CN112540071B - 一种基于表面增强拉曼光谱结合分子衍生化技术的地沟油中辣椒碱快速超灵敏检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于食品质量快速检测技术领域，涉及一种基于表面增强拉曼光谱结合分子衍生化技术的地沟油中辣椒碱的快速超灵敏检测方法；步骤为：利用对氨基苯硫酚的巯基与金纳米棒形成配位体系，增强基底与待测物质之间吸附力，使待测物质的拉曼信号极大增强；首先准备模拟地沟油样本，合成表面增强拉曼基底，然后提取油品中的辣椒碱，进行重氮化反应；再对辣椒碱衍生物的表面增强拉曼光谱检测及分析拉曼衍生物的特征峰；通过特征峰强度与辣椒碱浓度构建标准曲线；进而通过测定未知油品中的特征峰强度计算出辣椒碱浓度；本方法操作简单，可以实现对油中辣椒碱的快速准确检测，整个检测过程可在1分钟内完成，进而为地沟油的鉴别提供一种辅助方法。

Description

一种基于表面增强拉曼光谱结合分子衍生化技术的地沟油中 辣椒碱快速超灵敏检测方法
技术领域
本发明属于食品质量快速检测技术领域，具体涉及一种基于表面增强拉曼光谱结合分子衍生化技术对地沟油中辣椒碱的快速超灵敏检测方法。
背景技术
地沟油，主要包括三类，下水道中的油腻漂浮物或者将宾馆、酒楼的剩饭、剩菜(通称泔水)经过简单加工、提炼出的油，下水道收集的油；二是劣质猪肉、猪内脏、猪皮加工以及提炼后产出的油；三是用于油炸食品的油使用次数超过规定要求后，再被重复使用或往其中添加一些新油后重新使用的油。尽管现在流入市场餐馆中的地沟油经过过滤，蒸馏，脱色，除臭等精炼过程后颜色和气味与正常食用油相同，但是仍含有重金属离子，多环芳烃，生物毒素，以及油脂氧化过程中产生的降解产物等对人体健康产生重大威胁的有毒有害物质。食用地沟油后轻者会引起人们腹痛、呕吐等肠胃疾病，严重的会引起贫血，中毒性肝病等。我国每年产生的地沟油总共约有500万吨，虽然政府颁布各项政策以及向回收商提供补贴鼓励废油的收集管理和再利用(例如生物柴油)。但是，为了牟取更大的利益，不法商人将地沟油掺入食用油中流入百姓餐桌。多年来，地沟油在食用油行业已经成为严重的食品安全问题，不仅扰乱了市场，还严重危害到消费者的生命健康。
迄今为止，已经建立了许多不同的方法来检测地沟油，其中包括光谱(近红外，拉曼，太赫兹以及荧光)，核磁共振等非目标物检测法，以及质谱(HPSEC，MALDI-MS，GC/MS，HPLC/MS，HPLC-ESI-MS/MS)等目标物分析法。但是常用的目标物分析法主要针对油中的胆固醇、脂肪酸等内源性成分，重金属离子，多环芳烃，苯并芘，增塑剂，黄曲霉毒素等外源性成分和电导率等物理参数来区分地沟油和正常食用油。但值得注意的是有些指标只能根据国家食品安全标准来决定油品品质的好坏，有些指标的含量的超标可能是在加工运输以及存储引入，并不能作为特异性指标来判断油品是否为地沟油。单纯利用某个指标判定缺乏广泛的适用性，只适于初步判别。因此，要准确判断食用油是否含“地沟油”，必须建立油脂内源性的特异性指标与外源性的排除性指标相结合的多指标体系。辣椒碱是引起辣味的主要化学成分，主要存在于辣椒中，辣椒是餐饮业中使用量较大的调味料，辣椒中含有的辣椒素类物质具有脂溶性强、稳定性好、沸点高等特点，目前的地沟油加工工艺很难完全除去这类物质，而接触过辣椒的餐厨废弃油脂几乎难以避免含有这种成分，因此可将辣椒素类物质作为鉴别餐厨废弃油脂重要的外源性特征指标。
目前固相萃取-HPLC-MS法被国家卫生部认为是检测辣椒素以鉴别地沟油的四种仪器检查方法之一。除HPLC-MS外，还使用了UPLC-MS/MS，免疫亲和层析结合LC-MS/MS，单克隆抗体和电化学传感器等方法检测辣椒素。但是，色谱和质谱分析繁琐，费时，并且无法实现实时，快速的检测。酶联免疫和抗原抗体等方法需要特殊以及昂贵的试剂。综上所述，尽管这些方法能够检测辣椒素，但是快速灵敏以及便捷实惠的检测方法才能满足市场和消费者的需求。
SERS具有灵敏度高、响应快、分子信息丰富、数据采集无破坏等优点，广泛应用于生物分析、环境监测、食品安全等领域，甚至临床诊断和治疗。因此，利用SERS技术测定辣椒碱是一种非常有吸引力的方法。有文献表明辣椒碱这类生物碱拉曼散射截面低，与金属表面的亲和力非常弱，这在很大程度上限制了辣椒碱的SERS检测。但辣椒碱含有酚类结构，可以和重氮化试剂发生偶联反应，生成分子量更大，拉曼活性较高的偶氮染料。因此，亟需建立一种低成本的、快速的、高效的实现地沟油的鉴别方法。
发明内容
本发明旨在克服现有技术中存在的缺陷与不足，如高效液相色谱的操作繁琐以及辣椒碱分子本身存在的拉曼散射截面低等问题。本发明提供了基于表面增强拉曼光谱法结合分子衍生化技术快速超灵敏检测辣椒碱，采用对氨基苯硫酚-金纳米棒体系建立一种低成本的、快速的、高效的实现地沟油的鉴别方法。
具体的，本发明通过以下方案实现：
(1)准备不同辣椒碱浓度的模拟地沟油样本；将辣椒碱标品溶于食用油中，得到模拟地沟油；
(2)合成表面增强拉曼基底：通过种子生长法得到金纳米棒粗溶液，粗溶液经离心、纯水洗涤，聚乙烯吡咯烷酮功能化，离心洗涤后得到固体金纳米棒，将固体分散到乙醇中得到金纳米棒溶液，备用；
(3)分别提取步骤(1)中不同辣椒碱浓度的模拟地沟油样本中的辣椒碱；
(4)将步骤(3)提取出来的辣椒碱分别进行重氮偶合反应，得到不同辣椒碱浓度对应的辣椒碱衍生物溶液；
(5)将步骤(2)中得到金纳米棒溶液分别与步骤(4)中得到的辣椒碱衍生物溶液等比例混合，得到混合液；并检测混合液中辣椒碱衍生物的表面增强拉曼光谱，分析辣椒碱衍生物的SERS特征峰，得到SERS特征峰强度；
(6)利用步骤(5)中得到的辣椒碱衍生物的特征峰强度与步骤(1)中辣椒碱浓度之间的线性关系绘制标准曲线，得到辣椒碱浓度与辣椒碱衍生物特征峰强度之间关系的回归方程；
(7)通过检测未知地沟油样本的SERS特征峰强度，并代入步骤(6)中得到的回归方程，进一步计算出辣椒碱浓度。
其中，步骤(1)中所述不同辣椒碱的浓度范围为10-4-10-11；具体方法为：将10mg克辣椒碱标品溶于正常食用油中，用100ml容量瓶定容，得到含有100mg/L辣椒碱的模拟地沟油，再将其用正常食用油稀释至10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10、10-11M浓度。
其中，步骤(2)中所述固体金纳米棒与乙醇的用量比为20-150mg：0.5ml。
其中，步骤(3)中所述提取辣椒碱的具体方法为：将模拟地沟油加入溶剂中，模拟地沟油与溶剂的体积比为1:2，溶剂为甲醇、乙醇或乙腈的一种；经涡旋搅拌器涡旋后，在频率0～60KHz和功率0～210W的超声条件下30℃恒温辅助萃取10～20分钟，经离心后取上清液，即完成辣椒碱的提取。
优选方法为：取1ml模拟地沟油于10ml离心管中，加入2ml甲醇，使用涡旋搅拌器涡旋10分钟，然后使用频率20KHz和功率90W超声设备在恒温30℃条件下辅助萃取20分钟，最后在10000转、30℃条件下离心10分钟取上清液。
其中，步骤(4)中所述的辣椒碱重氮偶合反应的具体过程为：将一定量的对氨基苯硫酚与浓盐酸溶解于纯水中，得到溶液A；所述对氨基苯硫酚、浓盐酸与溶液A用量关系为(6.25-50)mg：(0.1-0.5)mL：50mL；所述浓盐酸的浓度为12M；然后配置质量浓度为2％-18％的亚硝酸钠水溶液为溶液B，配制质量浓度为2％-18％的碳酸钠水溶液为溶液C；所有溶液均在当天配制，并且存放在4摄氏度冰箱中；
然后进行重氮化反应：取溶液A和溶液B混合，摇晃20～30s后放入冰水混合物中保持60～90s，形成偶氮中间体；然后进行偶合反应：在偶氮中间体中加入溶液C、步骤(3)中的上清液，摇晃20～30s，然后再放入冰水混合物中反应60～90s，得到辣椒碱衍生物溶液；所述溶液A、溶液B、溶液C和上清液的用量比为1ml：1ml：1ml：2ml。
优选方法为：将18.75mg对氨基苯硫酚和0.3ml浓度为12M的盐酸溶解于纯水中，定容成50ml，得到溶液A；然后配置质量浓度为10％的亚硝酸钠水溶液为溶液B，配制质量浓度为8％的碳酸钠水溶液为溶液C；所有溶液均在当天配制，并且存放在4摄氏度冰箱中。
首先进行重氮化反应：取1ml溶液A于10ml离心管中，加入1ml溶液B，摇晃30s后将离心管放入冰水混合物中保持一分钟，形成偶氮中间体；然后进行偶合反应：在偶氮中间体中加入1ml溶液C，再加入步骤(3)中的上清液2ml，摇晃30s，然后放入冰水混合物中反应1分钟，得到辣椒碱衍生物溶液。
其中，步骤(5)中所述获取SERS特征峰强度的具体方法为：将单面抛光的硅片磨砂面用酒精清洗干净，再用超纯水冲洗，然后风干，取2.5ul辣椒碱衍生物溶液与2.5ul金纳米棒溶液混合，孵育1分钟后滴在风干的硅片上，待水分蒸发后用便携式拉曼光谱仪进行检测；测试时激光强度设置为3，积分时间设置为5s，激发光波长设置为785nm；连续测定三次，取3次测定的平均为最终拉曼光谱值；将得到的辣椒碱衍生物的SERS峰与检测系统中存在的干扰物出现的峰进行比较，分析辣椒碱衍生物的特征SERS峰，得到SERS特征峰强度。
其中，步骤(6)中所述构建标准曲线的具体方法为：一种辣椒碱浓度的模拟地沟油样本有其相对应的一个特征峰强度；将步骤(5)中得到的某一特征峰强度与对应的辣椒碱浓度作线性关系分析，得到回归方程以及回归系数。
其中，步骤(7)中所述未知地沟油样本检测的具体方法为：将地沟油样本按照步骤(3)中的方法提取其中的辣椒碱，再按步骤(4)中的方法对提取液进行重氮偶合反应，将得到的辣椒碱衍生物溶液与步骤(2)中得到的金纳米棒溶液等体积混合，然后使用便携式拉曼光谱仪检测特征峰；然后通过特征峰的强度以及步骤(6)中得到的回归方程计算地沟油样本中辣椒碱含量。
为了验证该方法的特异性，进行了特异性测定。
特异性检测的具体方法为：使用相同浓度的双酚A,叔丁基对苯二酚，生育酚分别进行与辣椒碱衍生化相同的衍生化步骤，然后分别测定生成物的紫外可见吸收光谱以及SERS光谱，将测定的结果与辣椒碱衍生物的紫外可见吸收以及SERS光谱进行比较。
与现有技术相比，本发明的有益效果体现如下：
(1)本发明与现有表面增强拉曼光谱法直接检测辣椒碱相比，采用了基于重氮偶合反应的分子衍生化技术使辣椒碱与重氮化试剂反应生成分子量更大的偶氮染料，一方面提高了分子与拉曼增强基底之间的接触面积，另一方面形成的偶氮分子相对于辣椒碱具有更高的拉曼散射截面以及拉曼活性，更容易检测到物质的拉曼特征峰。本发明与同时用分子衍生化技术结合表面增强拉曼光谱检测辣椒碱相比，采用了拉曼活性高的探针分子对氨基苯硫酚(4-ATP),4-ATP中含有的-SH键能够与本发明中采用的拉曼增强基底金纳米棒形成稳定的Au-S,从而增大待测分子与基底之间的亲和力，更容易使得待测分子的拉曼峰得到放大，使得检测范围更宽，检测限更低。
(2)本发明与现有的辣椒碱检测方法相比，检测范围更宽，检测限更低，灵敏度更高。另外分析时间短，1min即可获得所需的拉曼光谱数据，对检测人员无特殊要求，且用于实现该方法的检测装置相对于高效液相色谱等装置来说成本低，装置轻巧，便于携带，适合用于现场检测。
附图说明
图1为金纳米棒表征图。
图2为重氮偶合反应示意图。
图3是由辣椒碱衍生化得到的辣椒碱衍生物的SERS特征峰图。
图4为辣椒碱衍生化得到的辣椒碱衍生物的SERS光谱与经DFT计算的理论拉曼光谱。
图5为模拟地沟油中10-4-10-10M浓度辣椒碱衍生化后得到的辣椒碱衍生物SERS光谱。
图6为1114与1392cm-1处SERS特征峰强度与模拟地沟油中辣椒碱浓度建立的回归曲线。
图7为10-5M辣椒碱、双酚A，叔丁基对苯二酚以及生育酚加入重氮偶合试剂后的SERS光谱。
图8为10-5M辣椒碱、双酚A，叔丁基对苯二酚以及生育酚加入重氮偶合试剂后的紫外可见吸收光谱。
具体实施方式
下面通过具体的实例并结合附图对本发明进一步阐述，但并不限制本发明。
实施例1：
(1)准备模拟地沟油样本：本发明是通过检测地沟油中重要的外源性物质辣椒碱从而对地沟油进行初步鉴别。虽然地沟油的鉴别需要将内源性指标与外源性特异性指标结合，但是辣椒碱作为重要的外源性物质可以在地沟油鉴别中起到重要辅助作用；模拟地沟油样本配制的浓度是根据以甲醇为溶液，辣椒碱标品的检测限而定的，通过本方法得到辣椒碱甲醇标准液的检测限是10-11；因此配制的实际模拟地沟油样本的浓度范围为10-4-10-11。
(2)合成拉曼增强基底：本技术采用金纳米棒作为拉曼增强基底，研究表明，金纳米棒比金纳米球能达到更强的增强效果。
合成方法为：首先合成金纳米粒子种子液，用于后期金纳米棒的生长。将0.25ml浓度为0.01M的HAuCl4超纯水溶液加入到1ml浓度为0.1M的CTAB(十二烷基溴化铵)溶液中，然后快速加入新配制的冷的0.6ml浓度为0.01M的NaBH4(硼氢化钠)溶液，在室温条件下以650转/分钟的速度用磁力搅拌器快速搅拌老化30分钟。将2.8克CTAB和0.4936克油酸钠加入100ml温度为50摄氏度纯水中，用玻璃棒搅拌，待溶液冷却到30摄氏度后加入7.2ml浓度为0.04M的硝酸银溶液，650转速度搅拌15分钟，随后将100ml浓度为0.001M的HAuCl4缓慢加入到上述溶液中，搅拌1.5小时，得到生长液。最后在生长液中加入0.84ml浓度为37％的浓盐酸以及0.32ml种子液和0.5ml浓度为64mM的抗坏血酸，放入30摄氏度水浴中静置48小时。将紫红色的金纳米棒溶液离心，用纯水洗净，然后分散到10ml浓度为5mg/ml的聚乙烯吡咯烷酮乙醇溶液中进行表面功能化，在搅拌1小时后，将溶液以7500转/分离心除去多余的聚乙烯吡咯烷酮，然后将离心得到的固体金纳米棒加入0.5ml乙醇再分散，备用。合成后的金纳米棒用紫外可见吸收光谱(UV-vis)以及透射电镜进行表征。如图1(A)结果显示合成的金纳米棒具有两个特征消光峰，其中524nm处的消光峰属于TSPR，而905nm处的消光峰属于LSPR，符合金纳米棒的一维各向异性。如图1(B)TEM结果显示金纳米棒形貌较为均匀，长度多为50nm，长径比(AR,长度、直径)多集中在2.5-3.5nm。以该金纳米棒作为增强基底，以对氨基苯硫酚作为探针分子，测试基底的性能，可检测到的对氨基苯硫酚的最低浓度为10-7M，说明金纳米棒具有较高的增强效果。
(3)模拟地沟油预处理，提取油品中的辣椒碱：本研究为了提高油中地沟油的提取率，分别采取甲醇、乙醇、乙腈作为溶剂提取辣椒碱，料液比均为1:2。并使用0、20、40、60KHz以及0、60、90、120、150、180、210W功率多模式三频超声设备进行辅助萃取。最终经结果对比可知，以甲醇为溶剂，超声频率20KHz以及功率为90W时萃取效果最好，提取率达到72％。
(4)基于步骤(3)将提取出来的辣椒碱进行重氮耦合反应：重氮偶合反应示意图如图2所示，首先是重氮化反应，本技术采用拉曼探针分子4-ATP作为偶氮反应底物，其中的伯胺基可以通过质子转移在低温以及重氮化试剂亚硝酸钠(NaNO2)以及盐酸(HCl)存在下转化为-N2+，从而形成偶氮中间体。紧接着在偶氮中间体中加入碳酸钠除去过量的亚硝酸钠，避免偶氮盐分解，另外形成弱碱性环境诱导偶氮中间体和酚类化合物邻位发生耦合反应，生成具有强SERS信号的偶氮衍生物。在重氮偶合反应过程中，各试剂的浓度对最后生成的偶氮含量及其重要。4-ATP在偶氮反应中提供伯氨基，并且其中的-SH在后期拉曼检测中与形成Au-S，增大偶氮染料分子与增强基底之间的结合力。盐酸的含量不足会导致反应速率降低，生成偶氮中间体的质量下降，从而影响偶联反应和最终的实验结果。适当过量的酸可以确保重氮盐的稳定性，但大量过量的酸存在会导致副产物的生成，导致SERS光谱强度的降低。同样过量的亚硝酸钠会导致衍生物分解。过量的碳酸钠会形成重碱性环境导致重氮盐和碱发生副反应。在对0、6.25、12.5、18.75、31.25、50mg 4-ATP分别进行重氮化反应过后发现加入18.75mg4-ATP时的生成物在472nm处的紫外吸收峰最高；在对0、100、200、300、400、500ul盐酸分别进行重氮化反应过后发现300ul时的生成物在472nm处的紫外吸收峰最高；在对0、2％、5％、8％、10％、12％、15％、18％亚硝酸钠分别进行重氮化反应过后发现10％时生成物在472nm处的紫外吸收峰最高，相同浓度梯度的碳酸钠在8％时的生成物在472nm处的紫外吸收峰最高。因此，本技术中涉及到的重氮偶合反应最终试剂量为18.75mg对氨基苯硫酚(4-ATP)，300ul盐酸，10％亚硝酸钠以及8％碳酸钠。
(5)基于步骤(2)和步骤(4)进行辣椒碱衍生物的表面增强拉曼光谱检测：本技术采用的是海洋光学ACCUMAN(SR-510Pro)便携式科研级拉曼光谱仪，，光谱范围最大可覆盖170-3900cm-1，光谱分辨率可达4cm-1。如图3所示，通过测定金纳米棒、甲醇、对氨基苯硫酚、偶氮中间体以及加了辣椒碱以后的SERS光谱，得到以辣椒碱衍生化得到的偶氮染料的拉曼特征峰分别出现在555、854、1022、1114、1178、1392、1420、1477cm-1处。为了更好的了解辣椒碱衍生物的结构，使用DFT计算了辣椒碱衍生物的理论拉曼峰。结果显示理论拉曼峰与SERS能够较好地吻合(见图4)，峰的归属情况见下表1，其中1392cm-1处特征峰是酚结构中的δ(CH)和δ(OH)振动以及苯环上的C–C的摇摆振动导致的。另外1420cm-1处的特征峰是由反式异构体中的ν(N＝N)振动引起的，清楚地证明了偶氮染料中(N＝N)的反式异构体的存在。
(6)绘制辣椒碱检测标准曲线：本发明首先通过检测以甲醇为背景的辣椒碱的浓度来确定本方法的灵敏度以及检测范围，进而预估本方法检测地沟油中辣椒碱的检测范围，便于配制不同辣椒碱浓度的地沟油。通过对步骤(5)中得到的特征峰的分析，在辣椒碱甲醇溶液中，1114与1392cm-1处辣椒碱衍生物SERS特征峰的强度与辣椒碱浓度在10-4-10- 11M处存在良好的线性关系，将两者强度与辣椒碱浓度作标准曲线，回归方程分别y＝161.47x+4127.14,y＝160.224x+4102.81，R2分别为0.992与0.9953。在模拟地沟油中，1114与1392cm-1处SERS特征峰的强度与辣椒碱浓度在10-4-10-10M处存在良好的线性关系(见图5)，将两者强度与模拟地沟油中辣椒碱浓度作标准曲线，回归方程分别为y＝136.807x+3888.395，y＝143.49x+4066.138,R2分别为0.9802与0.9926(见图6)，检测限达到10-10M。虽然模拟地沟油中的辣椒碱经过甲醇提取，但是由于溶解在甲醇中的其他油中的杂质以及甲醇对于油中辣椒碱的不完全提取，使得该方法检测地沟油中辣椒碱得到的检测范围要低于甲醇中辣椒碱的检测。
(7)地沟油样本检测：将辣椒碱浓度为10-3、10-7、10-8、10-9、10-10M的模拟地沟油样本以步骤(3)预处理后，以步骤(4)相同的过程发生衍生化，然后检测SERS光谱，将1392cm-1峰处的强度带入1392cm-1处特征峰的标准曲线y＝143.49x+4066.138中计算实际检测浓度，得到检测结果与实际值进行比较，比较结果如表2所示；表2显示该方法回收率为78％-103％，说明本发明的检测方法可靠。
为了验证该技术对于辣椒碱的检测特异性，以双酚A，生育酚以及叔丁基对苯二酚作为干扰物。双酚A是塑料制品中的主要成分，油、酒等物质如果长期储存在塑料容器中难免会有部分双酚A溶解其中。叔丁基对苯二酚以及生育酚是常用的油品抗氧化剂。将相同浓度的的双酚A,叔丁基对苯二酚以及生育酚以上述步骤(4)相同的过程进行衍生化，然后测定紫外吸收光谱以及SERS光谱。结果显示双酚A和叔丁基对苯二酚以及生育酚都可以发生重氮偶合反应。但是辣椒碱可以根据特征峰(见图7)从干扰物中识别出来。另外紫外可见吸收光谱中也同样显示只有辣椒碱在472nm处有吸收(见图8)，进一步证明该技术对辣椒碱检测的特异性。此外，由于叔丁基对苯二酚结构中存在两个酚羟基，产生的空间位阻使其电子亲和力减弱，偶联度降低。另外，由于酚羟基的邻位缺乏，偶氮中间体与生育酚中较弱的杂环上的氢原子反应生成少量的偶氮化合物，从而导致生育酚衍生物较弱的拉曼光谱峰和紫外可见吸收峰。
表1辣椒碱衍生化产生的偶氮染料的DFT计算拉曼峰与SERS峰归属
Figure BDA0002769774860000091
Figure BDA0002769774860000101
表2模拟地沟油中辣椒碱的回收率
Figure BDA0002769774860000102
说明：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。

Claims (10)

1.一种基于表面增强拉曼光谱结合分子衍生化技术的地沟油中辣椒碱快速超灵敏检测方法，其特征在于，步骤如下：
(1)准备不同辣椒碱浓度的模拟地沟油样本；将辣椒碱标品溶于食用油中，得到模拟地沟油；
(2)合成表面增强拉曼基底：通过种子生长法得到金纳米棒粗溶液，粗溶液经离心、纯水洗涤，聚乙烯吡咯烷酮功能化，离心洗涤后得到固体金纳米棒，将固体分散到乙醇中得到金纳米棒溶液，备用；
(3)分别提取步骤(1)中不同辣椒碱浓度的模拟地沟油样本中的辣椒碱，得到含有辣椒碱的上清液；
(4)将步骤(3)提取出来的辣椒碱分别进行重氮偶合反应，得到不同辣椒碱浓度对应的辣椒碱衍生物溶液；
所述的辣椒碱重氮偶合反应的具体过程为：将一定量的对氨基苯硫酚与浓盐酸溶解于纯水中，得到溶液A；所述对氨基苯硫酚、浓盐酸与溶液A用量关系为(6.25-50)mg：(0.1-0.5)mL：50mL；所述浓盐酸的浓度为12M；然后配置质量浓度为2％-18％的亚硝酸钠水溶液为溶液B，配制质量浓度为2％-18％的碳酸钠水溶液为溶液C；
重氮化反应：取溶液A和溶液B混合，摇晃20～30s后放入冰水混合物中保持60～90s，形成偶氮中间体；然后进行偶合反应：在偶氮中间体中加入溶液C、步骤(3)中的上清液，摇晃20～30s，然后再放入冰水混合物中反应60～90s，得到辣椒碱衍生物溶液；
(5)将步骤(2)中得到金纳米棒溶液分别与步骤(4)中得到的辣椒碱衍生物溶液等比例混合，得到混合液；并检测混合液中辣椒碱衍生物的表面增强拉曼光谱，分析辣椒碱衍生物的SERS特征峰，得到SERS特征峰强度；
(6)利用步骤(5)中得到的辣椒碱衍生物的特征峰强度与步骤(1)中辣椒碱浓度之间的线性关系绘制标准曲线，得到辣椒碱浓度与辣椒碱衍生物特征峰强度之间关系的回归方程；
(7)通过检测未知地沟油样本的SERS特征峰强度，并代入步骤(6)中得到的回归方程，进一步计算出辣椒碱浓度。
2.根据权利要求1所述的基于表面增强拉曼光谱结合分子衍生化技术的地沟油中辣椒碱快速超灵敏检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述不同辣椒碱的浓度范围为10-4-10-11；具体方法为：将10mg克辣椒碱标品溶于正常食用油中，用100ml容量瓶定容，得到含有100mg/L辣椒碱的模拟地沟油，再将其用玉米油分别稀释至10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10、10-11M浓度。
3.根据权利要求1所述的基于表面增强拉曼光谱结合分子衍生化技术的地沟油中辣椒碱快速超灵敏检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述固体金纳米棒与乙醇用量比为20-150mg：0.5ml。
4.根据权利要求1所述的基于表面增强拉曼光谱结合分子衍生化技术的地沟油中辣椒碱快速超灵敏检测方法，其特征在于，步骤(3)中提取辣椒碱的具体方法为：将模拟地沟油加入溶剂中，模拟地沟油与溶剂的体积比为1:2，溶剂为甲醇、乙醇或乙腈的一种；经涡旋搅拌器涡旋后，在频率0～60KHz和功率0～210W的超声条件下30℃恒温辅助萃取10～20分钟，经离心后取上清液，即完成辣椒碱的提取。
5.根据权利要求4所述的基于表面增强拉曼光谱结合分子衍生化技术的地沟油中辣椒碱快速超灵敏检测方法，其特征在于，取1ml模拟地沟油于10ml离心管中，加入2ml甲醇，使用涡旋搅拌器涡旋10分钟，然后使用频率20KHz和功率90W超声设备在恒温30度条件下辅助萃取20分钟，最后在10000转、30度条件下离心10分钟取上清液。
6.根据权利要求1所述的基于表面增强拉曼光谱结合分子衍生化技术的地沟油中辣椒碱快速超灵敏检测方法，其特征在于，步骤(4)中所有溶液均在当天配制，并且存放在4摄氏度冰箱中；所述溶液A、溶液B、溶液C和上清液的用量比为1ml：1ml：1ml：2ml。
7.根据权利要求1所述的基于表面增强拉曼光谱结合分子衍生化技术的地沟油中辣椒碱快速超灵敏检测方法，其特征在于，将18.75mg对氨基苯硫酚和0.3ml浓度为12M的盐酸溶解于纯水中，定容成50ml，得到溶液A；然后配置质量浓度为10％的亚硝酸钠水溶液为溶液B，配制质量浓度为8％的碳酸钠水溶液为溶液C；所有溶液均在当天配制，并且存放在4摄氏度冰箱中;
首先进行重氮化反应：取1ml溶液A于10ml离心管中，加入1ml溶液B，摇晃30s后将离心管放入冰水混合物中保持一分钟，形成偶氮中间体；然后进行偶合反应：在偶氮中间体中加入1ml溶液C，再加入步骤(3)中的上清液2ml，摇晃30s，然后放入冰水混合物中反应1分钟，得到辣椒碱衍生物溶液。
8.根据权利要求1所述的基于表面增强拉曼光谱结合分子衍生化技术的地沟油中辣椒碱快速超灵敏检测方法，其特征在于，步骤(5)中获取SERS特征峰强度的具体方法为：将单面抛光的硅片磨砂面用酒精清洗干净，再用超纯水冲洗，然后风干，取2.5ul辣椒碱衍生物溶液与2.5ul金纳米棒溶液混合，孵育1分钟后滴在风干的硅片上，待水分蒸发后用便携式拉曼光谱仪进行检测；测试时激光强度设置为3，积分时间设置为5s，激发光波长设置为785nm；连续测定三次，取3次测定的平均为最终拉曼光谱值；将得到的辣椒碱衍生物的SERS峰与检测系统中存在的干扰物出现的峰进行比较，分析辣椒碱衍生物的特征SERS峰，得到SERS特征峰强度。
9.根据权利要求1所述的基于表面增强拉曼光谱结合分子衍生化技术的地沟油中辣椒碱快速超灵敏检测方法，其特征在于，步骤(6)中构建标准曲线的具体方法为：一种辣椒碱浓度的模拟地沟油样本有其相对应的一个特征峰强度；将步骤(5)中得到的某一特征峰强度与对应的辣椒碱浓度作线性关系分析，得到回归方程以及回归系数。
10.根据权利要求1所述的基于表面增强拉曼光谱结合分子衍生化技术的地沟油中辣椒碱快速超灵敏检测方法，其特征在于，步骤(7)中所述未知地沟油样本检测的具体方法为：将地沟油样本按照步骤(3)中的方法提取其中的辣椒碱，再按步骤(4)中的方法对提取液进行重氮偶合反应，将得到的辣椒碱衍生物溶液与步骤(2)中得到的金纳米棒溶液等体积混合，然后使用便携式拉曼光谱仪检测特征峰；然后通过特征峰的强度以及步骤(6)中得到的回归方程计算地沟油样本中辣椒碱含量。
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