CN112575041A

CN112575041A - 一种混合碳源高效发酵生产phb的工程菌及其应用

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Publication number: CN112575041A
Application number: CN201910942722.1A
Authority: CN
Inventors: 王小元; 王建莉; 马文渐; 梁浩; 杨惠婷; 胡晓清; 李烨
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2019-09-30
Filing date: 2019-09-30
Publication date: 2021-03-30
Anticipated expiration: 2039-09-30
Also published as: CN112575041B

Abstract

本发明公开了一种混合碳源高效发酵生产PHB的工程菌及其应用，属于基因工程和发酵工程领域。本发明在大肠杆菌中敲除敲除大肠杆菌基因组上核心糖基因簇的14个基因得到突变菌WJW01，继续敲除大肠杆菌基因组上O‑抗原基因簇的11个基因得到突变菌WJW02，随后将PHB合成的三个基因分别转化到精简菌株WJW02中，并敲除了ptsG基因，使构建的重组菌可以利用木糖和葡萄糖混合碳源合成PHB高达细胞干重的78.4％，是野生型对照菌W3110/pDXW‑8‑phaCAB(1.5％)的6倍，且较WJW02/pDXW‑8‑phaCAB提高50％。

Description

一种混合碳源高效发酵生产PHB的工程菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种混合碳源高效发酵生产PHB的工程菌及其应用，属于基因工程和发酵工程领域。

背景技术

聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates，PHA)是一类由微生物合成的可再生可降解且具有多元材料学性能的高分子聚合物，在医学、材料和环保领域有着广泛的应用前景。聚羟基脂肪酸酯广泛存在于微生物细胞内，主要作为碳源及能量的贮存载体。生长环境C:N比例越高，越有利于PHA的合成。PHA在胞内以疏水性颗粒的形式存在，在特定条件下其含量可以超过细胞干重的90％。PHA根据单体种类、聚合方式的不同，具有从坚硬质脆的硬塑料到柔软的弹性体等一系列多样性的材料学特性。由于PHA可由可再生资源为原料合成，进入自然界后可以被细菌等生物完全降解，替代常规石油基塑料可以缓解严重的“白色污染”问题，从而引起世界各国科学界和工业界的广泛重视。

聚3-羟基丁酸酯(PHB)是PHA中的一种，大肠杆菌常用于PHB的工业生产。PHB是一种胞内产物，PHB颗粒是胞内的碳源储存物质，以不溶性微球状颗粒状形式存在于细胞质中。PHB合成受到很多调控，如C:N比例，当碳过剩、氮缺乏时，PHB更易合成，当胞内其他C源代谢旺盛时，或者氨基酸转运酶活低时，PHB合成会受到影响。大肠杆菌合成PHB的关键在于平衡产物和细胞生长，既要使得细胞生长好，又要增强其合成途径的代谢流，并通过控制产物形成途径的表达水平来提高产量。而原始大肠杆菌菌株利用以木糖为主要底物的混合碳源合成PHB的产量较低，一般为0-20％，现有报道中主要通过优化发酵条件、优化代谢途径、提高胞内辅酶浓度和优化表达质粒等手段来改善PHB的合成；通过代谢工程改造改善大肠杆菌利用木糖等其他底物的效率，但是这些方法使得PHB产量的提高仍然无法满足工业上生产的需求。因此，提供一种新的提高PHB合成的方法，对于进一步提高PHB的合成具有十分重大的意义。

发明内容

为了解决上述存在的技术问题，本发明在大肠杆菌中敲除大肠杆菌基因组上核心糖基因簇的14个基因得到突变菌WJW01，继续敲除大肠杆菌基因组上O-抗原基因簇的11个基因得到突变菌WJW02，随后将PHB合成的三个基因转化到精简菌株WJW02中，得到的重组菌WJW02/pDXW-8-phaCAB可以利用木糖和葡萄糖混合碳源(发酵培养基I)为底物合成PHB占细胞干重的52.2％，是野生型对照菌W3110/pDXW-8-phaCAB(13.1％)的4倍，在WJW02中继续敲除ptsG基因后，重组菌WJW02G/pDXW-8-phaCAB可以利用木糖和葡萄糖混合碳源(发酵培养基I)为底物合成PHB占细胞干重的78.4％，是野生型对照菌W3110/pDXW-8-phaCAB(13.1％)的6倍，较WJW02/pDXW-8-phaCAB提高50％。

本发明的第一个目的是提供一种提高菌株在混合碳源中对葡萄糖和木糖利用率的方法，所述方法是敲除大肠杆菌基因组上核心糖基因簇，并敲除大肠杆菌基因组上O-抗原基因簇；所述核心糖基因簇为gmhD-waaQ；所述O-抗原基因簇为wbbL-rmlB。

在一种实施方式中，所述大肠杆菌为大肠杆菌W3110。

在一种实施方式中，所述核心糖基因簇含有14个基因，分别为waaQ，waaG，waaP，waaS，waaB，waaO，waaR，waaY，waaZ，waaU，waaL，waaC，waaF，gmdD，其序列的NCBI登录号依次为“BAE77660.1”，“BAE77661.1”，“BAE77662.1”，“BAE77663.1”，“BAE77664.1”，“BAE77665.1”，“BAE77666.1”，“BAE77667.1”，“BAE77668.1”，“BAE77669.1”，“BAE77670.1”，“BAE77671.1”，“BAE77672.1”,“BAE77673.1”。

在一种实施方式中，所述O-抗原基因簇wbbL-rmlB含有11个基因，分别为wbbL::IS5，wbbK，wbbJ，wbbI，wzy，glf，wzx，rmlC，rmlA，rmlD，rmlB，其序列登录号依次为“BAA15873.1”，“BAA15874.1”，“BAA15875.1”，“BAA15876.1”，“BAA15877.1”，“BAA15878.1”，“BAA15879.1”，“BAA15880.1”，“BAA15881.1”，“BAA15882.1”，“BAA15883.1”，“BAA15884.1”。

本发明的第二个目的是提供应用上述任一方法构建获得的重组大肠杆菌。

在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌还表达了β-酮基硫解酶、乙酰辅酶A还原酶和PHB合成酶的编码基因，并敲除了大肠杆菌基因组中的ptsG基因。

在一种实施方式中，所述ptsG基因的序列登录号为“BAA35908.1”，其敲除片段序列如SEQ ID NO.6所示。

本发明的第三个目的是提供所述重组大肠杆菌在含混合碳源的环境中偏好性利用葡萄糖和木糖合成代谢产物中的应用。

在一种实施方式中，用于检测出发菌株发酵的培养基有两种，培养基I和培养基II，用于合成PHB的发酵培养基为培养基I。其中，培养基I的组成包括：14.5g/L木糖，3.4g/L葡萄糖，17.1g/L Na₂HPO₄·12H₂O，3g/L KH₂PO₄，0.5g/L NaCl，添加1mM MgSO₄，0.1mMCaCl₂，10mg/mL维生素B1；培养基II的组成包括：16g/L糖蜜(9.29g/L木糖，4.24g/L阿拉伯糖和2.45g/L葡萄糖)，17.1g/L Na₂HPO₄·12H₂O，3g/L KH₂PO₄，0.5g/L NaCl，添加1mMMgSO₄，0.1mM CaCl₂，10mg/mL维生素B1。

本发明还提供所述重组菌或所述方法在药物制备、材料或环保领域的应用。

本发明的有益效果：

本发明在大肠杆菌中敲除敲除大肠杆菌基因组上核心糖基因簇的14个基因得到突变菌WJW01，继续敲除大肠杆菌基因组上O-抗原基因簇的11个基因得到突变菌WJW02，随后将PHB合成的三个基因分别转化到精简菌株WJW02中，得到的重组菌WJW02/pDXW-8-phaCAB可以利用木糖和葡萄糖混合碳源(发酵培养基I)为底物合成PHB占细胞干重的52.2％，是野生型对照菌W3110/pDXW-8-phaCAB(13.1％)的4倍，在WJW02中继续敲除ptsG基因后，重组菌WJW02G/pDXW-8-phaCAB可以利用木糖和葡萄糖混合碳源(发酵培养基I)为底物合成PHB占细胞干重的78.4％，是野生型对照菌W3110/pDXW-8-phaCAB(13.1％)的6倍，较WJW02/pDXW-8-phaCAB提高50％。

生物材料

野生型大肠杆菌W3110购买自ATCC，保藏编号为ATCC39936。

大肠杆菌WJW00(基因型为E.coliW3110ΔrfaD)已经于专利公布号：CN103820377A，的专利申请中公开，其是在野生型大肠杆菌W3110中，敲除核心糖中L-D-庚糖合成关键基因rfaD(又名gmhD)获得。

表1序列表

附图说明

图1：大肠杆菌大片段敲除示意图。

图2：质粒pDTW202-cat的构建。

图3：LPS精简菌株WJW02的构建。

图4：PCR验证WJW02的构建；泳道1：在W3110中敲除基因簇waaQ-gmhD；泳道2：在W3110中敲除基因簇wbbL-rmlB；泳道3和4：野生菌W3110对照。

图5：出发菌株W3110和WJW02利用混合碳源为底物的发酵曲线；其中，糖蜜表示采用发酵培养基II发酵；木糖+葡萄糖表示采用发酵培养基I发酵。

图6：出发菌株W3110和WJW02利用混合碳源为底物的发酵pH变化曲线；其中，糖蜜表示采用发酵培养基II发酵；木糖+葡萄糖表示采用发酵培养基I发酵。

图7：出发菌株W3110和WJW02利用混合碳源为底物的发酵残糖变化曲线；其中，(a)为在发酵培养基II中的发酵情况；(b)为在发酵培养基I中的发酵情况。

图8：重组菌株WJW02/pDXW-8-phaCAB和对照菌W3110/pDXW-8-phaCAB利用发酵培养基I合成PHB的摇瓶发酵；(a)为重组菌W3110/pDXW-8-phaCAB和WJW02/pDXW-8-phaCAB发酵过程的OD变化；(b)为重组菌W3110/pDXW-8-phaCAB和WJW02/pDXW-8-phaCAB发酵24h和48h下的菌体干重；(c)为重组菌W3110/pDXW-8-phaCAB和WJW02/pDXW-8-phaCAB发酵24h和48h下的PHB干重比。

具体实施方式

(1)基因的敲除方法

采取组合式位点特异性重组方法进行大片段基因簇敲除，如图1所示，在靶基因簇的一端通过Red重组引入lox L-kan片段，接着在另一端通过Red重组引入cat-lox R片段，然后通过Cre酶表达，识别位点lox L和lox R，进行位点重组，并采用AMP抗性筛选，通过抗性验证获得无Kan、Cm抗性的转化子，进一步采用PCR验证基因型，确定转化子正确无误。采用FRT位点的精简方法类似，在靶基因簇的两端引入FRT位点(可以为两个)，然后通过Flp酶表达，识别FRT位点，通过抗性筛选即可获得正确敲除突变株。Flp酶可以不断识别FRT位点，直到将不含必需基因的最远端FRT位点重组。

(2)PHB产量测定方法

将发酵液倒入离心管中静止放置2h，弃去上清后，冷冻菌体，并冷冻干燥。称取一定量冷冻干燥菌体进行甲酯化，采用已报道的常规甲酯化方法甲酯化，最后进行常规气象色谱定量。

(3)发酵参数测定方法

①OD和pH测定：用去离子水调零，调整稀释倍数至在比色皿中测的OD₆₀₀在0.2至0.8之间。待示数稳定后记录读数，乘以稀释倍数，即得OD。

对刚取的发酵样品直接进行pH测定，采用pH计测定直接读数。

②残糖测定：采用高效液相HPLC进行残糖测定。仪器型号为Waters1525 HPLC，采用色谱柱Sugarpak1，规格为6.5mmid×300mm，流动相为纯水，采用示差折光检测器，柱温设定为85℃，流速为0.3mL/min，进样体积为10μL。根据标准样品浓度和不同糖的出峰面积，计算得出不同糖成分的浓度。

③PHB的提取和测定：取不同发酵时间的PHB合成细胞，离心收集5mL细胞，采用pH7.4的PBS缓冲液洗涤两次，离心收集后，将细胞转移到预先准确称重的离心管中，包上保鲜膜，并扎出多个小洞，使得水分可以蒸干，又避免菌液喷出，在真空冷冻干燥机中冻干48h至完全干燥，一般触摸管底为常温状态，表明已经完全干透，或者用手指轻弹管底，菌体可以散开并轻易脱离管壁，则视为菌体完全干燥。称重量，计算出干重。

称取1-10mg完全干燥的干菌体，同时称取PHB标准样品约10mg转移至预先准确称重的酯化管中，以便准确计算称得的样品重量。然后进行酯化操作，加入2mL甲醇(含有3％硫酸)和2mL氯仿，加上酯化管盖子并盖紧，期间可以超声，帮助样品散开，使得酯化更彻底，沸水浴6h以上。大约半小时后，即可观察到PHB标样一般以粉末形式迅速熔化。若未观察到半小时后标准品的形态变化与溶解，则应更换整套试剂，甲醇和氯仿的变质都会导致酯化无法正常进行，而更换新开封的试剂往往可以解决上述问题，经过六小时沸水浴后，在通风橱中冷却充分后，小心打开酯化管并加入1mL去离子水，这时需要分别将盖子旋紧并激烈震荡至体系完全充分混匀，此时将酯化管置于通风处中静置3h以上以分相，分相后，上层为水相，下层为有机相，取适量有机相加入到气相样品瓶中，盖紧盖子保持密封，保存在-80℃中。

气相色谱是定量PHB含量的准确灵敏的手段。气相定量采用岛津GC 2010气相色谱，使用安捷伦DB WAX 30m-0.32mm气相色谱柱和火焰离子化检测器，进样温度为250℃。以不同量的商业化PHB作为标样绘制各标准样品的标准曲线。

实施例1工程菌WJW00的构建

工程菌WJW00已经在SCI论文《Construction and Characterization of anEscherichia coli Mutant Producing Kdo₂-Lipid A》中公开(公开日：2014年3月13日)。具体构建过程如下：

(1)gmhD(又名rfaD)基因敲除片段的获得；

采用化学全合成或PCR分步扩增的方法获得gmhD基因敲除片段，其两端为gmhD基因上下游同源臂、中间为带有FRT位点的kan片段。gmhD基因敲除片段的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。将gmhD基因敲除片段克隆到质粒pBlueScriptIISK(+)，获得重组质粒pBlueScript IISK(+)-gmhDU-Fkan-gmhDD。以该质粒为模板，可以扩增获得敲除片段gmhDU-Fkan-gmhDD。

(2)敲除感受态的制备及电转化；

(3)突变株抗性标记的去除；

其中，步骤(2)和(3)的具体条件同公开号为CN103820377B的专利申请文件。

实施例2 LPS精简菌株WJW01的构建

脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)包括类脂A、核心糖和O-抗原三部分，其中类脂A为高度保守区，而核心糖和O-抗原由不同的糖分子组成。其中核心糖合成基因簇包含14个基因，分别是waaQ，waaG，waaP，waaS，waaB，waaO，waaR，waaY，waaZ，waaU，waaL，waaC，waaF，gmdD(又名rfaD)，其序列的NCBI登录号依次为“BAE77660.1”，“BAE77661.1”，“BAE77662.1”，“BAE77663.1”，“BAE77664.1”，“BAE77665.1”，“BAE77666.1”，“BAE77667.1”，“BAE77668.1”，“BAE77669.1”，“BAE77670.1”，“BAE77671.1”，“BAE77672.1”,“BAE77673.1”。

在实施例1得到的菌株WJW00基础上继续敲除核心糖基因簇gmdD(rfaD)-waaFC-waa QGPSBORYZUL中除gmhD基因外剩余的13个基因。

(1)参照实施例1中gmhD基因的敲除过程敲除waaQ基因

1)waaQ基因敲除片段的获得

采用化学全合成或PCR分步扩增的方法获得waaQ基因敲除片段，其两端为waaQ基因上下游同源臂、中间为带有FRT位点的kan片段。waaQ基因敲除片段的核苷酸序列如SEQID NO.3所示。将waaQ基因敲除片段克隆到pBlueScript II SK(+)，获得重组质粒pBlueScript II SK(+)-waaQU-Fkan-waaQD。以该质粒为模板，可以扩增获得敲除片段waaQU-Fkan-waaQD。

2)敲除感受态的制备及电转化

接种带有Red重组辅助质粒pKD46(Datsenko K A,Wanner B L.One-Stepinactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12using PCRproducts.Proc Natl Acad Sci U S A,2000,97(12):6640-6645)的大肠杆菌W3110(ATCC39936)于含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，30℃，200rpm过夜培养。按2％接种量转接100mL LB液体培养基，30℃，200rpm培养至OD₆₀₀＝0.2时加入L-阿拉伯糖(终浓度为30mmol/L)诱导重组酶的表达，继续培养至OD₆₀₀＝0.5，将培养液冰浴半小时后转入预冷的50mL离心管中，4℃，8000rpm离心10min收集菌体，沉淀用预冷的10％甘油洗涤3次，最后用1mL 10％甘油悬浮，每管80μL分装至预冷的无菌EP管中。

将500-1000ng waaQ敲除片段加入感受态细胞中，混匀，冰浴15min，1.5kv电击5ms，30℃孵育2h，涂布30μg/mL卡那霉素的LB固体平板，30℃培养，挑取转化子于含30μg/mL卡那霉素及100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，PCR验证结果。

3)突变株抗性筛选

将PCR验证阳性的菌株接种含30μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，42℃过夜培养，将培养液划线30μg/mL卡那霉素的LB固体平板，37℃培养，挑取单菌落验证其对氨苄青霉素的敏感性，将含有卡那霉素抗性并对氨苄青霉素敏感的菌株命名为WJW00△waaQ::kan并保藏。

(2)核心糖基因簇的敲除

步骤(1)得到的菌株WJW00△waaQ::kan基因组上存在三个FRT位点，分别为gmhD敲除遗留的1个FRT位点和waaQ敲除引入的抗性标记两端的2个FRT位点。

以菌株WJW00△waaQ::kan为出发菌株做感受态，转入pCP20质粒(Cherepanov PP,Wackernagel W.Gene disruption in Escherichia coli:Tc^R and Km^R cassettes withthe optio n of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistancedeterminant.Gene,1995,158(1):9-14)，42℃热激表达FLP酶，将阳性菌株于含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，加入L-阿拉伯糖(终浓度为30mmol/L)诱导Flp重组酶的表达，介导所有的FRT位点特异性重组，因此将三个FRT位点重组后，不仅删除了卡那霉素抗性标记，也删除了gmhD和waaQ之间的所有基因。

采用引物waaQ-U-F和gmhD-D-R PCR验证挑选转化子，将PCR验证正确的菌株42℃热激后划线LB平板，挑取单菌落验证其对氨苄青霉素及卡那霉素的敏感性，选取对两种抗生素均敏感的菌株命名为WJW01并保藏。

表2引物序列表

实施例3 LPS精简菌株WJW02的构建

O-抗原合成基因簇rmlBDACX-glf-wbbHIJKL包含11个基因，分别是wbbL::IS5，wbbK，wbbJ，wbbI，wzy，glf，wzx，rmlC，rmlA，rmlD，rmlB，其序列登录号依次为“BAA15873.1”，“BAA15874.1”，“BAA15875.1”，“BAA15876.1”，“BAA15877.1”，“BAA15878.1”，“BAA15879.1”，“BAA15880.1”，“BAA15881.1”，“BAA15882.1”，“BAA15883.1”，“BAA15884.1”。在WJW01基础上进一步敲除O-抗原合成基因簇后获得WJW02。具体操作如下：

(1)工具质粒pDTW202-cat的构建

O-抗原基因簇wbbL-rmlB的敲除采取lox LR位点特异性重组方法。因此在构建大肠杆菌基因组精简系统时，需要构建1个工具质粒pDTW202-cat。该质粒的构建过程具体为：

1)以质粒pDTW109(参见谭延振的硕士学位论文《谷氨酸棒状杆菌基因敲除系统的构建》3.2.1节，公开日：2012.03.27)为模板，利用引物Tac-M-cat-F和Tac-M-cat-R，扩增带有Tac-M-cat基因盒，并以酶切位点SmaI进行单酶双切，得到抗性片段以备连接。

2)以工具质粒pDTW202质粒(参见谭延振的硕士学位论文《谷氨酸棒状杆菌基因敲除系统的构建》2.4.2节，公开日：2012.03.27)为模板，利用引物pDTW202-lox RE-F和pDTW202-lox LE-R，扩增不含有kan抗性基因片段的剩余质粒片段，也采用SmaI进行单酶双切，所扩增的质粒片段带有lox L和lox R特异性位点。

3)将步骤1)与步骤2)中得到的片段利用T4连接酶进行连接，构建得到带有lox L-cat-lox R基因盒的质粒pDTW202-cat(见图2)，其含带有较强启动性的氯霉素抗性基因cat，可以用于基因簇敲除筛选标记。酶切和PCR验证均正确。

(2)wbbL和rmlB基因的敲除

1)wbbL和rmlB基因敲除片段的获得

wbbL基因敲除片段的构建：采用化学全合成或PCR分步扩增的方法获得wbbL基因敲除片段。其上下游同源臂分别设计在引物中，以工具质粒pDTW202为模板，采用引物wbbL-U-loxLE-kan和wbbL-D-kan直接扩增获得wbbL敲除片段，该敲除片段只含有lox L位点，而不含有lox R位点。wbbL基因敲除片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

rmlB基因敲除片段的构建：采用化学全合成或PCR分步扩增的方法获得rmlB基因敲除片段。其上下游同源臂分别设计在引物中，以工具质粒pDTW202-cat为模板，采用引物rmlB-U-cat和rmlB-D-loxRE-cat直接扩增获得rmlB敲除片段，该敲除片段只含有lox R位点，而不含有lox L位点。rmlB基因敲除片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

2)敲除感受态的制备及电转化

将500-1000ng wbbL敲除片段加入感受态细胞中，混匀，冰浴15min，1.5kv电击5ms，30℃孵育2h，涂布30μg/mL卡那霉素的LB固体平板，30℃培养，挑取转化子于含30μg/mL卡那霉素及100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，采用引物wbbL-F和wbbL-R PCR验证结果。正确菌株命名为WJW01ΔwbbL::loxL-kan。

在WJW01ΔwbbL::loxL-kan菌株中进一步敲除rmlB基因，将500-1000ng rmlB敲除片段加入感受态细胞中，涂布30μg/mL氯霉素的LB固体平板，30℃培养，挑取转化子于含30μg/mL卡那霉素及30μg/mL氯霉素的LB液体培养基中培养，采用引物rml-F和rml-R PCR验证结果。

将PCR验证阳性的菌株接种含30μg/mL卡那霉素及30μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，42℃过夜培养，将培养液划线30μg/mL卡那霉素及30μg/mL氯霉素的LB固体平板，37℃培养，挑取单菌落验证其对氨苄青霉素的敏感性，将含有卡那霉素抗性和氯霉素抗性并对氨苄青霉素敏感的菌株命名为W3110△wbbL::kan△rmlB::cat并保藏。

(3)O-抗原合成基因簇的敲除

步骤(2)得到的菌株W3110△wbbL::kan△rmlB::cat基因组上存在1个lox L位点和1个lox R位点。以此为出发菌株做感受态，转入pKD-Cre质粒(韩雅宁硕士毕业论文《合成不同结构类脂A分子的大肠杆菌的构建》，公开日：2013-12-31)，表达Cre酶，将阳性菌株于含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，加入L-阿拉伯糖(终浓度为30mmol/L)诱导Cre重组酶的表达，介导lox L和lox R位点特异性重组，不仅删除了卡那霉素抗性标记和氯霉素抗性标记，也删除了wbbL和rmlB之间的所有基因。采用引物wbbL-F和rmlB-R进行PCR验证，将PCR验证正确的菌株42℃热激后划线LB平板，挑取单菌落验证其对氨苄青霉素、卡那霉素和氯霉素的敏感性，选取对三种抗生素均敏感的菌株命名为WJW02并保藏。

精简菌株WJW02的基因型经过PCR验证正确，而对照野生型的片段太长，扩增不出条带，说明精简菌株WJW02的LPS基因簇已经被成功删除。

表3引物序列表

实施例4出发菌株W3110和LPS精简菌株WJW02利用混合碳源发酵特性

混合碳源培养基主要是有两种，分别是发酵培养基I和发酵培养基II。其中，发酵培养基I的组成包括：14.5g/L木糖，3.4g/L葡萄糖，17.1g/L Na₂HPO₄·12H₂O，3g/L KH₂PO₄，0.5g/L NaCl，添加1mM MgSO₄，0.1mM CaCl₂，10mg/mL维生素B1；发酵培养基II的组成包括：16g/L糖蜜(9.29g/L木糖，4.24g/L阿拉伯糖和2.45g/L葡萄糖)，17.1g/L Na₂HPO₄·12H₂O，3g/L KH₂PO₄，0.5g/L NaCl，添加1mM MgSO₄，0.1mM CaCl₂，10mg/mL维生素B1。

菌株在LB平板上活化培养14h左右，挑取1大环菌苔接种到15mL LB/100mL锥形瓶中，置于37℃，200rpm条件下培养5h至对数中期，OD₆₀₀约2.0，按照初始OD₆₀₀＝0.25分别转接到含有100mL发酵培养基I和发酵培养基II的500mL锥形瓶(不含挡板)中，置于37℃，200rpm条件下培养48h，每隔12h取样依次，测定OD₆₀₀，残糖，pH，如表4-5和图5-7所示。

其中木糖和葡萄糖混合碳源的发酵培养基I的发酵初始糖浓度为14.47g/L木糖和3.38g/L葡萄糖。

发酵培养基II的初始糖浓度为9.29g/L木糖，4.24g/L阿拉伯糖和2.45g/L葡萄糖。

结果表明：

1)LPS精简菌株WJW02在混合碳源中较W3110生长更好，发酵后生物量显著提高

在混合碳源中，两者的二次生长出现在30h之后，利用木糖和葡萄糖混合碳源(发酵培养基I)发酵时，WJW02在48h达到最高菌浓，较W3110提高50％；在利用糖蜜混合碳源(发酵培养基II)时，在36h达到最高菌浓，WJW02较W3110提高70％。

2)LPS精简菌株WJW02可以更好地利用木糖，较W3110更容易利用木糖

大肠杆菌W3110和WJW02在发酵12h前葡萄糖会被用完；WJW02同时利用了木糖和少量阿拉伯糖，W3110几乎不消耗木糖，但利用阿拉伯糖。WJW02较W3110更容易利用木糖。在木糖和葡萄糖混合碳源发酵时，WJW02利用木糖的速率稳定直至发酵最后，而W3110在12-24h之间利用木糖，但是24h之后利用迟缓，尤其是36h后，不再利用木糖；在利用糖蜜混合碳源(发酵培养基II)发酵时，葡萄糖最先被利用完，进而W3110利用阿拉伯糖，几乎不消耗木糖，而WJW02优先消耗木糖，几乎不消耗阿拉伯糖。

3)LPS精简菌株WJW02利用混合碳源发酵的pH较W3110显著提高，且先降后升

大肠杆菌W3110利用混合碳源发酵时pH呈现一直下降的趋势，而LPS精简菌株WJW02的pH呈现先降后升的变化趋势，且一直高于W3110的pH，并在27h有明显转折，达到最低5.4左右，后又提高，利用两种混合碳源发酵60h后可达到6.13和6.34，而W3110仅4.7左右。

表4大肠杆菌W3110和LPS精简菌株利用木糖和葡萄糖混合碳源(发酵培养基I)的发酵参数测定

表5大肠杆菌W3110和LPS精简菌株利用糖蜜混合碳源(发酵培养基II)的发酵参数测定

实施例5重组菌W3110/pDXW-8-phaCAB和WJW02/pDXW-8-phaCAB的构建

(1)质粒的构建

质粒pDXW-8-phaCAB已经于文章《Ma,W.,Wang,J.,Li,Y.,et.al.Poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate)co-produced with L-isoleucine inCorynebacterium glutamicum WM001[J].Microb Cell Fact,2018,17(1):93 10.1186/s12934-018-0942-7》中公开(公开日：2018-12-31)。具体构建过程如下：

以罗氏真养菌基因组NC_008313.1为模板，采用引物phaCAB-F/phaCAB-R扩增得到phaCAB基因簇(phaCAB基因簇见登录号https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MH558939.1)，用限制性内切酶EcoRI和XhoI消化PCR产物，载体pDXW-8(构建方法公开于公开号为CN101693901B的专利中)也用EcoRI和XhoI消化处理，酶切产物纯化后，使用T4连接酶22℃过夜连接，转化至大肠杆菌DH5α，筛选正确转化子，得到正确转化子DH5α/pDXW-8-phaCAB，提取质粒即获得正确重组质粒pDXW-8-phaCAB。

表6引物序列表

(2)感受态的制备

分别接种大肠杆菌W3110(ATCC39936)和实施例3中构建得到的工程菌WJW02于LB液体培养基中，37℃，200rpm过夜培养。按2％接种量转接到50mL LB液体培养基，37℃，200rpm培养至OD₆₀₀＝0.5，将培养液冰浴半小时后转入预冷的50mL离心管中，4℃，8000rpm离心10min收集菌体，沉淀用预冷的0.01M的CaCl₂洗涤3次，最后用1mL 0.01M的CaCl₂悬浮，加入1m 30％甘油混匀，每管200μL分装至预冷的无菌EP管中。

(3)转化

将100-200ng的质粒pDXW-8-phaCAB加入感受态细胞中，混匀，冰浴30min，42℃热击90s，冰浴2～3min，加入1mL LB培养基复苏，37℃孵育2h，涂布30μg/mL卡那霉素的LB固体平板，37℃培养，挑取转化子于含30μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中培养种子液，即得到重组菌株W3110/pDXW-8-phaCAB和WJW02/pDXW-8-phaCAB。

实施例6重组菌发酵生产PHB

采用发酵培养基I的组成包括：16g/L木糖，4g/L葡萄糖，17.1g/L Na₂HPO₄·12H₂O，3g/L KH₂PO₄，0.5g/L NaCl，添加1mM MgSO₄，0.1mM CaCl₂，10mg/mL维生素B1。

(1)种子液培养

分别挑取1环实施例5中得到的重组菌W3110/pDXW-8-phaCAB和WJW02/pDXW-8-phaCAB菌苔至25mL LB培养基中，并添加30μg/mL卡那霉素，37℃、200rpm培养5h至对数中期。

(2)发酵合成PHB

培养方法：将种子液(OD₆₀₀＝1.8左右)按照初始OD₆₀₀＝0.25转接至含木糖和葡萄糖混合碳源的发酵培养基I，并加入卡那霉素使其终浓度为30μg/mL，37℃、200rpm，发酵48h。

(3)定量测定工程菌胞内合成PHB

对重组菌W3110/pDXW-8-phaCAB和WJW02/pDXW-8-phaCAB进行发酵，并在不同时间点取样2mL，测定相应的发酵参数。结果表明：WJW02/pDXW-8-phaCAB的发酵曲线OD₆₀₀较野生对照W3110/pDXW-8-phaCAB更高(图8A)，24h时提高9.4％；在30h后出现二次生长，42h后达到最高，WJW02/pDXW-8-phaCAB为9.5，W3110/pDXW-8-phaCAB为6.6，但在48h时有所下降，分别为9.2和5.3，但WJW02/pDXW-8-phaCAB较W3110/pDXW-8-phaCAB提高74％；WJW02/pDXW-8-phaCAB的细胞干重也较野生对照W3110/pDXW-8-phaCAB更高(图8B)，发酵24h后，可提高6％，发酵48h后可提高95％；发酵24h后WJW02/pDXW-8-phaCAB可以合成PHB高达细胞干重的52.2％(图8C)，是野生型对照菌W3110/pDXW-8-phaCAB(13.1％)的3倍(图8C)，但在48h合成PHB占细胞干重比有所下降，因此采用混合碳源(发酵培养基I)发酵WJW02/pDXW-8-phaCAB的发酵周期为24h最佳。以上结果说明敲除脂多糖核心糖基因簇14个基因以及敲除O-抗原合成基因簇rmlBDACX-glf-wbbHIJKL的11个基因可以显著提高其利用混合碳源合成PHB的能力。

表7采用木糖和葡萄糖(发酵培养基I)为碳源的摇瓶发酵(24h)

实施例7在LPS精简菌株WJW02中进一步敲除ptsG基因的突变株WJW02G的构建及其利用木糖和葡萄糖的混合碳源(发酵培养基I)生产PHB的应用

(1)WJW02G的构建

敲除流程同实施例1。同源臂片段设计在引物中，以pKD13为模板扩增带有FRT位点的卡那抗性基因盒，获得敲除片段后，在WJW02中进行后续敲除。最后采用验证引物ptsG-test-F/ptsG-test-R验证基因型。

所用引物序列见表8所示。

表8引物序列表

(2)重组菌WJW02G/pDXW-8-phaCAB的构建及其PHB的发酵生产

重组菌WJW02G/pDXW-8-phaCAB的构建同实施例5，PHB的发酵同实施例6.

采用木糖、葡萄糖混合碳源(发酵培养基I)发酵结果如下表9所示。

结果表明在WJW02中敲除ptsG基因后，利用混合碳源木糖和葡萄糖(发酵培养基I)发酵24h后，使得PHB产量占细胞干重达到最高为78.4％，较野生对照W3110/pDXW-8-phaCAB(13.1％)提高5倍，较WJW02/pDXW-8-phaCAB(52.2％)提高50％。表明在WJW02精简菌株中敲除ptsG基因后可以更好地生产PHB。

表9重组菌WJW02G/pDXW-8-phaCAB的摇瓶发酵

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种混合碳源高效发酵生产PHB的工程菌及其应用

<160> 26

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 310

<212> PRT

<213> E.coli W3110

<400> 1

Met Ile Ile Val Thr Gly Gly Ala Gly Phe Ile Gly Ser Asn Ile Val

1 5 10 15

Lys Ala Leu Asn Asp Lys Gly Ile Thr Asp Ile Leu Val Val Asp Asn

20 25 30

Leu Lys Asp Gly Thr Lys Phe Val Asn Leu Val Asp Leu Asn Ile Ala

35 40 45

Asp Tyr Met Asp Lys Glu Asp Phe Leu Ile Gln Ile Met Ala Gly Glu

50 55 60

Glu Phe Gly Asp Val Glu Ala Ile Phe His Glu Gly Ala Cys Ser Ser

65 70 75 80

Thr Thr Glu Trp Asp Gly Lys Tyr Met Met Asp Asn Asn Tyr Gln Tyr

85 90 95

Ser Lys Glu Leu Leu His Tyr Cys Leu Glu Arg Glu Ile Pro Phe Leu

100 105 110

Tyr Ala Ser Ser Ala Ala Thr Tyr Gly Gly Arg Thr Ser Asp Phe Ile

115 120 125

Glu Ser Arg Glu Tyr Glu Lys Pro Leu Asn Val Tyr Gly Tyr Ser Lys

130 135 140

Phe Leu Phe Asp Glu Tyr Val Arg Gln Ile Leu Pro Glu Ala Asn Ser

145 150 155 160

Gln Ile Val Gly Phe Arg Tyr Phe Asn Val Tyr Gly Pro Arg Glu Gly

165 170 175

His Lys Gly Ser Met Ala Ser Val Ala Phe His Leu Asn Thr Gln Leu

180 185 190

Asn Asn Gly Glu Ser Pro Lys Leu Phe Glu Gly Ser Glu Asn Phe Lys

195 200 205

Arg Asp Phe Val Tyr Val Gly Asp Val Ala Asp Val Asn Leu Trp Phe

210 215 220

Leu Glu Asn Gly Val Ser Gly Ile Phe Asn Leu Gly Thr Gly Arg Ala

225 230 235 240

Glu Ser Phe Gln Ala Val Ala Asp Ala Thr Leu Ala Tyr His Lys Lys

245 250 255

Gly Gln Ile Glu Tyr Ile Pro Phe Pro Asp Lys Leu Lys Gly Arg Tyr

260 265 270

Gln Ala Phe Thr Gln Ala Asp Leu Thr Asn Leu Arg Ala Ala Gly Tyr

275 280 285

Asp Lys Pro Phe Lys Thr Val Ala Glu Gly Val Thr Glu Tyr Met Ala

290 295 300

Trp Leu Asn Arg Asp Ala

305 310

<210> 2

<211> 1854

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

tccgttacac cttcagcaac ggttttgaac ggtttgtcgt aacccgccgc gcgcagattt 60

gtcagatctg cctgagtgaa cgcctgatag cggcctttca gtttatccgg gaacggaatg 120

tattcgatct ggcctttctt gtgataagcc agcgtagcat cagctaccgc ctggaaggat 180

tccgcacgac cagtaccgag attgaagatg ccggaaacgc cattttccag gaaccacaga 240

ttcacatcag ccacgaattc gtgtaggctg gagctgcttc gaagttccta tactttctag 300

agaataggaa cttcggaata ggaacttcaa gatcccctta ttagaagaac tcgtcaagaa 360

ggcgatagaa ggcgatgcgc tgcgaatcgg gagcggcgat accgtaaagc acgaggaagc 420

ggtcagccca ttcgccgcca agctcttcag caatatcacg ggtagccaac gctatgtcct 480

gatagcggtc cgccacaccc agccggccac agtcgatgaa tccagaaaag cggccatttt 540

ccaccatgat attcggcaag caggcatcgc catgggtcac gacgagatcc tcgccgtcgg 600

gcatgcgcgc cttgagcctg gcgaacagtt cggctggcgc gagcccctga tgctcttcgt 660

ccagatcatc ctgatcgaca agaccggctt ccatccgagt acgtgctcgc tcgatgcgat 720

gtttcgcttg gtggtcgaat gggcaggtag ccggatcaag cgtatgcagc cgccgcattg 780

catcagccat gatggatact ttctcggcag gagcaaggtg agatgacagg agatcctgcc 840

ccggcacttc gcccaatagc agccagtccc ttcccgcttc agtgacaacg tcgagcacag 900

ctgcgcaagg aacgcccgtc gtggccagcc acgatagccg cgctgcctcg tcctgcagtt 960

cattcagggc accggacagg tcggtcttga caaaaagaac cgggcgcccc tgcgctgaca 1020

gccggaacac ggcggcatca gagcagccga ttgtctgttg tgcccagtca tagccgaata 1080

gcctctccac ccaagcggcc ggagaacctg cgtgcaatcc atcttgttca atcatgcgaa 1140

acgatcctca tcctgtctct tgatcagatc ttgatcccct gcgccatcag atccttggcg 1200

gcaagaaagc catccagttt actttgcagg gcttcccaac cttaccagag ggcgccccag 1260

ctggcaattc cggttcgctt gctgtccata aaaccgccca gtctagctat cgccatgtaa 1320

gcccactgca agctacctgc tttctctttg cgcttgcgtt ttcccttgtc cagatagccc 1380

agtagctgac attcatccgg ggtcagcacc gtttctgcgg actggctttc tacgtgttcc 1440

gcttccttta gcagcccttg cgccctgagt gcttgcggca gcgtgagctt caaaagcgct 1500

ctgaagttcc tatactttct agagaatagg aacttcgaac tgcaggtcga cggatccccg 1560

gaattaattc tcatgtttga cagcttatca ctgatcagtg aattaatggc aagctttact 1620

tgccgtccca ctcggtggtg gaagagcacg cgccttcgtg gaaaatcgct tcgacatcgc 1680

cgaactcttc gccagccata atctggatca ggaagtcttc cttatccata tagtctgcga 1740

tattcagatc caccaggttc acaaacttgg tgccgtcttt caggttgtcc accaccagaa 1800

tatcggtgat gcctttatca ttcagggctt taacgatgtt gctgccgata aagc 1854

<210> 3

<211> 1697

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

agcacgtcaa agtaagtgcg ttatcagtat tcaggtagct gttgagcctg gggcggtagc 60

gtgctttttt ctgcttaact taaccagaca atcacacaaa agagtcgcta gtggaaaagc 120

catttcgaaa aatcctggtc ataaaggaat tcgtgtaggc tggagctgct tcgaagttcc 180

tatactttct agagaatagg aacttcggaa taggaacttc aagatcccct tattagaaga 240

actcgtcaag aaggcgatag aaggcgatgc gctgcgaatc gggagcggcg ataccgtaaa 300

gcacgaggaa gcggtcagcc cattcgccgc caagctcttc agcaatatca cgggtagcca 360

acgctatgtc ctgatagcgg tccgccacac ccagccggcc acagtcgatg aatccagaaa 420

agcggccatt ttccaccatg atattcggca agcaggcatc gccatgggtc acgacgagat 480

cctcgccgtc gggcatgcgc gccttgagcc tggcgaacag ttcggctggc gcgagcccct 540

gatgctcttc gtccagatca tcctgatcga caagaccggc ttccatccga gtacgtgctc 600

gctcgatgcg atgtttcgct tggtggtcga atgggcaggt agccggatca agcgtatgca 660

gccgccgcat tgcatcagcc atgatggata ctttctcggc aggagcaagg tgagatgaca 720

ggagatcctg ccccggcact tcgcccaata gcagccagtc ccttcccgct tcagtgacaa 780

cgtcgagcac agctgcgcaa ggaacgcccg tcgtggccag ccacgatagc cgcgctgcct 840

cgtcctgcag ttcattcagg gcaccggaca ggtcggtctt gacaaaaaga accgggcgcc 900

cctgcgctga cagccggaac acggcggcat cagagcagcc gattgtctgt tgtgcccagt 960

catagccgaa tagcctctcc acccaagcgg ccggagaacc tgcgtgcaat ccatcttgtt 1020

caatcatgcg aaacgatcct catcctgtct cttgatcaga tcttgatccc ctgcgccatc 1080

agatccttgg cggcaagaaa gccatccagt ttactttgca gggcttccca accttaccag 1140

agggcgcccc agctggcaat tccggttcgc ttgctgtcca taaaaccgcc cagtctagct 1200

atcgccatgt aagcccactg caagctacct gctttctctt tgcgcttgcg ttttcccttg 1260

tccagatagc ccagtagctg acattcatcc ggggtcagca ccgtttctgc ggactggctt 1320

tctacgtgtt ccgcttcctt tagcagccct tgcgccctga gtgcttgcgg cagcgtgagc 1380

ttcaaaagcg ctctgaagtt cctatacttt ctagagaata ggaacttcga actgcaggtc 1440

gacggatccc cggaattaat tctcatgttt gacagcttat cactgatcag tgaattaatg 1500

gcaagcttaa ttatgatcgt ggcgttttgt ttatataaat attttccatt tggtgggctt 1560

caacgtgact ttatgcgcat tgcatcaaca gttgccgcac ggggccacca tgttcgggta 1620

tatacacagt cgtgggaagg cgattgcccg aaagcatttg agcttattca ggtgccagtt 1680

aagtcccata ccaacca 1697

<210> 4

<211> 1342

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

acttattaaa gtataaatag cttatccatg cttatatgct tacggcttta taaatacgac 60

tcactatagg gcgaattggg taccgggccc taccgttcgt ataatgtatg ctatacgaag 120

ttatttcacg ctgccgcaag cactcagggc gcaagggctg ctaaaggaag cggaacacgt 180

agaaagccag tccgcagaaa cggtgctgac cccggatgaa tgtcagctac tgggctatct 240

ggacaaggga aaacgcaagc gcaaagagaa agcaggtagc ttgcagtggg cttacatggc 300

gatagctaga ctgggcggtt ttatggacag caagcgaacc ggaattgcca gctggggcgc 360

cctctggtaa ggttgggaag ccctgcaaag taaactggat ggctttcttg ccgccaagga 420

tctgatggcg caggggatca agatctgatc aagagacagg atgaggatcg tttcgcatga 480

ttgaacaaga tggattgcac gcaggttctc cggccgcttg ggtggagagg ctattcggct 540

atgactgggc acaacagaca atcggctgct ctgatgccgc cgtgttccgg ctgtcagcgc 600

aggggcgccc ggttcttttt gtcaagaccg acctgtccgg tgccctgaat gaactccaag 660

acgaggcagc gcggctatcg tggctggcca cgacgggcgt tccttgcgca gctgtgctcg 720

acgttgtcac tgaagcggga agggactggc tgctattggg cgaagtgccg gggcaggatc 780

tcctgtcatc tcaccttgct cctgccgaga aagtatccat catggctgat gcaatgcggc 840

ggctgcatac gcttgatccg gctacctgcc cattcgacca ccaagcgaaa catcgcatcg 900

agcgagcacg tactcggatg gaagccggtc ttgtcgatca ggatgatctg gacgaagagc 960

atcaggggct cgcgccagcc gaactgttcg ccaggctcaa ggcgcggatg cccgacggcg 1020

aggatctcgt cgtgacccat ggcgatgcct gcttgccgaa tatcatggtg gaaaatggcc 1080

gcttttctgg attcatcgac tgtggccggc tgggtgtggc ggaccgctat caggacatag 1140

cgttggctac ccgtgatatt gctgaagagc ttggcggcga atgggctgac cgcttcctcg 1200

tgctttacgg tatcgccgct cccgattcgc agcgcatcgc cttctatcgc cttcttgacg 1260

agttcttctg agcgggactc tggggttcga tagatcctgc gcaccaatca acaaccgtat 1320

cagaatagat actttcttta gg 1342

<210> 5

<211> 1305

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

caacatggct ttcagcagcc agtatttcac gctgccgcaa gtaagttggc agcatcaccc 60

gacgcacttt gcgccgaata aatacctgtg acggaagatc acttcgcaga ataaataaat 120

cctggtgtcc ctgttgatac cgggaagccc tgggccaact tttggcgaaa atgagacgtt 180

gatcggcacg taagaggttc caactttcac cataatgaaa taagatcact accgggcgta 240

ttttttgagt tatcgagatt ttcaggagct aaggaagcta aaatggagaa aaaaatcact 300

ggatatacca ccgttgatat atcccaatgg catcgtaaag aacattttga ggcatttcag 360

tcagttgctc aatgtaccta taaccagacc gttcagctgg atattacggc ctttttaaag 420

accgtaaaga aaaataagca caagttttat ccggccttta ttcacattct tgcccgcctg 480

atgaatgctc atccggaatt ccgtatggca atgaaagacg gtgagctggt gatatgggat 540

agtgttcacc cttgttacac cgttttccat gagcaaactg aaacgttttc atcgctctgg 600

agtgaatacc acgacgattt ccggcagttt ctacacatat attcgcaaga tgtggcgtgt 660

tacggtgaaa acctggccta tttccctaaa gggtttattg agaatatgtt tttcgtctca 720

gccaatccct gggtgagttt caccagtttt gatttaaacg tggccaatat ggacaacttc 780

ttcgcccccg ttttcaccat gggcaaatat tatacgcaag gcgacaaggt gctgatgccg 840

ctggcgattc aggttcatca tgccgtctgt gatggcttcc atgtcggcag aatgcttaat 900

gaattacaac agtactgcga tgagtggcag ggcggggcgt aattttttta aggcagttat 960

tggtgccctt aaacgcctgg tgctacgcct gaataagtga taataagcgg atgaatggca 1020

gaaattcgaa agcaaattcg acccggtcgt cggttcaggg cagggtcgtt aaatagccgc 1080

ttatgtctat tgctggttta ccggtttatt gactaccgga agcagtgtga ccgtgtgctt 1140

ctcaaatgcc tgaggccagt ttggggttcg ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaac 1200

ggtaccgcgg tggagctcca gcttttgttc cctttagtga gggttaattg cgcttaattt 1260

attccatatt acttcagagc atgctgtgaa ataagcggct ctcag 1305

<210> 6

<211> 1448

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

acgtaaaaaa agcacccata ctcaggagca ctctcaattg tgtaggctgg agctgcttcg 60

aagttcctat actttctaga gaataggaac ttcggaatag gaacttcaag atccccttat 120

tagaagaact cgtcaagaag gcgatagaag gcgatgcgct gcgaatcggg agcggcgata 180

ccgtaaagca cgaggaagcg gtcagcccat tcgccgccaa gctcttcagc aatatcacgg 240

gtagccaacg ctatgtcctg atagcggtcc gccacaccca gccggccaca gtcgatgaat 300

ccagaaaagc ggccattttc caccatgata ttcggcaagc aggcatcgcc atgggtcacg 360

acgagatcct cgccgtcggg catgcgcgcc ttgagcctgg cgaacagttc ggctggcgcg 420

agcccctgat gctcttcgtc cagatcatcc tgatcgacaa gaccggcttc catccgagta 480

cgtgctcgct cgatgcgatg tttcgcttgg tggtcgaatg ggcaggtagc cggatcaagc 540

gtatgcagcc gccgcattgc atcagccatg atggatactt tctcggcagg agcaaggtga 600

gatgacagga gatcctgccc cggcacttcg cccaatagca gccagtccct tcccgcttca 660

gtgacaacgt cgagcacagc tgcgcaagga acgcccgtcg tggccagcca cgatagccgc 720

gctgcctcgt cctgcagttc attcagggca ccggacaggt cggtcttgac aaaaagaacc 780

gggcgcccct gcgctgacag ccggaacacg gcggcatcag agcagccgat tgtctgttgt 840

gcccagtcat agccgaatag cctctccacc caagcggccg gagaacctgc gtgcaatcca 900

tcttgttcaa tcatgcgaaa cgatcctcat cctgtctctt gatcagatct tgatcccctg 960

cgccatcaga tccttggcgg caagaaagcc atccagttta ctttgcaggg cttcccaacc 1020

ttaccagagg gcgccccagc tggcaattcc ggttcgcttg ctgtccataa aaccgcccag 1080

tctagctatc gccatgtaag cccactgcaa gctacctgct ttctctttgc gcttgcgttt 1140

tcccttgtcc agatagccca gtagctgaca ttcatccggg gtcagcaccg tttctgcgga 1200

ctggctttct acgtgttccg cttcctttag cagcccttgc gccctgagtg cttgcggcag 1260

cgtgagcttc aaaagcgctc tgaagttcct atactttcta gagaatagga acttcgaact 1320

gcaggtcgac ggatccccgg aattaattct catgtttgac agcttatcac tgatcagtga 1380

attaatggcg gaccatggct aattcccatt ccgtaagacg ttggggagac taaggcagcc 1440

agatggct 1448

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

ccgctcgaga gcacgtcaaa gtaagt 26

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

aaaactgcag gctttatcgg cagcaaca 28

<210> 9

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

tcccccgggg taagttggca gcatcacccg acgca 35

<210> 10

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

tcccccggga actggcctca ggcatttgag aag 33

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

tcccccgggt ggggttcgat aacttcgtat 30

<210> 12

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

tcccccgggt tgcggcagcg tgaaataac 29

<210> 13

<211> 73

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

acttattaaa gtataaatag cttatccatg cttatatgct tacggcttta taaatacgac 60

tcactatagg gcg 73

<210> 14

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

cctaaagaaa gtatctattc tgatacggtt gttgattggt gcgcaggatc tatcgaaccc 60

cagagtcccg 70

<210> 15

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 15

taaatgccgc agggcctgta attgaacggt caacatggct ttcagcagcc agtatttcac 60

gctgccgcaa cc 72

<210> 16

<211> 74

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 16

ctgagagccg cttatttcac agcatgctct gaagtaatat ggaataaatt aagcgcaatt 60

aaccctcact aaag 74

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 17

tcccatcact gccataccga 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 18

tcgggcggac caaatgatac 20

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 19

cgcgtaagct gtcgtctcag ta 22

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 20

tcataggcat gcatgcagtg c 21

<210> 21

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

ctggaattca gaaggagaat caaatcatgg cgaccgg 37

<210> 22

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

ccgctcgaga ggtcagccca tatgcagg 28

<210> 23

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

acgtaaaaaa agcacccata ctcaggagca ctctcaattg tgtaggctgg agctgcttc 59

<210> 24

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

agccatctgg ctgccttagt ctccccaacg tcttacggaa tgggaattag ccatggtcc 59

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

cctgtacacg gcgaggctct 20

<210> 26

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

aataacacct gtaaaaaagg cagcc 25

Claims

1.一种提高菌株在混合碳源中对葡萄糖和木糖利用率的方法，其特征在于，敲除大肠杆菌基因组上核心糖基因簇，并敲除大肠杆菌基因组上O-抗原基因簇；所述核心糖基因簇为gmhD-waaQ；所述O-抗原基因簇为wbbL-rmlB。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核心糖基因簇含有14个基因，分别为waaQ，waaG，waaP，waaS，waaB，waaO，waaR，waaY，waaZ，waaU，waaL，waaC，waaF，gmdD，其序列的NCBI登录号依次为“BAE77660.1”，“BAE77661.1”，“BAE77662.1”，“BAE77663.1”，“BAE77664.1”，“BAE77665.1”，“BAE77666.1”，“BAE77667.1”，“BAE77668.1”，“BAE77669.1”，“BAE77670.1”，“BAE77671.1”，“BAE77672.1”,“BAE77673.1”。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述O-抗原基因簇wbbL-rmlB含有11个基因，分别为wbbL::IS5，wbbK，wbbJ，wbbI，wzy，glf，wzx，rmlC，rmlA，rmlD，rmlB，其序列登录号依次为“BAA15873.1”，“BAA15874.1”，“BAA15875.1”，“BAA15876.1”，“BAA15877.1”，“BAA15878.1”，“BAA15879.1”，“BAA15880.1”，“BAA15881.1”，“BAA15882.1”，“BAA15883.1”，“BAA15884.1”。

4.根据权利要求1～3任一所述的方法，其特征在于，所述大肠杆菌为大肠杆菌W3110。

5.应用权利要求1～4任一所述方法构建获得的重组大肠杆菌。

6.根据权利要求5所述的重组大肠杆菌，其特征在于，还表达了β-酮基硫解酶、乙酰辅酶A还原酶和PHB合成酶的编码基因，并敲除大肠杆菌基因组中的ptsG基因。

7.根据权利要求5所述的重组大肠杆菌，其特征在于，用于敲除ptsG基因的敲除片段含有SEQ ID NO.6所示的序列。

8.权利要求5～7任一所述重组大肠杆菌在含混合碳源的环境下偏好性利用葡萄糖和木糖合成代谢产物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，以葡萄糖和木糖为主要碳源发酵生产PHB。

10.权利要求1～5任一所述方法，或权利要求6～7任一所述重组菌在药物制备、材料或环保领域的应用。