CN112587712B - 基于纳米纤维空间结构可控的复合细菌纤维素敷料及制法 - Google Patents

基于纳米纤维空间结构可控的复合细菌纤维素敷料及制法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于纳米纤维空间结构可控的复合细菌纤维素敷料及制法，首先将明胶基水溶液滴加到含有蛋白成分的非织造材料上，待干燥后，向其上滴加培养菌液，直至复合非织造材料吸附培养菌液饱和后，加入发酵培养液进行静置培养，最后将静置培养得到的复合物浸入浓度为0.1～1wt％的曲拉通水溶液中进行纯化后干燥制得非织造材料复合细菌纤维素敷料；制得的敷料具有疏密结构，具体是非织造的微米级纤维上分布着细菌纤维素的纳米纤维，且纳米纤维的分布与疏密程度可调。本发明制得的非织造材料复合细菌纤维素敷料具有良好的生物相容性、力学性能和吸收伤口渗出液性能，在伤口敷料、人体修复材料和组织工程材料等生物医用领域具有巨大的应用前景。

Description

基于纳米纤维空间结构可控的复合细菌纤维素敷料及制法
技术领域
本发明属于生物医用材料技术领域，涉及一种基于纳米纤维空间结构可控的复合细菌纤维素敷料及制法，特别涉及一种基于纳米纤维空间结构可控的复合细菌纤维素敷料及其制备方法。
背景技术
人体皮肤是人体最大的器官，是人体的天然屏障，对维持体内环境的稳定和阻止微生物入侵起重要作用，人们在生产、生活中难免造成许多种类的伤口。使用敷料覆盖暴露的创面是临床上常用的一种治疗伤口的方法。一个性能优良的创面敷料可以起到皮肤的部分功能，提供一个有利于创面愈合的潮湿环境，甚至起到保护阻止细菌入侵的作用，等待创面上皮化或过渡到重建永久性皮肤屏障。
细菌纤维素(Baterial Cellulose BC)是由微生物在温和条件下通过代谢糖源，并分泌于体外的一种胞外多糖，是自然界纤维素的一种存在形式。与植物或海藻纤维素具有相同的化学组成外，还具有独特的物理、化学和机械性质：超细网状结构；高抗张强度和弹性模量；高亲水性，有良好的透气、吸水、透水性能，并有非凡的持水性和高湿强度。大量研究表明细菌纤维素具有良好的体内、体外生物相容性和良好的生物可降解性，以及极好的形状维持性能和形状可调控性。采用细菌纤维素制成的伤口护理产品可以为伤口提供促进愈合的动态湿性微环境；其超细的三维纳米网络结构能够模拟细胞外基质，进一步促进上皮化过程；并且可以任意裁剪，与皮肤有极好的伏贴性，具有一定的镇痛效果；其优异的机械性能和抗张强度使得产品具有一定的可缝性，便于固定。因此采用医用细菌纤维素制备的湿性敷料有望成为一种较理想的慢性伤口护理产品。
细菌纤维素皮肤修复材料具有优异的生物相容性和良好的力学性能；与现有的水凝胶、水胶体、泡沫材料相比具有完美的吸液/给液平衡(HydroBalance)性能；超细的网络结构可以与创面紧密贴合，与皮肤黏附性好，无需额外添加粘胶剂避免换药时的二次损伤；可模拟细胞外基质结构促进细胞增殖和迁移，加快伤口愈合。目前已成功将细菌纤维素应用于伤口敷料产品的主要有：德国Lohmann&Rauscher公司的
Figure BDA0002841988040000011
X湿性敷料，巴西BioFill公司的
Figure BDA0002841988040000012
和
Figure BDA0002841988040000013
美国Xylos公司的
Figure BDA0002841988040000014
等皮肤创伤修复敷料产品。国外大量报道中，细菌纤维素已经被用于伤口敷料领域，尤其在应对老人褥疮、糖尿病足等难愈渗出型伤口方面具有卓越的表现。大量的临床报道中，细菌纤维素皮肤修复产品用于治疗慢性下肢静脉溃疡，与标准治疗方法作为对照，BC产品能够有效地自溶清创，肉芽组织形成时间短，能够显著加快慢性伤口愈合，减轻疼痛。但是BC皮肤修复材料也存在一些问题：目前的
Figure BDA0002841988040000015
X和
Figure BDA0002841988040000016
X PHMB产品在使用时都需要使用二级敷料。二级敷料的使用主要是为了控制湿性BC敷料的水蒸气透过率、提供阻菌屏障并固定敷料。虽然有报道称，BC表面的纳米网络结构可以阻止细菌入侵，但是其水蒸气透过率较大，在无二级敷料配合时失水速率较快。
因此，本专利以细菌纤维素材料制备具有模拟皮肤微环境的功能化敷料为目标。在已有的医用纤维水刺非织造材料的基础上，采用发酵培养方式复合细菌纤维素材料，构建由纳米纤维、微米纤维到疏密双层结构可控的非织造材料复合细菌纤维素敷料，使其在伤口护理过程中具有阻菌、控制伤口微环境、促进伤口愈合等功能。
发明内容
本发明的目的是解决现有技术中存在的上述问题，提供一种基于纳米纤维空间结构可控的复合细菌纤维素敷料及制法。本发明以模拟皮肤微环境的功能化敷料为目标，采用细菌纤维素发酵培养技术设计并构建微米级纤维、纳米级纤维、疏密双层可控的非织造材料复合细菌纤维素敷料。利用表面电荷作用，调控纳米纤维在非织造材料的空间分布，克服了目前细菌纤维素敷料产品缺少二级敷料保护、纳米纤维分布均质化、纤维结构调控方法有限的难题，得到一种基于纳米纤维空间结构可控的复合细菌纤维素敷料。本发明提供的一种基于纳米纤维空间结构可控的复合细菌纤维素敷料的制备方法为：首先将明胶基水溶液滴加到含有蛋白成分的非织造材料上，待干燥后，在其上滴加培养菌液，直至复合非织造材料吸附培养菌液饱和后，加入发酵培养液进行静置培养，最后将静置培养得到的复合物浸入浓度为0.1～1wt％的曲拉通水溶液中进行纯化后干燥制得非织造材料复合细菌纤维素敷料。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种基于纳米纤维空间结构可控的复合细菌纤维素敷料的制备方法，包括如下步骤：
(1)首先将明胶基水溶液滴加到含有蛋白成分的非织造材料上，经干燥得到复合型非织造材料；
(2)然后向步骤(1)得到的复合型非织造材料上滴加培养菌液，直至复合型非织造材料吸附培养菌液饱和后，加入菌株培养液进行静置培养；
(3)最后将步骤(2)中静置培养得到的复合物浸入浓度为0.1～1wt％的曲拉通水溶液中进行纯化后冷冻干燥制得基于纳米纤维空间结构可控的复合细菌纤维素敷料；曲拉通是非离子表面活性剂，在生物领域常用来进行各种组织脱细胞基质的制备，曲拉通能够溶解细胞膜及相关蛋白，达到清除组织中细胞成分的目的；本发明中将静置培养得到的复合物浸入在浓度为0.1～1wt％的曲拉通水溶液中，其目的是破坏发酵细菌的菌体，然后通过反复纯水的冲洗，达到彻底清除复合物中的细菌残留；
步骤(1)中，明胶基水溶液是将明胶基成分溶于水后调节pH值为5～7得到；复合型非织造材料中明胶基成分含量为0.1～5wt％；明胶基成分为明胶颗粒和蛋白组分；当溶液pH值高于物质等电点时，物质表面带负电；当溶液pH值低于物质等电点时，物质表面带正电；上述明胶基水溶液中的物质等电点均大于7，含有蛋白成分的非织造材料中的蛋白成分等电点均小于5，因此在这里调节pH值为5～7时，明胶基水溶液中的物质表面带正电，含有蛋白成分的非织造材料表面带负电，明胶基水溶液中的物质会在静电力作用下吸附到非织造材料的纤维表面；
步骤(2)中，加入的发酵培养液的液面高度高于复合型非织造材料上表面4～20mm；所述培养菌液是在浓缩菌液中加入菌株培养液并均匀分散得到；
所述培养菌液中的菌株细胞密度为103～1013个/mL；
所述浓缩菌液由等电点为3.5～4的菌株依次经过活化、扩增和离心的工序获得；浓缩菌液是经过活化、扩增和离心工序得到，从而可以确保最终得到菌株细胞密度可控的培养菌液；
所述离心的转速为2000～8000r/min，时间为3～5min；离心的转速与时间需要一定的调控，转速过高或者时间过长，会使细菌菌体团聚，后面不易分散，而且会造成细菌菌体损伤，影响活率；如果转速过低或者时间较短，细菌没有完全离心下来，造成细菌菌体随上清液丢弃；
所述菌株培养液是通过调节所述发酵培养液的pH值为5.0～6.0得到；调节pH值的方式为：采用加入柠檬酸和/或醋酸降低pH值，采用加入氢氧化钠和/或碳酸氢钠提高pH值。
作为优选的技术方案：
如是所述的一种基于纳米纤维空间结构可控的复合细菌纤维素敷料的制备方法，所述含有蛋白成分的非织造材料是由含有蛋白成分的医用短纤维经水刺非织造加工得到；含有蛋白成分的医用短纤维平均直径为5～50μm；
所述含有蛋白成分的医用短纤维是将蛋白溶液加入到医用纤维纺丝溶液体系中，经湿法纺丝得到；
含有蛋白成分的医用短纤维中蛋白的含量为0.1～5wt％；
蛋白溶液为蚕丝蛋白、角质蛋白、还原角蛋白、血清蛋白、鱼胶蛋白、卵白蛋白、粘蛋白和血纤蛋白的一种以上的溶液；蛋白溶液的浓度为0.5～10wt％；
医用纤维是指粘胶纤维、莱赛尔纤维、壳聚糖纤维和海藻酸纤维中的一种纤维或两种以上纤维混纺而成；
含有蛋白成分的非织造材料克重为40～200g/m2。
如上所述的一种基于纳米纤维空间结构可控的复合细菌纤维素敷料的制备方法，步骤(1)中明胶基水溶液的配置过程为：将明胶基成分溶于去离子水中，在35～45℃的温度条件下搅拌1～6h得到；明胶基水溶液中明胶颗粒的含量为1～3wt％，蛋白组分的含量不高于1wt％；所述蛋白组分为牛血清白蛋白、血红蛋白和肌红蛋白的一种以上；
干燥为自然干燥、烘箱干燥或者冷冻干燥；自然干燥是在室温(25℃)下干燥12～48h；烘箱干燥的温度为35～50℃，时间为1～6h；冷冻干燥是在-20℃温度条件下冷冻6～24h，再真空干燥12～24h。
如上所述的一种基于纳米纤维空间结构可控的复合细菌纤维素敷料的制备方法，步骤(2)中复合型非织造材料吸附培养菌液饱和后在28～37℃的温度条件下静置10min～2h，之后再加入发酵培养液进行静置培养；
静置培养的温度为28～32℃，时间为5～9天；
所述发酵培养液是由如下含量的各组分配制而成：
Figure BDA0002841988040000041
发酵培养液中柠檬酸与磷酸氢二钠，磷酸二氢钾与磷酸氢二钾可以形成两组缓冲溶液体系，对于pH的调节与稳定有重要意义。
如上所述的一种基于纳米纤维空间结构可控的复合细菌纤维素敷料的制备方法，所述均匀分散是指采用漩涡混匀器在500～1000rpm下连续振动10～30s。
如上所述的一种基于纳米纤维空间结构可控的复合细菌纤维素敷料的制备方法，所述活化是将等电点为3.5～4的菌株置于50～500mL的发酵培养液中进行摇床培养；
摇床培养的转速为50～150r/min，温度为28～37℃，时间为6～24h。
如上所述的一种基于纳米纤维空间结构可控的复合细菌纤维素敷料的制备方法，所述扩增是将活化得到的菌液与发酵培养液按1:10～1000的体积比混合后进行静置培养；
静置培养的温度为28～37℃，时间为3～9天。
如上所述的一种基于纳米纤维空间结构可控的复合细菌纤维素敷料的制备方法，步骤(3)中将静置培养得到的复合物在曲拉通水溶液中浸泡之前用纯净水清洗2～3次，浸泡之后用纯净水洗净；
所述复合物在曲拉通水溶液中浸泡的时间为30～300min。
本发明还提供采用如上所述的方法制得的一种基于纳米纤维空间结构可控的复合细菌纤维素敷料，为由致密层和疏松层组成的疏密结构，其中致密层为细菌纤维素薄膜，疏松层为含有蛋白成分的非织造材料与细菌纤维素的复合层；致密层的厚度为0.5～10mm；疏松层的厚度为含有蛋白成分的非织造材料的厚度。疏松层是非织造材料与细菌纤维素的复合层，这里的复合是指非织造的微米级纤维上粘附有细菌菌株，然后通过发酵培养，在微米级纤维的表面生长有细菌纤维素的纳米纤维。在细菌纤维素的发酵过程中，存在其向非织造材料上表面生长，并且形成单纯细菌纤维素膜的情况。因此，疏松层的厚度就是非织造材料的厚度，这里的复合是指微米纤维与纳米纤维的交织复合；致密层厚度实际就是细菌纤维素材料向非织造材料表面生长，并且超过非织造表面的厚度，也是单纯的细菌纤维素膜的厚度。一般情况下细菌纤维素在足够高的培养液中正常培养，会在气液接触面形成较致密的纳米纤维结构，越向培养液下方纳米纤维越疏松；本发明在放置了非织造材料的基础上，限制了培养液的高低，则最终产物会在非织造材料上表面形成一定厚度的纯细菌纤维素致密层，而与非织造材料复合的部分就形成了疏松层；且致密层与疏松层的过渡是连续的整体，其内部的细菌纤维素纳米纤维是一个连续的整体，纳米纤维的平均直径为20～40nm；疏松层具体是非织造的微米级纤维上分布着细菌纤维素纳米纤维，且细菌纤维素纳米纤维的分布与疏密程度可调，细菌纤维素纳米纤维占疏松层的表面积比例为20～80％；细菌纤维素纳米纤维间的平均距离为50～1000nm。纳米纤维密度与分布可以通过调节复合蛋白的比例(即明胶基成分在非织造材料的占比)和培养菌液中的菌株细胞密度来实现。本发明用细菌纤维素纳米纤维间的平均距离(Distance between nanofiber)来表征纳米纤维在疏松层三维空间的疏密程度；用细菌纤维素纳米纤维占疏松层的表面积比例即纤维面积比(Fiber area ratio)来表征纳米纤维在疏松层三维空间的分布情况。主要测试方法如下：用图像处理软件对疏松层的场发射电镜照片进行处理，将FE-SEM图片转换为二值化，去除噪点，设置背景为黑色，纳米纤维为白色。用画线测量工具在图片上任意画一条直线，得到直线上的二值化曲线，其中相邻峰值代表细菌纤维素纳米纤维间的距离。同时，用图像处理软件可以得到某一区域内纤维面积占该区域面积的百分比。对每个样品随机选取10个以上区域进行测量，分别得到细菌纤维素纳米纤维间的平均距离与纤维面积比。
在实际的应用中，纳米纤维在疏松层三维空间中的分布主要取决于发酵培养时菌株在非织造材料中的分布。在初始发酵时，菌株表面为负电荷，菌株会主动吸附在非织造材料的明胶基成分表面，因此复合型非织造材料中明胶基成分的比例较多时，菌株分布较广泛，则纳米纤维在支架中的分布就广泛。反之亦然。其次，纳米纤维在三维空间中的疏密程度，即纳米纤维与纤维之间的距离长短，主要取决于发酵培养时菌株的细胞密度与培养时间。菌株密度越高，培养时间越长，则纳米纤维的密度越高。因此，细菌纤维素纳米纤维的空间三维结构调节可以有几种情况：1、纳米纤维在疏松层三维空间中分布广泛，且纳米纤维与纤维之间的距离较短，密度较高；2、纳米纤维在疏松层三维空间中分布广泛，但纳米纤维与纤维之间的距离较长，密度较低；3、纳米纤维在疏松层三维空间中只有零星分布，且纳米纤维与纤维之间的距离较长，密度较低；4、纳米纤维在疏松层三维空间中只有零星分布，但纳米纤维与纤维之间的距离较短，密度较高。
作为优选的技术方案：
如上所述的一种基于纳米纤维空间结构可控的复合细菌纤维素敷料，孔隙率为70～95％；内毒素小于0.5EU/mL；干态下，非织造材料复合细菌纤维素敷料中细菌纤维素的占比为0.5～10wt％。
有益效果：
(1)本发明的一种基于纳米纤维空间结构可控的复合细菌纤维素敷料的制备方法，克服了目前细菌纤维素敷料产品缺少二级敷料保护、纳米纤维分布均质化、纤维结构调控方法有限的难题；
(2)复合型非织造材料在制备过程中，蛋白分子之间具有正负电荷差异，增强了分子间作用力；同时纳米纤维贯穿致密层与疏松层，并且联通贯穿非织造材料的内部，进一步提高了复合材料的力学性能；
(3)本发明的基于纳米纤维空间结构可控的复合细菌纤维素敷料具有良好的生物相容性、低内毒素，在伤口护理过程中具有阻菌、控制伤口微环境、促进伤口愈合等功能
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
一种基于纳米纤维空间结构可控的复合细菌纤维素敷料的制备方法，步骤如下：
(1)将明胶颗粒(含量为1wt％)与牛血清白蛋白(含量为0.2wt％)溶于去离子水中，在35℃的温度条件下搅拌1h，加入柠檬酸调节pH值为5，得到明胶基水溶液；
(2)将明胶基水溶液滴加到含有蛋白成分的非织造材料上，经自然干燥，得到明胶基成分含量为0.1wt％的复合型非织造材料；其中自然干燥是在室温下干燥12h；含有蛋白成分的非织造材料的克重为40g/m2，是由含有蛋白成分(含量为0.1wt％)的平均直径为5μm的医用短纤维经水刺非织造加工得到；含有蛋白成分的医用短纤维是将蚕丝蛋白溶液(浓度为0.5wt％)加入到医用纤维(粘胶纤维)纺丝溶液体系中，经湿法纺丝得到；
(3)配置发酵培养液，具体由如下含量的各组分配制而成：
葡萄糖1wt％；
蛋白胨0.05wt％；
酵母膏0.05wt％；
柠檬酸0.01wt％；
磷酸氢二钠0.04wt％；
磷酸二氢钾0.02wt％；
磷酸氢二钾0.02wt％；
水余量。
(4)由等电点为3.5的菌株依次经过活化、扩增和离心的工序获得浓缩菌液；
(4.1)活化：将等电点为3.5的菌株置于50mL的发酵培养液中进行摇床培养，摇床培养的转速为50r/min，温度为28℃，时间为6h；
(4.2)扩增：将活化得到的菌液与发酵培养液按1:10的体积比混合后进行静置培养，静置培养的温度为28℃，时间为3天；
(4.3)离心：离心的转速为2000r/min，时间为3min；
(5)调节发酵培养液pH值为5得到菌株培养液；
(6)在步骤(4)得到的浓缩菌液中加入步骤(5)得到的菌株培养液并均匀分散得到菌株细胞密度103个/mL的培养菌液；其中，均匀分散是指采用漩涡混匀器在500rpm下连续振动10s；
(7)然后向步骤(2)得到的复合型非织造材料上滴加步骤(6)得到的培养菌液，直至复合型非织造材料吸附培养菌液饱和后，在28℃的温度条件下静置10min，之后再加入菌株培养液，在温度为28℃条件下进行静置培养5天；其中加入的发酵培养液的液面高度高于复合型非织造材料上表面4mm；
(8)先将步骤(7)中静置培养得到的复合物用纯净水清洗2次，再在浓度为0.1wt％的曲拉通水溶液中浸泡30min，之后用纯净水洗净，冷冻干燥制得基于纳米纤维空间结构可控的复合细菌纤维素敷料；其中，冷冻干燥具体为：在-20℃温度条件下冷冻6h，再真空干燥12h；
最终制得的一种基于纳米纤维空间结构可控的复合细菌纤维素敷料由致密层和疏松层组成的疏密结构，孔隙率为70％；内毒素小于0.5EU/mL；其中致密层为细菌纤维素薄膜，疏松层为含有蛋白成分的非织造材料与细菌纤维素的复合层；致密层的厚度为0.5mm；疏松层的厚度为含有蛋白成分的非织造材料的厚度；疏松层具体是非织造的微米级纤维上分布着细菌纤维素纳米纤维；细菌纤维素纳米纤维的平均直径为20nm；细菌纤维素纳米纤维占疏松层的表面积比例为20％；细菌纤维素纳米纤维间的平均距离为1000nm；干态下，非织造材料复合细菌纤维素敷料中细菌纤维素的占比为0.5wt％。
实施例2
一种基于纳米纤维空间结构可控的复合细菌纤维素敷料的制备方法，步骤如下：
(1)将明胶颗粒(含量为1.3wt％)与牛血清白蛋白(含量为0.4wt％)溶于去离子水中，在37℃的温度条件下搅拌2h，加入柠檬酸调节pH值为5，得到明胶基水溶液；
(2)将明胶基水溶液滴加到含有蛋白成分的非织造材料上，经自然干燥，得到明胶基成分含量为0.5wt％的复合型非织造材料；其中自然干燥是在室温下干燥48h；含有蛋白成分的非织造材料的克重为70g/m2，是由含有蛋白成分(含量为3wt％)的平均直径为10μm的医用短纤维经水刺非织造加工得到；含有蛋白成分的医用短纤维是将角质蛋白溶液(浓度为10wt％)加入到医用纤维(莱赛尔纤维)纺丝溶液体系中，经湿法纺丝得到；
(3)配置发酵培养液，具体由如下含量的各组分配制而成：
葡萄糖2wt％；
蛋白胨0.1wt％；
酵母膏0.2wt％；
柠檬酸0.05wt％；
磷酸氢二钠0.08wt％；
磷酸二氢钾0.04wt％；
磷酸氢二钾0.04wt％；
水余量。
(4)由等电点为3.5的菌株依次经过活化、扩增和离心的工序获得浓缩菌液；
(4.1)活化：将等电点为3.5的菌株置于100mL的发酵培养液中进行摇床培养，摇床培养的转速为60r/min，温度为30℃，时间为10h；
(4.2)扩增：将活化得到的菌液与发酵培养液按1:100的体积比混合后进行静置培养，静置培养的温度为30℃，时间为4天；
(4.3)离心：离心的转速为3000r/min，时间为3min；
(5)调节发酵培养液pH值为5得到菌株培养液；
(6)在步骤(4)得到的浓缩菌液中加入步骤(5)得到的菌株培养液并均匀分散得到菌株细胞密度105个/mL的培养菌液；其中，均匀分散是指采用漩涡混匀器在600rpm下连续振动13s；
(7)然后向步骤(2)得到的复合型非织造材料上滴加步骤(6)得到的培养菌液，直至复合型非织造材料吸附培养菌液饱和后，在30℃的温度条件下静置30min，之后再加入菌株培养液，在温度为29℃条件下进行静置培养5天；其中加入的发酵培养液的液面高度高于复合型非织造材料上表面6mm；
(8)先将步骤(7)中静置培养得到的复合物用纯净水清洗2次，再在浓度为0.2wt％的曲拉通水溶液中浸泡60min，之后用纯净水洗净，冷冻干燥制得基于纳米纤维空间结构可控的复合细菌纤维素敷料；其中，冷冻干燥具体为：在-20℃温度条件下冷冻10h，再真空干燥14h；
最终制得的一种基于纳米纤维空间结构可控的复合细菌纤维素敷料由致密层和疏松层组成的疏密结构，孔隙率为75％；内毒素小于0.5EU/mL；其中致密层为细菌纤维素薄膜，疏松层为含有蛋白成分的非织造材料与细菌纤维素的复合层；致密层的厚度为1mm；疏松层的厚度为含有蛋白成分的非织造材料的厚度；疏松层具体是非织造的微米级纤维上分布着细菌纤维素纳米纤维；细菌纤维素纳米纤维的平均直径为25nm；细菌纤维素纳米纤维占疏松层的表面积比例为40％；细菌纤维素纳米纤维间的平均距离为800nm；干态下，非织造材料复合细菌纤维素敷料中细菌纤维素的占比为1wt％。
实施例3
一种基于纳米纤维空间结构可控的复合细菌纤维素敷料的制备方法，步骤如下：
(1)将明胶颗粒(含量为1.5wt％)与牛血清白蛋白(含量为0.6wt％)溶于去离子水中，在40℃的温度条件下搅拌3h，加入醋酸调节pH值为5，得到明胶基水溶液；
(2)将明胶基水溶液滴加到含有蛋白成分的非织造材料上，经烘箱干燥，得到明胶基成分含量为1wt％的复合型非织造材料；其中烘箱干燥的温度为35℃，时间为1h；含有蛋白成分的非织造材料的克重为100g/m2，是由含有蛋白成分(含量为5wt％)的平均直径为20μm的医用短纤维经水刺非织造加工得到；含有蛋白成分的医用短纤维是将还原角蛋白溶液(浓度为1.5wt％)加入到医用纤维(壳聚糖纤维)纺丝溶液体系中，经湿法纺丝得到；
(3)配置发酵培养液，具体由如下含量的各组分配制而成：
果糖3wt％；
蛋白胨0.2wt％；
酵母膏0.4wt％；
柠檬酸0.1wt％；
磷酸氢二钠0.1wt％；
磷酸二氢钾0.06wt％；
磷酸氢二钾0.06wt％；
水余量。
(4)由等电点为3.5的菌株依次经过活化、扩增和离心的工序获得浓缩菌液；
(4.1)活化：将等电点为3.5的菌株置于150mL的发酵培养液中进行摇床培养，摇床培养的转速为80r/min，温度为32℃，时间为13h；
(4.2)扩增：将活化得到的菌液与发酵培养液按1:200的体积比混合后进行静置培养，静置培养的温度为32℃，时间为5天；
(4.3)离心：离心的转速为4000r/min，时间为4min；
(5)调节发酵培养液pH值为5得到菌株培养液；
(6)在步骤(4)得到的浓缩菌液中加入步骤(5)得到的菌株培养液并均匀分散得到菌株细胞密度108个/mL的培养菌液；其中，均匀分散是指采用漩涡混匀器在700rpm下连续振动15s；
(7)然后向步骤(2)得到的复合型非织造材料上滴加步骤(6)得到的培养菌液，直至复合型非织造材料吸附培养菌液饱和后，在32℃的温度条件下静置40min，之后再加入菌株培养液，在温度为30℃条件下进行静置培养6天；其中加入的发酵培养液的液面高度高于复合型非织造材料上表面8mm；
(8)先将步骤(7)中静置培养得到的复合物用纯净水清洗2次，再在浓度为0.3wt％的曲拉通水溶液中浸泡120min，之后用纯净水洗净，冷冻干燥制得基于纳米纤维空间结构可控的复合细菌纤维素敷料；其中，冷冻干燥具体为：在-20℃温度条件下冷冻15h，再真空干燥16h；
最终制得的一种基于纳米纤维空间结构可控的复合细菌纤维素敷料由致密层和疏松层组成的疏密结构，孔隙率为80％；内毒素小于0.5EU/mL；其中致密层为细菌纤维素薄膜，疏松层为含有蛋白成分的非织造材料与细菌纤维素的复合层；致密层的厚度为3mm；疏松层的厚度为含有蛋白成分的非织造材料的厚度；疏松层具体是非织造的微米级纤维上分布着细菌纤维素纳米纤维；细菌纤维素纳米纤维的平均直径为30nm；细菌纤维素纳米纤维占疏松层的表面积比例为50％；细菌纤维素纳米纤维间的平均距离为700nm；干态下，非织造材料复合细菌纤维素敷料中细菌纤维素的占比为3wt％。
实施例4
一种基于纳米纤维空间结构可控的复合细菌纤维素敷料的制备方法，步骤如下：
(1)将明胶颗粒(含量为1.8wt％)与血红蛋白(含量为0.8wt％)溶于去离子水中，在42℃的温度条件下搅拌4h，加入醋酸调节pH值为6，得到明胶基水溶液；
(2)将明胶基水溶液滴加到含有蛋白成分的非织造材料上，经烘箱干燥，得到明胶基成分含量为2wt％的复合型非织造材料；其中烘箱干燥的温度为50℃，时间为6h；含有蛋白成分的非织造材料的克重为130g/m2，是由含有蛋白成分(含量为4wt％)的平均直径为30μm的医用短纤维经水刺非织造加工得到；含有蛋白成分的医用短纤维是将血清蛋白溶液(浓度为8wt％)加入到医用纤维(海藻酸纤维)纺丝溶液体系中，经湿法纺丝得到；
(3)配置发酵培养液，具体由如下含量的各组分配制而成：
蔗糖4wt％；
蛋白胨0.3wt％；
酵母膏0.6wt％；
柠檬酸0.2wt％；
磷酸氢二钠0.2wt％；
磷酸二氢钾0.08wt％；
磷酸氢二钾0.08wt％；
水余量。
(4)由等电点为4的菌株依次经过活化、扩增和离心的工序获得浓缩菌液；
(4.1)活化：将等电点为4的菌株置于200mL的发酵培养液中进行摇床培养，摇床培养的转速为100r/min，温度为34℃，时间为17h；
(4.2)扩增：将活化得到的菌液与发酵培养液按1:400的体积比混合后进行静置培养，静置培养的温度为34℃，时间为7天；
(4.3)离心：离心的转速为5000r/min，时间为4min；
(5)调节发酵培养液pH值为6得到菌株培养液；
(6)在步骤(4)得到的浓缩菌液中加入步骤(5)得到的菌株培养液并均匀分散得到菌株细胞密度1010个/mL的培养菌液；其中，均匀分散是指采用漩涡混匀器在800rpm下连续振动18s；
(7)然后向步骤(2)得到的复合型非织造材料上滴加步骤(6)得到的培养菌液，直至复合型非织造材料吸附培养菌液饱和后，在34℃的温度条件下静置1h，之后再加入菌株培养液，在温度为31℃条件下进行静置培养7天；其中加入的发酵培养液的液面高度高于复合型非织造材料上表面10mm；
(8)先将步骤(7)中静置培养得到的复合物用纯净水清洗3次，再在浓度为0.4wt％的曲拉通水溶液中浸泡150min，之后用纯净水洗净，冷冻干燥制得基于纳米纤维空间结构可控的复合细菌纤维素敷料；其中，冷冻干燥具体为：在-20℃温度条件下冷冻18h，再真空干燥18h；
最终制得的一种基于纳米纤维空间结构可控的复合细菌纤维素敷料由致密层和疏松层组成的疏密结构，孔隙率为85％；内毒素小于0.5EU/mL；其中致密层为细菌纤维素薄膜，疏松层为含有蛋白成分的非织造材料与细菌纤维素的复合层；致密层的厚度为5mm；疏松层的厚度为含有蛋白成分的非织造材料的厚度；疏松层具体是非织造的微米级纤维上分布着细菌纤维素纳米纤维；细菌纤维素纳米纤维的平均直径为33nm；细菌纤维素纳米纤维占疏松层的表面积比例为60％；细菌纤维素纳米纤维间的平均距离为500nm；干态下，非织造材料复合细菌纤维素敷料中细菌纤维素的占比为5wt％。
实施例5
一种基于纳米纤维空间结构可控的复合细菌纤维素敷料的制备方法，步骤如下：
(1)将明胶颗粒(含量为2wt％)与血红蛋白(含量为0.9wt％)溶于去离子水中，在44℃的温度条件下搅拌5h，加入氢氧化钠调节pH值为6，得到明胶基水溶液；
(2)将明胶基水溶液滴加到含有蛋白成分的非织造材料上，经烘箱干燥，得到明胶基成分含量为3wt％的复合型非织造材料；其中烘箱干燥的温度为40℃，时间为4h；含有蛋白成分的非织造材料的克重为150g/m2，是由含有蛋白成分(含量为2wt％)的平均直径为35μm的医用短纤维经水刺非织造加工得到；含有蛋白成分的医用短纤维是将鱼胶蛋白溶液(浓度为8wt％)加入到医用纤维(粘胶纤维)纺丝溶液体系中，经湿法纺丝得到；
(3)配置发酵培养液，具体由如下含量的各组分配制而成：
甘露醇5wt％；
蛋白胨0.5wt％；
酵母膏0.7wt％；
柠檬酸0.3wt％；
磷酸氢二钠0.3wt％；
磷酸二氢钾0.1wt％；
磷酸氢二钾0.1wt％；
水余量。
(4)由等电点为4的菌株依次经过活化、扩增和离心的工序获得浓缩菌液；
(4.1)活化：将等电点为4的菌株置于300mL的发酵培养液中进行摇床培养，摇床培养的转速为120r/min，温度为35℃，时间为19h；
(4.2)扩增：将活化得到的菌液与发酵培养液按1:600的体积比混合后进行静置培养，静置培养的温度为35℃，时间为7天；
(4.3)离心：离心的转速为6000r/min，时间为5min；
(5)调节发酵培养液pH值为6得到菌株培养液；
(6)在步骤(4)得到的浓缩菌液中加入步骤(5)得到的菌株培养液并均匀分散得到菌株细胞密度1011个/mL的培养菌液；其中，均匀分散是指采用漩涡混匀器在900rpm下连续振动20s；
(7)然后向步骤(2)得到的复合型非织造材料上滴加步骤(6)得到的培养菌液，直至复合型非织造材料吸附培养菌液饱和后，在35℃的温度条件下静置80min，之后再加入菌株培养液，在温度为32℃条件下进行静置培养7天；其中加入的发酵培养液的液面高度高于复合型非织造材料上表面14mm；
(8)先将步骤(7)中静置培养得到的复合物用纯净水清洗3次，再在浓度为0.5wt％的曲拉通水溶液中浸泡180min，之后用纯净水洗净，冷冻干燥制得基于纳米纤维空间结构可控的复合细菌纤维素敷料；其中，冷冻干燥具体为：在-20℃温度条件下冷冻20h，再真空干燥20h；
最终制得的一种基于纳米纤维空间结构可控的复合细菌纤维素敷料由致密层和疏松层组成的疏密结构，孔隙率为90％；内毒素小于0.5EU/mL；其中致密层为细菌纤维素薄膜，疏松层为含有蛋白成分的非织造材料与细菌纤维素的复合层；致密层的厚度为7mm；疏松层的厚度为含有蛋白成分的非织造材料的厚度；疏松层具体是非织造的微米级纤维上分布着细菌纤维素纳米纤维；细菌纤维素纳米纤维的平均直径为35nm；细菌纤维素纳米纤维占疏松层的表面积比例为70％；细菌纤维素纳米纤维间的平均距离为300nm；干态下，非织造材料复合细菌纤维素敷料中细菌纤维素的占比为7wt％。
实施例6
一种基于纳米纤维空间结构可控的复合细菌纤维素敷料的制备方法，步骤如下：
(1)将明胶颗粒(含量为2.5wt％)与肌红蛋白(含量为1wt％)溶于去离子水中，在44℃的温度条件下搅拌6h，加入氢氧化钠调节pH值为7，得到明胶基水溶液；
(2)将明胶基水溶液滴加到含有蛋白成分的非织造材料上，经冷冻干燥，得到明胶基成分含量为4wt％的复合型非织造材料；其中冷冻干燥是在-20℃温度条件下冷冻6h，再真空干燥12h；含有蛋白成分的非织造材料的克重为180g/m2，是由含有蛋白成分(含量为2wt％)的平均直径为40μm的医用短纤维经水刺非织造加工得到；含有蛋白成分的医用短纤维是将卵白蛋白溶液(浓度为6wt％)加入到医用纤维(莱赛尔纤维)纺丝溶液体系中，经湿法纺丝得到；
(3)配置发酵培养液，具体由如下含量的各组分配制而成：
甘露醇5.5wt％；
蛋白胨0.8wt％；
酵母膏0.9wt％；
柠檬酸0.4wt％；
磷酸氢二钠0.4wt％；
磷酸二氢钾0.15wt％；
磷酸氢二钾0.15wt％；
水余量。
(4)由等电点为4的菌株依次经过活化、扩增和离心的工序获得浓缩菌液；
(4.1)活化：将等电点为4的菌株置于400mL的发酵培养液中进行摇床培养，摇床培养的转速为140r/min，温度为36℃，时间为22h；
(4.2)扩增：将活化得到的菌液与发酵培养液按1:800的体积比混合后进行静置培养，静置培养的温度为36℃，时间为8天；
(4.3)离心：离心的转速为7000r/min，时间为5min；
(5)调节发酵培养液pH值为6得到菌株培养液；
(6)在步骤(4)得到的浓缩菌液中加入步骤(5)得到的菌株培养液并均匀分散得到菌株细胞密度1012个/mL的培养菌液；其中，均匀分散是指采用漩涡混匀器在1000rpm下连续振动25s；
(7)然后向步骤(2)得到的复合型非织造材料上滴加步骤(6)得到的培养菌液，直至复合型非织造材料吸附培养菌液饱和后，在36℃的温度条件下静置100min，之后再加入菌株培养液，在温度为31℃条件下进行静置培养8天；其中加入的发酵培养液的液面高度高于复合型非织造材料上表面18mm；
(8)先将步骤(7)中静置培养得到的复合物用纯净水清洗3次，再在浓度为0.8wt％的曲拉通水溶液中浸泡250min，之后用纯净水洗净，冷冻干燥制得基于纳米纤维空间结构可控的复合细菌纤维素敷料；其中，冷冻干燥具体为：在-20℃温度条件下冷冻22h，再真空干燥22h；
最终制得的一种基于纳米纤维空间结构可控的复合细菌纤维素敷料由致密层和疏松层组成的疏密结构，孔隙率为95％；内毒素小于0.5EU/mL；其中致密层为细菌纤维素薄膜，疏松层为含有蛋白成分的非织造材料与细菌纤维素的复合层；致密层的厚度为9mm；疏松层的厚度为含有蛋白成分的非织造材料的厚度；疏松层具体是非织造的微米级纤维上分布着细菌纤维素纳米纤维；细菌纤维素纳米纤维的平均直径为38nm；细菌纤维素纳米纤维占疏松层的表面积比例为75％；细菌纤维素纳米纤维间的平均距离为100nm；干态下，非织造材料复合细菌纤维素敷料中细菌纤维素的占比为9wt％。
实施例7
一种基于纳米纤维空间结构可控的复合细菌纤维素敷料的制备方法，步骤如下：
(1)将明胶颗粒(含量为3wt％)与血红蛋白、肌红蛋白的混合物(血红蛋白、肌红蛋白的混合物总含量为1wt％)溶于去离子水中，在45℃的温度条件下搅拌6h，加入碳酸氢钠调节pH值为7，得到明胶基水溶液；其中血红蛋白与肌红蛋白的质量比为1:1；
(2)将明胶基水溶液滴加到含有蛋白成分的非织造材料上，经冷冻干燥，得到明胶基成分含量为5wt％的复合型非织造材料；其中冷冻干燥是在-20℃温度条件下冷冻24h，再真空干燥24h；含有蛋白成分的非织造材料的克重为200g/m2，是由含有蛋白成分(含量为1wt％)的平均直径为50μm的医用短纤维经水刺非织造加工得到；含有蛋白成分的医用短纤维是将粘蛋白和血纤蛋白的混合溶液(浓度为6wt％)加入到医用纤维(壳聚糖纤维)纺丝溶液体系中，经湿法纺丝得到；其中粘蛋白和血纤蛋白的质量比为1:1；
(3)配置发酵培养液，具体由如下含量的各组分配制而成：
葡萄糖6wt％；
蛋白胨1wt％；
酵母膏1wt％；
柠檬酸0.5wt％；
磷酸氢二钠0.4wt％；
磷酸二氢钾0.2wt％；
磷酸氢二钾0.2wt％；
水余量。
(4)由等电点为4的菌株依次经过活化、扩增和离心的工序获得浓缩菌液；
(4.1)活化：将等电点为4的菌株置于500mL的发酵培养液中进行摇床培养，摇床培养的转速为150r/min，温度为37℃，时间为24h；
(4.2)扩增：将活化得到的菌液与发酵培养液按1:1000的体积比混合后进行静置培养，静置培养的温度为37℃，时间为9天；
(4.3)离心：离心的转速为8000r/min，时间为5min；
(5)调节发酵培养液pH值为6得到菌株培养液；
(6)在步骤(4)得到的浓缩菌液中加入步骤(5)得到的菌株培养液并均匀分散得到菌株细胞密度1013个/mL的培养菌液；其中，均匀分散是指采用漩涡混匀器在1000rpm下连续振动30s；
(7)然后向步骤(2)得到的复合型非织造材料上滴加步骤(6)得到的培养菌液，直至复合型非织造材料吸附培养菌液饱和后，在37℃的温度条件下静置2h，之后再加入菌株培养液，在温度为30℃条件下进行静置培养9天；其中加入的发酵培养液的液面高度高于复合型非织造材料上表面20mm；
(8)先将步骤(7)中静置培养得到的复合物用纯净水清洗3次，再在浓度为1wt％的曲拉通水溶液中浸泡300min，之后用纯净水洗净，冷冻干燥制得基于纳米纤维空间结构可控的复合细菌纤维素敷料；其中，冷冻干燥具体为：在-20℃温度条件下冷冻24h，再真空干燥24h；
最终制得的一种基于纳米纤维空间结构可控的复合细菌纤维素敷料由致密层和疏松层组成的疏密结构，孔隙率为95％；内毒素小于0.5EU/mL；其中致密层为细菌纤维素薄膜，疏松层为含有蛋白成分的非织造材料与细菌纤维素的复合层；致密层的厚度为10mm；疏松层的厚度为含有蛋白成分的非织造材料的厚度；疏松层具体是非织造的微米级纤维上分布着细菌纤维素纳米纤维；细菌纤维素纳米纤维的平均直径为40nm；细菌纤维素纳米纤维占疏松层的表面积比例为80％；细菌纤维素纳米纤维间的平均距离为50nm；干态下，非织造材料复合细菌纤维素敷料中细菌纤维素的占比为10wt％。

Claims (8)

1.一种基于纳米纤维空间结构可控的复合细菌纤维素敷料的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）首先将明胶基水溶液滴加到含有蛋白成分的非织造材料上，经干燥得到复合型非织造材料；
（2）然后向步骤（1）得到的复合型非织造材料上滴加培养菌液，直至复合型非织造材料吸附培养菌液饱和后，加入菌株培养液进行静置培养；
（3）最后将步骤（2）中静置培养得到的复合物进行纯化后冷冻干燥制得基于纳米纤维空间结构可控的复合细菌纤维素敷料；所述纯化是指浸入浓度为0.1~1wt%的曲拉通水溶液中进行处理；
步骤（1）中，明胶基水溶液是将明胶基成分溶于水后调节pH值为5~7得到；复合型非织造材料中明胶基成分含量为0.1~5wt%；明胶基成分为明胶颗粒和蛋白组分；
步骤（1）中所述含有蛋白成分的非织造材料是由含有蛋白成分的医用短纤维经水刺非织造加工得到；含有蛋白成分的医用短纤维平均直径为5~50μm；
所述含有蛋白成分的医用短纤维是将蛋白溶液加入到医用纤维纺丝溶液体系中，经湿法纺丝得到；
含有蛋白成分的医用短纤维中蛋白的含量为0.1~5wt%；
蛋白溶液为蚕丝蛋白、角质蛋白、还原角蛋白、血清蛋白、鱼胶蛋白、卵白蛋白、粘蛋白和血纤蛋白的一种以上的溶液；蛋白溶液的浓度为0.5~10wt%；
医用纤维是指粘胶纤维、莱赛尔纤维、壳聚糖纤维和海藻酸纤维中的一种以上；
含有蛋白成分的非织造材料克重为40~200g/m2；
步骤（2）中，加入的发酵培养液的液面高度高于复合型非织造材料上表面4~20mm；所述培养菌液是在浓缩菌液中加入菌株培养液并均匀分散得到；
所述培养菌液中的菌株细胞密度为103~1013个/mL；
所述浓缩菌液由等电点为3.5~4的菌株依次经过活化、扩增和离心的工序获得；
所述离心的转速为2000~8000r/min，时间为3~5min；
所述菌株培养液是通过调节所述发酵培养液的pH值为5.0~6.0得到；
基于纳米纤维空间结构可控的复合细菌纤维素敷料为由致密层和疏松层组成的疏密结构，其中致密层为细菌纤维素薄膜，疏松层为含有蛋白成分的非织造材料与细菌纤维素的复合层；致密层的厚度为0.5~10mm；疏松层的厚度为含有蛋白成分的非织造材料的厚度；细菌纤维素纳米纤维的平均直径为20~40nm；疏松层具体是非织造的微米级纤维上分布着细菌纤维素纳米纤维，且细菌纤维素纳米纤维占疏松层的表面积比例为20~80%；细菌纤维素纳米纤维间的平均距离为50~1000nm。
2.根据权利要求1所述的一种基于纳米纤维空间结构可控的复合细菌纤维素敷料的制备方法，其特征在于，步骤（1）中明胶基水溶液的配置过程为：将明胶基成分溶于去离子水中，在35~45℃的温度条件下搅拌1~6h得到；明胶基水溶液中明胶颗粒的含量为1~3wt%，蛋白组分的含量不高于1wt%；所述蛋白组分为牛血清白蛋白、血红蛋白和肌红蛋白的一种以上；
干燥为自然干燥、烘箱干燥或者冷冻干燥；自然干燥是在室温下干燥12~48h；烘箱干燥的温度为35~50℃，时间为1~6h；冷冻干燥是在-20℃温度条件下冷冻6~24 h，再真空干燥12~24h。
3.根据权利要求1所述的一种基于纳米纤维空间结构可控的复合细菌纤维素敷料的制备方法，其特征在于，步骤（2）中复合型非织造材料吸附培养菌液饱和后在28~37℃的温度条件下静置10min~2h，之后再加入发酵培养液进行静置培养；
静置培养的温度为28~32℃，时间为5~9天；
所述发酵培养液是由如下含量的各组分配制而成：
葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇 1~6wt%；
蛋白胨 0.05~1wt%；
酵母膏 0.05~1wt%；
柠檬酸 0.01~0.5wt%；
磷酸氢二钠 0.04~0.4wt%；
磷酸二氢钾 0.02~0.2wt%；
磷酸氢二钾 0.02~0.2wt%；
水 余量。
4.根据权利要求1所述的一种基于纳米纤维空间结构可控的复合细菌纤维素敷料的制备方法，其特征在于，所述均匀分散是指采用漩涡混匀器在500~1000rpm下连续振动10~30s。
5.根据权利要求1所述的一种基于纳米纤维空间结构可控的复合细菌纤维素敷料的制备方法，其特征在于，所述活化是将等电点为3.5~4的菌株置于50~500mL的发酵培养液中进行摇床培养；
摇床培养的转速为50~150r/min，温度为28~37℃，时间为6~24h。
6.根据权利要求5所述的一种基于纳米纤维空间结构可控的复合细菌纤维素敷料的制备方法，其特征在于，所述扩增是将活化得到的菌液与发酵培养液按1:10~1000的体积比混合后进行静置培养；
静置培养的温度为28~37℃，时间为3~9天。
7.根据权利要求1所述的一种基于纳米纤维空间结构可控的复合细菌纤维素敷料的制备方法，其特征在于，步骤（3）中将静置培养得到的复合物在曲拉通水溶液中浸泡之前用纯净水清洗2~3次，浸泡之后用纯净水洗净；
所述复合物在曲拉通水溶液中浸泡的时间为30~300min。
8.根据权利要求1所述的一种基于纳米纤维空间结构可控的复合细菌纤维素敷料的制备方法，其特征在于，基于纳米纤维空间结构可控的复合细菌纤维素敷料的孔隙率为70~95%；内毒素小于0.5EU/mL；干态下，非织造材料复合细菌纤维素敷料中细菌纤维素的占比为0.5~10wt%。
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