CN112552359A - 一种磺达肝葵钠五糖中间体自动化制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种磺达肝葵钠五糖中间体自动化制备方法，基于自动化制备装置，该方法通过自动进样，自动取样监测实现(D+EF+GH)三组分的自动化制备，得到全保护的磺达肝葵钠五糖中间体(式I)，实现了磺达肝葵钠五糖中间体的自动化合成，可节省人力，提高效率和生产力，具有较高的安全性和重现性；可直接在线监测，便于优化和监测反应实时状态，同时自动控温能更好满足反应对升降温的需求；采用了“预活化”一釜模式，减少分离次数，操作方便；选取了常用的酯类保护基，具有较高的立体选择性和收率，可使用通用的脱保护方法，对于降低磺达肝葵钠的生产成本和大规模生产具有重要意义。式I中的各取代基定义与说明书中的定义相同。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，特别是涉及一种磺达肝葵钠五糖中间体自动化制备方法。
背景技术
肝素和硫酸化肝素是糖胺聚糖中非常重要的一类线性硫酸化多糖，存在于大多数动物细胞的表面，并在各种生理过程中发挥关键作用，例如抗凝血，抗病毒感染，炎症反应，细胞粘附，细胞生长调节，脂质代谢和肿瘤转移等。磺达肝葵钠(Arixtra,Fondaparinuxsodium)是能与抗凝血酶III特异性结合的最小五糖结构域，结构式如图5所示，五个糖环根据习惯命名依次为D、E、F、G、H环。
磺达肝葵钠是首个也是目前唯一一个人工合成的已上市肝素类寡糖抗凝药物，于2002年上市，商品名叫“安卓”，广泛应用于下肢骨科手术中，预防静脉血血栓事件的发生，2017年全球市场销售额约为1.9亿美元；与其他低分子肝素相比，它具有显著的抗凝血活性、更少的副作用和更长的半衰期，然而超过50步总收率低于0.1％的人工合成使其成为最贵的肝素类药物，极大的限制其广泛应用。自2008年专利到期以来，磺达肝素五糖目前已有众多(3+2)[ChemMedChem 2014,9,1071-1080；J.Org.Chem.2016,81,162-184.]、(4+1)[Angew.Chem.Int.Ed.2014,53,9876–9879.]的汇聚式合成、一釜三组分合成(Org.Chem.Front.2019,6,3116-3120；Org.Lett.2020,22,4638-4642.)和酶法、化学酶法的延伸合成及硫酸化修饰(Science 2011,334,498-501.)，但都需要高度专业化、受到特殊糖化学训练的专业人员在特殊的糖化学实验室完成，耗时费力，这在很大程度上提高了磺达肝素获得的成本，因此目前仍迫切需要更好的策略和技术提高磺达肝葵钠五糖的获得效率。如果能成功使用自动化合成方式高效、快速的得到全保护的磺达肝素五糖中间体，将显著降低磺达肝葵钠的获得成本，对其大规模生产和应用具有重要意义。
发明内容
基于此，本发明的目的是提供一种磺达肝葵钠五糖中间体自动化制备方法，节省人力，降低了人为因素的影响，提高磺达肝葵钠五糖中间体的获得效率。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
一种磺达肝葵钠五糖中间体自动化制备方法，所述方法应用于一种磺达肝葵钠五糖中间体自动化制备装置，所述自动化制备装置包括：反应器、上位机、惰性气体装置、第一活化剂容器、第二活化剂容器、第一样品容器、第二样品容器、第三样品容器、自动进样系统、低温循环装置和磁力搅拌装置；
所述惰性气体装置分别与所述自动进样系统、所述第一活化剂容器、所述第二活化剂容器、所述第一样品容器、所述第二样品容器和第三样品容器连接；所述自动进样系统与所述反应器连接；所述自动进样系统、低温循环装置和磁力搅拌装置均与上位机连接；
所述磺达肝葵钠五糖中间体具有式I所示结构，命名为DEFGH-1；
式I中，R1为酰基或者硅保护基；R2和R6独立地为羧基保护基；R3和R4独立地为酰基；R5和R7独立地为酰基；X、Y、Z独立地为N3或者各种带保护基的氨基；
所述磺达肝葵钠五糖中间体的制备原料包括化合物D-1、化合物EF-1和GH-1；
所述方法包括：
所述第一样品容器中放入化合物D-1；所述化合物D-1具有式II所示结构：
式II中，R1为酰基或者硅保护基；SR8为硫苷类离去基；X为N3或者各种带保护基的氨基；
所述第二样品容器中放入化合物EF-1；所述化合物EF-1具有式III所示结构：
式III中，R2为羧基保护基，R3和R4独立地为酰基；SR8为硫苷类离去基；Y为N3或者各种带保护基的氨基；
所述第三样品容器中放入化合物GH-1，所述化合物GH-1具有式IV所示结构：
式IV中，R5和R7独立地为酰基，R6为羧基保护基，Z为N3或者各种带保护基的氨基；
气体保护：通过自动进样系统向所述第一样品容器、第二样品容器、第三样品容器、第一活化剂容器、第二活化剂容器和反应器中充满惰性气体；
通过低温循环装置给反应器降温；
通过自动进样系统将所述化合物D-1传送到反应器；
通过磁力搅拌装置对所述反应器中所述化合物D-1进行搅拌，进行预干燥；
通过自动进样系统将第一活化剂容器中的第一活化剂和第二活化剂容器中的第二活化剂依次传送到所述反应器，对所述化合物D-1进行第一设定时间的预活化；
通过自动进样系统将化合物EF-1传送到所述反应器；
通过低温循环装置给反应器程序升温，进行反应第二设定时间；
通过低温循环装置给反应器降温；
通过自动进样系统将第一活化剂容器中的第一活化剂和第二活化剂容器中的第二活化剂依次传送到所述反应器，对所述化合物D-1和所述化合物EF-1反应生成的中间体进行第三设定时间的预活化；
通过自动进样系统将化合物GH-1传送到所述反应器；
通过低温循环装置给反应器程序升温，进行反应第四设定时间；
通过自动进样系统将淬灭反应溶剂传送到所述反应器，终止反应，获得化合物DEFGH-1。
可选地，所述第一活化剂为苯硫氯，所述第二活化剂为三氟甲磺酸银。
可选地，通过低温循环装置给反应器降温时设置降温温度为-75℃。
可选地，所述磁力搅拌装置转速设置为400-1000rpm。
可选地，所述通过磁力搅拌装置对所述反应器中所述化合物D-1进行搅拌的时间为1-300min。
可选地，所述自动化制备装置还包括检测装置，所述检测装置与所述反应器管道连接，所述检测装置与所述上位机电连接。
可选地，所述对所述化合物D-1进行第一设定时间的预活化之后，所述方法还包括：
通过检测装置检测所述化合物D-1是否有剩余，若有剩余则报警。
可选地，所述对所述化合物D-1和所述化合物EF-1反应生成的中间体进行第三设定时间的预活化之后，所述方法还包括：
通过检测装置检测所述化合物D-1和所述化合物EF-1反应生成的中间体是否有剩余，若有剩余则报警。
可选地，所述通过低温循环装置给反应器程序升温，进行反应第四设定时间之后，所述方法还包括：
通过检测装置检测所述化合物GH-1是否有剩余，若有剩余则报警。
可选地，所述淬灭反应溶剂为三乙胺。
根据本发明提供的具体实施例，本发明公开了以下技术效果：
本发明公开了一种磺达肝葵钠五糖中间体自动化制备方法，通过上位机控制自动进样系统进行自动进样，通过上位机控制检测装置对反应器中反应物进行自动在线检测，实现磺达肝葵钠五糖中间体自动化制备，节省人力，降低了人为因素的影响，提高了磺达肝葵钠五糖中间体的获得效率，降低磺达肝葵钠五糖中间体的成本。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明一种磺达肝葵钠五糖中间体自动化制备装置结构示意图；
图2为本发明检测装置示意图；
图3为本发明一种磺达肝葵钠五糖中间体自动化制备方法流程示意图；
图4为本发明检测装置对比判断的流程示意图；
图5为本发明五糖结构式示意图；
图6为本发明化合物D-1、化合物EF-1与化合物GH-1反应生成DEFGH-1的原理图；
图7为本发明上位机在线监测界面；
图8为本发明化合物D-1制备原理示意图；
图9为本发明化合物EF-1制备原理示意图；
图10为本发明实施例中化合物D-3、化合物EF-4与化合物GH-2反应生成DEFGH-2的原理图；
图中标号说明：
1、反应器，2、惰性气体装置，3、第一样品容器，4、第二样品容器，5、第三样品容器，6-1、第一活化剂容器，6-2、第二活化剂容器，7、第一切换阀，8、第二切换阀，9、第一注射泵，10、第二注射泵，11、磁力搅拌装置，12、低温循环装置，13、废气处理装置，14、废液处理装置，15、第一电磁阀，16、第二电磁阀，17、第三电磁阀，18、第四电磁阀，19、第五电磁阀，20、压力传感器，21、流量计，30、取样装置，31、动力模块，32、监测分析模块，33、上位机。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明的目的是提供一种磺达肝葵钠五糖中间体自动化制备方法，节省人力，降低了人为因素的影响，提高了磺达肝葵钠五糖中间体的获得效率，降低成本。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1为本发明一种磺达肝葵钠五糖中间体自动化制备装置结构示意图；图2为本发明检测装置示意图，如图1-2所示，本发明公开了一种磺达肝葵钠五糖中间体自动化制备装置，所述自动化制备装置包括：反应器1、上位机33、惰性气体装置2、第一活化剂容器6-1、第一活化剂容器6-2、第一样品容器3、第二样品容器4、第三样品容器5、切换阀、注射泵、低温循环装置12、磁力搅拌装置11和检测装置。自动进样系统包括切换阀和注射泵。
所述惰性气体装置2分别与所述切换阀、所述第一活化剂容器6-1、所述第二活化剂容器6-2、所述第一样品容器3、所述第二样品容器4和第三样品容器5连接；所述第一样品容器3、所述第二样品容器4、第三样品容器5、所述第一活化剂容器6-1和所述第二活化剂容器6-2均与所述切换阀连接，所述切换阀分别通过注射泵与所述反应器1连接；所述检测装置与所述反应器1连接；所述切换阀、注射泵、低温循环装置12、磁力搅拌装置11和检测装置均与上位机33连接；所述低温循环装置12为所述反应器1提供低温环境，所述磁力搅拌装置11用于搅拌所述反应器1中反应物。
所述切换阀包括第一切换阀7和第二切换阀8；所述注射泵包括第一注射泵9和第二注射泵10，所述第二注射泵10的量程比所述第一注射泵9的量程大，所述第一切换阀7与所述第一注射泵9连接，所述第二切换阀8与所述第二注射泵10连接。
所述自动化制备装置还包括流量计21，所述流量计21设置在所述注射泵与所述反应器1之间的管路上。所述自动化制备装置还包括压力传感器20，所述压力传感器20设置在所述注射泵与所述反应器1之间的管路上。
所述自动化制备装置还包括，废气处理装置13和废液处理装置14，所述废气处理装置13和所述废液处理装置14均与所述反应器1连接。
惰性气体装置2通过调压过滤器与第四电磁阀18的第一端口连接，惰性气体装置2通过调压过滤器与第五电磁阀19的第一端口连接，第四电磁阀18的第二端口与第一电磁阀15的第一端口，第一电磁阀15的第二端口与第二切换阀8的第10通道连接，第一电磁阀15的第三端口与第一切换阀7的第10通道连接，第五电磁阀19的第二端口分别与第一样品容器3、第二样品容器4、第三样品容器5、第一活化剂容器6-1和第二活化剂容器6-2连接，第一样品容器3与第一切换阀7的第1通道连接，第二样品容器4与第一切换阀7的第2通道连接，第三样品容器5与第一切换阀7的第3通道连接，第一活化剂容器6-1分别与第一切换阀7的第9通道和第二切换阀8的第9通道连接，第二活化剂容器6-2分别与第一切换阀7的第8通道和第二切换阀8的第8通道连接。
如图3所示，本发明公开了一种磺达肝葵钠五糖中间体自动化制备方法，所述磺达肝葵钠五糖中间体具有式I所示结构，命名为DEFGH-1；
式I中，R1为酰基或者硅保护基，优选乙酰基(Ac)或叔丁基二苯基硅基(TBDPS)；R2和R6独立地为羧基保护基，优选为甲基(Me)；R3和R4独立地为酰基，优选为乙酰基(Ac)；R5和R7独立地为酰基，优选为乙酰基(Ac)或者苯甲酰基(Bz)；X、Y、Z独立地为N3或者各种带保护基的氨基；SR8为硫苷类离去基，优选但不限于苯硫基、对甲基苯硫基、邻甲基苯硫基或2-甲基-5-叔丁基苯硫基；
所述磺达肝葵钠五糖中间体的制备原料包括化合物D-1、化合物EF-1和GH-1；
所述方法包括：
步骤101：所述第一样品容器3中放入化合物D-1，所述化合物D-1具有式II所示结构：
式II中，R1为酰基或者硅保护基，优选为乙酰基(Ac)或叔丁基二苯基硅基(TBDPS)；SR8为硫苷类离去基，优选但不局限于苯硫基、对甲基苯硫基、邻甲基苯硫基或2-甲基-5-叔丁基苯硫基；X为N3或者各种带保护基的氨基；在本发明中，所述化合物D-1具体优选具有式II-1所示结构，命名为化合物D-3：
所述第二样品容器4中放入化合物EF-1；所述化合物EF-1具有式III所示结构：
式III中，R2为羧基保护基，优选为甲基(Me)；R3和R4独立地为酰基，优选为乙酰基(Ac)；SR8为硫苷类离去基，优选但不局限于苯硫基、对甲基苯硫基、邻甲基苯硫基或2-甲基-5-叔丁基苯硫基；Y为N3或者各种带保护基的氨基；在本发明中，所述化合物EF-1具体优选具有式III-1所示结构，命名为化合物EF-4：
所述第三样品容器5中放入化合物GH-1，所述化合物GH-1具有式IV所示结构：
式IV中，R5和R7独立地为酰基，优选为乙酰基(Ac)或者苯甲酰基(Bz)；R6为羧基保护基，优选为甲基(Me)；Z为N3或者各种带保护基的氨基；在本发明中，所述化合物GH-1具体优选具有式IV-1所示结构，命名为化合物GH-2：
化合物D-1，化合物EF-1和化合物GH-1一釜三组分反应生成磺达肝葵钠五糖中间体DEFGH-1的原理示意图如图6所示。
当化合物D-1优选具有式II-1所示结构，化合物EF-1优选具有式III-1所示结构，化合物GH-1优选具有式IV-1所示结构，所得磺达肝葵钠五糖中间体具有式I-1所示结构，命名为化合物DEFGH-2：
步骤102：气体保护：通过自动进样系统向所述第一样品容器、第二样品容器、第三样品容器、第一活化剂容器、第二活化剂容器和反应器中充满惰性气体。
步骤103：通过低温循环装置给反应器降温。
步骤104：通过自动进样系统将所述化合物D-1传送到反应器。
步骤105：通过磁力搅拌装置对所述反应器中所述化合物D-1进行搅拌，进行预干燥。
步骤106：通过自动进样系统将第一活化剂容器中的第一活化剂和第二活化剂容器中的第二活化剂依次传送到所述反应器，对所述化合物D-1进行第一设定时间的预活化。
步骤107：通过自动进样系统将化合物EF-1传送到所述反应器。
步骤108：通过低温循环装置给反应器程序升温，进行反应第二设定时间。反应的第二设定时间即为程序升温时间。
步骤109：通过低温循环装置给反应器降温。
步骤110：通过自动进样系统将第一活化剂容器中的第一活化剂和第二活化剂容器中的第二活化剂依次传送到所述反应器，对所述化合物D-1和所述化合物EF-1反应生成的中间体进行第三设定时间的预活化。
步骤111：通过自动进样系统将化合物GH-1传送到所述反应器。
步骤112：通过低温循环装置给反应器程序升温，进行反应第四设定时间。反应的第四设定时间即为程序升温时间。
步骤113：通过自动进样系统将淬灭反应溶剂传送到所述反应器，终止反应，获得化合物DEFGH-1。
所述第一活化剂优选为苯硫氯，所述第二活化剂优选为三氟甲磺酸银。
通过低温循环装置给反应器降温时设置降温温度为-75℃。
所述磁力搅拌装置转速设置为400-1000rpm。所述通过磁力搅拌装置对所述反应器中所述化合物D-1进行搅拌的时间为1-300min。
所述自动化制备装置还包括检测装置，所述检测装置与所述反应器管道连接，所述检测装置与所述上位机电连接。
所述对所述化合物D-1进行第一设定时间的预活化之后，所述方法还包括：通过检测装置检测所述化合物D-1是否有剩余，若有剩余则报警。若无剩余则执行步骤107。
所述对所述化合物D-1和所述化合物EF-1反应生成的中间体进行第三设定时间的预活化之后，所述方法还包括：
通过检测装置检测所述化合物D-1和所述化合物EF-1反应生成的中间体是否有剩余，若有剩余则报警。若无剩余则执行步骤111。
所述通过低温循环装置给反应器程序升温，进行反应第四设定时间之后，所述方法还包括：通过检测装置检测所述化合物GH-1是否有剩余，若有剩余则报警。若无剩余则执行步骤113。
所述淬灭反应溶剂为三乙胺。
步骤113之后，还包括清洗管路、停止制冷、停止搅拌并关闭惰性气体。
所述检测装置采用高效液相色谱法对反应器1中所述化合物D-1、所述化合物EF-1或所述化合物GH-1进行检测。
参考文献报道(Org.Chem.Front.2019,6,3116-3120.)，D-1的制备方法为：由商业化的氨基葡萄糖D-2的异头位乙酰化后上硫苷得到稳定的单糖砌块D-1，D-1的制备方法如图8所示。
参考文献报道(Org.Chem.Front.2019,6,3116-3120.)，EF-1的制备方法为：由商业化的二糖中间体EF-3在叔丁基二甲硅基三氟甲磺酸酯(TBSOTf)条件下打开内酯得到EF-4，随后将EF-4上硫苷并在硫脲作用下脱除临时保护基氯乙酰基得到二糖中间体EF-1，EF-1的制备方法如图9所示。
参考文献报道(Org.Chem.Front.2019,6,3116-3120.)，全保护的五糖中间体DEFGH-1通用的脱保护和磺酸化的制备方法为：DEFGH-1在强碱条件下先脱除酰基和羧基保护基或者先酸性条件脱除大位阻硅保护基再在强碱条件下先脱除酰基和羧基保护基，随后在加热条件下O-磺酸化，并通过催化氢化的方式脱除苄基和氨基保护基，同时将叠氮还原成氨基，最后再将氨基磺酸化即可得到磺达肝葵钠(DEFGH)。
本实施例中监测分析模块32采用高效液相色谱法检测对反应器1中所述化合物D-1、所述化合物EF-1或所述化合物GH-1进行检测。
本发明还公开了一种计算机可读存储介质，存储有计算机可执行指令，计算机可执行指令设置为执行所述的一种磺达肝葵钠五糖中间体自动化制备方法。
本发明公开了一种磺达肝葵钠五糖中间体自动化制备方法，与现有技术相比具有以下优点和有益效果：1、本发明实现了磺达肝葵钠五糖中间体的自动化制备，可节省人力，提高效率和生产力，具有较高的安全性和重现性。2、可直接在线监测，便于优化和监测反应实时状态，同时自动控温能更好满足反应对升降温的需求。3、采用了“预活化”一釜模式，减少分离次数，操作方便。4、选取了常用的酯类保护基，具有较高的立体选择性和收率，可使用通用的脱保护方法，对于降低磺达肝葵钠的生产成本和大规模生产具有重要意义。
实施例：
自动化前：优选苯硫氯(p-TolSCl)和三氟甲磺酸银(AgOTf)作为“预活化”体系，并分别准备p-TolSCl(稀释于二氯甲烷，连接通道号6)和AgOTf[溶解于甲苯和二氯甲烷的混合溶液(V/V＝3:1)，连接通道号5]的储备液且与相应的进样管道连接，但也不限于其他的“预活化”体系；优选新鲜活化的4A分子筛提前加入到合成仪的反应器中并密闭反应器；准备化合物D-3(连接通道号1)，化合物EF-4(连接通道号2)和GH-2(连接通道号3)的储备液(溶解于一定量的二氯甲烷)并分别与相应的进样管道连接；准备干燥的二氯甲烷(连接通道号9)作为进样或者清洗管路的溶剂与相应的管道连接；准备淬灭反应溶剂三乙胺(稀释于二氯甲烷并连接通道号8)与相应的管道连接；打开合成仪的各个开关并打开软件控制程序，自动连接后编写磺达肝葵钠五糖中间体自动化合成项目程序(如下表1)，具体的指令和参数可以按照反应要求修改、删除、增加、调序和插入等，大部分指令已经模块化可以根据需求插入，简单便捷。
自动化中：编写完程序后装载项目，点击“开始”按钮，自动化制备装置依次自动化执行编写的项目程序表，操作人员可根据实际情况暂停和停止自动化反应过程。
表1磺达肝葵钠五糖中间体自动化合成项目程序表
注：此表以0.08mmol EF-4(1.0eq)的量举例说明磺达肝葵钠五糖中间体一般自动化过程，具体各个指令的参数随着投料量和指令的重复使用与否而变动，指令第一次出现时具体参数列出，后续重复出现没有列出，所有的指令都可以按逻辑关系单独、重复和独立的运行，保证自动化正常执行。
下面详细解释说明上述表1中各指令。
1、气体保护：a控制第四电磁阀18和第五电磁阀19打开，控制第一电磁阀15和第一切换阀7相通，控制第一切换阀7的10通道和第一注射泵9相通(第一切换阀7—第一注射泵9)，控制第二电磁阀16和第三电磁阀17通往废液瓶，控制流量计21打开，第一注射泵9V型通气P1s(气源有设定好的一定的压力，所以气体能顺利通过)，排空第一切换阀7到废液之间管路的空气及别的气体；b控制第一电磁阀15和第二切换阀8相通，控制第二切换阀8的10通道和第二注射泵10相通(第二切换阀8—第二注射泵10)，第二注射泵10V型通气P2s，排空第二切换阀8到废液之间管路的空气及别的气体；c控制第三电磁阀17通往反应瓶，第二注射泵10V型通气一直运行，排空第二切换阀8到反应器1之间管路的空气及别的气体(确保所有管路内都填充氩气，整个过程流量计21是开放的)，直到有指令指导关闭气路，否则一直有气体通过第四电磁阀18-第一电磁阀15—第二切换阀8—第二注射泵10—第二电磁阀16-第三电磁阀17—反应器1—气体排出至大气中(常压)。注射泵V型运行即控制注射泵进样管路和出样管路直接相通，气体不经过注射器的吸、吐过程。
控制参数：P1为第一注射泵9V型运行时间(s)，P2为第二注射泵10V型运行时间(s)。
2、开始降温：控制超低温循环装置12按照设定温度开始制冷降温和循环，直到实际温度达到设定温度(P1')±区间温度(P2')的范围内，一直保持设定温度直到收到新的指令。控制参数：P1'为设定温度(℃)，P2'为区间温度(℃)。
3、关闭气体：控制第四电磁阀18和第五电磁阀19关闭。无控制参数。
4、传送砌块：运行此指令前需要运行气体保护指令。首先PLC会根据进样体积(P3)和补偿体积(P4)的和来判断第一电磁阀15与那个注射泵相通：当体积和大于小量程的注射泵量程时，第一电磁阀15与大量程的第二注射泵10相通，当体积和小于小量程的注射泵量程时，第一电磁阀15与小量程的第一注射泵9相通。当第二注射泵10与对应的第二切换阀8相通时，根据第二切换阀8的通道号(A1)来抽取不同的样品，控制第二电磁阀16、第三电磁阀17和废液相通，控制第二切换阀8由10通道变到(A1)通道，打开流量计21，第二注射泵10首先以流速A2uL/s泵液充满体积P5uL，然后排出到废液管路，使第二注射泵10到第三电磁阀17的管路之间充满进样样品，然后第二注射泵10再以流速A2uL/s从(A1)通道泵液进样体积(P3)和补偿体积(P4)之和，当抽取样品刚好完成时，控制第五电磁阀19关闭，控制流量计21清零和第三电磁阀17转到反应器1，流量计21开始计数并控制到达想要的进样体积(P3)时让第三电磁阀17再转换到与废液相通，直到注射泵排出完全，若注射泵排出完全还达不到想要的进样体积，可能存在储液瓶没有样品溶液或者样品溶液不够的情况，则报警提示。控制参数：A1为切换阀通道号，A2为注射泵流速；P3为进样体积；P4为补偿体积；P3为充满体积。
5、管路清洗：该指令一般在传送砌块和输活化剂后面使用，也可以单独使用。
5.1、气路冲洗管路到废液(气冲管路)：控制第四电磁阀18和第五电磁阀19打开，控制第二电磁阀16、第三电磁阀17和废液相通，控制第一电磁阀15和第二切换阀8相通，控制第二切换阀8回归10通道和第二注射泵10相通，第二注射泵10V型运行(B1)s(气体从第四电磁阀18—第一电磁阀15—第一切换阀7—第一注射泵9—第二电磁阀16—第三电磁阀17通过)鼓吹气体冲洗第二切换阀8到第三电磁阀17之间的管路到废液。控制参数：B1为时间(s)。
5.2、溶剂冲洗管路到废液(液洗管路)：控制第二切换阀8由10通道到A1通道号(溶剂一般为二氯甲烷)和第二注射泵10相通，第二注射泵10以(C3)uL/s流速泵二氯甲烷(C4)uL并排出清洗第二切换阀8到废液的管路，并回归原位。控制参数：A1为切换阀通道号，C3为注射泵流速uL/s，C4为液洗体积uL。
5.3、气路冲洗管路到废液(气冲管路)：控制第二切换阀8由P2通道回归10通道和第二注射泵10相通，第一注射泵9V型运行P5(s)，鼓吹气体冲洗第二切换阀8到第三电磁阀17之间的管路(里面应该是清洗溶剂二氯甲烷)到废液，并回归原位。控制参数：P5为时间(s)。
5.4、气路冲洗管路到反应器1(气冲管路)：当运行P5(S)时间后，控制第三电磁阀17由废液转到与反应器1相通，鼓吹气体冲洗第三电磁阀17到反应器1之间的管路到反应器1，并一直运行保持气体一直经过反应器1的放气口排出，直到有新的指令下达(此时第一电磁阀15、第二电磁阀16、第三电磁阀17、第四电磁阀18和第五电磁阀19都是开放的并经过第二切换阀8及第二注射泵10和反应器1保持相通的状态)。控制参数：利用P5的参数。
6、开启搅拌：磁力搅拌装置11的磁力搅拌功能由数显的可视化控制界面，设定转速为D1(rpm)后开启搅拌，设定延时时间为D2(分钟，min)，即为达到设定转速后开始计时，时间到达设定的延时时间后该指令结束，可以执行下一个指令。控制参数：D1为转速，D2为延时时间(分钟)。
7、输活化剂：此指令与传送砌块指令的动作类似，只是切换阀通道连接的是各种活化剂。运行此指令前需要运行气体保护指令。首先PLC会根据进样体积(P3)和补偿体积(P4)的和来判断第一电磁阀15与那个注射泵相通：当体积和大于小量程的注射泵量程时，第一电磁阀15与大量程的第二注射泵10相通，当体积和小于小量程的注射泵量程时，第一电磁阀15与小量程的第一注射泵9相通。当第二注射泵10与对应的第二切换阀8相通时，根据第二切换阀8的通道号(A1)来抽取不同的样品，控制第二电磁阀16,第三电磁阀17和废液相通，控制第二切换阀8由10通道变到(A1)通道，打开流量计21，第二注射泵10首先以流速A2uL/s泵液充满体积P5uL，然后排出到废液管路，使第二注射泵10到第三电磁阀17的管路之间充满进样样品，然后第二注射泵10再以流速A2uL/s从(A1)通道泵液进样体积(P3)和补偿体积(P4)之和，当抽取样品刚好完成时，控制第五电磁阀19关闭，控制流量计21清零和第三电磁阀17转到反应器1，流量计21开始计数并控制到达想要的进样体积(P3)时让第三电磁阀17再转换到与废液相通，直到注射泵排出完全，若注射泵排出完全还达不到想要的进样体积，可能存在储液瓶没有样品溶液或者样品溶液不够的情况，则报警提示。控制参数：A1为切换阀通道号，A2为注射泵流速；P3为进样体积；P4为补偿体积；P3为充满体积。
8、活化等待：此指令为输活化剂后活化原料的等待时间，即为“预活化”时间，所以称为活化等待，设定参数一般为E1(分钟)，也可用于代替等待时间的指令，可重复使用。控制参数：E1为时间(min)
9、反应时间：此指令为满足反应对温度的需求变化和反应的时间，区别于开始降温，主要控制超低温循环装置12。控制超低温循环装置12变化温度，按照设定温度(F1)开始运行，直到实际温度达到设定温度(F1)±区间温度(F2)的范围内，此时开始计时满足延时时间(F3)后执行下一个指令，通过重复使用反应时间指令达到程序升降温的目的。控制参数：F1为设定温度(℃)，F2为区间温度(℃)，F3为延时时间(分钟)。
10、反应等待：此指令为反应基本结束后的等待取样监测的时间，区别于活化等待，设定参数一般为G1(分钟)，也可用于代替等待时间的指令，可重复使用。控制参数：G1为时间(min)
11、停止搅拌：控制磁力搅拌停止搅拌。无控制参数。
12、停止制冷：控制低温循环装置12停止制冷和循环。
总体分析：整个自动化过程对进样的准确性要求最高，所以通过注射泵和流量计21双重控制，并有合适的指令冲洗管路，避免交叉污染，所以在保证整体体系运行稳定的状态下，进样准确。
13、取样监测：一般在自动自动化制备装置的指令活化等待之后，
取样监测：该指令的主要功能就是自动取样、进样、清洗管路和触发HPLC运行，检测装置如图2所示。首先控制第三注射泵以取样速度(H3，uL/s)正向运行吸取反应液到一定的量程，该量程为取样容量(H4，uL)，刚开始是空气进入第三注射泵的注射器，滑轨带动不锈钢针头下行到一定的取样位置(H2，分1,2,3档位)穿刺取样口的密闭橡胶垫片，针头和反应液接触，停留时间为取样时间(H1，S，一般时间很短)，随后滑轨上行抽出反应器1(第三注射泵一直运行所以反应液不会滴落)，机械转盘旋转至一定角度后停止，滑轨下行穿刺有机溶剂(一般为乙腈)储液瓶口，针头和有机溶剂接触，停留时间为稀释反应液的时间，即为稀释时间(H5，s，该时间比反应液接触长的多，滑轨可停止一定时间)，此时有机溶剂会稀释反应液一起进入第三注射泵的注射器中，注射器的顶部是空气，注射器相当于稀释反应液的储液样品瓶，随后滑轨上行抽出有机溶剂储液瓶，机械转盘继续旋转至废液瓶处下行一定距离后(无需穿刺)等待反向清洗到废液。第三注射泵则是继续正向吸取运行相当于稀释混匀，注射器下吸一定距离后达到设定容量(X uL)后上行排出被稀释的反应液，控制电磁阀和高压流路切换阀连接，控制高压流路切换阀处于上样状态，以第三注射泵的动力进样，直到第三注射泵回归原位，被稀释的反应液则被注入到高压流路切换阀的loop(定量环)中，进样后上位机软件控制给出类似开关的短接信号触发HPLC开始运行，HPLC控制高压流路切换阀转变为进样状态，等待一定时间后转回上样状态以备下次上样。HPLC运行3-8min结束后立即给出TXT报告，输出在上位机的指定文件夹里，HPLC运行结束后可以自动平衡柱子，以待下一次进样监测。在HPLC运行分析的同时，控制电磁阀和有机溶剂储液瓶(中间瓶)连接，控制第三注射泵以一定速度反向吸取同样容量有机溶剂(一般也为乙腈)并反向冲洗滑轨管道，有机滤头和不锈钢针头到废液。控制机械转盘在回转到有机溶剂储液瓶处，滑轨下行穿刺有机溶剂储液瓶，停留一段时间，控制第三注射泵正向吸取同样容量的有机溶剂，控制电磁阀和高压流路切换阀相通，第三注射泵泵有机溶剂正向清洗管路至高压流路切换阀连接的废液瓶中。根据上述过程再重复反洗和正洗各一次，共反向和正向清洗两次，管路基本清洗干净。滑轨上行并回转到反应器1位置，以备下次取样和进样。控制参数：H1，取样时间(s)，H2，取样位置，H3，取样速度(μL/s)，H4，取样容量，H5，稀释时间(s)。
至此，在线监测系统的硬件及其控制方案能够按照设计的逻辑关系稳定运行，不管是否使用“监测结果”指令，在“取样监测”指令运行结束后，HPLC就会给出目前反应液的一个接近实时的状态，便于后续或者下次同样目标分子自动化制备的优化和调控。
14、“监测结果”指令的运行则是在上位机的“在线监测”界面通过设定数据报告的逻辑关系来记录、对比、反馈和调控自动化运行是否继续下去。一般情况下，“监测结果”指令紧挨在“取样监测”指令的后面执行，当然也可以手动控制单独运行，它的主要功能就是提取最新的TXT报告，并和上一个TXT报告进行对比和判断，如果符合预期则继续自动化，如果超过设定限度则会报警提示超限的原因并等待人为处理，使用人员可以根据实际情况选择继续或停止自动化运行。
在自动化运行过程中，当“取样监测”指令运行时，“监测结果”界面就会提前提取数据库文件夹里的最新TXT报告作为已知数据(如图7所示)，并一直刷新文件夹等待更新的TXT报告；当“取样监测”指令运行结束后，设计上位机会从“自动运行”界面跳转到“监测结果”界面，如果此时HPLC运行结束并有了新的TXT报告则“监测结果”界面会自动直接捕获最新的数据报告作为采集数据(如图7所示)；如果HPLC还未运行结束，“监测结果”界面会继续一直刷新数据文件夹等待最新的数据报告出现并捕获作为采集数据(如图7所示)。
为了方便对比和判断，并没有将HPLC输出原始数据的所有内容都提取出来，而是将最重要和最常用的几个参数按原始数据顺序提取(如图7所示)，包括：PEAK(峰数)，R.TIME(保留时间)，AREA(峰面积)，HEIGHT(峰高)，A/H(面积/高度)，CONC.(浓度比)。其中对比的标准就是保留时间和浓度比，因为不同化合物在同样的分析方法下保留时间是不同的，而相同的化合物在同样的分析方法下保留时间是基本一样的。
设计“在线监测”界面具体的逻辑关系是依据正常“预活化”一釜自动化制备的反应进程而设计的(如图4所示)。当提取到已知数据后，首先对CONC.进行大小的第一次对比判断，选择CONC.中的最大值作为未被活化的“给体”或者活化后刚加入的“受体”的浓度比，并高亮显示此数据行，因为不管是给体还是受体都有强紫外吸收的硫苷离去基，正常的一釜糖基化中，通过设置监测的开始时间可以排除掉活化剂活化硫苷后生成的极性非常小的强紫外副产物，再有强紫外吸收的化合物只有给体、受体和可能的新产物。提取到CONC.的最大值后，找到其相对应的R.TIME，将对应的R.TIME按±0.05(变量)扩大在采集数据中的搜索范围，避免相同化合物在同样分析方法下保留时间的微小差异；在采集数据中搜索已知数据R.TIME±0.05后的数值进行第二次对比判断，如果没有搜索到相应的数据则说明反应液目前的状态是没有“给体”或者“受体”的，代表“给体”或者“受体”已经被完全活化或者完全反应消失了；如果在采集数据中仍然搜索到有和已知数据中相同的R.TIME说明反应液目前的状态是仍存在未被活化或者未完全反应的“给体”和“受体”，则找到其对应的CONC.，这时设计了一个CONC.的“对比限度”参数(在自动化程序的编写过程中人为根据经验和具体实验要求填写)继续进行第三次对比判断：如果搜索到的采集数据中的CONC.低于设定的“对比限度”数值，说明虽然仍存在未被活化或者未完全反应的“给体”和“受体”，但浓度比很低，符合预期的反应进程，可以继续自动化制备装置；如果CONC.高于设定的“对比限度”数值，说明未被活化或者未完全反应的“给体”和“受体”的剩余量超出预期，此时上位机会给报警提示并高亮显示此数据行，自动化会暂停等待使用人员来处理：如果人为选择继续则继续后续自动化，当有“取样监测”和“监测结果”指令运行时会重复上述逻辑判断直到整个自动化制备装置完成，并可以生成自动化制备装置报告；如果人为处理选择停止则终止后续所有程序指令，同样可以生成自动化制备装置报告，但只显示停止之前的砌块信息。
通过上述上位机“在线监测”界面三次的递进式自动对比判断，可以清晰的了解和跟踪反应进程，如果出现“受体”剩余的报警提示，使用人员也可以根据接近实时的反应状态做出最合理的处理。
当然，“取样监测”和“监测结果”指令属于可选项，可是使用也可以不使用。
自动化后：保存、总结和分析自动化合成结果；拆卸反应器后将反应液用硅藻土过滤，滤液减压浓缩后经柱层析分离和制备液相分离，得到白色固体化合物DEFGH-2，并清洗反应器干燥以备下次使用；回收和清洗储液瓶的砌块和试剂；用二氯甲烷代替使用过的砌块和试剂溶液，设置“样瓶清洗”指令(参数为：切换阀通道号、流速(uL/s)、进样体积(uL))依次自动清洗各个储备过样品的储液瓶以备下次自动化使用；最后执行“气体保护”指令，泄去管路的气体压力，先关闭软件再关闭合成仪。不同目标化合物的自动化差异主要有活化体系、活化温度、反应时的温度和时间有差异，整体的自动化动作执行基本一致。
本发明自动在线监测是根据自主研发的合成仪配套的自动取样和进样设备，自动取样和进样完成后，上位机软件会自动给出短接信号触发HPLC(岛津LC-20A分析性高效液相)按批处理依次受指令控制运行，具体分析方法一般是使用的岛津LC-20A分析性高效液相，使用60％B-100％B-8.0min梯度洗脱，紫外可变波长检测器(254nm和280nm)监测，色谱柱为：Waters C18,5μm,2.1mm*50mm，流动相为：A H2O+0.037％(v/v)TFA和B ACN+0.018％(v/v)TFA。
磺达肝葵钠五糖中间体DEFGH-2(Methyl6-O-acetyl-3,4-di-O-benzyl-2-deoxy-2-azido-α-D-glucopyranosyl-(1→4)-(Methyl2,3-di-O-benzyl-β-D-glucopyranosyluronate)-(1→4)-3,6-di-O-acetyl-2-deoxy-2-azido-α-D-glucopyranosyl-(1→4)-(methyl2-O-acetyl-3-O-benzyl-α-L-idopyranosyluronate)-(1→4)-6-O-benzoyl-3-O-benzyl-2-deoxy-2-benzyloxycarbonylamino-α-D-glucopyranoside)的自动化制备方法：
准备化合物D-3(49.80mg,0.096mmol)、化合物EF-4(60.1mg,0.08mmol)和化合物GH-2(53.97mg,0.064mmol)根据p-TolSCl(800uL,770uL取于90uL稀释于5000uL)/AgOTf[3000uL,2500uL取于246.8mg溶于10000uL(8mL甲苯+2mL DCM)混合溶液]活化体系的一般自动化过程，经柱层析分离(石油醚/乙酸乙酯，2:1)和制备液相分离，得到白色化合物3-81(73mg,0.03840mmol,60％)，目前应用于所述自动化制备装置，五糖DEFGH-2的合成量已经可以达到克级规模，有望继续优化效率和放大规模，图10为以化合物D-3、化合物EF-4和化合物GH-2为原料，制备化合物DEFGH-2的反应原理示意图。所得化合物DEFGH-2的表征结果为：Rf＝0.12(petroleum ether/ethyl acetate,2:1)；1H NMR(600MHz,CDCl3)δ8.11(d,J＝7.3Hz,2H),7.57(t,J＝7.4Hz,1H),7.46(t,J＝7.7Hz,2H),7.40–7.30(m,30H),7.26–7.20(m,5H),5.55(d,J＝3.8Hz,1H),5.48(d,J＝4.0Hz,1H),5.40–5.35(m,1H),5.07–5.01(m,5H),4.90(d,J＝5.9Hz,2H),4.87(d,J＝6.5Hz,1H),4.86(s,1H),4.85–4.83(m,2H),4.82(s,1H),4.80(dd,J＝5.1,2.8Hz,2H),4.77(d,J＝5.5Hz,2H),4.71(d,J＝10.9Hz,2H),4.59(d,J＝11.0Hz,2H),4.48(d,J＝11.8Hz,1H),4.43–4.37(m,2H),4.31(d,J＝11.5Hz,1H),4.25–4.18(m,2H),4.09(dd,J＝7.1,4.7Hz,2H),4.06–4.01(m,3H),3.96–3.93(m,1H),3.91–3.87(m,2H),3.79(s,3H),3.74(dt,J＝15.4,9.4Hz,2H),3.63(t,J＝9.7Hz,1H),3.56(s,3H),3.54(d,J＝6.3Hz,2H),3.46(dd,J＝8.9,8.1Hz,1H),3.37(s,3H),3.31(dd,J＝10.4,3.7Hz,1H),3.22(dd,J＝10.8,3.4Hz,1H),2.10(s,3H),2.09(s,3H),2.07(s,3H),2.04(s,3H).13C NMR(151MHz,CDCl3)δ170.66(Ac,C＝O),170.11(x2,Ac,C＝O),170.03(Ac,C＝O),169.51(COOMe,C＝O),168.39(COOMe,C＝O),166.16(Bz,C＝O),155.85(Cbz,C＝O),138.29,138.10,137.57,137.56,137.49,137.33,136.30,133.11,129.86,128.61,128.56,128.55,128.52,128.50,128.44,128.39,128.28,128.18,128.09,128.07,128.05,128.03,127.99,127.94,127.91,127.64,127.58,127.35,127.24,127.07,103.28(C-1),98.77(C-1),98.09(C-1),97.62(C-1),97.57(C-1),83.78,81.64,80.14,78.81,77.03,76.28,75.79,75.54,75.22,75.17,74.99,74.70,74.42,73.69,73.25,69.71,69.61,69.42,69.34,66.96,63.26,62.73,62.22,61.40,60.87,55.28,54.60,52.68,52.22,20.88,20.86,20.76,20.69.HRMS(ESI+)Anal.Calcd for C98H107N7O32Na[M+Na]+1916.6853,found1916.6826.
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处。综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
Claims (10)
1.一种磺达肝葵钠五糖中间体自动化制备方法，其特征在于，所述方法应用于一种磺达肝葵钠五糖中间体自动化制备装置，所述自动化制备装置包括：反应器、上位机、惰性气体装置、第一活化剂容器、第二活化剂容器、第一样品容器、第二样品容器、第三样品容器、自动进样系统、低温循环装置和磁力搅拌装置；
所述惰性气体装置分别与所述自动进样系统、所述第一活化剂容器、所述第二活化剂容器、所述第一样品容器、所述第二样品容器和第三样品容器连接；所述自动进样系统与所述反应器连接；所述自动进样系统、低温循环装置和磁力搅拌装置均与上位机连接；
所述磺达肝葵钠五糖中间体具有式I所示结构，命名为DEFGH-1；
式I中，R1为酰基或者硅保护基；R2和R6独立地为羧基保护基；R3和R4独立地为酰基；R5和R7独立地为酰基；X、Y、Z独立地为N3或者各种带保护基的氨基；
所述磺达肝葵钠五糖中间体的制备原料包括化合物D-1、化合物EF-1和GH-1；
所述方法包括：
所述第一样品容器中放入化合物D-1；所述化合物D-1具有式II所示结构：
式II中，R1为酰基或者硅保护基；SR8为硫苷类离去基；X为N3或者各种带保护基的氨基；
所述第二样品容器中放入化合物EF-1；所述化合物EF-1具有式III所示结构：
式III中，R2为羧基保护基，R3和R4独立地为酰基；SR8为硫苷类离去基；Y为N3或者各种带保护基的氨基；
所述第三样品容器中放入化合物GH-1，所述化合物GH-1具有式IV所示结构：
式IV中，R5和R7独立地为酰基，R6为羧基保护基，Z为N3或者各种带保护基的氨基；
气体保护：通过自动进样系统向所述第一样品容器、第二样品容器、第三样品容器、第一活化剂容器、第二活化剂容器和反应器中充满惰性气体；
通过低温循环装置给反应器降温；
通过自动进样系统将所述化合物D-1传送到反应器；
通过磁力搅拌装置对所述反应器中所述化合物D-1进行搅拌，进行预干燥；
通过自动进样系统将第一活化剂容器中的第一活化剂和第二活化剂容器中的第二活化剂依次传送到所述反应器，对所述化合物D-1进行第一设定时间的预活化；
通过自动进样系统将化合物EF-1传送到所述反应器；
通过低温循环装置给反应器程序升温，进行反应第二设定时间；
通过低温循环装置给反应器降温；
通过自动进样系统将第一活化剂容器中的第一活化剂和第二活化剂容器中的第二活化剂依次传送到所述反应器，对所述化合物D-1和所述化合物EF-1反应生成的中间体进行第三设定时间的预活化；
通过自动进样系统将化合物GH-1传送到所述反应器；
通过低温循环装置给反应器程序升温，进行反应第四设定时间；
通过自动进样系统将淬灭反应溶剂传送到所述反应器，终止反应，获得化合物DEFGH-1。
2.根据权利要求1所述的磺达肝葵钠五糖中间体自动化制备方法，其特征在于，所述第一活化剂为苯硫氯，所述第二活化剂为三氟甲磺酸银。
3.根据权利要求1所述的磺达肝葵钠五糖中间体自动化制备方法，其特征在于，通过低温循环装置给反应器降温时设置降温温度为-75℃。
4.根据权利要求1所述的磺达肝葵钠五糖中间体自动化制备方法，其特征在于，所述磁力搅拌装置转速设置为400-1000rpm。
5.根据权利要求1所述的磺达肝葵钠五糖中间体自动化制备方法，其特征在于，所述通过磁力搅拌装置对所述反应器中所述化合物D-1进行搅拌的时间为1-300min。
6.根据权利要求1所述的磺达肝葵钠五糖中间体自动化制备方法，其特征在于，所述自动化制备装置还包括检测装置，所述检测装置与所述反应器管道连接，所述检测装置与所述上位机电连接。
7.根据权利要求6所述的磺达肝葵钠五糖中间体自动化制备方法，其特征在于，所述对所述化合物D-1进行第一设定时间的预活化之后，所述方法还包括：
通过检测装置检测所述化合物D-1是否有剩余，若有剩余则报警。
8.根据权利要求6所述的磺达肝葵钠五糖中间体自动化制备方法，其特征在于，所述对所述化合物D-1和所述化合物EF-1反应生成的中间体进行第三设定时间的预活化之后，所述方法还包括：
通过检测装置检测所述化合物D-1和所述化合物EF-1反应生成的中间体是否有剩余，若有剩余则报警。
9.根据权利要求6所述的磺达肝葵钠五糖中间体自动化制备方法，其特征在于，所述通过低温循环装置给反应器程序升温，进行反应第四设定时间之后，所述方法还包括：
通过检测装置检测所述化合物GH-1是否有剩余，若有剩余则报警。
10.根据权利要求1所述的磺达肝葵钠五糖中间体自动化制备方法，其特征在于，所述淬灭反应溶剂为三乙胺。
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