CN112590203B

CN112590203B - 一种负载药物、活性因子、细胞的可控梯度支架及其3d打印方法和专用多喷头3d打印机

Info

Publication number: CN112590203B
Application number: CN202011489540.2A
Authority: CN
Inventors: 阮长顺; 彭刘琪; 陈志刚; 王品品; 吴明明
Original assignee: Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Current assignee: Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Priority date: 2020-12-16
Filing date: 2020-12-16
Publication date: 2022-09-30
Anticipated expiration: 2040-12-16
Also published as: CN112590203A

Abstract

本申请涉及生物组织和器官3D打印的技术领域，尤其是涉及一种负载药物、活性因子、细胞的可控梯度支架及其3D打印方法和多喷头3D打印机。本申请的可控梯度支架一步交替打印成型；一体化梯度支架至少包括有两种材料：第一材料和第二材料；第一材料负载有负载药物、活性因子或细胞的一种或多种；第二材料负载有负载药物、活性因子或细胞的一种或多种；第一材料和第二材料分别交替打印后构建成一体化梯度支架。本申请构建的负载药物、活性因子、细胞一体化梯度支架不存在双层梯度界面不牢固，易脱落的问题。本申请使用多喷头交替打印的方式构建三维细胞的一体化梯度支架，为实现生物体复杂组织器官的构建提供了基础。

Description

一种负载药物、活性因子、细胞的可控梯度支架及其3D打印方法和专用多喷头3D打印机

技术领域

本申请涉及生物组织和器官3D打印的技术领域，尤其是涉及一种负载药物、活性因子、细胞的可控梯度支架及其3D打印方法和多喷头3D打印机。

背景技术

一直以来，研究者们试图通过组织工程的方法来构建体内复杂组织器官，以解决临床中受损组织的修复问题以及器官移植所面临的感染、排异、供体短缺等诸多问题。然而不同组织器官的功能微环境差异较大，因此，选择合适的技术在体外成功构建具有差异性功能化的组织器官，实现负载细胞且可以同时调控微环境促进修复重建作用的梯度支架具有很大的难度。

目前所使用的梯度组织器官构建方法主要有：1）传统注模的制造方式；2）开发含活细胞的可注射材料体系，微创植入缺损部位后形成多相支架；3）通过3D打印技术构建梯度支架。

第一种虽然有较精确的结构设计，但是支架本身不包含细胞，在植入缺损部位后需要引导细胞生长进入支架内部，容易导致细胞在支架内部生长不均出现“空心化”的现象，或者出现构建出来的支架孔隙较大、较难获得100μm以下的微孔的问题，以至于无法提供利于细胞生长的三维支撑环境，因此不易于细胞在培养过程中的粘附。

第二种虽然引入了外源细胞，但是所形成支架仍存在结构可控性差、无法实现精准结构的问题。

第三种目前3D打印技术打印方式比较单一，常用单喷头打印的方式，其只能打印单一材料来构建的支架。当需要两种支架的局部结构进行组合时，容易出现双层梯度界面不牢固，易脱落的问题。因此该无法实现复杂组织器官的构建。

因此，针对上述中的相关技术，发明人认为：现在技术中存在无法提供一种精密度高、且可仿生复杂组织器官的可控梯度支架的缺陷。

发明内容

为了克服上述缺陷，本申请提供一种负载药物、活性因子、细胞的可控梯度支架及其3D打印方法和多喷头3D打印机。

第一方面，本申请提供一种负载药物、活性因子、细胞的可控梯度支架，采用如下的技术方案：

一种负载药物、活性因子、细胞的可控梯度支架，包括一体化梯度支架，所述一体化梯度支架一步交替打印成型；所述一体化梯度支架至少包括有两种材料:第一材料和第二材料；所述第一材料负载有药物、活性因子或细胞的一种或多种；所述第二材料负载有药物、活性因子或细胞的一种或多种；所述第一材料和第二材料分别交替打印后构建成一体化梯度支架。

通过采用上述技术方案，本方案使用多喷头交替打印的方式构建的可控梯度的一体化梯度支架，多层结构在一组交替打印中成型，每种材料均可单独控制，精密度高，为构建具有高精密度、复杂结构的组织器官提供了基础。本方案中的第一材料和第二材料可负载药物、活性因子或细胞中的任一种或者任两种或者三种兼含再配合其它可打印材料共同构建，这样便可对生物材料的功能进行优化，为构建具有复杂功能的一体化梯度支架提供基础。综上功能，因此本方案可提供一种精密度高、且可仿生复杂组织器官的可控梯度支架。

本方案构建的可控梯度支架层数可以为几层也可以是多层支架，其梯度可以为单一梯度也可以是复杂梯度，根据实际临床需求来定。

本方案中负载药物、活性因子、细胞的一体化梯度支架是一体化支架，是一步交替打印成型的，不存在相关技术双层梯度界面不牢固，易脱落的问题。

本方案一体化梯度支架在一个整体步骤中一步交替打印成型，生产效率高，获得的生物体复杂组织器官的结构稳定性好。

优选的，所述第一材料为混合有活性因子或者药物的热塑性材料；所述第二材料为混合有细胞或者活性因子或者药物的水凝胶材料；所述第一材料和所述第二材料分别交替打印出一个结构层。

通过采用上述技术方案，本方案中第一材料中的热塑性高分子具有支撑能力，并可负载入药物或活性因子；第二材料负责构建生物相容性好的微生物环境且负责负载细胞的功能。两种材料结合交替打印获得一个结构层。

优选的，所述活性因子为β-磷酸三钙、生物玻璃中的一种；

所述热塑性材料为聚己内酯、聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚L-丙交酯-己内酯中的一种或几种；

所述细胞为软骨细胞，骨髓间充质干细胞，内皮细胞，神经细胞中的一种或几种；

所述药物为抗炎、止痛药的一种或两种。

通过采用上述技术方案，本方案中生物活性因子可以为负载的细胞提供必要的生物微环境，诱导细胞的特异性分化，如软骨层负载细胞向软骨分化，而软骨下骨层向成骨分化，或者其他功能等，因此可以替换成其他具有诱导生物活性的因子。本方案中的水凝胶材料也可以换成其他生物相容性良好的材料，其多孔结构能够为细胞的黏附和增殖提供场所。本方案中的热塑性材料也可以替换成其它具有打印预形状功能的材料。本方案中一体化梯度支架的形貌为人体或动物的组织或器官，例如骨、耳朵、肝脏等组织器官。本方案中细胞可为单一种类细胞，也可为多种类按比例混合的多细胞，可实现生物体复杂组织器官的构建。本方案的第一材料也可以负载有不同功能的药物。

优选的，所述第一材料和所述第二材料交替打印的结构层还设有顶层，顶层涂覆有第三材料；所述第三材料为混合有活性因子或者药物的水凝胶材料。

通过采用上述技术方案，本方案中增加的第三材料，用于复合其它功能，以满足复杂且具有精密仿生结构的一体化梯度支架的构建。此处主要提供药物的第二个负载场所，第三材料负载的药物，可以用来缓慢释放药物，帮助人体或动物体装入一体化梯度支架后的辅助治疗。

优选的，所述第一材料和所述第二材料交替打印的结构层底部还连接有由第四材料打印而成的底层，所述第四材料为混合有活性因子或者药物的热塑性材料。

通过采用上述技术方案，底层和第四材料为复杂组织器官的构建提供了可能。具体使用时第四材料和第一材料有相似性，区别在于带有的活性因子不同。

第二方面，本申请提供一种负载药物、活性因子、细胞的可控梯度支架的3D打印方法，采用如下的技术方案：

一种负载药物、活性因子、细胞的可控梯度支架的3D打印方法，其步骤如下：

S1. 打印材料准备:将热塑性材料与活性因子或药物混合作为第一种打印墨水；将混合有细胞或者活性因子或者药物的水凝胶作为第二种打印墨水；

S2.在3D生物打印机的各喷头的通道内装载各打印墨水；

S3.一步交替打印：第一种打印墨水通过3D生物打印机带有温控通道的喷头喷出，第二种打印墨水通过3D生物打印机的另一喷头喷出,第一材料和第二材料交替打印，获得一体化梯度支架半成品；

S4.固型：一体化梯度支架半成品打印完成后，放于紫外交联仪中进行光固型，使一体化梯度支架半成品塑化成型；

S5.培养增殖：将塑化成型的一体化梯度支架取出，加入培养基，放置于培养箱中培养，使细胞在水凝胶的孔隙中黏附并增殖，最后获得一体化梯度支架的成品。

通过采用上述技术方案，本方案中至少可以配制两种打印墨水，墨水根据实际临床需求进行调整。该两种墨水使用多喷头交替打印的方式构建可控梯度的一体化梯度支架，可以实现结构的个性化定制，本方案最终可以提供一种精密度高、且可仿生复杂组织器官的可控梯度支架。

优选的，所述步骤S4之前，还包括步骤涂覆:在一体化梯度支架半成品的顶层涂覆第三材料。

通过采用上述技术方案，第三材料负载有药物，可以用来缓慢释放药物，帮助人体或动物体装入一体化梯度支架后的辅助治疗。

第三方面，本申请提供一种多喷头3D打印机，采用如下的技术方案：

一种多喷头3D打印机，包括多喷头3D打印机本体，所述多喷头3D打印机本体至少包括有两个喷头,第一喷头和第二喷头；所述第一喷头带有温控通道，温控通道内装载有由热塑性材料与活性因子或药物混合形成的第一种打印墨水；所述第二喷头的通道内装载混合有细胞或者活性因子或者药物的水凝胶材料的第二种打印墨水。

通过采用上述技术方案，提供了一种装载有多种墨水、用于打印一体化梯度支架的专用多喷头3D打印机。该种多喷头3D打印机具有多喷头，可以进行交替打印，用于构建复杂且具有精密仿生结构的可控梯度的支架。

优选的，多喷头3D打印机打印方法如下:

第一步：校正打印中所用到的各通道位置，并使与通道相连的所有喷头底部均在同一水平线上；

第二步：所述第一喷头和第二喷头相对上下左右移动进行打印：打印过程中打印基体静止，每完成第一材料或者第二材料的打印，第一喷头和第二喷头的位置均上移；根据预先设计的打印基体的形状打印，打印下一材料时，第一喷头或第二喷头下降进行打印；如此循环，第一喷头和第二喷头交替打印，直至完成打印。

通过采用上述技术方案，提供了一种多喷头3D打印机的打印方法，该打印过程简单灵活，可适用于复杂且具有精密仿生结构的可控梯度的支架的打印。

综上所述，本申请包括以下至少一种有益技术效果：

1.本申请负载药物、活性因子、细胞的一体化梯度支架是一体化支架，是一步交替打印成型的，不存在双层梯度界面不牢固，易脱落的问题；

2.本申请一体化梯度支架可为细胞提供较好的生长空间，有效地解决细胞在支架上粘附率低及向支架内部生长缓慢的问题；

3.本申请一体化梯度支架具有一定组分和结构设计性，可以精准仿生体内组织、器官复杂性和异质性，进一步推动生物3D打印体外构建组织、器官的可行性；

4.本申请一体化梯度支架在实际构建过程中，可以按照临床需求设计特定外形和内部结构，实现结构的个性化定制；

5.本申请一体化梯度支架的打印方法采用了温控打印和多喷头交替打印的方法，这种打印方法可以构建负载药物、活性因子、细胞的不同梯度的支架，甚至构建其它更为复杂的组织器官；

6.本申请一体化梯度支架打印方法中的固型步骤采用紫外光固化法，该方法温和且对细胞的损伤较少；

7.本申请一体化梯度支架打印方法实现了在体外精确构建人体或动物的组织或器官的可能；

8.本申请多喷头3D打印机打印的一体化梯度支架的形状与程序设计相关联，可根据不同需求设计程序，打印出不同形貌的一体化梯度支架。

附图说明

图1是本申请实施例1多喷头构建具有缓释抗炎药的含细胞仿生骨软骨一体化支架的过程图。

图2是本申请实施例1打印的软骨下骨层支架的形貌。

图3是本申请实施例1扫描电镜观察的软骨下骨层支架表面形貌。

图4是本申请实施例1打印的软骨层支架的形貌。

图5是本申请实施例1扫描电镜观察的软骨层支架表面形貌。

图6是本申请实施例1培养增殖后的骨软骨一体化支架图片；图中，A展示面为正面，B展示面为切开后的正面。

图7是本申请实施例2大尺寸骨组织支架的形貌。

图中，1、打印墨水一；2、打印墨水二；3、打印墨水三；4、具有缓释抗炎药物的含细胞骨软骨一体化支架；5、涂物。

具体实施方式

以下结合附图1-7对本申请作进一步详细说明。

本申请实施例公开一种负载药物、活性因子、细胞的可控梯度支架，是一种负载药物、活性因子或者细胞三者中的任一种或者任两种或者三种兼含再配合其它可打印材料所共同构建的一体化梯度支架。其中，所负载的药物可以是单一一种或多种类按比例混合的药物；所负载的活性因子可以是单一一种或多种类按比例混合的活性因子；所用到的细胞可为单一种类细胞，也可为多种类按比例混合的多细胞。所构建的一体化梯度支架层数可以为几层也可以是多层支架，其梯度可以为单一梯度也可以是复杂梯度，依实际临床需求来定。本申请的一体化梯度支架可用作于人体或动物体的复杂组织或器官。

本申请的一体化梯度支架一步交替打印成型，其至少包括有两种材料，第一材料、第二材料和第三材料。第一材料为混合有活性因子或者药物的热塑性材料。第二材料为混合有细胞或者活性因子或者药物的水凝胶材料。第一材料和第二材料交替打印构建一个结构层。该结构层还可以设置顶层，顶层涂覆第三材料，第三材料为混合有活性因子或者药物的水凝胶材料。结构层底部还连接有由第四材料打印而成的底层，第四材料为混合有活性因子或者药物的热塑性材料。底层的第四材料和第一材料有相似性，区别在于在应用例中带有的活性因子不同；顶层的第三材料和第二材料也有相似性。

下文以骨软骨一体化支架和大尺寸骨组织支架为示例进行说明。下文中构建的骨软骨一体化支架，其结构也可以设计成其它复杂结构，如骨、耳朵、肝脏等组织器官。这些复杂组织器官如具有其它结构层，例如第二结构层，第二结构层的材料可以参照上述结构层的两种材料，采用两种材料交替打印而成，或者第二结构层也可以仅仅由热塑性材料混合活性因子构建而成。

实施例1骨软骨一体化支架

本实施例1的骨软骨一体化支架从下至上依次包括软骨下骨层支架、软骨层支架和含有抗炎药的水凝胶层，三层结构牢固连接。

其中，软骨下骨层支架由含有聚己内酯和β-磷酸三钙的打印墨水一1打印而成，使用的聚己内酯的分子量为10000～100000，β-磷酸三钙的含量为5%～40%；

软骨层支架由两种墨水材料交替打印而成，分别为含有聚己内酯和小分子有机化合物Kartogenin（KNG）的打印墨水二2、含有双键透明质酸、人体髓间充质干细胞hBMSCs、紫外光引发剂、水的打印墨水三3；其中，打印墨水二2使用的聚己内酯的分子量为10000～100000， KNG的质量百分比为1wt%；打印墨水三3使用的含有双键透明质酸的质量分数为5%～30%，人体髓间充质干细胞hBMSCs的密度为1×10⁶～5×10⁶CFU/mL，紫外光引发剂的含量为0.05%～0.1%，其余组分为水；

水凝胶层由双键透明质酸混合含有蛋白酶敏感度的多肽和双氯酸芬钠的混合物构成；使用的双键透明质酸的质量分数为5%～30%、多肽的含量为4～16mg/mL，双氯芬酸钠的含量为20～80 mg/mL。

打印墨水一1和打印墨水二2的主要作用是为骨软骨一体化支架提供支撑力。打印墨水三3的主要作用是实现细胞在骨软骨一体化支架上的精准投递，从而打印出具有类似真实组织器官功能的骨软骨一体化支架。

参照图1，本实施例1的骨软骨一体化支架的具体获得方法如下：

S1.打印材料准备：将聚己内酯（Mw=14000、分子量为100000）和β-磷酸三钙（含量为20%）以4：1的重量比例在60℃溶解混匀，获得打印墨水一1；将聚己内酯（Mw=14000、分子量为100000）和KGN（1wt%）以1：1的重量比例混合均匀，获得打印墨水二2；将双键透明质酸（质量分数为5%）与人体髓间充质干细胞hBMSCs（2×10⁶ CFU/mL）、紫外光引发剂(含量为0.01%)、其余组成成分为水，四者混合，获得打印墨水三3；将双键透明质酸与多肽(10 mg/mL)、双氯酸芬钠（50 mg/mL）混合，三者体积比为1：0.5：0.5，获得含抗炎药的涂物。

S2.在3D生物打印机的各喷头的通道内装载各打印墨水，第一个喷头的温控通道装载打印墨水一1；第二个喷头的温控通道装载打印墨水二2；第三个喷头的通道装载打印墨水三3。

S3.3D生物打印机第一个喷头的温控通道先打印打印墨水一1，构建软骨下骨层支架，软骨下骨层支架打印4层共1 mm。软骨下骨层支架形貌参见图2和图3。

S4. 软骨层支架的一步交替打印：3D生物打印机的第二个喷头的温控通道在软骨下骨层支架上打印打印墨水二2， 3D生物打印机的第三个喷头的通道在打印墨水二2构建的基体上打印打印墨水三3；第二个喷头的温控通道和第三个喷头的通道随后交替打印，以保证人体髓间充质干细胞在软骨层支架中的分布，构建成软骨层支架。软骨层支架形貌参见图4和图5。第二个喷头和第三喷头完成一组交替打印形成的软骨层支架为一层，软骨层支架打印6层共1.5 mm。

S5.涂覆：在软骨层支架的顶层涂敷含抗炎药的涂物5，用来缓慢释放抗炎药，最终形成骨软骨一体化支架。水凝胶层厚度优选控制在0.5 mm。

S6.固型：骨软骨一体化支架打印完成后，放置于紫外交联仪中进行光固型300s，使骨软骨一体化支架塑化成型。

S7.培养增殖：将塑化成型的骨软骨一体化支架取出，加入α-MEM培养基，放置于37℃培养箱中培养，使人骨髓间充质干细胞在双键透明质酸的孔隙中黏附并增殖，得到最终的具有缓释抗炎药物的含细胞骨软骨一体化支架4，其形貌参见图6。

本实施例1中软骨下骨层支架和软骨层支架的层高比例根据临床需求设计打印。

实施例2大尺寸骨组织支架

大尺寸骨组织支架由两种材料在一种多喷头3D生物打印机中一步交替打印成型。

其中，第一材料为由聚己内酯和β-磷酸三钙构成的打印墨水一，使用的聚己内酯的分子量为10000～100000，β-磷酸三钙的含量为5%～40%；

第二材料为由双键接枝的明胶、双键接枝的海藻酸钠、紫外光引发剂、水、人骨髓间充质干细胞和人脐静脉内皮细胞混合的打印墨水四；使用的双键接枝的明胶的质量分数为5%～20%、双键修饰的海藻酸钠质量分数为1%～10%、紫外光引发剂0.05%～0.1%，其余组分为水；人骨髓间充质干细胞和人脐静脉内皮细胞的密度均控制在1×10⁶～3×10⁶CFU/mL。

本实施例2的大尺寸骨组织支架的具体获得方法如下：

S1.打印材料准备：将聚己内酯（Mw=14000）和β-磷酸三钙以4：1的重量比例在60℃溶解混匀，获得打印墨水一；将双键接枝的明胶（8%）、双键接枝的海藻酸钠（2%）、紫外光引发剂(0.01%)和水，四者混合得到的水凝胶，再将水凝胶包裹人骨髓间充质干细胞（1.5×10⁶ CFU/mL）和人脐静脉内皮细胞（1.5×10⁶ CFU/mL），其中两种细胞的体积比例设置为1：1，最后获得打印墨水四；

S2.在3D生物打印机的各喷头的通道内装载各原打印墨水，3D生物打印机的第一个喷头的温控通道内装载打印墨水一，3D生物打印机的第二个喷头的通道内装载打印墨水四。

S3. 大尺寸骨组织的一步交替打印：3D生物打印机的第一个喷头的温控通道打印打印墨水一；3D生物打印机的第二个喷头的通道在支撑支架层上打印打印墨水四；第一个喷头的温控通道和第二个喷头的通道随后交替打印，构建大尺寸骨组织支架。两个喷头一组交替打印后获得的大尺寸骨组织支架为一层。大尺寸骨组织共打印134层共约4cm高，内径8mm，外径20mm。

S4.固型：构建的大尺寸骨组织支架打印完成后，放置于紫外交联仪中进行光固型60～100s，使大尺寸骨组织支架塑化成型。

S5.培养增殖：将塑化成型的大尺寸骨组织支架取出，加入α-MEM培养基，放置于37℃培养箱中培养，使人骨髓间充质干细胞和人脐静脉内皮细胞在水凝胶层的孔隙中黏附并增殖，得到真正的大尺寸骨组织支架，其形貌参见图7。

上述实施例1或实施例2中：

（1）聚己内酯可替换成其它热塑性且具有打印预形状的材料，例如聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚L-丙交酯-己内酯等的一种或多种；

（2）具有成骨作用的β-磷酸三钙可替换成其它具有调节微环境功能的活性材料，例如生物玻璃等；

（3）具有成软骨作用的小分子有机化合物Kartogenin（KGN）可替换成其它具有促软骨分化的活性组分；

（4）使用到的细胞可根据实际临床需求，采用软骨细胞、骨髓间充质干细胞、内皮细胞、神经细胞等的一种或多种细胞；

（5）双键修饰的透明质酸作为细胞载体，为细胞的黏附增殖提供场所，因此双键修饰的透明质酸也可替换为改性后的明胶、胶原、壳聚糖等生物相容性好的生物材料；

（6）透明质酸的双碱修饰方法也不限于双键接枝，其它方法，例如采用接枝酪胺基团酶交联的方法获得的双键修饰的透明质酸同样可行；

（7）固型方法除了使用紫外光固化法，其它聚合方法也可使用，例如酶交联、离子交联等方法。

本申请实施例还公开一种负载药物、活性因子、细胞的可控梯度支架的3D打印方法的专用多喷头3D打印机。多喷头3D打印机本体包括有多个喷头，但至少包括有两个喷头,第一喷头和第二喷头；第一喷头至少带有温控通道，温控通道内装载有由热塑性材料与活性因子或药物混合形成的打印墨水一；第二喷头为普通的通道，通道内装载混合有细胞或者活性因子或者药物的水凝胶材料的打印墨水二。由至少该两种喷头进行温控打印和交替打印。

多喷头3D打印机的第一喷头和第二喷头均受气压或者电压驱动喷墨，气压或者电压驱动对带有活性因子的打印墨水一和带有细胞的打印墨水二产生作用力的同时又不会对打印材料造成伤害、或影响打印材料的活性。

本申请实施例专用多喷头3D打印机的打印方法如下:第一步：校正打印中所用到的各通道位置，并使与通道相连的所有喷头底部均在同一水平线上。以最先出料的喷头为基准，调整喷头在打印平台上的位置。

第二步：第一喷头和第二喷头相对上下左右移动进行打印：打印过程中打印基体静止，每完成第一材料或者第二材料的打印，第一喷头和第二喷头的位置均上移；根据预先设计的打印基体的形状，打印下一材料时，第一喷头或第二喷头下降进行打印；如此循环，第一喷头和第二喷头交替打印，直至完成打印。

上述打印过程全部在生物安全柜中完成，以确保整体操作环境无菌。打印基体的形状与多喷头3D打印机的程序设计有关，可根据不同需求设计程序，打印出不同形貌、尺寸或梯度的一体化梯度支架。

以上均为本申请的较佳实施例，并非依此限制本申请的保护范围，故：凡依本申请的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本申请的保护范围之内。

Claims

1.一种负载药物、活性因子、细胞的可控梯度支架的3D打印方法，其特征在于，所述负载药物、活性因子、细胞的可控梯度支架包括一体化梯度支架，从下至上依次包括软骨下骨层支架、软骨层支架和含有抗炎药的水凝胶层，三层结构牢固连接；所述一体化梯度支架包括至少两种材料的第一材料和第二材料；所述第一材料和第二材料分别交替打印后构建成该软骨层支架;

所述第一材料为混合有活性因子或者药物的热塑性材料；所述第二材料为混合有细胞或者活性因子或者药物的水凝胶材料，所述第一材料和所述第二材料分别交替打印出该软骨层支架;

所述第一材料和所述第二材料交替打印的结构层上还设有顶层，顶层涂覆有第三材料；所述第三材料为混合有活性因子或者药物的水凝胶材料,以形成该水凝胶层;

所述第一材料和所述第二材料交替打印的结构层的底部还连接有由第四材料打印而成的底层，所述第四材料为混合有活性因子或者药物的热塑性材料,以形成该软骨下骨层支架;

该3D打印方法包括步骤如下：

S1. 打印材料准备:将热塑性材料与活性因子或药物混合为打印墨水一(1)与打印墨水二(2)；将混合有细胞或者活性因子或者药物与紫外光引发剂的水凝胶作为打印墨水三(3)；

S2.在3D生物打印机的各喷头的通道内装载各打印墨水，其中第一喷头的温控通道装载打印墨水一(1)；第二喷头的温控通道装载打印墨水二(2)；第三喷头的通道装载打印墨水三(3)；

S3.第一喷头的温控通道先打印打印墨水一(1)，构建该软骨下骨层支架；

S4.一步交替打印：打印墨水二(2)通过3D生物打印机带有温控通道的第二喷头喷出，打印墨水三(3)通过3D生物打印机的第三喷头喷出,第二喷头和第三喷头交替打印，构建成该软骨层支架；

S5.涂覆：在该软骨层支架的顶层涂敷含抗炎药的涂物(5)，用来缓慢释放抗炎药，最终形成骨软骨一体化支架；

S6.固型：一体化梯度支架半成品打印完成后，放于紫外交联仪中进行光固型，使一体化梯度支架半成品塑化成型；

S7.培养增殖：将塑化成型的一体化梯度支架取出，加入培养基，放置于培养箱中培养，使细胞在水凝胶的孔隙中黏附并增殖，得到最终的具有缓释抗炎药物的含细胞骨软骨一体化支架(4)；

S1的打印材料准备具体为将Mw=14000的聚己内酯和具有成骨作用含量20%的β-磷酸三钙以4：1的重量比例在60℃溶解混匀，获得打印墨水一(1)；将Mw=14000的聚己内酯和具有成软骨作用1wt%的小分子有机化合物Kartogenin（KGN）以1：1的重量比例混合均匀，获得打印墨水二(2)；将作为细胞载体且质量分数5%的双键透明质酸与2×10 CFU/mL的人体髓间充质干细胞hBMSCs、含量0.01%的紫外光引发剂、其余组成成分为水，四者混合，获得打印墨水三(3)；将双键透明质酸、10 mg/mL的多肽、50 mg/mL的双氯酸芬钠混合，三者体积比为1：0.5：0.5，获得含抗炎药的涂物(5)。

2.根据权利要求1所述的3D打印方法，其特征在于，使用的多喷头3D打印机的方法包括：

第二步：第二喷头和第三喷头相对上下左右移动进行打印：打印过程中打印基体静止，每完成第一材料或者第二材料的打印，第二喷头和第三喷头的位置均上移；根据预先设计的打印基体的形状打印，打印下一材料时，第二喷头或第三喷头下降进行打印；如此循环，第二喷头和第三喷头交替打印，直至完成打印。