，替换实施例2中的精子悬液，其他操作同实施例2，在收集区收集精子样本进行正常形态学和DNA碎片指数比较，结果见表3。

表3表明，与10％PVP牛顿流体相比，经本发明精子显微操作制动液筛选后获得的精子具有更高的正常形态率和DNA完整率(P<0.05)。由此说明，对轻度少、弱精症患者精子，本发明显微操作制动液比常规使用的10％PVP在选择精子方面效果更好。

表3在不同流体中轻度少、弱精症患者精子正常形态率和DNA碎片指数的比较

注：^a：相对于对照组P<0.05，^a*：相对于牛顿流体(10％PVP)组P<0.05，^b：相对于对照组P<0.05，^b*：相对于牛顿流体(10％PVP)组P<0.05。

实施例4、精子显微操作制动液对畸精症患者精子的优选

参照WHO《人类精液检查与处理实验室手册》第五版的参数标准，选取畸精症(精子正常形态率<4％)患者精液，采用实施例2方法经密度梯度离心处理后得到精子悬液，并替换实施例2中的精子悬液，其他操作相同，在收集区收集精子样本进行正常形态学和DNA碎片指数比较，结果见表4。

表4表明，与10％PVP牛顿流体相比，经本发明精子显微操作制动液筛选后获得的精子具有更高的正常形态率和DNA完整率(P<0.05)。由此可见，对畸精症患者精子，本发明显微操作制动液比10％PVP对精子的选择性显著增强，效率更高。

表4在不同流体中畸精症患者精子正常形态率和DNA碎片指数的比较

注：^a：相对于对照组P<0.05，^a*：相对于牛顿流体(10％PVP)组P<0.05，^b：相对于对照组P<0.05，^b*：相对于牛顿流体(10％PVP)组P<0.05。

实施例5：不同熟练程度的操作者用本发明所述精子显微操作制动液选择精子均获得了稳定的精子质量。

不同熟练程度的操作者分别进行实施例2精子显微操作制动液组和PVP组实验，比较精子的正常形态率和DNA碎片指数，结果见表5。结果显示：1，同一操作者用本发明精子显微操作制动液选择的精子正常形态率和DNA完整率均显著高于10％PVP精子制动液。2，不同熟练程度的操作者用本发明精子显微操作制动液选择的精子均获得了无显著差异的正常形态率和DNA完整率。熟练者(5年以上ICSI操作经验)、基本掌握者(1～2年ICSI操作经验)和初学者(小于6个月的ICSI操作经验)应用本发明精子显微操作制动液选择的精子正常形态率和DNA碎片率分别为7.68±1.36％、7.42±0.72％、7.46±1.50％和11.94±3.37％、12.58±2.33％、12.28±2.36％，三组之间无显著差异。由此说明，不同熟练程度的操作者应用本发明精子显微操作制动液精子选择的结果稳定，大大减少了对操作者个人经验和熟练程度的依赖，操作者无需接受长时间的培训即可开展该技术。

表5不同操作者用两种制动液选择精子的正常形态率和DNA碎片指数的比较

注：^a,b：在初学者组中相对于牛顿流体(10％PVP)组P<0.05，^c,d：在基本掌握者组中相对于牛顿流体(10％PVP)组P<0.05，^e,f：在熟练者组中相对于牛顿流体(10％PVP)组P<0.05，^g：相对于初学者P<0.05，^g*：相对于基本掌握者P<0.05。

实施例6：精子显微操作制动液在卵胞浆内单精子注射技术中的应用

ICR小鼠(浙江省医学科学院实验动物中心)雌鼠腹腔注射孕马血清促性腺激素(PMSG)(宁波第二激素厂)10IU，48小时后腹腔注射人绒毛膜促性腺激素(hCG)(宁波第二激素厂)10IU。14小时后脱颈处死。打开腹腔，取出双侧输卵管，体视镜下用针尖撕开输卵管壶腹部壁，获取卵子团，用透明质酸溶液消化，去除颗粒细胞，获得成熟卵子，移至受精培养液孵育。

ICR小鼠雄鼠处死，取出附睾和输精管，体视镜下针尖划破，释放精子，上游法收集精子。替换实施例2中的精子悬液。在实施例2显微操作制动液收集区用显微操作注射针吸取精子，移入实施例1制备的H液，在H液中用显微操作注射针在精子颈部压住并划动，使精子断尾(精子断尾是小鼠体外显微授精的常规操作)。吸取精子头移入含成熟卵子液滴中，将精子头注入卵胞浆内完成卵胞浆内单精子注射。注射好的卵子再移入胚胎培养皿编号微滴中单个培养。

比较本发明显微操作制动液和常规10％PVP制动液在卵胞浆内单精子注射技术中的结果。结果显示(表6)：本发明精子制动液的受精率和囊胚形成率均高于10％PVP制动液。实验结果证明，使用本发明精子制动液进行卵胞浆内单精子注射可以有效提高体外受精率和囊胚形成率。

表6不同制动液在卵胞浆内单精子注射技术中的应用比较

注：^a：相对于牛顿流体(10％PVP)P<0.05，^b：相对于牛顿流体(10％PVP)P<0.05。

Claims (9)

1.一种精子显微操作制动液，其特征在于所述制动液组成为：5～15mg/mL羧甲基纤维素，0.1～1μg/L的17β-雌二醇，体积浓度10％人血清替代物，溶剂为MOPS缓冲液或HEPES缓冲液。

2.如权利要求1所述精子显微操作制动液，其特征在于所述制动液组成为：10mg/mL羧甲基纤维素，0.5μg/L的17β-雌二醇，体积浓度10％人血清替代物，溶剂为MOPS缓冲液。

3.一种权利要求1所述精子显微操作制动液在制备精子显微检测条中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述检测条按如下方法制备：将精子显微操作制动液制成长条形液滴，依次分为加样区、优选区和收集区；表面覆盖矿物油或石蜡油与空气隔离，于37℃，饱和湿度的培养箱中平衡6小时以上，制成精子显微检测条。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述精子显微检测条长20～40mm、宽3～4mm。

6.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述加样区占精子显微检测条总长1/5；优选区占显微检测条总长2/5；收集区占显微检测条总长2/5。

7.一种权利要求1所述精子显微操作制动液在制备卵胞浆内单精子注射试剂中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述注射试剂由精子显微操作制动液和精子注射液组成，所述精子注射液组成为：15～25mg/mL羧甲基纤维素，体积浓度10％人血清替代物，溶剂为MOPS或HEPES缓冲液。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述精子注射液组成为：20mg/mL羧甲基纤维素，体积浓度10％人血清替代物，溶剂为MOPS缓冲液。

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