CN112546032A

CN112546032A - 根皮素的新应用

Info

Publication number: CN112546032A
Application number: CN202011333352.0A
Authority: CN
Inventors: 江蓝; 孙文静; 俞思勇; 石杪藟; 方应邹; 洪贝月; 汪道奇; 郑胜男; 庾庆华
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2020-11-24
Filing date: 2020-11-24
Publication date: 2021-03-26
Anticipated expiration: 2040-11-24
Also published as: CN112546032B

Abstract

本发明公开了根皮素的新应用，具体表现在减少动物机体食源性重金属镉蓄积毒性的应用，属于医药技术领域。本发明发现，根皮素能够显著改善镉处理导致的白羽肉鸡精神沉郁和体重增长减缓的现象，缓解镉诱发的肠绒毛固有层过度空泡化；显著抑制镉诱导的肠隐窝过度增殖；缓解肝、肾细胞的坏死，表现在核固缩、核溶解的细胞减少。因此，有望将根皮素开发为一类具有预防重金属镉中毒的膳食保健品或补充剂。

Description

根皮素的新应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及根皮素的新应用。尤其涉及其在减少动物机体食源性镉蓄积毒性的应用。

背景技术

镉是一类污染范围广，半衰期长(10～30年)以及具有慢性蓄积毒性的重金属，被美国毒物管理委员会(ATSRD)列为第6位危及动物身体健康的有毒物质，国际癌症研究机构(IARC)也将其确认为第I类致癌物。镉在自然环境中的含量低，其主要来源于矿石开采、石油冶炼、工业废水的排放等人类生产活动。

环境中的镉主要通过消化道、呼吸道和皮肤三大途径进入机体，由于镉半衰期久，难以代谢排出体外，可造成肝、肾、骨骼、睾丸、神经纤维、血管、肠道等其它器官与组织的损伤和毒性作用，其中镉对肝脏，肾脏等代谢器官的研究最为广泛和深入，而镉对肠道影响的研究相对较少。肠道作为机体摄入镉的最主要途径，不仅是镉损伤的靶器官，也是抑制镉摄入的关键部位。经由肠道摄入的镉以二价离子态竞争十二指肠、空肠的Fe²⁺、Zn²⁺、Ca²⁺的转运蛋白进入上皮细胞内，并通过相关机制转运出细胞进入血液循环系统。进入胃肠的镉仅有3～5％的量会被吸收入血，并与血液中的金属硫蛋白(MT) 结合，主要蓄积于肝、肾两大代谢器官。

根皮素(Phloretin)，别名三羟苯酚丙酮2，4，6-三羟基-3-(4-羟基苯基)苯丙酮，是国外新近研究开发出一种新型天然皮肤美白剂的主要成分，主要分布于苹果、梨等多汁水果的果皮及根皮。目前针对根皮素的体内研究较少，已有部分研究指出根皮素具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等多种生物活性。但是，暂无任何根皮素与镉相关的研究，更没有根皮素在缓解镉蓄积导致机体脏器损伤和中毒的作用的相关研究。

发明内容：

发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了一种生物活性物质-根皮素在一定剂量下可预防或治疗食源性镉造成蓄积毒性作用或疾病的药物及保健品方面的应用。根皮素可以有效缓解镉蓄积导致的白羽肉鸡生长抑制、肠绒毛形态紊乱、隐窝异常增殖、肾小管损伤。

技术方案：本发明提供了根皮素在制备预防或治疗重金属镉相关疾病方面的药物或保健品或补充剂中的应用。

其中，相关疾病方可能为中毒或其他疾病，所述中毒或疾病为肝、肾、骨骼、睾丸、神经纤维、血管、肠道等脏器中毒和损伤。

其中，所述药物剂型为片剂、胶囊、口服液、糖浆、滴丸、注射液剂型或冻干粉针剂型中的一种。

其中，所述根皮素纯度≥0.98，溶于PBS(pH 7.2-7.4)中，配制成每天每只口服剂量：白羽肉鸡40mg/kg的剂量。

本发明内容还包括根皮素在制备降低空肠组织炎症因子TNF-α的药物中的应用。

本发明内容还包括根皮素在制备降低空肠隐窝深度的药物中的应用。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下的特色和优点：本发明的根皮素在缓解镉蓄积毒性中有显著作用：根皮素预处理后饲喂镉的肉鸡相较于空白对照组：

(1)根皮素预处理8天后，体重增长趋势高于空白对照组与镉处理组(P＝0.016)，说明其具有一定的促生长功能。

(2)肝脏剖检眼观及镜检结果显示，肝细胞完整，未出现病理损伤，而空白对照组出现一定程度的空泡变性，说明根皮素具有维持白羽肉鸡肝脏形态稳定性的功能。

根皮素预处理后饲喂镉的肉鸡相较于镉处理组：

(1)体重显著上升(P＝0.027)，精神状态更佳，被毛更加整齐丰满。

(2)肠绒毛结构正常，空肠组织病理学打分与镉处理组差异极显著(P＜0.001)。

(3)空肠组织炎症因子TNF-α表达水平极显著下降(P＜0.01)。

(4)镉处理组出现典型的肾脏功能的损伤，表现为肾脏整体性肿大，肾小管上皮细胞脱落、核固缩，而根皮素预处理后饲喂镉的肉鸡肾脏未出现肿大，肾小管上皮细胞较为完好。

附图说明：

图1、白羽肉鸡试验设计方案；

图2、白羽肉鸡体重增长图，根皮素处理后体重显著高于镉处理组(P＝0.027)；

图3、白羽肉鸡空肠HE染色、空肠TNF-α表达及组织病理学打分结果，图A-C 为白羽肉鸡空肠HE染色结果，可见Cd处理后肠绒毛固有层增厚并空泡化，根皮素+Cd 组肠绒毛结构正常(图A为空白空肠横切面，图B为Cd组空肠横切面，图C为根皮素与Cd处理组空肠横切面，1标尺＝100μm)；图D为RT-qPCR检测空肠组织TNF-α结果，根皮素处理后TNF-α表达量显著下降；图E为组织病理学打分结果，根皮素处理后组织病理学打分显著低于Cd组。

图4、白羽肉鸡肝、肾HE染色结果。显微镜下观察肝肾HE染色结果，图A-C为肝脏染色结果，可见Cd组出现淋巴细胞聚集及肝细胞坏死，根皮素处理组及空白组正常(注：A-C上图1标尺＝100μm，下图1标尺＝25μm)；图D-F为肾脏染色结果，可见Cd组肾小管上皮细胞核固缩、核消失，发生坏死，空白组、根皮素处理组正常(注： D-F图1标尺＝25μm，已用Δ标示病变细胞)。

图5、白羽肉鸡空肠隐窝深度统计结果，可见Cd组相较于空白组隐窝深度显著升高，根皮素+Cd组隐窝深度相较于Cd组显著下降，与空白组无显著差异性，说明根皮素能显著抑制Cd诱发的肠隐窝过度增殖。

具体实施方法：

下面通过具体的实施例和附图对本发明进一步说明。下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规试剂和常规方法。

1、动物试验设计

(1)分组：将体重在140-220g体重的6日龄白羽肉鸡随机分为三组，分别为空白对照组(空白)、镉处理组(Cd)、根皮素和镉处理组(根皮素+Cd)，每组6-8只。

(2)处理：空白组的鸡只自由饮水采食，每天灌胃PBS(PH 7.2～7.4)200μL。 Cd组的鸡只自由饮水采食，6-15日龄饮用纯净的自来水，每天灌胃200μL PBS(PH 7.2～7.4)，15日龄起，在饮水中添加100ppm CdCl₂。根皮素+Cd组的鸡自由采食饮水，每天灌胃40mg/kg根皮素，15日龄起，在饮水中添加100ppm CdCl₂。于27日龄统一剖检采样。

2、小鸡体重记录

为了探究镉暴露和根皮素对小鸡体重影响，自镉处理小鸡的前一天开始，每天称量并记录小鸡体重，观察小鸡的精神状态，直到试验结束。

3、空肠、肾脏、肝脏组织病理形态学观察

利用组织切片技术和HE染色观察组织形态学变化。

4、空肠组织病理学打分

依据肠绒毛厚度、肠绒毛顶端完整性、上皮细胞完整性、肠隐窝深度、炎性细胞浸润程度、隐窝溃疡程度、隐窝出血程度进行打分，由3人采用双盲法进行打分(满分13 分)，并制作统计图。具体打分方式见下表1：

表1

5、RT-qPCR检测空肠组织炎症因子TNF-α表达水平变化

(1)荧光定量PCR引物设计

利用NCBI中GenBank数据库进行查找和设计特异性引物，以白羽肉鸡的GAPDH 作为内参基因，引物序列由上海生工公司进行合成，具体引物序列如下：

(2)肠道组织RNA的提取

将空白对照组(空白)、镉处理组(Cd)、根皮素和镉处理组(根皮素+Cd)三组的小肠组织从-70℃冰箱中取出。根据标准的Trizol法提取RNA的步骤进行组织RNA 的提取。提取的RNA用DEPC水溶解，并及时反转录为较为稳定的cDNA，剩余的RNA 冻存在-70℃冰箱中。

(3)cDNA的合成

用分光光度仪测定提取的组织RNA的浓度，对反转录体系中RNA进行定量，在

II两步法qPCR试剂盒的体系和程序下，在普通PCR扩增仪中反转录为cDNA，然后保存在-20℃。

(4)实时荧光定量PCR和分析方法(2^-ΔΔCt法)

以GAPDH为内参基因，量化目的基因的表达水平，采用SYBR-Green PCR试剂盒和7500荧光检测系统进行实时荧光定量PCR检测，按照说明书设置反应程序。qPCR 热循环条件如下：95℃30s；95℃10s；60℃30s进行40个循环；95℃15s；60℃60s； 95℃15s；用2^-ΔΔCt方法分析基因表达水平。ΔΔCt＝(Ct靶基因-Ct内参)试验组-(Ct 靶基因-Ct内参对照组)。

6、数据统计

数据均采用平均值±标准差(Means±SD.)表示采用SPSS 16.0软件对数据进行方差齐性分析后进行方差分析。采用单因子方差(One-Way ANOVA)分析多组数值差异。 *P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，差异有统计学意义。

7、试验结果

(1)体重数据

未处理镉之前，根皮素处理组体重高于空白对照组，说明根皮素具有一定的促生长作用。空白组与根皮素+Cd组体重显著高于Cd组，说明根皮素能够缓解镉的生长抑制作用(图2)。

(2)空肠的肠绒毛形态结构的观察、炎症表达情况及病理打分

空白组空肠绒毛结构完整。Cd组固有层内细胞空泡化，肠绒毛整体变粗。根皮素 +Cd组空肠肠绒毛结构完整，未出现明显病理变化。Cd组TNF-α表达水平显著升高，根皮素处理后能够显著下调TNF-α的表达，说明根皮素具有抗Cd诱发的炎症因子作用；病理学打分Cd组得分显著高于另外两组(图3)。综上，根皮素对镉损伤肠黏膜屏障具有一定的修复作用。

(3)肝脏、肾脏形态结构的观察

空白组肾脏组织形态良好；Cd组肾脏肾小管上皮细胞坏死，出现核固缩、核消失；根皮素+Cd组部分视野出现肾小管上皮细胞坏死，视野区内形态正常。Cd组肝脏中央静脉周围淋巴细胞浸润，周围肝细胞坏死(图4)。

(4)空肠隐窝深度变化

Cd隐窝深度显著升高，根皮素处理后隐窝深度显著下降，且空白与根皮素+Cd处理组无显著差异，这说明根皮素能够抑制镉诱发的肠隐窝过度增殖(图5)。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 根皮素的新应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgatggtcca catggcatcc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gggaacagaa ctggcctctc 20

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgtgtatgtg cagcaacccg tagt 24

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggcattgcaa tttggacaga agt 23

Claims

1.根皮素在制备预防或治疗重金属镉相关疾病方面的药物、保健品或补充剂中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述疾病为肠、肝或肾脏损伤相关疾病。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物剂型为片剂、胶囊、口服液、糖浆、滴丸、注射液剂型或冻干粉针剂型中的一种。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述根皮素添加剂量为40mg/kg/每天。

5.根皮素在制备降低空肠组织炎症因子TNF-α的药物中的应用。

6.根皮素在制备降低空肠隐窝深度的药物中的应用。