CN112552386A

CN112552386A - 菊花TCPCm2-1蛋白及其编码基因的应用

Info

Publication number: CN112552386A
Application number: CN202011583600.7A
Authority: CN
Inventors: 刘华; 黄丛林; 陈筱溪; 陈海霞; 郭双; 罗昌; 陈东亮
Original assignee: BEIJING AGRO-BIOTECHNOLOGY RESEARCH CENTER
Current assignee: BEIJING AGRO-BIOTECHNOLOGY RESEARCH CENTER
Priority date: 2020-12-28
Filing date: 2020-12-28
Publication date: 2021-03-26
Anticipated expiration: 2040-12-28
Also published as: CN112552386B

Abstract

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体公开了菊花TCPCm2‑1蛋白及其编码基因的应用。本发明在菊花中克隆了TCP转录因子家族的基因TCPCm2‑1，构建了过表达载体，利用纳米磁珠花粉介导法导入菊花，获得了4个整株雄蕊败育的菊花株系，证明该基因过表达可以抑制菊花管状花雄蕊的正常发育，进而提出了其在抑制植物雄蕊正常发育、创制植物雄蕊败育株系、在植物雄蕊败育种质材料改良中的应用。本发明还发现该基因可使植物花瓣退化或缺失，故还提出了与此相关的应用。本发明可以用于植物败育株系的创制，免除去雄、削花等繁重工作、降低人力、物力投入，提高工作效率，具有非常重要的应用前景。

Description

菊花TCPCm2-1蛋白及其编码基因的应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体地说，涉及一种菊花TCPCm2-1蛋白及其编码基因的应用。

背景技术

菊花(Chrysanthemummorifolium)属于菊科菊属，是世界四大切花之一，也是重要的盆花和露地绿化用花卉。菊花的头状花序是其主要观赏部位，由舌状花和管状花组成，菊花的舌状花是两侧对称的单性花，雌蕊正常发育，雄蕊败育，舌状花位于头状花序的外轮，花冠伸长成两侧对称、颜色鲜艳，主要发挥了吸引授粉者的功能，而菊花的管状花是雌雄蕊正常发育的两性花，位于舌状花的内侧，花冠小且常呈现半透明膜质，雌雄蕊伸出管状花花冠，利于授粉结实，因此管状花的主要功能是繁衍后代。

杂交育种是菊花的重要育种方法，由于菊花的自花授粉仍有一定的结实率，所以严格的杂交育种需要进行去雄、套袋等工作，如果利用舌状花的雌蕊进行授粉则要对舌状花瓣进行削剪(因为舌状花较长，要削剪掉一段才能使雌蕊的柱头露出来)，要耗费大量的人力物力。

因此，有必要创制雄蕊败育的菊花材料。

发明内容

TCP转录因子是植物特有的一类转录因子，本发明在菊花中克隆了TCP转录因子家族的基因TCPCm2-1，构建了过表达载体，利用纳米磁珠花粉介导法导入菊花，获得了4个整株雄蕊败育的菊花株系，证明该基因过表达可以抑制菊花管状花雄蕊的正常发育，进而提出了其相关应用。

本发明的具体方案如下：

本发明提供了菊花TCPCm2-1蛋白或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在以下方面的应用：

(1)抑制植物雄蕊正常发育；

(2)创制或选育植物雄蕊败育株系；

(3)植物雄蕊败育种质资源改良；

(4)使植物花瓣退化或缺失；

(5)创制或选育植物花瓣退化或缺失株系。

本发明中，所述菊花TCPCm2-1蛋白具有以下任意一种氨基酸序列：

1)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；或

2)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或插入获得的具有相同功能蛋白的氨基酸序列。

应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的氨基酸序列，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。

本发明中，所述菊花TCPCm2-1蛋白的编码基因具有以下任一种核苷酸序列：

(1)SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或

(2)SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入获得的具有相同功能蛋白的编码核苷酸序列；

(3)在严格条件下可以与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列。

本发明中，所述生物材料为表达盒、载体、宿主细胞或重组菌。

本发明中，所述植物为拟南芥或菊花。

本发明还提供了一种创制雄蕊败育的转基因植物株系的方法，其通过转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖的方法，使植物表达或过表达菊花TCPCm2-1基因；

优选地，所述转基因包括利用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、基因枪、电导、农杆菌介导、磁珠转化的方法将包含所述菊花TCPCm2-1基因的重组表达载体导入植物中，获得转基因植物株系。

本发明另提供一种转基因植物或其后代，其包括编码菊花TCPCm2-1蛋白的遗传物质，所述菊花TCPCm2-1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明可以创制植物(菊花、拟南芥等)雄蕊败育株系，败育株系的创制可以避免去雄、削花等繁重工作，应用于植物杂交育种中可以降低人力、物力投入，提高工作效率，具有非常重要的应用前景。此外，植物花粉是重要的致敏源之一，雄蕊败育后，解决了花粉污染的问题，更加促进了植物切花、盆花和地被植物在室内装饰和室外绿化中的广泛应用。

此外，本发明还可创制植物花瓣退化或缺失的株系，以为后续研究和应用提供基础。

附图说明

图1为部分T1代拟南芥株系发生死亡的照片；

图2为菊花TCPCm2-1在转基因拟南芥中的表达情况图；

图3为转TCPCm2-1基因拟南芥的表型观察照片；

图4为植物表达载体pMDC85的结构图；

图5为本发明转基因阳性株系根尖的GFP荧光图像；

图6为本发明转基因阳性株系的PCR凝胶电泳图；

图7为本发明纳米磁珠介导转化花粉授粉后的实生阳性种子苗生长过程照片；

图8为本发明雄蕊正常发育的株系(对照株系)及过表达TCPCm2-1的败育株系的照片；

图9为本发明雄蕊败育株系的花序、舌状花、管状花、花蕊(雌蕊和败育雄蕊)照片；

图10为本发明雄蕊败育株系的花药、花粉电镜扫描图；

图11为本发明正常发育株系(对照株系)的舌状花、管状花、花药照片及花粉电镜扫描图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

本发明质粒DNA的获得：

对金鱼草，拟南芥和菊科植物等物种中已经克隆出来的TCP家族的基因进行比对，根据其保守结构域设计简并引物(表1)。以菊花品种‘粉地毯’花蕾总RNA反转录的cDNA为模版，克隆菊花TCP基因的中间片段。利用RACE基因全长克隆技术，克隆菊花TCP基因的全长，命名为TCPCm2-1，具体核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。其编码的蛋白氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

表1 TCP类基因的简并引物

利用质粒为模版、采用PCR的方法克隆基因，首先连接植物表达载体pCAMBIA1304(购自北京拜尔迪生物技术有限公司)，表达载体PCR引物见表2，通过农杆菌花器官侵染法导入拟南芥进行功能研究。

表2构建表达载体PCR反应用到的引物

所用土壤农杆菌为EHA105菌株，转化所用拟南芥的生态型为Col-0。经过抗生素筛选，获得转TCPCm2-1基因的T1代拟南芥120株，在小苗上盆后1-2周内，发生了小苗死亡现象，可能与基因的致死效应有关，部分T1代拟南芥株系发生死亡的照片见图1，其中，A为部分盆栽的转基因拟南芥小苗，B、C、D、E、F分别为死亡的转基因拟南芥小苗单株。

最终统计存活下来并经过PCR验证的拟南芥株系结果显示，转TCPCm2-1基因的T1代拟南芥有42株，将T1代种子播种到添加50mg/L潮霉素的MS平板上，分别随机挑选后代分离比为3:1(潮霉素抗性：非抗性)的6个转基因株系进行T2代和T3代筛选，以获得纯合的转基因种子；将T3代转基因拟南芥的种子与野生型同时播种，在相同的环境条件下栽培，对转基因拟南芥进行基因表达分析和表型分析。

具体，通过real-time RT-PCR对TCPCm2-1在转基因拟南芥中是否表达及其表达量的高低进行了分析(RT-PCR引物见表3)；每个样本设置3个生物学重复和3个技术重复；具体结果见图2，其中A为TCPCm2-1基因表达的PCR检测结果，B为实时荧光定量PCR检测TCPCm2-1基因的表达量结果。由图2可以看出，TCPCm2-1在6个转基因拟南芥株系(编号分别为5、8、11、18、29、35)均有表达(参见图2中的A)。荧光定量的结果显示，TCPCm2-1在不同转基因株系表达量不同(参见图2中的B)，其中#35转基因株系的TCPCm2-1基因表达量最高，#8次之；而#5的表达量最低。

表3转基因拟南芥荧光定量PCR反应用到的引物

本实施例选择#35和#8转基因株系继续进行表型观察。观察结果如图3所示，A：野生型拟南芥的花；B、D：转TCPCm2-1基因拟南芥的花，花瓣和雄蕊的发育被抑制；C：转TCPCm2-1基因拟南芥的花序；E：转TCPCm2-1基因拟南芥的雄蕊败育；F：转TCPCm2-1基因拟南芥株系。

由图3可知，野生型拟南芥的每朵花均有四枚萼片、四枚花瓣、六枚雄蕊(四长二短)和一个雌蕊。而转TCPCm2-1基因拟南芥的花瓣和雄蕊发生了明显变异。转TCPCm2-1基因拟南芥的花瓣发育受到了不同程度的抑制。如图3所示，与野生型相比，转TCPCm2-1基因株系的花瓣严重退化或者缺失。转TCPCm2-1基因株系的雄蕊发育也受到了抑制，野生型拟南芥为六枚雄蕊，转TCPCm2-1基因株系的雄蕊只有两枚，没有产生花粉，因此转化TCPCm2-1过表达后，获得了雄蕊败育的拟南芥株系。而转TCPCm2-1基因拟南芥的花萼和雌蕊的发育都是正常的。转化拟南芥进行功能分析表明，TCPCm2-1过表达抑制了拟南芥雄蕊的发育。

实施例2

本实施例将TCPCm2-1基因(如SEQ ID NO.2所示)与带有GFP筛选标记的pMDC85表达载体相连接，构建过表达载体(植物表达载体pMDC85的结构参见图4)；根据pMDC85的多克隆位点，选择TCPCm2-1的基因序列中不含有的两个限制性酶切位点Pac1、Asc1，将酶切位点序列引入目的片段PCR扩增的引物中，将TCPCm2-1基因连接到植物表达载体pMDC85获得质粒DNA待用。TCPCm2-1基因加酶切位点后的引物见表4。

表4

本实施例继续将所构建的质粒DNA转入菊花中进行表型观察。具体步骤如下：

(1)磁珠与质粒DNA的复合：

将纳米磁珠(德国Chemicell，平均粒径100纳米，1μg/μL)和上述构建的质粒DNA按质量比1:4混匀，室温结合30min。

将结合好的磁珠-DNA混合物重悬于2mL花粉培养液中。花粉培养液含：150g/L蔗糖、150mg/L MgSO₄·7H₂O、110mg/L H₃BO₃、210mg/L KNO₃、40mg/L KCl、125mg/L Ca(NO₃)₂·4H₂O、365mg/L MnSO₄·H₂O、7.25mg/L Na2EDTA、0.23mg/LNa₂MoO₄·2H₂O、25mg/L GA3。

(3)转染

在晴朗的上午9—12点之间收集‘粉地毯’(Chrysanthemum morifolium‘Fenditan’)刚散开的新鲜花粉，称取过筛花粉约0.25g，小心转移至培养皿中，然后再加入2mL上述含有磁珠-DNA混合物的花粉培养液充分浸没，盖好培养皿盖子，将其置于磁板上室温静置半小时。

(4)授粉

用塑料刮板将磁转化后的花粉转移至500目尼龙布均匀平铺，用滤纸吸干水分。取干燥后的花粉，选择菊花品种‘金盏’(Chrysanthemummorifolium‘Jinzhan’)的花序上正在盛开的、最适合的雌蕊柱头(雌蕊柱头顶端开叉成“V”形，在中午前后的太阳光下可见亮晶晶的粘液状物质)进行授粉。

(5)阳性苗筛选

收获种子后随机选取150粒种子播种，2周后种子发芽，经过苗期生长，最终成活株系有85株。

对成活株系进行GFP荧光验证，具体为：取小苗的根尖部分，切成约0.5-1厘米根段，置于载玻片上，压片，置于荧光显微镜下观察，拍照。以野生型‘金盏’菊花的根系为对照。最终在实生苗的根系中检测到GFP表达的有24株，阳性株系的验证结果参见图5。图中CK为阴性对照株系；各数字编号为经验证为阳性的株系的编号。

进一步对在实生苗的根系中检测到GFP表达的24株植株的TCPCm2-1基因表达进行PCR检测。具体地，同时在TCPCm2-1和GFP的基因序列上分别设计上游和下游引物(表5)，利用PCR进行了验证，结果参见图6，其中，M：Marker；CK：阴性对照株系；各数字编号为经验证为阳性的株系的编号；从验证结果可知，成活苗的阳性株系比率达到28％。该实验表明本发明纳米磁珠花粉介导法大大提高了菊花转基因成功率，是一种操作简便、十分有效的转基因技术。

表5验证阳性转化株系的PCR引物

(6)转基因株系的表型变异观察

将24株阳性苗(参见图7，其中从左至右依次显示阳性苗的生长过程)在长日照下培养150天后进行短日照处理90天，植株开花后，进行表型观察，发现有4株转基因菊花(TCPCm2-1-OE 14#，21#，50#，66#)的雄蕊全部败育，雄蕊正常发育的株系及过表达TCPCm2-1的败育株系的照片见图8。

对照株系的舌状花雄蕊败育，管状花雄蕊正常发育，伴随着管状花的开放，其雄蕊的花丝伸长，花药伸出花冠、到达柱头顶端时花粉囊裂开、散粉；败育株系不仅舌状花的雄蕊是败育的，管状花的雄蕊也是败育的，其花药的花丝不能伸长，始终处于花冠内部，花粉囊最终也不能开裂、散粉。通过电镜扫描实验发现对照株系正常发育的花粉是饱满的，败育株系的花粉囊中的花粉粘成一团、其花粉是干瘪的。雄蕊败育株系的花序及舌状花和管状花、雌蕊和败育雄蕊观察照片见图9，雄蕊败育株系的花药、花粉电镜扫描图见图10，雄蕊发育正常的对照株系的舌状花、管状花、花药照片及花粉电镜扫描图见图11。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 北京农业生物技术研究中心

<120> 菊花TCPCm2-1蛋白及其编码基因的应用

<130> KHP201118956.3

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 272

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Phe Ser Ser Asn Pro Phe Pro Glu Phe Leu Pro Ser Pro Asn Val

1 5 10 15

Pro Leu Pro Ser Asn Leu Tyr Phe Asp Leu Glu Lys Asp Tyr Ile Asn

20 25 30

Thr Gly Pro Phe Ile Ser Thr Asp Gly Tyr Val His Gly Tyr Asn Ala

35 40 45

Leu Thr Arg Leu Pro Phe Met Glu Asp Leu Asn Thr Ile Ser Gln Asp

50 55 60

Phe Leu Ser Gln Gln His Gln Phe Ser Asp Val Gln Arg Phe Gln Ser

65 70 75 80

Pro Glu Asp Val Asp Asp Leu Leu Gly Leu Val Ile Ser Ser Ser Lys

85 90 95

Ser Lys Lys Lys Thr Asp Thr Ser Lys Lys Asp Gly His Ser Lys Ile

100 105 110

Asn Thr Ala Gln Gly Pro Arg Asp Arg Arg Val Arg Leu Ser Ile Glu

115 120 125

Ile Ser Arg Lys Phe Phe Cys Leu Gln Asp Leu Leu Gly Phe Asp Lys

130 135 140

Ala Ser Lys Thr Leu Asp Trp Leu Phe Ser Lys Ser Lys Asn Ala Ile

145 150 155 160

Lys Glu Leu Val Glu Asp Ile Asn His Ser Ser Ser Ser Thr Val Thr

165 170 175

Asp Gln Ser Lys Leu Asn Phe Leu Glu Ala Ile Lys Gly Gly Ser Asp

180 185 190

Glu Asp Lys Glu Lys Lys Lys Ser Ala Ile Lys Tyr Gly Asp Val Lys

195 200 205

Arg Lys Lys Met Thr Pro Lys Ser Lys Ala Val Val Gln Glu Asn Leu

210 215 220

Ala Arg Asp Gln Ser Arg Ala Met Ala Arg Ala Arg Ala Arg Glu Arg

225 230 235 240

Thr Arg Glu Lys Met Asn Thr Lys Thr Ala Asp Asp Asp Leu Lys Thr

245 250 255

Leu Leu His Asp Asp Phe Asp Tyr His Val Cys Tyr Ser Ala Tyr Ile

260 265 270

<210> 2

<211> 819

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgttttctt caaacccctt tccagagttt ctcccatccc ctaatgtccc ccttccttcc 60

aatttatact ttgatcttga aaaagactat attaacactg gcccgtttat ctccaccgac 120

ggctatgttc atggctacaa cgctcttact cgtctaccat tcatggagga tcttaataca 180

attagtcaag attttcttag tcaacagcat cagttttctg atgttcaaag gtttcagtct 240

cctgaagatg ttgatgatct tctagggtta gtaatttcta gctcgaagtc aaagaagaaa 300

actgacacat ccaagaaaga tggacacagt aagattaaca cagctcaagg ccctcgggat 360

cgaagggtga gattgtccat tgagatctca agaaagttct tttgtcttca agacttgcta 420

ggttttgaca aagcaagcaa aacccttgat tggttattta gtaaatcgaa gaacgcgatt 480

aaggagctgg ttgaagacat aaaccacagc tcatcttcca ctgtgactga tcaatctaag 540

cttaattttc ttgaagccat taaaggagga tcagatgaag ataaagagaa aaagaagtca 600

gcaatcaagt atggtgatgt caaaaggaag aaaatgacac caaaatcaaa agctgtcgtt 660

caagagaatc tagcaagaga ccagtctagg gccatggcaa gagcgagagc acgagaaagg 720

actagagaaa agatgaatac caaaacagct gatgatgatt tgaagacatt acttcatgat 780

gattttgatt accatgtatg ctattccgcc tatatctag 819

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgttttcyt caaacccytt tc 22

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gttttgcttg ctttgtcraa mccta 25

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

actagtatgt tttcttcaaa cccctttcca g 31

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggtgacccaa ctagatatag gcggaatagc 30

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ccatggcaag agcgagagca c 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gatataggcg gaatagcata c 21

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ggtgtcatgg ttggtatggg tc 22

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cctctgtgag tagaactggg tgc 23

<210> 11

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ccttaattaa atgttttctt caaacccc 28

<210> 12

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ttggcgcgcc agatataggc ggaatagcat aca 33

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ccatgtatgc tattccgcct a 21

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gttcatccat gccatgtgta atc 23

Claims

1.菊花TCPCm2-1蛋白或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在抑制植物雄蕊正常发育中的应用。

2.菊花TCPCm2-1蛋白或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在创制或选育植物雄蕊败育株系，或在植物雄蕊败育种质资源改良中的应用。

3.菊花TCPCm2-1蛋白或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在使植物花瓣退化或缺失中的应用。

4.菊花TCPCm2-1蛋白或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在创制或选育植物花瓣退化或缺失株系中的应用。

5.根据权利要求1-4任一所述的应用，其特征在于，所述菊花TCPCm2-1蛋白具有以下任意一种氨基酸序列：

1)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；或

6.根据权利要求1-4任一所述的应用，其特征在于，所述菊花TCPCm2-1蛋白的编码基因具有以下任一种核苷酸序列：

(1)SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或

7.根据权利要求1-4任一所述的应用，其特征在于，所述生物材料为表达盒、载体、宿主细胞或重组菌。

8.如权利要求1-4任一所述的应用，其特征在于，所述植物为拟南芥或菊花。

9.创制雄蕊败育的转基因植物株系的方法，其特征在于，通过转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖的方法，使植物表达或过表达菊花TCPCm2-1基因；优选地，所述转基因包括利用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、基因枪、电导、农杆菌介导、磁珠转化的方法将包含所述菊花TCPCm2-1基因的重组表达载体导入植物中，获得转基因植物株系。

10.一种转基因植物或其后代，其特征在于，包括编码菊花TCPCm2-1蛋白的遗传物质，所述菊花TCPCm2-1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。