CN112546045A - 一种贾第虫伴侣蛋白j抑制剂knk437及其医用用途 - Google Patents

一种贾第虫伴侣蛋白j抑制剂knk437及其医用用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种贾第虫伴侣蛋白J抑制剂KNK437，同时还公开了其在抗贾第虫及其病毒中的医用用途，可用于贾第虫及其病毒的治疗，特别是在制备抗贾第虫及其病毒的小分子药物中的用途，具有分子量小、安全、高效等优点。

Description

一种贾第虫伴侣蛋白J抑制剂KNK437及其医用用途
技术领域
本发明提供一种贾第虫伴侣蛋白J抑制剂KNK437，同时还公开了其在抗贾第虫及其病毒中的医用用途，可用于贾第虫及其病毒的治疗，属于抗寄生虫药技术领域。
背景技术
十二指肠贾第虫（Giardia duodenalis），简称贾第虫（Giardia），是一种寄生于人和多种动物小肠的原虫，呈世界范围内分布，临床上可引起人和动物腹泻，严重威胁着动物和人类健康，但迄今尚无理想的防控办法。此外，已报道贾第虫体内含有病毒，增加了对贾第虫防治的难度。贾第虫病毒为dsRNA病毒，基因组大小为6.2kb，有2个开放阅读框，分别编码100KDa的衣壳蛋白和RNA依赖RNA聚合酶（RNA dependent RNA polymerase，RdRp）的190KDa的蛋白，贾第虫病毒对贾第虫致病性有较大的影响。目前研究发现病毒RdRp作为RNA病毒编码的主要蛋白，具有复制和转录两种重要功能。据报导RdRp复制活性需要宿主因子热休克蛋白70的激活，由宿主的调控蛋白调节。但目前有关抗原虫病毒RdRp的药物研究报导较少，尚未见贾第虫病毒RdRp抑制剂的相关研究报道。
发明内容
本发明一种贾第虫伴侣蛋白J抑制剂KNK437，为一种泛-HSP抑制剂。
本发明还公开了贾第虫伴侣蛋白J抑制剂KNK437在抗贾第虫及其病毒中的医用用途，可用于贾第虫及其病毒的治疗。
本发明提供的一种贾第虫伴侣蛋白J抑制剂KNK437，为一种泛-HSP抑制剂，分子量：245.23，分子式：C13H11NO4。
本发明所述的贾第虫伴侣蛋白J抑制剂KNK437在制备抗贾第虫及其病毒的小分子药物中的用途。
本发明所述的伴侣蛋白J抑制剂KNK437的获得方法，包括以下步骤：
构建的含病毒贾第虫酵母双杂交cDNA文库和贾滴虫病毒RNA依赖RNA聚合酶（RdRp）诱饵质粒pGBKT7-RdRp，筛选获得RdRp互作蛋白-伴侣蛋白J，并利用GST pull-down、免疫共沉淀等技术进一步验证RdRp与伴侣蛋白J二者的互作关系，后利用伴侣蛋白J抑制剂KNK437处理贾第虫，检测其抗贾第虫和贾第虫病毒作用效果，即得。
本发明的积极效果在于：
公开了一种新的贾第虫伴侣蛋白J抑制剂KNK437，并提供了该抑制剂的医用用途，特别是在制备抗贾第虫及其病毒的小分子药物中的用途，具有分子量小、安全、高效等优点。
附图说明
图1为本发明pull-down验证RdRp和伴侣蛋白J蛋白间相互作用；
图2为本发明免疫共沉淀验证蛋白互作（A: 重组蛋白在真核细胞中的表达B:免疫共沉淀 1:His-RdRp和HA-伴侣蛋白J共转染2:His-RdRp单转染3:HA-伴伴侣蛋白J单转染）；
图3为本发明不同浓度抑制剂处理对贾第虫增殖的影响；
图4为本发明不同浓度抑制剂处理对伴侣蛋白J表达的影响；
图5为本发明贾第虫病毒衣壳蛋白基因表达量检测。
具体实施方式
以下描述了本发明的具体实施方式,但是本领域的技术人员应当理解,这仅仅是举例说明,本发明的保护范围是由所附权利要求书限定的,本领域的技术人员在不背离本发明的原理和实质的前提下,可以对这些实施方式做出多种变更或修改,这些变更和修改均落入本发明的保护范围。
实施例1
贾第虫病毒RdRp互作蛋白的筛选
将构建成功的诱饵载体pGBKT7-RdRp转化酵母菌Y2HGold中，进行毒性和自激活检测，并对诱饵基因pGBKT7-RdRp在酵母菌中表达情况进行检测。将诱饵载体pGBKT7-RdRp与酵母双杂交cDNA文库共转化酵母菌中，另外将pGBKT7-p53/pGADT7-T和pGBKT7-lam/pGADT7-T分别作为阳性对照和阴性对照，分别涂布于相应的营养缺陷型选择培养基中，初步筛选并鉴定捕获基因--伴侣蛋白J抑制剂KNK437：为一种泛-HSP抑制剂，分子量：245.23，分子式：C13H11NO4。
实施例2
GST pull down
将成功构建的原核表达载体pET-32a-RdRp和pGEX-4T-1-伴侣蛋白J 分别转化大肠杆菌感受态Trans1-T1，加入诱导剂TPIG 16℃诱导过夜后收集菌体沉淀超声破碎，分别收集上清及沉淀，利用SDS-PAGE分析蛋白表达情况。利用GST琼脂糖凝胶纯化GST-伴侣蛋白J融合蛋白，利用His标签蛋白纯化试剂盒进行纯化His-RdRp融合蛋白。GST-伴侣蛋白J与His-RdRp共孵育为实验组，GST标签蛋白与His-RdRp共孵育为对照组，进行GST pull down试验，并进行Western Blot分析。结果发现SDS-PAGE分析原核表达产物GST-伴侣蛋白J融合蛋白分子质量单位约为70KDa，该蛋白以可溶性和包涵体两种表达形式，His-RdRp融合蛋白分子质量单位约为34 KDa，该蛋白以可溶性和包涵体两种表达形式，SDS-PAGE显示纯化的GST-伴侣蛋白J蛋白为单一条带。收集GST pull down洗脱液，以anti-His单克隆抗体为一抗进行Western Blot，GST-伴侣蛋白J与His-RdRp孵育的洗脱液中可检测His-RdRp融合蛋白（图1），说明伴侣蛋白J与RdRp可在体外存在相互作用。
实施例3
免疫共沉淀
HEK-293T细胞铺板后待生长80%左右时进行转染。其中pcDNA-His-RdRp/pcDNA-HA-伴侣蛋白J为共转染组，pcDNA-His-RdRp和pcDNA-HA-伴侣蛋白J为单转染组，分别收集不同转染组细胞，用RIAP裂解液裂解后取上清进行Western Blot分析蛋白表达情况，余下上清分别加入anti-His抗体和anti-HA抗体共孵育后进行免疫共沉淀，对洗脱液进行Western Blot分析。结果发现转染后的细胞裂解液以anti-His抗体为一抗进行WesternBlot，共转染组检测到His-RdRp和HA-伴侣蛋白J表达，pcDNA-His-RdRp单转染组只检测到His-RdRp，pcDNA-HA-伴侣蛋白J单转染组只检测到HA-伴侣蛋白J表达(图2A)。在anti-His抗体沉淀的复合物中pcDNA-His-RdRp/HA-伴侣蛋白J共转染组同时检测到pcDNA-His-RdRp和HA-伴侣蛋白J，pcDNA-His-RdRp单转染组中只检测到His-RdRp，HA-伴侣蛋白J单转染组无特异性条带，说明RdRp和伴侣蛋白J在真核细胞中有相互作用（图2B）。在anti-HA抗体沉淀的复合物中pcDNA-His-RdRp/HA-伴侣蛋白J共转染组同时检测到pcDNA-His-RdRp和HA-伴侣蛋白J，HA-伴侣蛋白J单转染组只检测到HA-伴侣蛋白J，His-RdRp单转染组无特异性条带，说明RdRp和伴侣蛋白J在真核细胞中有相互作用（图2 B）。
通过以下试验例来证明本发明的医用用途：
试验例1
贾第虫伴侣蛋白J抑制剂KNK437抗贾第虫作用
对贾第虫进行分组，分别为抑制剂组1、抑制剂组2、DMSO溶剂组和正常培养组，将生长对数期的贾第虫处理后倒入离心管，700g 离心5min，用4mL培养液重悬虫体后进行虫体计数，分别吸取1×106个虫体悬液/mL于4个贾第虫培养管中，抑制剂组中利用KNK437原液（10mg溶于408μL DMSO）分别稀释为100μM、200μM，另加相同体积于DMSO溶剂组和正常培养组，置于37℃培养箱中培养至对数期。将对数期的贾第虫冰浴30min后使贾第虫尽量脱壁直到在显微镜下观察不到贴壁虫体，700g 离心10min，弃上清，用PBS重悬贾第虫后进行虫体计数，检测不同浓度的抑制剂处理后对贾第虫增殖的影响。同时，利用TrizolTrizol裂解液提取不同浓度抑制剂处理的贾第虫虫体蛋白，进行Western blot分析不同剂量的抑制剂对贾第虫伴侣蛋白J表达和虫体增殖的影响。结果发现不同浓度伴侣蛋白J抑制剂KNK437处理贾第虫，均能明显抑制贾第虫的增殖，且随着抑制剂浓度的变化对贾第虫的增殖也稍有不同。抑制剂各组与DMSO溶剂组和正常培养组相比均为差异极显著。其中当抑制剂浓度为100μM，贾第虫滋养体数量减少了89%以上，DMSO溶剂组和正常培养组相比，差异不显著，表明少剂量的DMSO对贾第虫的增殖无明显影响（见图3）。
对不同浓度抑制剂处理贾第虫提取全蛋白Western blot检测结果表明抑制剂处理后贾第虫伴侣蛋白J表达量明显降低，说明抑制剂处理可抑制贾第虫的增殖（见图4）。
试验例2
贾第虫伴侣蛋白J抑制剂KNK437抗贾第虫病毒作用
将不同浓度贾第虫伴侣蛋白J抑制剂KNK437处理的贾第虫分别提取贾第虫总RNA，反转录为cDNA后对贾第虫病毒衣壳蛋白（capsid）基因进行相对荧光定量，以检测抑制剂处理后贾第虫病毒的相对含量。病毒capsid基因的相对荧光定量引物送长春库美公司合成，引物相关序列如下：
Capsid F：5’-GCTTTTGCCCTCGTCTACC-3’；
Capsid R：5’-ATCCCACACGCTCTTGACTT-3’；
Giardiaactin F：5’-CAGAACTGGCGTCAAACGTG-3’；
Giardiaactin R：5’-TTTCCTCCATACCACACGGC-3’。
将制备的cDNA10倍稀释后，每孔反应体系如下（表1）：
表1qPCR体系
成分 用量
forward primer 1 μL
reverse primer 1 μL
cDNA 2 μL
RNA-free H2O 6 μL
SYBE Green预混染料 10 μL
利用不同剂量抑制剂处理贾第虫后荧光定量PCR检测病毒衣壳蛋白基因含量，结果表明抑制剂处理后贾第虫病毒衣壳蛋白基因相对含量呈明显下降趋势。结果见图5，初步表明伴侣蛋白J表达水平的降低抑制了贾第虫病毒的增殖，即下调了RdRp酶活性。
序列表
<110> 吉林大学
<120> 一种贾第虫伴侣蛋白J抑制剂KNK437及其医用用途
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 990
<212> DNA
<213> 贾第虫伴侣蛋白J(Giardia lamblia Chaperone protein dnaJ)
<400> 1
atgggtagga gtttctatga ggtgctagga gtccctcata cggcagcccc ggacgccatc 60
aagcgggcat accgtaagca agccctgcgc tggcaccccg acaaaaaccg tgacaatcgc 120
caggaggcag aggctcggtt caaagagatt tcagaggcat atcgtatact atcggatcca 180
gagaaacgcg ccgtgtacga ccgctttgga gaagagggta tcaggatggt cgggccagat 240
ggaagcgtgg cagcgtcagg gcagccgcgg gttgtctttt ctggcatgcc gtttgccaat 300
ctagatgaag ccttcaagct gtttgagcaa gtctttggaa gcatggatcc gtttgcctct 360
gaatttgata tggggatgac tgactttggc acgtttccgt ccatgaacga gaccaagtgg 420
cggccaaggc ctcagaaaaa gcgtaaggat ccggatgttt tcgttgatct ggaactaacc 480
cttgaagaac tatacttcgg ggccacgaag cttcgcaaag ttactaggcg cgtaatgatg 540
gcagatgggt cgtcagagtc caaggtggag atgcttgaga taatcgtcaa acagggctgg 600
tcggagggca cacaaatccg gtttaaggag ctaggagatg aagcaccaaa catcacacct 660
tcggatctcg tttttgttgt caaggagctc ccccatccta acttcctaag agaaggagac 720
aatcttgttg tgacgtgtaa cgttcccctc agaaacgccc tctgtggcta tcaaacagag 780
ctcaaaaccc ttgacaatcg tacgctgcac atagttgtat cagaggtcat catccccggc 840
aacgtgaaga caatccacgg cgagggaatg cctctgagtg cagacccgcg acaacgtggt 900
cttctcctca tcaagttcaa tgtgcaattc ccatcacaca tcccggaggt caacaaggcc 960
gctctcatgg agctgctgcc gccaaattaa 990

Claims (3)

1.一种贾第虫伴侣蛋白J抑制剂KNK437，为一种泛-HSP抑制剂，分子量：245.23，分子式：C13H11NO4。
2.如权利要求1所述的贾第虫伴侣蛋白J抑制剂KNK437在制备抗贾第虫及其病毒的小分子药物中的用途。
3.如权利要求1所述的贾第虫伴侣蛋白J抑制剂KNK437的获取方法，包括以下步骤：
构建的含病毒贾第虫酵母双杂交cDNA文库和贾滴虫病毒RNA依赖RNA聚合酶（RdRp）诱饵质粒pGBKT7-RdRp，筛选获得RdRp互作蛋白-伴侣蛋白J，并利用GST pull-down、免疫共沉淀等技术进一步验证RdRp与伴侣蛋白J二者的互作关系，后利用伴侣蛋白J抑制剂KNK437处理贾第虫，检测其抗贾第虫和贾第虫病毒作用效果，即得。
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