CN112584873A

CN112584873A - 用作细胞穿透肽的肽

Info

Publication number: CN112584873A
Application number: CN201980047720.4A
Authority: CN
Inventors: 塞巴斯蒂安·德沙耶斯; 卡里迪亚·科纳特; 埃里克·维维斯; 古德伦·奥尔德里安; 普里斯卡·博伊斯盖林
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite de Montpellier I
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite de Montpellier I; Universite de Montpellier
Priority date: 2018-07-17
Filing date: 2019-07-16
Publication date: 2021-03-30
Also published as: EP3823675A1; WO2020016242A1; EP3597223A1; US20210292364A1; JP2021531274A; CA3105584A1; US11905338B2

Abstract

本发明涉及包含氨基酸序列LL‑[X]n‑LL的新肽，其中X选自R、L和W，并且n＝10至12，并且其中[X]n包含4个R、4个L以及2和4个之间的W，其可用作细胞穿透肽。本发明还涉及包含本发明的肽和货物分子的纳米粒子及其用途。

Description

用作细胞穿透肽的肽

技术领域

本发明涉及可用作细胞穿透肽的非天然存在肽。更特别地，本发明的肽能够与货物分子例如siRNA自组装形成基于肽的纳米粒子，以将货物分子转染到细胞中。本发明还涉及包含所述纳米粒子的药物组合物以及将货物分子递送到细胞中的方法。

背景技术

哺乳动物细胞中的RNA干扰(RNAi)开启了前所未有的研究机会来利用这种机制治疗各种疾病。短干扰RNA(siRNA)是双链RNA分子，长度为20-25个碱基对，在3个主末端处各自包含2个核苷酸的突出。与靶mRNA具有序列互补性的siRNA反义链可以诱导序列特异性基因表达抑制(沉默)。SiRNA已被证明是许多难以治疗的疾病例如病毒感染和癌症的潜在候选药物。

这些寡核苷酸的设计通用性和高度特异性本质突出了它们作为未来药物的潜力。然而，诸如缺乏细胞穿透性以及一旦进入细胞内后快速的内体/溶酶体降解的局限性可以通过使用特定的载体来克服。已经基于阳离子脂质、聚合物、树枝状聚合物和肽开发了许多递送技术。在这些非病毒载体材料当中，细胞穿透肽(CPP)由于其序列和功能多样性而日益受到欢迎。CPP通常是源自于各种各样的来源(例如人类、小鼠、病毒或纯合成)的短(最多30个氨基酸)肽。根据其结构特征，CPP可以分为两类：富含精氨酸的CPP和两亲性CPP。

两亲性CPP含有细胞内化以及与货物相互作用所必需的亲水性结构域和疏水性结构域二者。在一级两亲性CPP中，这些结构域根据它们沿着肽链的位置而分布，如对pVEC(A.Elmquist等人，具有载体功能的VE-钙黏着蛋白衍生的细胞穿透肽pVEC(VE-Cadherin-Derived Cell-Penetrating Peptide，pVEC，with Carrier Functions)，Exp.CellRes.269(2001)237–244)、MPG和Pep-1(S.Deshayes等人，(2005)细胞穿透肽：用于细胞内递送治疗剂的工具(Cell-penetrating peptides:tools for intracellular delivery oftherapeutics)，Cell.Mol.Life Sci.CMLS.62，1839–1849)所示。二级两亲性CPP是另一大类的肽，其中由于形成二级结构例如α螺旋或β片层而发生亲水性结构域和疏水性结构域之间的分离。许多最常用的CPP都是这类的成员，例如穿透素(penetratin)(D.Derossi等人，(1994)触角足同源结构域的第三个螺旋穿过生物膜易位(The third helix of theAntennapedia homeodomain translocates through biological membranes.)，J.Biol.Chem.269(14)10444-50)、转运素(transportan)(M.Pooga等人，(1998)通过转运素进行细胞穿透(Cell penetration by transportan)，FASEB J.12，67–77)、hCT-变体(人降钙素)(J.Hoyer等人，(2012)通过有效的肽介导的siRNA递送来敲落G蛋白偶联受体(Knock-down of a G protein-coupled receptor through efficient peptide-mediated siRNAdelivery)，J.Control.Release Off.J.Control.Release Soc.161(3)，826–834)、RICK(A.Vaissière等人，(2017)用于siRNA递送的反向翻转细胞穿透肽(A retro-inversocell-penetrating peptide for siRNA delivery)，J Nanobiotechnology.15(1)，34)或C6M1(M.Jafari等人，(2014)用于siRNA递送的新型两亲肽C6M1的血清稳定性和理化表征(Serum stability and physicochemical characterization of a novel amphipathicpeptide C6M1 for siRNA delivery)，PLoS ONE.9(5):e97797)。

使用CPP使寡核苷酸载体化(vectorize)的主要策略有两种：直接将寡核苷酸与CPP缀合(共价缀合方法)，或在CPP和寡核苷酸之间形成非共价复合体(基于纳米粒子的方法)。形成非共价纳米粒子(NP)在CPP介导的递送带有多个负电荷并因此能够与阳离子肽形成静电复合体的寡核苷酸中特别有效。另外，形成基于肽的纳米粒子是非常易于执行的一步过程，因为不需要化学修饰即可允许NP组装。因此，形成静电复合体仍然是CPP介导的siRNA递送的最流行的应用。

然而，迄今为止，所开发的NP存在一些缺点，包括缺乏稳定性、膜透性差、以有效的方式沉默靶基因的能力低、细胞毒性等。

因此，仍然需要克服上述局限的改进的细胞穿透肽。特别地，需要能够将化合物例如治疗剂高效递送到靶细胞中但不产生显著的细胞毒性和/或免疫原性效应的细胞穿透肽。

发明内容

通过对已经开发的CPP及其缺陷的工作，发明人已经鉴定到三个必需氨基酸，它们必须存在于序列中的特定位置以正面影响所述肽的溶解性、二级结构、低细胞毒性和高摄取效率。更特别地，发明人已经开发了仅由亮氨酸(L)、精氨酸(R)和色氨酸(W)残基组成的新CPP，其至少部分克服了先前CPP的缺点。这些新的短两亲性肽(对于富含W和R的两亲性肽而言，也称为WRAP)的色氨酸残基可以散布于整个序列或簇集在序列的一个结构域中。一般而言，本发明的肽表现出较高的整体转染功效以及较低程度的细胞毒性。

因此，本发明的一个目的是提供一种包含氨基酸序列LL-[X]n-LL的非天然存在肽，其中X选自R、L和W，n＝10至12，并且其中[X]n包含4个R、4个L和2至4个W。

在一个特定实施方式中，所述肽包含氨基酸序列LL-[X]m-RLL，其中m＝9至11。

在一个特定实施方式中，[X]n或[X]m包含簇集或散布在所述氨基酸序列中的2个和4个之间的W。

替代地，或附加地，[X]n或[X]m可包含至少一个由LL组成的簇，优选两个由LL组成的簇。

在一个特定实施方式中，所述肽包含选自以下的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成

-LLWRLWRLLWRLWRLLSEQ ID N°1-CPP1)，

-LLRLLRWWWRLLRLL(SEQ ID N°2–CPP2)，

-LLRLLRWWRLLRLL(SEQ ID N°3–CPP3)，和

-LLRLLRWWWWRLLRLL(SEQ ID N°4–CPP4)

本发明的肽特别可用作细胞穿透肽(CPP)。它们适合穿透哺乳动物细胞的质膜、以及用作转染剂。

本发明的一个进一步的目的是提供包含本发明的肽和货物分子的纳米粒子。货物分子可选自核酸、肽、蛋白质、脂质、小分子、药物活性剂、及其任何混合物。有利地，货物分子是核酸，选自DNA分子、RNA分子、PNA分子、siRNA分子、PMO分子、反义分子、LNA分子、mcDNA分子、miRNA分子、CRISPR/Cas9分子、质粒、核酶，适配体、镜像异构体(spiegelmers)和诱铒分子。

本发明的纳米粒子可用于制造药物组合物。本发明还提供了包含这样的纳米粒子和可药用载体的药物组合物。

本发明的另一个目的是提供一种将货物分子体外递送到细胞中和/或离体递送到组织和/或器官中的方法，所述方法包括使所述细胞与包含所述货物分子的本发明纳米粒子接触的步骤。

本发明的纳米粒子也可用于将货物分子递送到动物中的方法中，所述方法包括将包含所述货物分子的本发明纳米粒子施用于动物的步骤。

附图说明

图1：在亲水条件下通过PEPstrMOD预测所使用的两亲性肽的3D结构。肽的表面和带状结构图。对于表面图，给出了两个视图来确定其两亲特性：沿着N端至C端轴和旋转90°后。色氨酸残基以红色示出，精氨酸以蓝色示出，其余为黄色。

图2：在siRNA存在下所述两亲性肽形成复合体的能力的评价。(A)预先形成的CPP:siRNA复合体通过在GelRed染色的琼脂糖凝胶(1％wt/vol)上电泳进行分析。数据表示为：平均值±SD，n＝3。(B)基于CPP1和CPP2的纳米粒子的透射电子显微镜(TEM)图像。CPP:siRNA纳米粒子在超纯水中的图像(R＝20，40μM CPP)。放大图像的比例尺对应于500nm和100nm。

图3：在质粒存在下所述两亲性肽形成复合体的能力的评价。A)质粒pGL3在琼脂糖凝胶中迁移的图形表示。以不同的负载比(CR)配制预先形成的CPP:pGL3复合体，并通过在GelRed染色的琼脂糖凝胶(0.5％wt/vol)上电泳进行分析。数据表示为：平均值±SD，n＝2。CPP2:pGL3转染后，荧光素酶在MEF细胞(B)或MCF-7细胞(C)中的剂量依赖性表达。基于CPP2:pGL3的凝胶迁移性质，在CR1时以三种不同的质粒浓度(62.5ng、125ng和250ng)配制纳米粒子。NT＝未处理的细胞。数据表示为：平均值±SD，n＝2。

图4：CPP:siRNA纳米粒子敲落效率的细胞评价。(A)用CPP:siFLuc复合体在U87细胞中在20nM的恒定siFLuc浓度下以不同的摩尔比R转染后的相对Luc活性(％FLuc/NLuc)和相对毒性(LDH定量)。(B)在U87细胞上，相对Luc活性(％FLuc/NLuc)取决于总转染时间(24h相比于36h)。(C)用CPP:siFLuc纳米粒子以不同的siFLuc浓度(恒定摩尔比R＝20)转染U87细胞后的相对Luc活性(％FLuc/NLuc)和相对毒性(LDH定量)。

RNAiMAX按照供应商所述用于以20nM转染siFLuc(“对照”板块中的RNAi泳道)。缩写：R＝摩尔比，siFLuc＝siRNA FLuc，siSCR＝乱序(scrambled)siRNA，N.T.＝未处理的细胞，Ctrl＝对照，n.d.＝未确定。

图5：在U87细胞上，在同工型L(CPP2[L])中或在同工型(CPP2[D])中，取决于被CPP2载体化的siRNA的浓度，萤火虫荧光素酶表达降低的图形表示。FLuc/NLuc值相对于未处理细胞(N.T.)的条件归一化。

图6：取决于被CPP1或CPP2载体化的siRNA的浓度，萤火虫荧光素酶沉默的图形表示。在所有siRNA浓度下，即使存在10％的血清，该递送方式也有效(U87细胞)。FLuc/NLuc值相对于未处理细胞(N.T.)的条件归一化。

图7：在不同实验室中并用不同读取方法进行的萤火虫荧光素酶表达降低(U87细胞)的图形表示。FLuc/NLuc值相对于未处理细胞(N.T.)的条件归一化。

图8：CPP:siRNA与C6M1:siRNA或其它衍生CPP的比较。(A)与C6M1:siFLuc相比，在U87细胞中CPP:siFluc转染后萤火虫荧光素酶表达的敲落效率的图形表示。温育条件：5,000个细胞/孔，纳米粒子具有200nM肽和10nM siRNA(vol:vol配制)，温育时间1小时30分钟。FLuc/NLuc值相对于未处理细胞(N.T.)的条件归一化。n＝2个独立实验，一式三份。(B)与在亮氨酸“双重体(doublets)”中具有突变的衍生CPP纳米粒子(参见表1)相比，在U87细胞中CPP:siFluc转染(vol:vol配制)后萤火虫荧光素酶表达的敲落效率的图形表示。温育条件：5,000个细胞/孔，在指示的siRNA浓度下CPP:siRNA比＝20:1，温育时间1小时30分钟。FLuc/NLuc值相对于未处理细胞(N.T.)的条件归一化。n＝2个独立实验，一式三份。(C)与具有突变的衍生CPP2纳米粒子(参见表1)相比，在U87细胞中负载有siFluc的CPP:siFluc转染(稀释配制)后萤火虫荧光素酶表达的敲落效率的图形表示。温育条件：5,000个细胞/孔，在指示的siRNA浓度下CPP:siRNA比＝20:1，温育时间1小时30分钟。FLuc/NLuc值相对于未处理细胞(N.T.)的条件归一化。n＝3个独立实验，一式三份。

图9：CPP1:siRNA和CPP2:siRNA PBN活性评价。(A)在指示的siRNA-FLuc浓度下，在不同细胞系中CPP:siFLuc PBN转染后的相对FLuc活性(％)。U87：人胶质母细胞瘤细胞系，KB：Hela衍生的角蛋白形成细胞系，HuH7：人肝癌细胞系，RM1：鼠前列腺癌细胞系，Neuro2a：鼠神经母细胞瘤细胞系，MCF7：人乳腺癌细胞系，MDA-MB-231：人乳腺腺癌，MEF-RAS：Ras修饰的小鼠胚胎成纤维细胞，A549：人腺癌肺泡基底上皮细胞，HT29：人结肠癌细胞系，CMT93：直肠癌细胞系，GL261：鼠胶质母细胞瘤细胞系。(B)在指示的siRNA-CDK4浓度下，在U87细胞中CPP:siRNA纳米粒子转染后的CDK4沉默。缩写：siSCR＝乱序siRNA，N.T.＝未处理的细胞。(C)针对U87细胞中内源性CDK4蛋白表达，CPP1:siCDK4纳米粒子活性与作为siRNA转染剂的

RNAiMAX的活性的比较。黑色虚线＝无毒性，红色虚线＝剂量依赖性毒性。(D)用于评价CPP2纳米粒子与

RNAiMAX相比较的细胞毒性的克隆生成测定。不同的CPP2:siRNA纳米粒子(比率20，siRNA浓度50nM)在MEF-Ras细胞上温育(14天)，与单独的CPP2肽(100nM)或与RNAi:siRNA(siRNA浓度20nM)条件比较。(E)培养三天后，在单剂siCDK4(20nM)、双剂siCDK4(20nM+20nM)或三剂siCDK4(20nM+20nM+20nM)后，U87细胞中CPP:siRNA纳米粒子转染后的CDK4沉默。缩写：siSCR＝乱序siRNA，N.T.＝未处理的细胞。

图10：CPPP:siRNA纳米粒子的内化动力学。(A)在U87细胞中以20nM siRNA-FLuc浓度、以分钟计的不同温育时间进行CPP:siFLuc纳米粒子转染后的相对FLuc活性(％)。(B)在U87细胞中以20nM siRNA-CDK4浓度、以分钟计的不同温育时间进行CPP:siRNA纳米粒子转染后的CDK4沉默。(C)被CPP1或CPP2纳米粒子载体化的Cy5标记的siRNA(siRNA-Cy5＝20nM，R＝20)在活的U87细胞系中的细胞分布的可视化。细胞核使用Hoechst 33342染料标记。白色条表示20μm。(D)通过转盘(siRNA-Cy3b＝20nM，R＝20)，每5秒记录图像达1200秒，比较CPP1:siRNA-Cy3b和CPP2:siRNA-Cy3b的内化动力学。之后，针对时间绘制平均灰度值的百分比(平均值±SD；来自2至3个独立实验的2–5个独立计数的细胞)。

图11：在异种移植小鼠的肿瘤模型上，纳米粒子在体内诱导萤火虫荧光素酶表达的降低。(A)在CPP2纳米粒子:siFluc注射后指定时间的双重生物发光(Fluc和Nluc)和肿瘤荧光(U87-CMV-Fluc-CMV-iRFP-IRES)的代表性图像。(B)瘤内注射CPP2纳米粒子:siFluc(15μg的siRNA)后立即定量分析Fluc和Nluc荧光素酶。统计分析(平均值±SEM，n＝11)：相比于0h(＝对照)的单向ANOVA与Dunnet事后检验，*p<0.05。(C)瘤内注射CPP2纳米粒子:siFluc(20μg的siRNA)后立即定量分析Fluc mRNA。统计分析(平均值±SD，n＝4)：相比于0h(＝对照)的t-检验，***p＝0.0009。Fluc mRNA水平表示为与GAPDH蛋白的mRNA的比率(Fluc/GAPDH)。

图12：通过CPP纳米粒子对siRNA混合物载体化。(A)通过PBN同时转染2种siRNA：[CPP2:siCDK4/siCycB1]混合物显示出U87细胞中内源性CDK4和细胞周期蛋白(Cyclin)B1蛋白表达的剂量依赖性降低。(B)通过PBN以不同的化学计量比转染2种siRNA：[CPP1:siCDK4/siCycB1]混合物显示出内源性CDK4和细胞周期蛋白B1(U87细胞)蛋白的表达降低与每种siRNA的含量成反比。

图13：多接枝纳米粒子的开发。(A)RGD-Ahx-CPP2肽(R-CPP2，R＝20)以剂量依赖性方式转染siFluc后的相对FLuc活性(％)。(B)CPP2:RGD-Ahx-CPP混合物(CPP2:R-CPP2比从100％:0％至0％:100％)不影响Fluc荧光素酶活性的沉默(R＝20，20nM siFluc)。(C)CPP1纳米粒子的PEG化率对Fluc荧光素酶活性的影响(R＝20，20nM siFluc)。(D)多接枝CPP2纳米粒子对Fluc荧光素酶活性的影响(R＝20，20nM siFluc)。(E)由不同实体的简单混合物制成的肽纳米粒子的示意图。

图14：取决于所应用的配制条件，U87细胞中萤火虫荧光素酶沉默的图形表示。将U87细胞接种在P96孔板中(5,000个细胞/孔)。纳米粒子使用“vol:vol”条件(终浓度CPP:siRNA 100nM:5nM；200nM:10nM和400nM:20nM)或以高浓度(CPP[10μM]:siRNA[0.5μM])继以稀释(＝“稀释”条件)来配制。在无血清培养基中，纳米粒子的温育时间为1小时30分钟。添加血清后，将细胞温育36小时，然后进行荧光素酶测定。FLuc/NLuc值相对于未处理细胞(N.T.)的条件归一化。n＝2个独立实验，一式三份。

图15：CPP1:siRNA和CPP2:siRNA PBN对细胞悬液的活性的评价。(A)在U87细胞悬液中CPP:siFLuc纳米粒子以剂量依赖性方式(siRNA＝10nM、20nM和50nM)转染后的相对FLuc活性(％)。温育条件：10,000个细胞/孔，在指示的siRNA浓度下CPP:siRNA比＝20:1，在无血清培养基中的温育时间为1.5小时。FLuc/NLuc值相对于未处理细胞(N.T.)的条件归一化。缩写：siSCR＝乱序siRNA，siFLuc＝萤火虫荧光素酶特异性siRNA。n＝2个独立实验，一式三份。(B)在U87细胞悬液中CPP:siFLuc纳米粒子以剂量依赖性方式(siRNA＝10nM、20nM和50nM)转染后的相对FLuc活性(％)。温育条件：10,000个细胞/孔，在指示的siRNA浓度下CPP:siRNA比＝20:1，在含10％血清的培养基中的温育时间为1.5小时。FLuc/NLuc值相对于未处理细胞(N.T.)的条件归一化。缩写：siSCR＝乱序siRNA，siFLuc＝萤火虫荧光素酶特异性siRNA。n＝2个独立实验，一式三份。(C)在萤火虫荧光素酶稳定转染的U937人巨噬细胞悬液中CPP:siFLuc纳米粒子以剂量依赖性方式(siRNA＝10nM、20nM和50nM)转染后的相对FLuc活性(％)。温育条件：10,000个细胞/孔，在指示的siRNA浓度下CPP:siRNA比＝20:1(或单独的siRNA)，在无血清培养基中的温育时间为1.5小时。FLuc值相对于未处理细胞(N.T.)的条件归一化。n＝2个独立实验，一式三份。

图16：囊性纤维化情形下MBBO和质粒共转染的评价。(A)预先形成的CPP1:MBBO复合体通过在GelRed染色的琼脂糖凝胶(1％wt/vol)上电泳进行分析。数据表示为：平均值±SD，n＝2。(B)通过动态光散射(DLS)测量CPP1:MBBO复合体的平均尺寸(R＝5，10μM CPP1)。(C)使用Lipofectamin^TM RNAiMAX、

(PJ)或CPP2以1μg CFTR编码质粒以及使用RNAiMAX或CPP1以100nM MBBO转染支气管Beas-2b细胞。通过qPCR确定CFTR转录物和管家基因GAPDH的量。将CFTR值首先相对于GAPDH归一化，然后使用无3'-UTR结合性质的MBBO相对于对照条件归一化(MBBO-Ctrl＝1)。

具体实施方式

定义

如本文所用的术语“肽”或“肽分子”是指包含多个通过肽键连接的天然或修饰氨基酸残基的任何天然存在或非天然存在(例如，通过化学合成或重组DNA技术产生)的线性大分子。

如本文所用的术语“氨基酸残基”表示天然并入肽中的20种“标准”氨基酸中的任一种。所述氨基酸在本文中由其根据以下命名法的单字母或三字母代码表示：A：丙氨酸(Ala)；C：半胱氨酸(Cys)；D：天冬氨酸(Asp)；E：谷氨酸(Glu)；F：苯丙氨酸(Phe)；G：甘氨酸(Gly)；H：组氨酸(His)；I：异亮氨酸(Ile)；K：赖氨酸(Lys)；L：亮氨酸(Leu)；M：甲硫氨酸(Met)；N：天冬酰胺(Asn)；P：脯氨酸(Pro)；Q：谷氨酰胺(Gln)；R：精氨酸(Arg)；S：丝氨酸(Ser)；T：苏氨酸(Thr)；V：缬氨酸(Val)；W：色氨酸(Trp)，和Y：酪氨酸(Tyr)。通常，本发明的肽的氨基酸残基以L-异构体或D-异构体存在。如本文所用的术语“非天然氨基酸残基”表示非编码的或非蛋白原性的氨基酸，是并非在任何生物体的遗传密码中天然编码或发现的那些氨基酸。本文所用的术语“修饰的氨基酸残基”表示非标准氨基酸，例如翻译后修饰的氨基酸。翻译后修饰的实例包括磷酸化、糖基化、酰化(例如乙酰化、肉豆蔻酰化、棕榈酰化)、烷基化、羧化、羟基化、糖化、生物素化、泛素化、化学性质变化(例如β-消除脱酰亚胺、脱酰胺)、和结构变化(例如形成二硫键)。

细胞穿透肽

本发明涉及包含氨基酸序列LL-[X]n-LL的非天然存在肽，其中X选自R、L和W，n＝10至12，并且其中[X]n包含4个R、4个L和2至4个W，优选地3至4个W。

本发明人意外地发现，这样的肽(在本文中被称为本发明的肽)适合充当细胞穿透肽(CPP)，并可由此将货物分子递送至细胞的细胞质，优选通过哺乳动物细胞的质膜来递送。

本发明的肽具有14至16个氨基酸残基的长度，所述氨基酸残基全部选自R、L和W。实际上，本发明人已经发现，这三种氨基酸残基在所述肽的氨基酸序列中的特定分布导致了作为CPP特别令人感兴趣的肽。实际上，所述肽在被内化后显示出高细胞摄取能力、对它们相应的靶细胞的细胞毒性和/或免疫原性效应不显著(即，至少在足以介导细胞转染和/或穿透的浓度下，它们不会干扰细胞活力)。如本文所用的术语“不显著”应理解为在本发明的肽内化后杀死的靶细胞少于30％，特别是少于20％或10％。技术人员非常了解确定给定化合物的细胞毒性和/或被应用了这样的化合物的给定靶细胞的活力的方法(也参见，例如，Ausubel，F.M.等人(2001)现代分子生物学实验技术(Current Protocols inMolecular Biology)，Wiley&Sons，Hoboken，NJ，USA)。

如本文所用的术语“细胞摄取能力”是指所述肽通过细胞膜(即质膜、内体膜和内质网膜)和/或指导给定货物分子通过这些细胞膜的能力(即其转染能力)。具有所述穿过细胞膜的能力的肽在本文中被称为“细胞穿透肽”或“CPP”。本领域已经建立了确定给定肽的内化行为和/或转染能力的许多方法，例如，通过将可检测的标记物(例如荧光染料)与所述肽(和/或与待转染的货物分子)相连或通过将所述肽与报道分子融合，从而一旦发生所述肽的细胞摄取，就能够例如借助于FACS分析或通过特异性抗体进行检测(参见，例如，Ausubel，F.M.等人(2001)现代分子生物学实验技术(Current Protocols in MolecularBiology)，Wiley&Sons，Hoboken，NJ，USA)。技术人员还很了解如何选择在这样的方法中采用的肽和适用的货物的相应浓度范围，这可取决于肽的性质、货物的尺寸、使用的细胞类型等。

在一个特定实施方式中，本发明的肽包含氨基酸序列LL-[X]m-RLL，其中m＝9至11。

有利地，[X]n或[X]m包含由WW、WWW或WWWW组成的簇。优选地，这样的簇在中心，也就是说，在所述色氨酸簇的每一侧有相同数目的氨基酸残基。

在一个特定实施方式中，[X]n或[X]m包含至少一个由LL组成的簇，优选两个由LL组成的簇。

有利地，本发明的肽的净正电荷为5。

-LLWRLWRLLWRLWRLL(SEQ ID N°1)，

-LLRLLRWWWRLLRLL(SEQ ID N°2)，

-LLRLLRWWRLLRLL(SEQ ID N°3)，和

-LLRLLRWWWWRLLRLL(SEQ ID N°4)。

在一个特定实施方式中，所述肽还包含与所述氨基酸序列的C末端共价连接的一个或几个选自L-氨基酸、D-氨基酸、非天然氨基酸、修饰的氨基酸、半胱酰胺、硫醇、酰胺、羧基、任选取代的直链或支链C₁-C₆烷基、伯胺或仲胺、osidic衍生物、脂质、磷脂、脂肪酸、胆固醇、聚乙二醇、核定位信号和/或靶向分子的实体，和/或其中所述肽还包含与所述氨基酸序列的N末端共价连接的一个或几个选自L-氨基酸、D-氨基酸、非天然氨基酸、修饰的氨基酸、胺、乙酰基、任选取代的直链或支链C₁-C₆烷基、伯胺或仲胺、osidic衍生物、脂质、磷脂、脂肪酸、胆固醇、聚乙二醇、核定位信号和/或靶向分子的化学实体。

纳米粒子

本发明还提供了纳米粒子，其包含至少一个本发明的肽，所述肽与至少一个货物分子复合。这样的货物分子可以是如本文定义的任何货物分子。根据一个特定的实施方案，所述纳米粒子可包含多于一个本发明的肽。特别地，所述纳米粒子可包含多个相同或不同的肽。所述纳米粒子也可包含多于一个货物分子。特别地，所述纳米粒子可包含多个相同或不同的货物分子。

有利地，所述纳米粒子的尺寸在50至300nm之间，优选在100至200nm之间。

在一个实施方式中，所述肽和货物分子之间的复合体可以基于非共价键形成。这样的非共价键可以是离子键、氢键或疏水相互作用或这样的键的组合。

或者，所述肽和货物分子之间的复合体是通过共价键形成的。这样的共价键优选在所述肽的合适的反应性基团和所述货物之间形成，更优选在本发明的肽的末端和货物分子之间形成。取决于化学性质或货物分子，形成这样的共价键的部分、基团或残基可变化，并且创建这样的键在本领域人员的技能范围内。

有利地，所述货物分子选自核酸、肽、蛋白质、脂质、小分子、药物活性剂、及其任何混合物。

本发明的肽特别适合与核酸分子复合。因此，本发明的一个特定目的是提供包含本发明的肽和核酸分子或其任何混合物的纳米粒子，所述核酸分子选自DNA分子、RNA分子、PNA分子、siRNA分子、PMO分子、反义分子、LNA分子、mcDNA分子、miRNA分子、CRISPR/Cas9分子、质粒、核酶，适配体、镜像异构体和诱铒分子。

如本文所用的术语“miRNA分子”(或“miRNA”)是指源自于基因组基因座的内源RNA分子，其由可以形成局部RNA前体miRNA结构的转录物加工而成。成熟的miRNA的长度通常为20、21、22、23、24或25个核苷酸，但也可以存在其它核苷酸数量，例如18、19、26或27个核苷酸。

如本文所用的术语“shRNA分子”(即短发夹RNA分子)是指人工的单链干扰RNA分子，其在茎-环或发夹结构中包含“siRNA双链体”的正义和反义链两者。该发夹结构的茎的长度通常在19至29个核苷酸的范围内，并且环的长度通常在4至15个核苷酸的范围内。

术语“siRNA分子”是指针对编码靶分子的靶核酸、优选mRNA的小干扰RNA。siRNA是通常长度为约21至23个核苷酸的双链RNA。两条RNA链之一的序列对应于待降解的靶核酸的序列。因此，知道靶分子的核酸序列，优选mRNA序列，可以设计双链RNA，其中两条链之一与所述靶分子的mRNA互补，并且在所述siRNA应用到含有该基因的体系后，相应的对应靶核酸将会降解，从而降低相应的蛋白质的水平。

术语“核酶”是指催化活性的核酸，其优选由主要包含两个部分的RNA组成。第一部分显示出催化活性，而第二部分负责与靶核酸的特异性相互作用。

术语“适配体”是指D-核酸，其是单链或双链的并且与靶分子特异性相互作用。适配体目前用作治疗剂。

术语“镜像异构体”是指L-核酸，即由L-核苷酸构成。镜像异构体的特征在于以下事实：它们在生物系统中具有非常高的稳定性，并且与适配体可比地，与它们所针对的靶分子特异性相互作用。

在另一个实施方式中，货物分子是由至少两个共价连接、优选通过肽键共价连接的氨基酸组成的肽。在一个实施方式中，所述肽由L-氨基酸、D-氨基酸、非天然氨基酸或其混合物组成。或者，货物分子是蛋白质。

在另一个实施方式中，货物分子是小分子，优选分子量为1,000Da或更低。特别地，所述小分子是药物或候选药物。

在另一个实施方式中，货物分子是药物活性剂。

在另一个实施方式中，货物分子是脂质。

在另一个实施方式中，货物分子是抗体或蛋白质。

药物组合物

本发明的一个进一步的目的是提供包含本发明的纳米粒子(与至少一个货物分子相连的至少一个肽)和一种或多种可药用载体的药物组合物。实际上，本发明的纳米粒子可有利地用于制造药物组合物。

如本文所用的术语“药物组合物”涉及用于施用于对象、优选人类患者的组合物。根据本发明的药物组合物包括本领域中确立的任何药物剂型，例如胶囊、微胶囊、扁囊剂、丸剂、片剂、粉末剂、团粒剂、多颗粒制剂(例如珠子、颗粒或晶体)、气雾剂、喷雾剂、泡沫剂、溶液剂、分散剂、酊剂、糖浆剂、酏剂、悬液剂、油包水型乳剂例如油膏、和水包油型乳剂例如乳膏、洗液、香膏、皮肤贴剂、滴剂、糊剂和栓剂。

本发明的药物组合物包括适合于口服、直肠、鼻、局部(包括颊和舌下)、腹膜和肠胃外(包括肌内、皮下和静脉内)施用、或通过吸入或吹入施用的制剂。施用可以是局部或全身的。

本发明的另一个方面是如上所述的纳米粒子作为药物和作为标志物或显像剂的用途。

本发明还涉及一种将分子体外递送到细胞中的方法，所述方法包括使所述细胞与如上所述的纳米粒子或药物组合物接触的步骤。本发明还涉及一种将分子离体递送到组织和/或器官中的方法，所述方法包括使所述组织和/或器官与如上所述的纳米粒子或药物组合物接触的步骤。

本发明还涉及用于体内递送货物分子的方法，所述方法包括使所述动物与根据权利要求13至17中任一项所述的纳米粒子接触的施用步骤，所述纳米粒子包含所述货物分子。

在以下实施例中进一步开发本发明的若干方面，所述实施例通过附图(在实施例中描述)加以说明。

实施例

材料&方法

材料.二油基磷脂酰甘油(DOPG)和二油基磷脂酰胆碱(DOPC)磷脂、胆固醇(Chol)、鞘磷脂(SM)购自Avanti Polar Lipids。大单层囊泡(LUV)如先前的报道(A.Vaissière等人，(2017)用于siRNA递送的反向翻转细胞穿透肽(A retro-inverso cell-penetratingpeptide for siRNA delivery)，J Nanobiotechnology.15(1)，34)，通过挤出方法从DOPC/SM/Chol(2:2:1)的脂质混合物制备。

不同siRNA序列(未标记和Cy5标记的)购自Eurogentec。Cy3b标记的siRNA购自BioSynthesis。使用以下siRNA：抗萤火虫荧光素酶(siFLuc)：5’-CUU-ACG-CUG-AGU-ACU-UCG-AdTdT-3’(SEQ ID N°5)(正义链)和抗荧光素酶的相应乱序版本(siSCR)：5’-CAU-CAU-CCC-UGC-CUC-UAC-UdTdT-3’(SEQ ID N°6)(正义链)以及基于下面的抗细胞周期蛋白依赖性激酶4(siCDK4)siRNA：5′-CAG-AUC-UCG-GUG-AAC-GAU-GdTdT-3′(SEQ ID N°7)(反义链)和乱序版本：5′-AAC-CAC-UCA-ACU-UUU-UCC-CAA-dTdT-3′(SEQ ID N°8)(反义链)。

所述siRNA储备溶液是在不含RNase的水中制备的，肽储备溶液以及CPP:siRNA复合体如以前发表的那样制备(Konate K等人(2016)载体化性质的优化：二级两亲性肽的比较研究(Optimisation of vectorisation property:a comparative study for asecondary amphipathic peptide.)Int J Pharm.509，71-84)。

肽的合成和修饰：肽购自LifeTein或在我们实验室中使用标准Fmoc化学生产(表1中的序列)并通过HPLC/MS纯化(>95％纯度)。使用4摩尔过量的PEG马来酰亚胺2,000(Nanocs)，在室温下23小时期间将PEG实体接枝到在N末端带有半胱氨酸残基的纯化的CPP上。在合成期间，将RGD靶向序列接枝到在N末端带有氨基己酸作为接头的CPP上。

肽结构预测：使用PEPstrMOD服务器预测WRAP的三级结构(http://osddlinux.osdd.net/raghava/pepstrmod/)(H.Kaur等人，(2007)Protein Pept.Lett.14，626–630；S.Singh等人，(2015)Biol.Direct.10，73)。

圆二色性(CD)测量.在Jasco 810(日本)二色性测定仪上在光程为1mm的石英suprasil比色皿(Hellma)中记录肽在溶液中或在脂质体囊泡存在下的CD光谱。每种条件使用的肽浓度相同(40μM)。使用0.5nm的数据间距、1nm的带宽和标准灵敏度，从190nm至260nm之间的3次累计(accumulations)获得光谱。

琼脂糖凝胶迁移测定.在5％葡萄糖中以不同比率形成CPP:siRNA复合体，并在室温下预温育30分钟。如前所述，通过用GelRed(Interchim)染色以便进行UV检测的琼脂糖凝胶电泳(1％w/v)来分析每个样品。

动态光散射(DLS)和ζ电位(ZP).用Zetasizer NanoZS(Malvern)根据粒子分布平均尺寸(Z-平均)和均一性(PdI)来评价CPP:siRNA纳米粒子。ζ电位在5％葡萄糖+5mM NaCl中测定。所有结果均从三次独立测量获得(每次测量均在25℃下运行三次)。

透射电子显微术(TEM).对于透射电子显微术(TEM)，将一滴5μl的悬浮液沉积在涂有碳的300目网格上1分钟，通过碰触滤纸将其吸干，然后放在2％的乙酸双氧铀溶液滴上。1分钟后，通过用滤纸碰触边缘来除去多余的染色剂，将网格在室温下干燥几分钟，并使用在100kV加速电压下操作的Jeol 1200EX2透射电子显微镜进行检查。用SIS Olympus QuemesaCCD相机收集数据。

培养条件.将用编码萤火虫荧光素酶和Nanoluc荧光素酶(FLuc-NLuc)的质粒稳定转染的人胶质母细胞瘤U87 MG(Aldrian G等人，J.Control.Release 2017)，在完全培养基中生长：DMEM，具有GlutaMAX^TM(Life Technologies)、青霉素/链霉素(LifeTechnologies)、10％热灭活胎牛血清(FBS，PAA)、非必需氨基酸NEAA 1X(LifeTechnologies)。此外，添加潮霉素B(Invitrogen，50μg/ml)作为选择抗生素。

在不添加选择抗生素的相同完全培养基中生长源自于Hela的角蛋白形成细胞系(KB)、鼠神经母细胞瘤细胞系(Neuro2a)、人肝癌细胞系(HuH7)、人乳腺癌细胞系(MCF7)和腺癌人肺泡基底上皮细胞系(A549)。

鼠前列腺癌细胞系(RM1)在添加杀稻瘟菌素S(Invitrogen，10μg/mL)的相同完全培养基中生长，而人结肠癌细胞系(HT29)、直肠癌细胞系(CMT93)和鼠神经胶质母细胞瘤细胞系(GL261)在添加潮霉素B(Invitrogen，分别为1,400μg/mL、500μg/mL和150μg/mL)作为选择抗生素的相同完全培养基中生长。

人乳腺腺癌(MDA-MB-231)在添加G418(Invitrogen，100μg/mL)作为选择抗生素的相同完全培养基中生长。

从ATCC获得的永生化人支气管上皮细胞系BEAS-2B在用5％胎牛血清(FBS)(Eurobio)、1％Ultroser G(Pall BioSepra)、1％抗生素-抗真菌剂(Life TechnologiesSAS)和1％L-谷氨酰胺(Life Technologies SAS)完善的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM，Fisher Scientific)中生长，T型大永生化小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)在补充有青霉素/链霉素(Life Technologies)和10％热灭活的胎牛血清(FBS，PAA)的DMEM/F12培养基(LifeTechnologies)中生长。

所有细胞均维持在5％CO₂、37℃的潮湿培养箱中。

细胞培养和瞬时转染：将200,000Beas-2b细胞如以前所述(Viart V等人，EurRespir J.2015)接种在6孔板中。使用

或CPP2以1μg pm-cDNA-CFTR-3’UTR转染细胞，并使用RNAiMAX或CPP1以100nM MBBO转染细胞。

RNA提取和RT-qPCR：如以前所述(Viart V等人，Eur J Hum Genet 2012)提取总RNA、逆转录并扩增。使用1μg总RNA和MMLV逆转录酶进行逆转录，并用1:10稀释的第一链DNA进行qPCR。以GAPDH mRNA作为内源性对照，使用比较DDCt方法计算相对表达水平。

克隆生成测定.将MEF细胞接种在6孔板中(250个细胞/孔)。接种后24小时，将细胞与纳米粒子(R＝20，50nM siRNA)一起温育14天。为了集落可视化，将细胞在4℃下用甲醇:乙酸(3:1)溶液固定20分钟，并在室温下用Giemsa(Sigma Aldrich)/H₂O(3.5:10)溶液标记20分钟。用水除去剩余的染色溶液，并将板干燥数小时。对每个孔拍照并计数所有集落。

转染实验.对于荧光素酶测定，在实验前24小时，使用如上所述的相应培养基将不同的细胞(5,000个细胞/孔)接种到96孔板中。第二天，通过将siRNA和CPP(等体积，“CPP载siRNA(siRNA on CPP)”)在5％葡萄糖水中混合、然后在37℃下温育30分钟来形成纳米粒子。同时，将覆盖细胞的生长培养基替换为70μL新鲜的预温热无血清DMEM。将30μL所述纳米粒子溶液直接添加到细胞中，并在37℃下温育1.5小时。添加补充有20％FBS(最终FBS浓度＝10％)的DMEM后，将细胞进一步温育36小时，最后裂解以进行荧光素酶检测。为了在血清存在下进行转染，将细胞与纳米粒子一起在DMEM+10％FBS中于37℃下温育1.5小时，然后将补充有10％FBS的DMEM添加到细胞中，进一步温育36小时，然后进行最终的细胞裂解以检测荧光素酶。

对于Western印迹测定，在实验前24小时，使用如上所述的相应培养基，将75,000个U87细胞/mL/孔接种到24-孔板中。对于标准温育，将所述细胞与175μL新鲜的预温热无血清DMEM+75μL所述纳米粒子溶液一起温育。温育1.5小时后，在无需取出转染试剂的情况下将250μL LDMEM+20％FBS添加到每个孔中，然后将细胞再温育24小时。实验程序设计成在肽:siRNA摩尔比为R＝20、在500μL的最终体积中所含的siRNA浓度为5、10和20nM下测试肽:siRNA纳米粒子。添加DMEM+20％FBS(最终10％FBS)后，将细胞进一步温育24h，最后裂解以进行CDK4 Western印迹检测。

对于显微术实验，在成像之前24小时，将300,000个U87细胞接种到玻璃底皿(FluoroDish，World Precision Instruments)中。实验前，将细胞用D-PBS洗涤两次，并用1,600μL的完全培养基覆盖。之后，如前所述，将在5％葡萄糖水溶液中配制的400μL NP(肽:siRNA；R＝20，siRNA＝20nM)直接添加到细胞上。

细胞毒性测量.使用Cytotoxicity Detection Kit^Plus(LDH，RocheDiagnostics)，按照制造商的说明，对50μL的上清液进行纳米粒子诱导的细胞毒性评价。

荧光素酶报道基因沉默测定.通过测量细胞裂解物中剩余的萤火虫荧光素酶(FLuc)活性，对使用不同载体的siRNA递送进行评价。简而言之，36小时后，小心地除去覆盖细胞的培养基，并用50μL的0.5X被动裂解缓冲液(PLB；Promega)代替。在4℃下振荡30分钟后，将含有细胞的平板离心(10min，1,800rpm，4℃)，最后将5μL的各细胞裂解物上清液转移到白色96孔板中。对于U87-FLuc-NLuc细胞，如其它地方的报道(G.Aldrian等人，(2017)J.Control.Release Off.J.Control.Release Soc.256，79-91)，使用稀释一半的双重荧光素酶测定试剂(Promega)，通过读板光度计(POLARstar Omega，BMG Labtech)对两种荧光素酶活性进行定量。结果表示为每种荧光素酶的相对光单位(RLU)的百分比，其首先相对于未处理细胞归一化(％FLuc和％NLuc)、然后相对于％NLuc的值归一化，以获得相对Luc活性(％FLuc/％NLuc)。

对于其它仅具有FLuc表达的细胞系，使用稀释一半的荧光素酶测定试剂(Promega)，使用读板光度计来定量荧光素酶活性。结果表示为相对于未处理细胞归一化的相对光单位(RLU)的百分比(％FLuc)。

Western印迹.将转染的细胞在PBS中洗涤，并在RIPA缓冲液[50mM Tris pH 8.0，150mM氯化钠，1％Triton X-100，0.1％SDS(十二烷基硫酸钠，Sigma-Aldrich)，包含蛋白酶抑制剂(SigmaFAST，Sigma-Aldrich)]中裂解。将细胞与130μL/24-孔裂解缓冲液一起在冰上温育5分钟。之后，使细胞破碎并转移到1.5ml管中。在冰上5分钟后，将细胞裂解物离心(10min，13,400rpm，4℃)，收集上清液，并使用Pierce BCA蛋白质测定法(ThermoFisher)确定蛋白质浓度。通过4-20％

TGXTM Precast凝胶(Bio-Rad)分离细胞提取物(0.25-0.38μg/μL)。电泳后，将样品转移到

Turbo^TM Mini PVDF Transfer膜(Bio-Rad)上。作为抗体(全部来自Cell Signaling)，我们使用了抗细胞周期蛋白B1小鼠mAb V152、抗CDK4兔mAbD9G3E、抗粘着斑蛋白兔mAb E1E9V、抗小鼠IgG HRP和抗兔IgG HRP。在Amersham成像仪600(GE Healthcare Life Science)上，用Pierce ECL加Western印迹底物(ThermoFisher)来显示印迹。印迹的信号强度通过Image J进行定量。

共聚焦显微术.对于通过共聚焦显微术进行的细胞成像，使用倒置LSM780多光子显微镜(Zeiss)。在添加NP之后，将细胞在5％CO₂、37℃的潮湿培养箱中温育1小时。温育结束前10分钟，将Hoechst 33342染料添加到细胞中进行细胞核标记。然后，将细胞用D-PBS洗涤两次，并用FluoroBrite DMEM培养基(Life Technologies)覆盖。投影共聚焦图像并用ImageJ软件处理。

对于转盘实验，使用与转盘(ANDOR)系统偶联的倒置显微镜(Nikon Ti Eclipse)来研究活细胞内NP的内化动力学。添加NP后，将细胞通过笼式培养箱(Okolab)维持在37℃，并用EM-CCD摄像机(iXon Ultra)每5秒直接记录图像达1200秒，并用Andor IQ3软件进行投影。进行对照实验以确保在不同通道之间没有观察到排放渗出(emission bleedthrough)。所有图像均使用ImageJ软件处理。

体内小鼠实验：6至10周龄的免疫缺陷型NOG(NOD/SCID/IL-2Rγnull)小鼠在Bordeaux大学(University of Bordeaux)动物机构饲养。将维持在无特定病原体条件下的小鼠维持在12小时明暗周期内并且不限量提供水和食物的标准条件下。使用含2％异氟烷(Belamont，Nicholas Piramal Limited，英国伦敦)的空气进行麻醉。待成像的小鼠区域预先用剪毛器和脱毛膏剃毛。

通过在小鼠右后腿上注射U87-FRT-CMV-Fluc-CMV-Nluc细胞(2x10⁶个细胞/100μLPBS)来产生皮下肿瘤。植入后4周对皮下肿瘤成像。

mRNA提取和定量RT-PCR：使用Trizol(Thermo Fisher Scientific)从U87细胞分离总mRNA。使用1mg的总RNA，用NucleoSpin RNA(Macherey-Nagel)进行cDNA合成。使用FastSYBR Green Master Mix(Invitrogen)，利用MySYq Quantitative(Bio-Rad)进行定量PCR。用于Fluc扩增的引物是Fluc-Fw：TCCATTCCATCACGGTTTTGG(SEQ ID N°9)，Fluc-Rv：GCTATGTCTCCAGAATGTAGC(SEQ ID N°10)，GAPDH-Fw：GCCAAGGTCATCCATGACAAC(SEQ ID N°11)，GAPDH-Rv：GAGGAGTGGGTGTCGCTGTTG(SEQ ID N°12)。

在三个独立的实验中一式三份进行反应。将表示数据相对于管家基因GAPDH的几何平均值归一化，以控制表达水平的变异性，并使用2^DDCt方法进行分析。

结果

1.肽的表征：

在本实验中，已经研究和比较了几种两亲性肽形成基于肽的纳米粒子(PBN)以递送治疗剂分子的能力(表1)。肽CPP1至CPP4属于本发明的肽，由3种氨基酸组成：亮氨酸、精氨酸和色氨酸残基。所述肽为15至16个氨基酸长，C端部分具有酰胺基团(-CONH₂)并且N端部分具有胺(-NH₂)。本专利申请的所有肽单独具有+5的净正电荷(如果实体与所述N端部分偶联，则为+4)。

表1：细胞穿透肽的序列

ID	序列	CPP AA	电荷	Nb W
					CPP1	LLWRLWRLLWRLWRLL(SEQ ID N°1)	16	5	4
CPP1-1	LWRLWRLLWRLWRL(SEQ ID N°13)	14	5	4
					CPP2	LLRLLRWWWRLLRLL(SEQ ID N°2)	15	5	3
CPP2-1	LRLRWWWRLRL(SEQ ID N°14)	11	5	3
					CPP2-2	LLRLRWWWRLRLL(SEQ ID N°15)	13	5	3
CPP2-3	LRLLRWWWRLLRL(SEQ ID N°16)	13	5	3
					CPP3	LLRLLRWWRLLRLL(SEQ ID N°3)	14	5	2
CPP4	LLRLLRWWWWRLLRLL(SEQ ID N°4)	16	5	4
					C6M1	RLWRLLWRLWRRLWRLLR(SEQ ID N°17)	18	8	4
C6M1-L	RLWRLWRLWRRLWRLLR(SEQ ID N°18)	17	8	4
					P-CPP1	PEG<sub>2000</sub>-LLWRLWRLLWRLWRLL	16	4	4
P-CPP2	PEG<sub>2000</sub>-LLRLLRWWWRLLRLL	15	4	3
					R-CPP2	RGD-Ahx-LLRLLRWWWRLLRLL	15	4	3
CPP1-4R	RLLWRLW-----LWRLLR(SEQ ID N°19)	13	5	3
					CPP1-6R	RLLWRLWRLLWRLWRLLR(SEQ ID N°20)	18	7	4
CPP2-4R	RLLRLL-WWW-LLRLLR(SEQ ID N°21)	15	5	3
					CPP2-6R	RLLRLLRWWWRLLRLLR(SEQ ID N°22)	17	7	3

脚注：CPP AA＝CPP序列的氨基酸数量。

为了检查CPP的结构性质，首先对每种肽的3D结构进行了计算机预测。将在亲水环境中的CPP1至CPP4的序列提交给PepStrMOD服务器。计算后，由PepstrMOD生成的肽模型揭示，所有肽均采取α-螺旋结构(图1)。CPP1和CPP2似乎呈现出比其它模型更明显的螺旋度。

然后将预测的结构与实验研究进行比较。记录溶液中游离的肽的圆二色光谱，然后在siRNA存在下以及然后在添加脂质体后，记录肽的圆二色光谱。如表2所示，在siRNA分子存在下、甚至在中性或带负电荷的脂质(“大单层囊泡”(LUV))的存在下，所有肽(CPP1，CPP2，CPP3，和CPP4)都采取α螺旋结构。

表2：通过圆二色性对两亲性肽的构象分析。

脚注：随机卷曲(rc)构象在212nm处具有阳性条带，在195nm左右具有阴性条带。螺旋构象的特征是在207nm和222nm处有两个最小值，在191nm左右有一个最大值。观察到转角样结构在200nm和228nm处有两个最小值。CPP:siRNA摩尔比为R 20，CPP:脂质摩尔比为r10，CPP浓度为40μM。

2.两亲性肽的胶体表征

通过CD检测到的构象变化提示几乎所有CPP都与siRNA相互作用。为了评估siRNA的复合，通过琼脂糖位移测定研究了CPP:siRNA复合体的形成(图2)。单独的siRNA能够迁移到琼脂糖凝胶中(＝100％信号)，但是当与CPP复合时，所述肽以摩尔比依赖性方式阻止寡核苷酸迁移。CPP1、CPP2、CPP3和CPP4显然能够以类似的方式复合siRNA，并且在肽:siRNA摩尔比为R＝20和R＝40下具有最佳的复合。

CPP:siRNA复合体(5％葡萄糖，R＝20)的胶体特征根据通过动态光散射(DLS)得到的纳米粒子尺寸和均一性进行表征。强度测量结果(％)揭示，CPP1、CPP2、CPP3和CPP4形成了直径在80nm至200nm之间、多分散指数(PdI)为约0.3的PBN(表3)。基于数量(％)的纳米粒子尺寸分布提示，除了通过基于强度的尺寸分布发现的纳米粒子以外，还存在更小的纳米粒子。对于四种CPP:siRNA，这些更小的粒子的直径在20nm至50nm之间(表3)。更重要的是，即使在4℃下储存72小时，这两个测量的尺寸值也没有显著变化(数据未显示)。

由CPP1:siRNA或CPP2:siRNA构成的PBN兼具正电荷表面(ζ电位测量，表3)和通过透射电子显微镜测得的球形形状(图2B)。

表3：通过DLS测量进行的CPP表征。

脚注：对于获取平均尺寸来说，所有CPP:siRNA复合体均在R＝20下以500nM siRNA浓度在5％葡萄糖水溶液中形成，对于ZP评价来说，则是在具有5mM NaCl的5％葡萄糖水溶液中形成。n≥2次独立配制(3次测量/运行)。n.d.：未确定。*ZP在具有1mM NaCl的5％葡萄糖中测量。

3.负载有siRNA的CPP纳米粒子的功效取决于配制

根据配制期间应用的浓度，评价负载有siRNA的CPP纳米粒子的功效。

比较两种不同的配制：

1)稀释条件：在较高的浓度(例如CPP[10μM]:siRNA[0.5μM])下配制复合体，然后稀释至最终的siRNA浓度5nM、10nM和20nM以进行细胞培养测定。

2)体积:体积条件：分别制备CPP和siRNA溶液，然后混合在一起获得最终siRNA浓度5nM、10nM和20nM以进行细胞培养测定。

以使用CPP2进行的配制为例，取决于所应用的配制程序，可以增加纳米粒子的敲落效率(图14)。稀释条件似乎会诱导更高的敲落效率(增加2倍)。这对于转染已知“难以”转染的细胞来说特别令人感兴趣。

4.两亲性肽可用于配制质粒：

CPP1和CPP2肽在它们与寡核苷酸例如质粒结合时形成复合体(图3)。使用如上所述针对CPP与siRNA复合的琼脂糖凝胶(0.5％)，使复合体的形成可视化。以对应于CPP(正电荷)和质粒(负电荷)之间的电荷中性(CR＝1)的电荷比(CR)，使质粒被CPP复合。于是，庞大的CPP:质粒复合体不再能够迁移到琼脂糖凝胶中。

将单独的质粒条带的强度归一化为100％。通过逐渐增加CPP:质粒电荷比，得到pGL3质粒(6.56kbp)的复合，按比例地减少其迁移到琼脂糖凝胶中(0.5％)。

为了分析负载有质粒的CPP纳米粒子的转染潜力，用编码萤火虫荧光素酶(pGL3)的质粒转染MCF7(人乳腺癌)和MEF(小鼠胚胎成纤维细胞)细胞。与CPP2:pGL3(CR＝1)一起温育24小时后，裂解细胞，并通过添加萤火虫荧光素酶的底物(Promega的试剂盒)来定量萤火虫荧光素酶的表达。如图3B和3C所示，观察到与未处理的细胞相比，萤火虫荧光素酶活性的剂量依赖性增加，这与蛋白表达增加相关。

总之，所述PBN也可用于转染质粒，如前面使用siRNA时所示。

5.荧光素酶筛选测定中CPP:siRNA纳米粒子的细胞活性表征

如以前所述(L.N.Patel等人，(2007)Pharm.Res.24，1977–1992；A.Elmquist等人，(2001)Exp.Cell Res.269，237–244.)，在荧光素酶筛选测定中评价基于CPP的纳米粒子的细胞活性。在稳定转染以组成性表达FLuc/NLuc报道基因(U87-FRT-CMV/Fluc-CMV/iRFP-IRES-NLuc)的U87细胞系上进行了不同CPP:siRNA纳米粒子的敲落效率。

首先，我们研究了有效的荧光素酶敲落所需的肽和siRNA(恒定浓度20nM)之间的最佳摩尔比(图4A)。对于CPP1、CPP2、CPP3和CPP4，我们观察到在R＝20时大于70％的显著荧光素酶敲落，而这在R＝40时轻度增加。平行地，所有纳米粒子处理均未观察到相对细胞毒性(LDH测量)。

在总转染36小时后而且也在24小时后可观察到非常有希望的萤火虫荧光素酶敲落结果，这对实验者来说是显著的收获。在CPP2:siRNA以及CPP4:siRNA的摩尔比R 20和R40下，所述荧光素酶信号的相对降低在所有条件下均相同(～60-80％)，与所应用的转染时间无关(图4B)。

之后，通过使用R＝20的最佳肽:siRNA摩尔比来阐明最佳siRNA浓度(图4C)。所述三种PBN(CPP1、CPP2和CPP4)表现出非常好的剂量依赖性关系，显示出显著的敲落效率，IC50值为约7.5nM。在此再次在所有使用条件下均未检测到细胞毒性。

最后，我们可以认识到，所提出的纳米粒子与

RNAiMAX(目前市售的ThermoFisher产品，用于siRNA转染)在相同的使用siRNA浓度下诱导的荧光素酶敲落性降低相当。然而，在这些条件下，我们用

RNAiMAX载体化观察到相当于21％的显著细胞毒性(图4C)。

为了所述纳米粒子的重复应用或长期应用，优选使用同工型D的CPP，以减少其被细胞外或细胞内蛋白酶降解。在这种情形下，使用L或D构型的肽评价CPP2:siRNA纳米粒子的效率。

所述胶体性质的研究揭示，如由DLS证实的，同工型D的肽CPP2(CPP2[D])形成与CPP2[L]相同尺寸的纳米粒子(I％＝70±11nm，Nb％＝31±1nm，PdI＝0.302±0.024，对于CPP2[L]来说也参见表3)。

平行地，在恒定比R 20下观察到剂量依赖性(1nM至20nM siRNA)的萤火虫荧光素酶表达降低，因此与肽的异构化(CPP2[D]和CPP2[L])无关(图5)。

为了模拟体内应用，将纳米粒子在血清的存在下温育以模仿当通过静脉内注射施用时与血清蛋白的潜在相互作用。在针对CPP1的15nM和20nM siRNA和针对CPP2的10nM至20nM siRNA下，血清(10％)的存在对纳米粒子在萤火虫荧光素酶沉默方面的活性没有显著的有害影响(图6)。在10％血清的存在下观察到荧光素酶活性降低约70％，这相当于没有血清的情况。

最后，我们证明了通过CPP进行的siRNA转染在实验室与实验室之间是可再现的，并且与所使用的检测方法无关。在该比较中，将U87细胞与CPP2:siRNA纳米粒子一起在三种浓度的siRNA(5nM、10nM和20nM)下温育。温育后，将细胞裂解，并在转移到96孔板(双重荧光素酶试剂盒(Dual Luciferase kit)，Promega，使用PolarStar测量，BMG)或试管(荧光素酶测定试剂和Nano-Glo荧光素酶测定，Promega，使用Lumat LB 9507测量，BertholdTechnologies)中的细胞裂解物中定量萤火虫荧光素酶和NanoLuc的活性。在这两种情况下，显示萤火虫荧光素酶表达的剂量依赖性降低的值相同(图7)。

6.CPP:siRNA活性与其它具有相似序列的CPP的比较

合成了类似于CPP1和CPP2这两种肽的不同序列类似物，以显示氨基酸位置的重要性(CPP1相比于C6M1)以及亮氨酸残基的作用(CPP2相比于CPP2-1至CPP2-3，表1)。

为了显示我们的CPP在siRNA转染方面比Jafari等人(2013)发表的C6M1肽具有更好的效率，进行了直接比较。包含C6M1-L序列，其表示C6M1类似物，在所述肽序列的N端位置的亮氨酸双重体中有亮氨酸缺失(表1和图8A)。

将过表达萤火虫荧光素酶的人胶质母细胞瘤细胞(U87)与用四种载体肽CPP1、C6M1、C6M1-L和CPP2配制的包封有siRNA的纳米粒子(siFluc或siSCR作为阴性对照)一起温育。对于所有肽，使用相同的浓度(CPP＝200nM和siRNA＝10nM)，以相同的方式平行进行这些配制。随后将所有溶液在含有5.000个细胞/孔的P96板中温育1.5小时，以避免温育之间的偏倚。

在荧光素酶活性测量后，我们清楚地表明CPP1:siRNA和CPP2:siRNA可以诱导荧光素酶表达降低90％。相比之下，我们观察到荧光素酶敲落对于C6M1:siRNA来说相当于仅60％并且对于C6M1-L:siRNA来说相当于40％(图8A)。

总之，在降低荧光素酶表达方面，CPP1肽的活性比C6M1高3倍，比C6M1-L高6倍(对于两种比较，p＝****，单向ANOVA与Tukey事后检验)。另外，我们可以证明，即使CPP2肽也比C6M1(2倍)和C6M1-L(3.5倍)更有效。

为了了解亮氨酸“双重体”在肽序列中的重要性，我们通过去除不同位置的亮氨酸残基来生成类似物(见表1)。当用简单的亮氨酸残基代替CPP2序列的仅中间“双重体”(CPP2-1)或全部“双重体”(CPP2-2)时，我们在荧光素酶测定中观察到所述纳米粒子的完全失活(图8B)。

在第二步，我们想要分析在CPP1和CPP2序列的N和C端位置的“双重体”(分别为CPP1-1和CPP2-3)的重要性。该缺失也影响了中纳米粒子(siRNA-FLuc)在细胞中(incellulo)的活性(图8B)：

-与使用CPP2:siFluc PBN观察到的相比，纳米粒子CPP2-3:siFLuc显示出在荧光素酶沉默方面没有活性。

-纳米粒子CPP1-1:siFLuc的抑制活性降低，尤其是在10nM和20nM的siRNA浓度下，这相当于与相同浓度的CPP1:siFLuc纳米粒子相比，该PBN的活性低3x和5x倍。

在第三步，我们想要确认我们开发的CPP的共有序列及其与C6M1和C6M1-L相比各自的行为。因此，合成了在所述肽序列末端(N末端和C末端)带有附加的精氨酸残基的肽序列(参见表1中的CPP1-6R和CPP2-6R序列)。

然而，在序列内添加两个精氨酸也将会增加肽的总净电荷。为了获得与亲本肽相同的净电荷，设计了另外两个带有N和C端精氨酸残基但又缺失了两个内部精氨酸残基的肽(CPP1-4R和CPP2-4R，表1)。在所有情况下，在肽的两端添加精氨酸都降低了纳米粒子(siRNA-FLuc)在细胞中的活性(图8B)：

-与对CPP1:siFluc PBN观察到的相比，纳米粒子CPP1-4R:siFLuc显示出在荧光素酶沉默方面没有活性。纳米粒子CPP1-6:siFLuc的抑制活性降低，这相当于与相同浓度的CPP1:siFLuc纳米粒子相比，该PBN的活性低4x倍(5nM siRNA)和3x倍(10nM和20nM siRNA)。

-在所有siRNA浓度下，纳米粒子CPP2-4R:siFLuc和CPP2-6R的抑制活性降低，这相当于与CPP2:siFLuc纳米粒子相比，该PBN的活性低3x到4x倍。另外，CPP2-4R在荧光素酶活性测量中显示出一些变异性，这可能是由于纳米粒子温育的某些细胞毒性效应所致。

-DLS测量解释了获得的结果(表3)：CPP1-4R:siRNA比亲本纳米粒子更为聚集，CPP1-6R:siRNA粒子比CPP1:siRNA更大并且更具多分散性，CPP2-4R:siRNA和CPP2-6R:siRNA似乎形成了较小的纳米粒子，但与用CPP2:siRNA获得的纳米粒子相比，显得更具多分散性。

总之，CPP1和CPP2兼具允许稳定形成纳米粒子的最佳氨基酸组合与最高的敲落效率。

7.CPP:siRNA纳米粒子的转染效率实施例：

由于它们显示出最佳的转染效率，因此选择CPP1和CPP2进行另外的细胞研究和开发。为了评估它们作为通用转染剂的潜力，在不同细胞系上测试这两种肽。使用20nM siRNA在U87(人胶质母细胞瘤)、KB(源自于Hela的角蛋白形成细胞)、HuH7(人肝癌)和Neuro2a(鼠神经母细胞瘤)、MCF7(人乳腺)、MDA-MB-231(人乳腺腺癌)细胞中，使用50nM siRNA在CMT93(直肠癌)、MEF-RAS：Ras修饰的小鼠胚胎成纤维细胞、A549：人腺癌的肺泡基底上皮细胞、HT29(人结肠癌)和RM1(鼠前列腺癌)细胞中，以及用100nM siRNA在GL261(鼠胶质母细胞瘤)细胞中，检测出50％至80％的FLuc基因沉默，提示有些细胞系需要更高的siRNA剂量才能达到可比的敲落效率(图9A)。

基于CPP1和CPP2的NP还应用于靶向内源性蛋白细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)，已知CDK4在胶质母细胞瘤中过表达(D.W.Parsons等人，(2008)人胶质母细胞瘤多型性的综合基因组分析(An integrated genomic analysis of human glioblastomamultiforme)，Science.321，1807–1812)。两种肽均观察到显著的CDK4敲落，5nM、10nM和20nM分别对应于30％、60％和80％的CDK4表达抑制。CPP1:siCDK4在CDK4敲落上似乎具有比CPP2:siCDK4略高的效应(图9B)。

与

RNAiMAX(Thermo Fisher销售的脂质转染分子)的直接比较清楚地表明了所述PBN转染系统的优势(图9C)。这两种转染系统对于显著敲落CDK4均有效，但

RNAiMAX条件在低浓度下显示出明显的细胞毒性效应。细胞毒性可以在Western印迹中使用内部对照(粘着斑蛋白表达：深灰色柱)或总蛋白浓度(通过BCA试剂盒测量，红色值)来观察。

在50nM的siCDK4浓度下，CPP1诱导的CDK4敲落大于80％，而没有任何细胞毒性。另一方面，当用

RNAiMAX剂转染siRNA时，敲落是相同的，但伴有总细胞蛋白和粘着斑蛋白的量显著降低，表明该转染剂的显著细胞毒性(红色虚线)。

与对细胞存活和增殖表现出极高的毒性剖面的两种RNAiMAX条件相比，通过克隆生成测定也观察到了CPP2的细胞毒性(图9D)。与未处理的细胞相比，所有其它CPP2条件对细胞存活和增殖没有影响。正如所料，使用针对在细胞周期中实施的细胞周期蛋白D1蛋白的siRNA的对照条件显示细胞存活率降低了50％。

在随后三天的培养中连续三次施用NP后，还评价了基于CPP2的NP对内源蛋白CDK4的影响(图9E)。对所有条件均检测到显著的CDK4敲落，但与单次施用(第1剂)相比，对连续三剂的20nM siRNA(第3剂)明显观察到累积效应，提示了基于CPP2的NP随时间的潜在累积影响。

8.CPP:siRNA纳米粒子对细胞悬液的转染效率实施例：

为了评价负载有siRNA的CPP纳米粒子对非贴壁细胞(悬液)的转染潜力，对U87细胞进行了所谓的反向转染。在“标准”转染条件下，将细胞以期望的浓度在微量滴定板中铺板，并在粘附于孔底(6小时至24小时)后，用纳米粒子转染细胞。在“反向”转染期间，将纳米粒子转移到微量滴定板中，然后向所述纳米粒子添加胰蛋白酶消化的、重悬在有或没有血清的培养基中的细胞(参见图15A和B)。

在这两种情况下，CPP1:siFLuc和CPP2:siFLuc均显示出剂量依赖性的荧光素酶基因沉默，这是特异性的，因为CPP:siSCR纳米粒子没有显示出任何敲落效率。在没有或有血清的培养基中同样地观察到这种沉默特异性。然而，反向转染的沉默效率需要稍高的siRNA剂量(50nM而不是20nM)才能获得与“标准”转染相同的80-90％敲落。

接下来，评价了CPP2:siFLuc对非贴壁细胞例如萤火虫荧光素酶稳定转染的U937人巨噬细胞的转染潜力(图15C)。CPP2:siFLuc纳米粒子显示出剂量依赖性的荧光素酶基因沉默，这是所述转染特异性的，因为单独的siFLuc未显示出任何敲落效率。对于10nM、20nM和50nM的siRNA浓度，测得沉默效率分别为40％、80％和100％。

9.囊性纤维化的情形下CPP1:MBBO和CPP2:质粒共转染

囊性纤维化(CF)是一种遗传性病症，主要影响肺，但也影响胰腺、肝脏、肾脏和肠。它是由囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)蛋白的两个基因拷贝中都存在突变引起的。最近发现，CFTR受micorRNA例如miR-145和miR-494的转录后调节(Gillen AE等人，BiochemJ.2011；Megiorni F等人，Plos One，2011；Ramachandran S等人，PNAS，2012，Viart V等人，Eur Respir J.2015)。包括miR-145在内的几种miRNA在原代人气道上皮细胞中表达，其中在CF患者中CFTR的表达受到抑制(Gillen AE等人，Biochem J，2011)或失调(Oglesby IK等人，J immunol，2013；Ramachandran S等人，AJRCMB.2013)。

Taulan-Cardars博士团队设计了靶位点阻滞剂(TSB，也称为miRNA结合-阻滞剂寡核苷酸，MBBO)，以防止包括miR-101、miR-600、miR-145和miR-384在内的几种miRNA与CFTR基因的3'-UTR结合(PCT/EP2014/069522)。该MBBO可以被CPP1以摩尔比依赖性方式包封，并在R＝5时完全复合(图16A)。使用该摩尔比，我们获得了由动态光散射(DLS)确定的平均尺寸为180nm的纳米粒子(图16B)。

然后，我们评价了与不同的转染剂相比，MMBO转染对支气管Beas-2b细胞(图16C)中CFTR转录物的量的影响。在共转染实验中，用不同的MBBO(19-28pb)转染了编码CFTR(pm-cDNA-CFTR-3'UTR，11.8kbp)的质粒。将CFTR转录水平首先相对于管家基因GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)归一化，然后相对于对照MBBO(没有3'-UTR结合性质的MBP-Ctrl)归一化。分析了三种不同的转染剂组合：

-Lipofectamin^TM RNAiMAX既用于CFTR质粒转染也用于MBBO转染

-

用于CFTR质粒转染，CPP1用于MBBO转染

-CPP2用于CFTR质粒转染，CPP1用于MBBO转染。

如图16C所示，在支气管Beas-2b细胞中CPP2:质粒/CPP1:MBBO转染后CFTR转录物的量与使用

质粒/CPP1:MBBO进行转染相比要高2至3倍，比

:质粒/RNAiMAX:MBBO条件甚至高10至12倍。这种CFTR转录物增加与在基于CPP1和CPP2肽的转染的基础上的质粒和MBBO的更好转染性质相关。

10.负载有siRNA的PBN的内化动力学评价：

基于CPP1和CPP2的纳米粒子在基因沉默方面表现出显著的效率，提示了最佳的siRNA递送。因此，我们试图评价其时间依赖性细胞内化。将负载有siRNA的PBN(20nMsiFLuc)在从5分钟到90分钟的不同温育时间期间施加在人U87细胞上，然后将PBN溶液替换为含10％FBS的培养基36小时。结果揭示，温育5分钟后，CPP1和CPP2纳米粒子已经能够诱导FLuc活性降低40％，提示所述蛋白的快速且显著的敲落(图10A)。此外，这两种肽均在温育60分钟后观察到最大且饱和的FLuc沉默，而没有任何细胞毒性。与图4C相比，60分钟时的最大敲落效率略低，可能是由于：i)缺少30分钟的额外温育时间；和ii)PBN溶液被替换且未用补充培养基填补。

用载有siCDK4的PBN进行的相似的时间依赖性实验在Western印迹评价后揭示出相似的结果，确认了转染的快速效率(图10B)。此处再一次地，在温育5分钟后可以观察到首次敲落效率，在60分钟时达到最大沉默效率。

为了获得有关基于CPP的纳米粒子内化的更多信息，我们进行了共聚焦显微术实验。siRNA细胞分布的代表性图像揭示出的点状图案(图10C)与对其它PBN温育1小时后观察到的图案相当(A.Vaissière等人，(2017)用于siRNA递送的反向翻转细胞穿透肽(A retro-inverso cell-penetrating peptide for siRNA delivery)，J.Nanobiotechnology.15,34.；G.Aldrian等人，(2017)PEG化率影响基于肽的纳米粒子介导的体外和体内siRNA递送(PEGylation rate influences peptide-based nanoparticles mediated siRNAdelivery in vitro and in vivo)，J.Control.Release Off.J.Control.ReleaseSoc.256，79–91.；A.

等人，(2011)直接易位作为CADY自组装型基于肽的纳米粒子的主要细胞摄取(Direct translocation as major cellular uptake for CADY self-assembling peptide-based nanoparticles)，PloS One.6，e25924.)。然后，我们进行了转盘实验(图10D)，基于Cy3b标记的siRNA的细胞积累来评价这两种基于CPP的纳米粒子的内化动力学。如图形表示中所示，我们观察到由这两种PBN递送的siRNA在温育～15分钟(900秒至945秒)后达到最大荧光(90％±5％)。内化的IC50值(50％)分别在CPP1和CPP2纳米粒子温育240秒和185秒后获得。与以前分析的PBN例如在温育120分钟后达到内化最大值的RICK:siRNA或20％PEG-RICK:siRNA(A.Vaissière等人，(2017)用于siRNA递送的反向翻转细胞穿透肽(A retro-inverso cell-penetrating peptide for siRNA delivery)，J.Nanobiotechnology.15,34.；G.Aldrian等人，(2017)PEG化率影响基于肽的纳米粒子介导的体外和体内siRNA递送(PEGylation rate influences peptide-basednanoparticles mediated siRNA delivery in vitro and in vivo)，J.Control.ReleaseOff.J.Control.Release Soc.256，79–91.)相比，这种内化非常快。总而言之，所观察到的这两种基于CPP的纳米粒子的快速siRNA内化动力学可以解释甚至在温育5分钟后观察到的敲落功效(图10A和10B)。

11.纳米粒子的体内评价(鼠异种移植模型)：

为了评价纳米粒子在体内的效率，将它们注射到皮下肿瘤(鼠U87-CMV-FLuc-CMV-iRFP-IRES-Nluc细胞)中。为了产生肿瘤，将U87细胞(2.10⁶个细胞/100μL)皮下注射到B6白化病小鼠的右腿上。肿瘤生长后，将CPP2:siFluc纳米粒子(20μL)注入肿瘤中央。在Vivoptic(UMS 3767-波尔多大学(Bordeaux University))上使用Lumina LT软件(PerkinElmer Inc.)进行生物发光成像(BLI)。小鼠接受D-荧光素的腹膜内注射，并在注射后8分钟在施用麻醉剂溶液(2％异氟烷)后拍摄图像。

“双重”生物发光(Fluc和Nluc)和荧光(iRFP)的代表性图像显示在24小时时可见的萤火虫荧光素酶减少(图11A)。该现象在数量更多的动物(n＝11)的平均值上更为明显，揭示在24小时时荧光素酶信号降低了70％(*p<0.05)(具有15μg siFluc的CPP2:siFluc，R＝20)(图11B)。更重要的是，在注射CPP2:siFluc纳米粒子的注射后48小时时，mRNA-Fluc率下降了80％(***p＝0.0009)(图11C)。

12.通过CPP纳米粒子对siRNA“鸡尾酒”的载体化：

所述基于CPP的肽纳米粒子还可以允许递送靶向不同蛋白的几种不同siRNA的“混合物”，如下面示例的靶向细胞周期蛋白B1和CDK4蛋白的两种siRNA(以相同比例)的混合物(图12A)以及两种siRNA(以不同比例)的混合物(图12B)：

13.高度模块化纳米粒子(接枝PBN)的评价：

纳米粒子的靶向已经成为减少治疗剂分子在健康组织中的内化和防止不良副作用的必要先决条件。几年以来，靶向分子例如肽或糖已被接枝到纳米粒子上，其识别某些组织或细胞类型中过表达的受体(F.Danhier等人，(2012)Mol Pharm.9(11):2961-73.；22.；D.M.Copolovici等人，(2014)ACS Nano.8(3):1972-94.；D.Arosio等人，(2017)Recent PatAnticancer Drug Discov.12(2):148-168.)。

在癌症的情形下，由三个氨基酸(RGD)构成的靶向序列是为了增加单个治疗分子或载体的特异性而研究得最多的一种(U.K.Marelli UK等人，(2013)Front Oncol.3:222.)。已知该肽与在癌细胞表面上过表达的αvβ3整联蛋白受体特异性相互作用。

为了进行对调制纳米粒子的概念的验证，将RGD(带有氨基己酸接头，Ahx)的线性序列接枝到肽CPP2的N端部分。

使用荧光素酶测定法观察到，将CPP2肽延长4个残基似乎并不影响纳米粒子的形成(图13A)。荧光素酶的表达降低了～70％，与裸PBN相当(图4)。无论使用的接枝肽的百分比(单独的CPP2与RGD-Ahx-CPP2之间的比率)如何，该荧光素酶沉默水平保持恒定(图13B)。

使用基于肽的纳米粒子的主要局限是它们在血液中的寿命短。但是，得益于过多的肽化学，PBN可以被功能实体修饰以改善其药理性质(T.Lehto等人，(2016)DrugDeliv.Rev.106(Pt A)，172-182)。在这方面，PEG化被广泛用于改善它们的体内稳定性，以防止它们被肝脏和脾脏中的单核吞噬系统(MPS)识别以及与血液成分相互作用。例如，Genexol-PM[甲氧基-PEG-聚(D,L-丙交酯)紫杉醇]是第一个在美国II期临床试验中显示出真正成功的基于聚合物的胶束纳米粒子。

在这种情形下，已经实现了概念的验证，并表明在本专利中描述的肽纳米粒子可以被PEG实体接枝，甚至多元接枝(图13C)。添加20％PEG-CPP对纳米粒子的活性没有显著效应。只有100％PEG-CPP的条件才能完全抑制它。这些结果与用PEG-RICK获得的数据相关联(G.Aldrian等人，(2017)J.Control.Release Off.J.Control.Release Soc.256，79-91)。

此外，当添加的PEG-CPP不超过20％时，通过插入靶向RGD肽序列(CPP2:20％RGD-Ahx-CPP2:20％PEG-CPP2)配制的三方混合物显示出与裸纳米粒子(CPP2)相同的降低荧光素酶活性的潜力(图13D)。

序列表

<110> AXLR

<120> 用作细胞穿透肽的非天然存在肽

<130> B2793PC00

<160> 22

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CPP1

<400> 1

Leu Leu Trp Arg Leu Trp Arg Leu Leu Trp Arg Leu Trp Arg Leu Leu

1 5 10 15

<210> 2

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CPP2

<400> 2

Leu Leu Arg Leu Leu Arg Trp Trp Trp Arg Leu Leu Arg Leu Leu

1 5 10 15

<210> 3

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CPP3

<400> 3

Leu Leu Arg Leu Leu Arg Trp Trp Arg Leu Leu Arg Leu Leu

1 5 10

<210> 4

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CPP4

<400> 4

Leu Leu Arg Leu Leu Arg Trp Trp Trp Trp Arg Leu Leu Arg Leu Leu

1 5 10 15

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> siRNA

<400> 5

cuuacgcuga guacuucgat t 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 6

caucaucccu gccucuacut t 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 7

cagaucucgg ugaacgaugt t 21

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 8

aaccacucaa cuuuuuccca att 23

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 9

tccattccat cacggttttg g 21

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 10

gctatgtctc cagaatgtag c 21

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 11

gccaaggtca tccatgacaa c 21

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 12

gaggagtggg tgtcgctgtt g 21

<210> 13

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CPP1-1

<400> 13

Leu Trp Arg Leu Trp Arg Leu Leu Trp Arg Leu Trp Arg Leu

1 5 10

<210> 14

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CPP2-1

<400> 14

Leu Arg Leu Arg Trp Trp Trp Arg Leu Arg Leu

1 5 10

<210> 15

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CPP2-2

<400> 15

Leu Leu Arg Leu Arg Trp Trp Trp Arg Leu Arg Leu Leu

1 5 10

<210> 16

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CPP2-3

<400> 16

Leu Arg Leu Leu Arg Trp Trp Trp Arg Leu Leu Arg Leu

1 5 10

<210> 17

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C6M1

<400> 17

Arg Leu Trp Arg Leu Leu Trp Arg Leu Trp Arg Arg Leu Trp Arg Leu

1 5 10 15

Leu Arg

<210> 18

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C6M1-L

<400> 18

Arg Leu Trp Arg Leu Trp Arg Leu Trp Arg Arg Leu Trp Arg Leu Leu

1 5 10 15

Arg

<210> 19

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CPP1-4R

<400> 19

Arg Leu Leu Trp Arg Leu Trp Leu Trp Arg Leu Leu Arg

1 5 10

<210> 20

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CPP1-6R

<400> 20

Arg Leu Leu Trp Arg Leu Trp Arg Leu Leu Trp Arg Leu Trp Arg Leu

1 5 10 15

Leu Arg

<210> 21

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CPP2-4R

<400> 21

Arg Leu Leu Arg Leu Leu Trp Trp Trp Leu Leu Arg Leu Leu Arg

1 5 10 15

<210> 22

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CPP2-6R

<400> 22

Arg Leu Leu Arg Leu Leu Arg Trp Trp Trp Arg Leu Leu Arg Leu Leu

1 5 10 15

Arg

Claims

1.一种14至16个氨基酸残基长度的非天然存在的细胞穿透肽，其包含氨基酸序列LL-[X]n-LL，其中X选自R、L和W，并且n＝10至12，并且其中[X]n包含4个R、4个L以及2和4个之间的W。

2.根据权利要求1所述的肽，其包含氨基酸序列LL-[X]m-RLL，其中m＝9至11。

3.根据权利要求1或2所述的肽，其中[X]n或[X]m包含成簇或散在的W基序。

4.根据前述权利要求中任一项所述的肽，其中[X]n或[X]m包含至少一个由LL组成的簇，优选两个。

5.根据前述权利要求中任一项所述的肽，其中所述肽包含选自LLWRLWRLLWRLWRLL(SEQID N°1)、LLRLLRWWWRLLRLL(SEQ ID N°2)、LLRLLRWWRLLRLL(SEQ ID N°3)和LLRLLRWWWWRLLRLL(SEQ ID N°4)的氨基酸序列。

6.根据前述权利要求中任一项所述的肽，其中所述肽包含L-氨基酸和/或D-氨基酸。

7.根据前述权利要求中任一项所述的肽，其中所述肽的净正电荷为5。

8.根据前述权利要求中任一项所述的肽，其中所述肽还包含与所述氨基酸序列的C末端共价连接的一个或几个选自L-氨基酸、D-氨基酸、非天然氨基酸、半胱酰胺、硫醇、酰胺、羧基、任选取代的直链或支链C₁-C₆烷基、伯胺或仲胺、osidic衍生物、脂质、磷脂、脂肪酸、胆固醇、聚乙二醇、核定位信号和/或靶向分子的实体，和/或其中所述肽还包含与所述氨基酸序列的N末端共价连接的一个或几个选自L-氨基酸、D-氨基酸、非天然氨基酸、胺、乙酰基、任选取代的直链或支链C₁-C₆烷基、伯胺或仲胺、osidic衍生物、脂质、磷脂、脂肪酸、胆固醇、聚乙二醇、核定位信号和/或靶向分子的化学实体。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的肽作为细胞穿透肽(CPP)的用途。

10.根据权利要求9所述的肽的用途，其中所述细胞穿透肽(CPP)适合穿透哺乳动物细胞的质膜。

11.根据权利要求1至8中任一项所述的肽作为转染剂的用途。

12.一种纳米粒子，其包含根据权利要求1至8中任一项所述的肽和货物分子。

13.根据权利要求12所述的纳米粒子，其中所述货物分子选自核酸、肽、蛋白质、脂质、小分子、药物活性剂、及其任何混合物，优选为选自DNA分子、RNA分子、PNA分子、siRNA分子、PMO分子、反义分子、LNA分子、mcDNA分子、miRNA分子、CRISPR/Cas9分子、质粒、核酶，适配体、镜像异构体和诱铒分子的核酸。

14.根据权利要求12至13中任一项所述的纳米粒子，其中所述纳米粒子的尺寸在50至300nm之间，优选在100至200nm之间，和/或其中所述货物分子与所述肽共价或非共价结合。

15.一种药物组合物，其包含根据权利要求12至14中任一项所述的纳米粒子和可药用载体。

16.一种将货物分子体外递送到细胞中的方法，所述方法包括使所述细胞与根据权利要求12至14中任一项所述的纳米粒子接触的步骤，所述纳米粒子包含所述货物分子。

17.一种将货物分子离体递送到组织和/或器官中的方法，所述方法包括使所述组织和/或器官与根据权利要求12至14中任一项所述的纳米粒子接触的步骤，所述纳米粒子包含所述货物分子。