CN112557494B - 一种基于多元素和化学计量学的银鳕鱼物种鉴别方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于多元素和化学计量学的银鳕鱼物种鉴别方法。先收集已知物种的鳕鱼及银鳕鱼样品，去皮去骨，取鱼肉匀浆；超级微波前处理后，对样品进行51种痕量和常量矿物元素的电感耦合等离子体质谱(ICP‑MS)和电感耦合等离子体发射光谱法(ICP‑OES)测定；结合化学计量学中主成分分析(PCA)和偏最小二乘法‑判别分析(PLS‑DA)法，构建基于矿质元素的银鳕鱼物种与其他鳕鱼物种鉴别模型。由于市场上鳕鱼种类繁多，银鳕鱼价格、营养和口感均高于其它种类鳕鱼，该方法能有效对价格昂贵的银鳕鱼物种进行准确识别。本发明对其它种类鳕鱼假冒银鳕鱼的识别以及消费者利益保护都有着重要意义和较大的应用前景。

Description

一种基于多元素和化学计量学的银鳕鱼物种鉴别方法
技术领域
本发明涉及银鳕鱼物种鉴别技术领域，更具体地，涉及一种基于多元素和化学计量学的银鳕鱼物种鉴别方法。
背景技术
鳕鱼属脊椎动物门（Vertebrata）、脊椎动物亚门（Subphylum Vertebrata）、真骨鱼纲（Division Teleostei）、鳕形目（Gadiformes）。鳕鱼多是生活在海洋底层和深海中下层的冷水性鱼类。广泛分布于世界的各大洋。其中鳕科和无须鳕科中有许多经济价值极高的世界级重要经济鱼类。目前，我国鳕鱼的消费量正呈逐年递增趋势，市售鳕鱼主要分为三类：（1）属于鳕科的鳕鱼类，包括鳕属的大西洋鳕鱼（Gadus morhua），太平洋鳕鱼（Gadus macrocephalus），狭鳕（Theragra chalcogramma）及其他鳕科的鱼类，如黑线鳕（Melanogrammus aeglefinus），青鳕（Theragr achalcogramma）等；（2）不属于鳕科但被称为“银鳕鱼”的裸盖鱼（Anoplopoma fimbria）和南极犬牙鱼（Dissostichus eleginoides），其分别属鲉形目和鲈形目，但营养价值和价格高于鳕科的鳕鱼类；（3）鱼目混珠的假鳕鱼类，俗称油鱼，主要是为棘鳞蛇鲭（Ruvet tuspretiosus）和异鳞蛇鲭（Lepidocybium flavobrunneum），均属于鲈形目。它们外形与鳕鱼相似，但生物学上并非一个种群，含有人体不能消化的蜡脂。
鳕形目鱼类品种繁多，分布广泛，不同的鳕鱼品种市场价格差异悬殊，市售的银鳕鱼在营养价值和价格上远高于其它鳕鱼类。所以市场常出现以次充好，物种假冒的现象。此外，市售鳕鱼约有六成是去头去内脏的冷冻形式，其余四成是去皮去骨的鱼切片，消费者在购买时难以通过形态特征判断鳕鱼的种类。因此，为了更加有效地确保鳕鱼产品质量，防止欺诈，亟需建立对我国常见市售银鳕鱼与其他种类鳕鱼的物种鉴定方法，以区分银鳕鱼与其他鳕鱼物种。
无机元素溯源技术是应用于食品产地溯源的重要技术之一。该技术已被广泛应用于葡萄酒、蜂蜜、马铃薯、苦荞、葱、大米、小麦等植源性食品及羊肉、牛肉等陆生动物源食品的产地溯源，例如中国专利CN109752441A公开了一种基于多元素的车厘子/樱桃产地溯源方法，但在水产食品产地溯源或物种鉴别方面报道较少，已有报道的只有贻贝及刺参等少数种类的水产品产地溯源，而该技术在鳕鱼物种鉴别中的应用目前还未见报道。因此，开发高价值的银鳕鱼物种的鉴别技术，可以规范中国鳕鱼消费市场，提高相关部门的反欺诈监管水平，维护消费者权益，具有良好的社会和经济效益。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种基于多元素和化学计量学的银鳕鱼与其他种类鳕鱼的物种鉴别模型。通过采用主成分分析（PCA）结合偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）的技术对不同物种的鳕鱼中多元素进行分析，建立一种基于矿物元素和PCA与PLS-DA化学计量技术结合的鉴别银鳕鱼与其他鳕鱼物种的模型，从而进一步实现对银鳕鱼物种的鉴别。
本发明的第二个目的在于提供一种基于多元素和化学计量学区分银鳕鱼与其他鳕鱼物种的方法。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
一种银鳕鱼与其他种类鳕鱼的物种鉴别模型，其构建方法如下：
S1.收集物种已知的银鳕鱼和其他鳕鱼样品；
S2.将步骤S1的鳕鱼样品去骨、去皮，取鳕鱼肉进行匀浆；
S3.对步骤S2匀浆后的样品进行超级微波前处理；
S4.对步骤S3超级微波处理后的样品进行ICP-MS和ICP-OES多元素分析，获得鳕鱼样品中多元素含量数据；
S5.采用PCA与PLS-DA方法相结合的方式，对步骤S4获得的不同物种鳕鱼样品中多元素含量数据进行分析，建立银鳕鱼物种鉴别模型。
优选地，步骤S1中其他鳕鱼样品包括：黑鳕鱼、长尾鳕鱼、北极鳕鱼、壮鳕鱼、狭鳕鱼、美露鳕、真鳕鱼或太平洋鳕鱼中一种或多种；产地有：法国、美国、新西兰、智利、挪威、俄罗斯、中国、澳大利亚和南太平洋。鳕鱼大部分从广州永旺、广州正佳等大型超市购买；少量几个样品为吉林延边海关提供，最大程度保证样品物种的真实性。
优选地，步骤S5中PCA分析的方法是：将数据进行中心标准化，再采用F-检验筛选出各物种样品间的显著性差异变量，然后通过PCA提取出前8个主成分实现数据降维，从显著性差异变量中提取获得主成分，最后获得不同物种鳕鱼样品分布聚集区，用于PLS-DA模型分析建立。
优选地，步骤S5中PLS-DA分析的方法是：根据主成分分析的数据建立鳕鱼物种鉴别PLS-DA模型，可用于预测分析未知样品是否属于银鳕鱼物种。PLS-DA原理：对不同处理样本的特性分别进行训练，产生训练集，并检验训练集的可信度，是一种根据观察或测量的若干变量值，来判断研究对象如何分类的统计分析方法。
采用主成分分析初步获得不同鳕鱼物种训练集，根据主成分分析获得训练集情况，建立偏最小二乘法判别分析鳕鱼物种鉴别模型，并用于验证物种鉴别模型准确性。对比分析PCA与PLS-DA两种统计分析方法鉴别银鳕鱼物种的准确性；所有数据分析均在Simca14.1软件（瑞士Umetrics公司）环境中完成。
优选地，步骤S3超级微波前处理的方法是：称取匀浆样品，加入浓HNO3浸泡过夜，然后置于超级微波消解仪进行超级微波消解处理。冷却后放入赶酸仪中加热进行赶酸处理，然后用去离子水转移（如转移入50ml离心管中，定容到25ml），分别用于进行ICP-MS的痕量和ICP-OES常量矿物元素的检测。
进一步优选地，所述HNO3可选UP级，浓度68.0%。
优选地，所述超级微波消解处理的条件为：氮气条件下逐步升温微波处理，升温程序为：第一步为7～9min内从室温升到110～130℃，第二步为7～9min内从110～130℃升到210～230℃，第三步为210～230℃保持8～15分钟；三步压力均为15000MPa。
更优选地，所述超级微波消解处理的条件为：氮气条件下逐步升温微波处理，升温程序为：第一步为8min内从室温升到120℃，第二步为8min内从120℃升到220℃，第三步为210℃保持10分钟；三步功率均为1500W，压力均为15000MPa。
其中优选地，氮气条件是在密封反应器内充进高纯氮气30～50bar。
更优选地，氮气条件是在密封反应器内充进高纯氮气40bar。
优选地，赶酸处理时加热的温度为120～140℃。
更优选地，赶酸处理时加热的温度为130℃。
优选地，步骤S4中ICP-MS分析用铑和铟做为内标溶液。
优选地，步骤S4中的多元素共51种，分别是Be、B、Na、Mg、Al、Si、P、K、Ca、Sc、Ti、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Ga、Ge、As、Se、Sr、Y、Zr、Nb、Mo、 Ag、Cd、Sn、Sb、Cs、Ba、La、Ce、Pr、Nd、Sm、Eu、Gd、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu、Pb、Th、U、Tl。
其中，Na、Mg、P、K、Ca采用ICP-OES进行测定，其他元素采用ICP-MS进行测定。
另外，多元素测定方法准确性采用生物成分有证标准物质大虾GBW10050(GSB-28)进行验证，证书中硅、铝是以总量计算，消化时需要加氢氟酸，本方法测得的硅、铝含量为酸可溶性硅和铝，比证书值低；其他元素相对证书标示的含量，结果偏离在10%以内。
另外，由上述方法构建所得的银鳕鱼物种鉴别模型的表征描述如下：根据51种元素含量数据，利用主成分分析（PCA）初步判别的不同物种鳕鱼的得分聚集区（得分图分布区间）；以及根据偏最小二乘法-判别分析（PLS-DA）准确判别的不同物种鳕鱼51种元素含量关联信息。然后可基于该模型依据不同物种的鳕鱼得分图分布区间、分布规律和特征贡献率元素信息，进行银鳕鱼物种的鉴别，预测结果得分判别未知样品是否属于银鳕鱼。
基于上述模型，本发明还提供一种基于多元素和化学计量学区分银鳕鱼与其他鳕鱼物种的方法，包括如下步骤：
S1.收集未知物种的鳕鱼待测样品；
S2.对待测样品进行去皮、去骨匀浆前处理；
S3.对匀浆后的待测样品进行超级微波前处理；
S4.对超级微波处理后的待测样品进行ICP-MS和ICP-OES的多元素分析，获得待测样品中的多元素含量；
S5.将步骤S4获得的待测样品的数据输入到上述所建立的银鳕鱼物种溯源模型中进行分析判别，获得未知鳕鱼样品是否是银鳕鱼的物种鉴别。
优选地，步骤S1～S3的操作方法与上文银鳕鱼与其他种类鳕鱼的物种鉴别模型中步骤S1～S3相同。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提通过综合考虑鳕鱼产品特性，利用多元素含量，首次应用PCA与PLS-DA法对价格和营养都显著高于其它物种的银鳕鱼进行物种鉴别，提供了一种基于多种矿物元素的银鳕鱼物种的鉴别方法，这对鳕鱼市场质量把控和风险追溯以及消费者利益的保护都有着重要意义。
另外，本发明利用已物种鳕鱼的多元素含量进行PCA与PLS-DA分析法，建立银鳕鱼物种的鉴别。可作为对未知鳕鱼物种鉴别的方法，银鳕鱼物种的鉴别准确性接近70%，非银鳕鱼物种鉴别准确率百分之百，能有效对价格昂贵的银鳕鱼物种进行准确识别。本发明采用基于多元素含量作为银鳕鱼物种鉴别的方法，有着广谱、快速、准确的特点。而且可以按照本发明的方法不断补充扩大数据库，进一步提高模型的适用范围和判定准确率。
附图说明
图1为93份不同物种鳕鱼PCA分析结果（PCA分析得分图）。
图2为93份不同物种鳕鱼OPLS-DA分析结果（OPLS-DA分析得分图）。
图3为盲样PLS-DA预测得分图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1
本发明选取多种矿物元素含量作为银鳕鱼物种溯源的特征指纹信息，主要是基于矿物元素含量与环境、水、以及空气等因素中的矿物元素组成及含量有关，不同地域间的环境存在差异。将矿物元素作为物种鉴别的特征指纹信息，矿物元素含量相对气味、感官等指标参数更为稳定，可以作为物种溯源的指标。本发明采用PCA-LDA联合分析，建立银鳕鱼物种识别数据库，对银鳕鱼物种进行判别。
本实施例中所有数据分析均在SIMCA环境中完成。具体步骤：
1、收集样品：
广州大型超市购买鳕鱼样品；共收集到93个样本，其中银鳕鱼43个，另外50个为其他物种鳕鱼。其中2个狭鳕鱼由吉林延边海关提供，其他均从广州永旺、正佳等大型超市购得。本发明中已知不同物种鳕鱼种类及其多元素含量见表1。
2、样品前处理：鳕鱼解冻后，去皮、去骨，取肌肉匀浆。
3、多元素分析
称取1.0 g鳕鱼匀浆样品于超级微波消解管，加入浓HNO3浸泡过夜，置于超级微波消解仪（Milstone，美国Milstone公司）的样品架上，进行超级微波消解处理；待冷却后拿出消解管架，放入赶酸仪中加热，赶走剩下的HNO3和氮氧化物，即进行赶酸处理，最后用去离子水将消解液转入塑料离心管中，定容摇匀，上ICP-MS（PE ELAN-DRC-e，美国，PE公司）和ICP-OES（PE 5300，美国，PE公司）进行测定。ICP-MS多元素测定时用铑和铟做为内标溶液(100 ng/mL)，监控和校正仪器信号漂移。
表1 不同物种鳕鱼中矿物多元素的含量
Figure 633764DEST_PATH_IMAGE001
Figure 28973DEST_PATH_IMAGE002
注：“-”表示该元素对应元素含量未检出；最后7个元素（Zn~Hg）含量单位为mg/kg。
从表中可以看出，选择这51种元素作为研究对象时，单一元素因素组内和组间差异显著，但不能通过某1个或几个元素进行物种的鉴定，需要借助特定的化学计量学手段，根据鳕鱼中51种元素含量分布情况，进行多元统计分析来鉴别银鳕鱼物种。
4、PCA分析
将93个不同物种鳕鱼中51种元素含量数据进行主成分分析，PCA初步分析结果见图1，由图1可见，不同物种鳕鱼样品分布具有一定聚集效应，其中银鳕鱼物种的样品的聚集效应比较显著，北极鳕鱼呈现一定的聚集效应，其他物种的聚集效应不显著。由此可知，可根据鳕鱼中金属元素含量分布情况进行银鳕鱼物种鉴别。
5、PLS-DA最小二乘法判别分析
进一步进行PLS-DA模型分析，根据93个鳕鱼样品的51种元素含量进行OPLS-DA线性判别分析，分析结果见图2。由偏最小二乘法-判别分析（PLS-DA）分析结果可知，银鳕鱼物种样品具有显著聚集效应，显著不同于其他物种的样品，北极鳕鱼、阿拉斯加真鳕鱼和狭鳕鱼具有一定的聚集效应，推测可能和北极特殊的地理生态环境有关。
6、未知产地样品物种鉴别
测定未知物种鳕鱼样品的多元素含量，总计14个样品数据带入已知物种鳕鱼鉴别模型中。试验选择14个样品进行盲样验证，其中6个是银鳕鱼样品，8个为其它物种鳕鱼，预测结果得分越接近1表明盲样验证样品越符合模型预测结果。PLS-DA判定结果如图3所示，显示4个银鳕鱼判别得分大于0.75，其他样品的判定结果得分小于0.75。由此可知PLS-DA模型可有效的判别银鳕鱼样品，其他种类鳕鱼样品不能显著判定，银鳕鱼物种判别准确率近百分之七十，非银鳕鱼物种判别准确率百分之百。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种银鳕鱼与其他种类鳕鱼的物种鉴别模型，其特征在于，其构建方法如下：
S1.收集物种已知的银鳕鱼和其他鳕鱼样品；
S2.将步骤S1的鳕鱼样品去骨、去皮，取鳕鱼肉进行匀浆；
S3.对步骤S2匀浆后的样品进行超级微波前处理；
S4.对步骤S3超级微波前处理后的样品进行ICP-MS和ICP-OES多元素分析，获得鳕鱼样品中多元素含量数据；
S5.采用PCA与PLS-DA方法相结合的方式，对步骤S4获得的不同物种鳕鱼样品中多元素含量数据进行分析，建立银鳕鱼物种鉴别模型；
步骤S1所述其他鳕鱼包括黑鳕鱼、长尾鳕鱼、北极鳕鱼、壮鳕鱼、狭鳕鱼、美露鳕、真鳕鱼或太平洋鳕鱼中的一种或多种；
步骤S4中的多元素共51种，分别是Be、B、Na、Mg、Al、Si、P、K、Ca、Sc、Ti、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Ga、Ge、As、Se、Sr、Y、Zr、Nb、Mo、Ag、Cd、Sn、Sb、Cs、Ba、La、Ce、Pr、Nd、Sm、Eu、Gd、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu、Pb、Th、U、Tl；
其中，Na、Mg、P、K、Ca采用ICP-OES进行测定，其他元素采用ICP-MS进行测定。
2.根据权利要求1所述物种鉴别模型，其特征在于，步骤S5中PCA分析的方法是：将数据进行中心标准化，再采用F-检验筛选出各物种样品间的显著性差异变量，然后通过PCA提取出前8个主成分实现数据降维，从显著性差异变量中提取获得主成分，最后获得不同物种鳕鱼样品分布聚集区，用于PLS-DA模型分析建立；PLS-DA分析的方法是：根据主成分分析的数据建立鳕鱼物种鉴别PLS-DA模型，可用于预测分析未知样品是否为银鳕鱼。
3.根据权利要求1所述物种鉴别模型，其特征在于，步骤S3超级微波前处理的方法是：称取匀浆样品，加入浓HNO3浸泡过夜，然后进行超级微波消解处理，冷却后再加热进行赶酸处理，然后用去离子水转移。
4.根据权利要求1所述物种鉴别模型，其特征在于，步骤S4中ICP-MS分析用铑和铟作为内标溶液。
5.权利要求1～4任一项所述银鳕鱼与其他种类鳕鱼的物种鉴别模型在银鳕鱼物种鉴别中的应用。
6.一种基于多种矿物元素的银鳕鱼物种鉴别方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.收集未知物种的鳕鱼待测样品；
S2.对待测样品进行去皮、去骨匀浆前处理；
S3.对匀浆后的待测样品进行超级微波前处理；
S4.对超级微波前处理后的待测样品进行ICP-MS和ICP-OES的多元素分析，获得待测样品中的多元素含量；
S5.将步骤S4获得的待测样品的数据输入到权利要求1～4任一项所建立的银鳕鱼物种鉴别模型中进行分析判别，鉴别未知鳕鱼样品是否是银鳕鱼；
步骤S4中多元素共51种，分别是Be、B、Na、Mg、Al、Si、P、K、Ca、Sc、Ti、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Ga、Ge、As、Se、Sr、Y、Zr、Nb、Mo、Ag、Cd、Sn、Sb、Cs、Ba、La、Ce、Pr、Nd、Sm、Eu、Gd、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu、Pb、Th、U、Tl。
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