CN112533618A - 用于生成内胚层谱系细胞和β细胞的方法和组合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

在本公开的各个方面中提供用于生成内胚层谱系细胞和β细胞的方法和组合物及其用途。

Description

用于生成内胚层谱系细胞和β细胞的方法和组合物及其用途
相关申请的交叉参考
本申请要求2018年5月16日提交的美国临时申请序列号62/672300、2018年5月17日提交的美国临时申请序列号62/672695、2019年1月31日提交的美国临时申请序列号62/799252以及2019年1月8日提交的美国临时申请序列号62/789724的优先权，所述临时申请通过参考以其全部结合至本文中。
关于联邦政府赞助的研究或开发的声明
本发明是在国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的批准号为DK114233的政府支持下完成的。政府拥有本发明的某些权利。
通过参考结合的材料
作为本公开一部分的序列表包括计算机可读形式，其包含本发明的核苷酸和/或氨基酸序列。序列表的主题通过参考以其全部结合至本文中。
发明领域
本公开总体上涉及细胞疗法和制备β样细胞的方法。
发明概述
在本公开的各个方面中提供生成内胚层谱系细胞的方法和组合物及其用途。
本公开的一个方面提供一种以悬浮生成产生胰岛素的β细胞的方法，其包括：提供干细胞；提供无血清培养基；使干细胞与TGFβ/激活素激动剂或糖原合酶激酶3 (GSK)抑制剂或WNT激动剂接触一定量的足以形成定形内胚层细胞的时间；使定形内胚层细胞与FGFR2b激动剂接触一定量的足以形成原肠管细胞的时间；使原肠管细胞与RAR激动剂和任选地rho激酶抑制剂、平滑化拮抗剂、FGFR2b激动剂、蛋白激酶C激活剂或BMP 1型受体抑制剂接触一定量的足以形成早期胰腺祖细胞的时间；将早期胰腺祖细胞温育至少约3天，并任选地使早期胰腺祖细胞与rho激酶抑制剂、TGF-β/激活素激动剂、平滑化拮抗剂、FGFR2b激动剂或RAR激动剂接触一定量的足以形成胰腺祖细胞的时间；使胰腺祖细胞与Alk5抑制剂、γ分泌酶抑制剂、SANT1、Erbb1 (EGFR)或Erbb4激动剂或RAR激动剂接触一定量的足以形成内胚层细胞的时间；或在约24小时内调整细胞簇的大小，并使内胚层细胞在无血清培养基中成熟一定量的足以形成β细胞的时间。
在一些实施方案中，TGFβ/激活素激动剂为激活素A；糖原合酶激酶3 (GSK)抑制剂或WNT激动剂为CHIR；FGFR2b激动剂为KGF；平滑化拮抗剂为SANT-1；RAR激动剂为视黄酸(RA)；蛋白激酶C激活剂为PdBU；BMP 1型受体抑制剂为LDN；rho激酶抑制剂为Y27632；Alk5抑制剂为Alk5i；或Erbb4激动剂为β细胞素(betacellulin)。
在一些实施方案中，无血清培养基包含选自以下的一种或多种：MCDB131、葡萄糖、NaHCO3、BSA、ITS-X、Glutamax、维生素C、青霉素-链霉素、CMRL 10666、FBS、肝素、NEAA、微量元素A、微量元素B或ZnSO4。
在一些实施方案中，所述方法包括减小内胚层的簇大小，其中调整细胞簇的大小包括将簇分开并在成熟为β细胞之前重新聚集。
在一些实施方案中，胰腺祖细胞不与血清、T3、N-乙酰半胱氨酸、Trolox和R428中的任何一种或多种一起温育。
在一些实施方案中，足以形成定形内胚层细胞、原肠管细胞、早期胰腺祖细胞、胰腺祖细胞、内胚层细胞或β细胞的时间量在约1天-约8天之间。
在一些实施方案中，所述方法不包括在内胚层细胞成熟为β细胞中使用TGFβR1抑制剂(例如Alk5抑制剂II)。
在一些实施方案中，TGFβR1抑制剂的不存在允许进行TGFβ信号传导并促进从内胚层细胞功能性成熟为β细胞。
在一些实施方案中，TGFβR1抑制剂的不存在允许响应增加的葡萄糖水平或增加的促分泌素水平而增加来自细胞的胰岛素分泌。
在一些实施方案中，所述方法在内胚层细胞成熟为β细胞中不包含T3、N-乙酰半胱氨酸、Trolox或R428。
在一些实施方案中，β细胞为表达至少一种β细胞标志物的SC-β细胞，并经历包括第一和第二时相动态胰岛素分泌的葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)；与尸体人类胰岛相比较，β细胞以基本上相似的量分泌胰岛素；或者β细胞保持功能性达1天或更多天。
在一些实施方案中，干细胞为HUES8胚胎细胞、SEVA 1016或SEVA 1019。
本公开的另一方面提供用于治疗需要它的受试者的方法，所述方法包括：给予受试者治疗有效量的产生胰岛素的β细胞，其中β细胞根据以上生成。
本公开的另一方面提供一种将干细胞分化为内胚层谱系细胞的方法，其包括：提供干细胞；提供无血清培养基；使干细胞与TGFβ/激活素激动剂和糖原合酶激酶3 (GSK)抑制剂或WNT激动剂接触一定量的足以形成定形内胚层细胞的时间；使定形内胚层细胞与FGFR2b激动剂接触一定量的足以形成原肠管细胞的时间；使原肠管细胞与RAR激动剂和任选地平滑化拮抗剂/音猬因子抑制剂、FGF家族成员/FGFR2b激动剂、蛋白激酶3激活剂、BMP抑制剂或rho激酶抑制剂接触，任选地持续一定量的足以形成早期胰腺祖细胞的时间；将早期胰腺祖细胞温育至少约3天，并任选地包括使早期胰腺祖细胞与平滑化拮抗剂、FGFR2b激动剂、RAR激动剂、rho激酶抑制剂或TGF-β/激活素激动剂接触一定量的足以形成胰腺祖细胞的时间；使胰腺祖细胞与Alk5抑制剂/TGF-β受体抑制剂、甲状腺激素和γ分泌酶抑制剂和任选地SANT1、Erbb1 (EGFR)或Erbb4激动剂/EGF家族成员或RAR激动剂接触一定量的足以形成内胚层细胞或内分泌细胞的时间；任选地使内胚层细胞或内分泌细胞与Alk5抑制剂/TGF-β受体抑制剂或甲状腺激素接触一定量的足以形成内胚层谱系细胞(例如胰腺细胞、肝细胞或β细胞/SC-β细胞)的时间；或一次和在一定量的足以提高分化效率的时间内将细胞平板接种在硬质或软质基底上或向细胞引入细胞骨架调节剂，任选地细胞骨架调节剂包括拉春库林(latrunculin) A、拉春库林B、诺考达唑、细胞松弛素D、jasplakinolide、布雷他汀(blebbistatin)、y-27632、y-15、gdc -0994或整联蛋白调节剂。
本公开的另一方面提供一种将干细胞分化为内胚层谱系细胞的方法，其包括：将干细胞在包含TGFβ/激活素激动剂、激活素A、WNT激动剂和CHIR的培养基中温育约24小时，然后将细胞在包含激活素A且没有CHIR的培养基中温育约3天，产生第1阶段定形内胚层细胞；生成外分泌胰腺细胞，其包括在包含FGFR2b激动剂(KGF)的培养基中将第1阶段定形内胚层细胞温育约2天，产生第2阶段细胞；在包含FGFR2b激动剂(KGF)、BMP抑制剂(LDN193189)、TPPB、RAR激动剂(视黄酸(RA))和平滑化拮抗剂(SANT1)的培养基中将第2阶段细胞温育2天，产生第3阶段细胞；在包含FGFR2b激动剂(KGF)、BMP抑制剂(LDN193189)、TPPB、RAR激动剂(视黄酸)和平滑化拮抗剂(SANT1)的培养基中将第3阶段细胞温育约4天，产生第4阶段细胞，其中在温育的约前24小时中添加拉春库林A或在温育的整个约4天中添加诺考达唑；和在包含bFGF的培养基中将第4阶段细胞温育约6天，其中在这6天的最后两天期间添加烟酰胺；生成肠细胞，其包括在包含WNT激动剂(CHIR)和FGF4的培养基中将第1阶段定形内胚层细胞温育约4天，其中在温育的约前24小时中添加拉春库林A或在温育的整个约4天中添加诺考达唑，产生第2阶段细胞；在包含R-spondin1和BMP抑制剂(LDN193189)的培养基中将第2阶段细胞温育约7天；或生成肝细胞，其包括在包含FGFR2b激动剂(KGF)的培养基中将第1阶段定形内胚层细胞温育约2天，产生第3阶段细胞；在包含BMP4的培养基中将第3阶段细胞温育约4天，其中在温育的约前24小时中添加RAR激动剂(视黄酸)和拉春库林A或诺考达唑，产生第4阶段细胞；和在包含OSM、HGF和地塞米松的培养基中将第4阶段细胞温育约5天。
在一些实施方案中，所述方法包括在形成内胚层谱系细胞之前调整簇的大小。
在一些实施方案中，TGFβ/激活素激动剂为激活素A；糖原合酶激酶3 (GSK)抑制剂或WNT激动剂为CHIR；FGFR2b激动剂为KGF；平滑化拮抗剂或音猬因子抑制剂为SANT-1；FGF家族成员/FGFR2b激动剂为KGF；RAR激动剂为RA；蛋白激酶3激活剂为PDBU；BMP抑制剂为LDN；rho激酶抑制剂为Y27632；Alk5抑制剂/TGF-β受体抑制剂为Alk5i；甲状腺激素为T3；γ分泌酶抑制剂为XXI；Erbb1 (EGFR)或Erbb4激动剂/EGF家族成员为β细胞素；或RAR激动剂为RA。
在一些实施方案中，无血清培养基包含选自以下的一种或多种：MCDB131、葡萄糖、NaHCO3、BSA、ITS-X、Glutamax、维生素C、青霉素-链霉素、CMRL 10666、FBS、肝素、NEAA、微量元素A、微量元素B或ZnSO4。
在一些实施方案中，足以形成定形内胚层细胞、原肠管细胞、早期胰腺祖细胞、胰腺祖细胞、内胚层细胞或β细胞的时间量在约1天-约15天之间。
在一些实施方案中，将早期胰腺祖细胞平板接种或用s1p (鞘氨醇-1-磷酸) YAP激活(例如在约第4阶段期间)，以增加SC-β细胞诱导，防止不期望的过早内分泌定型，或允许转录因子表达的正确时机。
在一些实施方案中，将拉春库林A、拉春库林B或诺考达唑(例如在整个第4阶段、在第5阶段或大约第7天)引入到胰腺祖细胞，导致增强的平板接种细胞的内分泌诱导和增强的随后生成的β细胞的葡萄糖刺激的胰岛素分泌。
在一些实施方案中，将拉春库林A或拉春库林B引入到胰腺祖细胞，生成内胚层谱系细胞，比如肝细胞，或者拉春库林A或拉春库林B破坏细胞骨架肌动蛋白(例如第5阶段之前引入拉春库林A或拉春库林B产生肝细胞，或者在整个第5阶段引入拉春库林A或拉春库林B导致β细胞数量增加)。
在一些实施方案中，将YAP抑制剂(例如维替泊芬)引入到胰腺祖细胞。
在一些实施方案中，将拉春库林A或拉春库林B引入到胰腺祖细胞，从而增加葡萄糖介导的胰岛素分泌或胰岛素基因表达。
在一些实施方案中，内胚层谱系细胞选自β细胞、肝细胞或胰腺细胞。
在一些实施方案中，所述方法增强β细胞的诱导和功能。
在一些实施方案中，所述方法包括以平面(贴壁)培养进行培养。
在一些实施方案中，所述方法包括将细胞平板接种在硬质基底上，其中与在软质基底上或悬浮培养中的NKX6.1表达相比较，在硬质基底上的NKX6.1表达增加。
在一些实施方案中，平面(贴壁)细胞被分散并重新聚集或与随着外部线索(例如温度)变化疏水性的表面组合，允许细胞脱离并保持细胞排列、细胞外基质蛋白和胰岛素分泌。
在一些实施方案中，β细胞为SC-β细胞。
在一些实施方案中，干细胞选自HUES8和1016SeVA。
本公开的另一方面提供一种筛选的方法，其包括：提供从任一个以上方面或实施方案生成的细胞；或将化合物或组合物引入到细胞。
本公开的另一方面提供一种治疗需要它的受试者的方法，其包括：给予受试者治疗有效量的内胚层谱系细胞，其中细胞根据任一个以上方面或实施方案生成。
在一些实施方案中，受试者患有糖尿病或将细胞移植到受试者中。
本公开的另一方面提供一种通过任一个以上方面或实施方案的方法生成的细胞。
本公开的另一方面提供用于生成的方法或通过任一个以上方面或实施方案的方法生成的细胞，其中内胚层谱系细胞、β细胞或中间细胞表达CDX2、CHGA、FOXA2、SOX17、PDX1、NKX6-1、NGN3、NEUROG3、NEUROD1、NXK2-2、ISL1、KRT7、KRT19、PRSS1、PRSS2或INS。
其他目的和特征将在下文中部分地显而易见和部分地指出。
附图描述
本领域的技术人员将理解，以下描述的附图仅出于说明的目的。附图不旨在以任何方式限制本教导的范围。
图1A-图1F显示SC-β细胞簇经历葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)。(A) 使用的分化程序概述。(B)在相衬下未染色(上图)或在明亮视野下成像的用双硫腙(DTZ)染色(下图)的全部第6阶段簇的图像。(C)对胰高血糖素(GCG)、NKX6-1或PDX1染成红色，C-肽(CP)染成绿色，和用核标志物4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色的切片的石蜡包埋的第6阶段簇的免疫染色。(D) 用来自本研究的方案生成的第6阶段细胞(n = 16)、用Pagliuca方案生成的第6阶段细胞(n = 12)和尸体人类胰岛(n = 12)在静态葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)测定中的人类的胰岛素分泌。通过单侧配对t检验** P <0.01，**** P <0.001。通过单因素ANOVA Dunnett多重比较检验与本研究相比较#P <0.05，#### P <0.0001。(E) 对来自本研究的第6阶段细胞进行2、5.6、11.1或20 mM葡萄糖(n = 4)的静态GSIS测定。通过单因素ANOVA Dunnett多重比较检验与2 mM葡萄糖相比较* P <0.05，*** P <0.001，不显著(ns)。(F) 用来自本研究的方案生成的第6阶段细胞(n = 12)、用Pagliuca方案生成的第6阶段细胞(n = 4)和尸体人类胰岛(n = 12)在灌注GSIS测定中的动态人类胰岛素分泌。用低葡萄糖(2 mM)灌注细胞，除非当指示高葡萄糖(20 mM)之外。Act A，激活素A；CHIR，CHIR9901；KGF，角质形成细胞生长因子；RA，视黄酸；Y，Y27632；LDN，LDN193189；PdbU，佛波醇12,13-二丁酸酯；T3，三碘甲腺原氨酸；Alk5i，II型Alk5抑制剂；ESFM，富集无血清培养基(EnrichedSerum-Free Medium)。显示的所有第6阶段数据均用HUES8进行。
图2A-图2D显示SC-β细胞表达β细胞和胰岛标志物。(A) 单细胞分散，平板接种过夜，并对嗜铬粒蛋白A (CHGA)、GCG、生长抑素(SST)、NEUROD1、NKX6-1、PDX1或PAX6染成红色，C-肽(CP)染成绿色，和用DAPI染色的第6阶段簇的免疫染色。(B) 单细胞分散并对指示的标志物免疫染色的第6阶段簇的代表性流式细胞术点状图。(C) 盒须图，其量化表达指示的标志物的细胞比例。每个点为一个独立实验。(D) 用来自本研究的方案生成的第6阶段细胞(n = 8)、用Pagliuca方案生成的第6阶段细胞(n = 5)和尸体人类胰岛(n = 7)的实时PCR分析。通过单因素ANOVA Dunnett多重比较检验与本研究相比较ns，* P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001，**** P <0.0001。显示的所有第6阶段数据均用HUES8进行。
图3A-图3H显示SC-β细胞大大地提高葡萄糖耐量，并在移植之后的数月内具有持续功能。(A) 注射2 g/kg葡萄糖之后0和60分钟，禁食过夜的移植之后6个月的非经STZ处理的小鼠组(n = 3)的血清人类胰岛素。通过单侧配对t检验** P <0.01。(B) 移植之后6个月非经STZ处理的小鼠的切片的石蜡包埋的外植肾脏针对C-肽用DAPI (左)或C-肽和PDX1用DAPI (右)的免疫染色。手动绘制白色虚线以显示肾脏和移植物之间的边界(*)。(C) 手术之后10 d对于经STZ处理的未接受移植的小鼠组(STZ，无Txp；n = 6)、未经处理的未接受移植的小鼠(无STZ，无Txp；n = 5)和经STZ处理的接受移植的小鼠(STZ，Txp；n = 6)的葡萄糖耐量测试(GTT)。通过双因素ANOVA Tukey多重比较* P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001，**** P <0.0001。(D) (C)中所示数据的曲线下面积(AUC)计算。通过单因素ANOVATukey多重比较检验** P <0.01。(E) 注射2 g/kg葡萄糖之后0和60分钟，禁食过夜的STZ，Txp小鼠(n = 5)的血清人类胰岛素。通过单侧配对t检验** P <0.01。(F) 手术之后10 wk对于STZ，无Txp小鼠(n = 6)；无STZ，无Txp小鼠(n = 4)；和STZ，Txp小鼠(n = 5)的GTT。通过双因素ANOVA Tukey多重比较检验** P <0.01，*** P <0.001，**** P <0.0001。(G) (d)中所示数据的AUC计算。通过单因素ANOVA Tukey多重比较检验**P <0.01。(H) 注射2 g/kg葡萄糖之后0和60分钟，禁食过夜的STZ，Txp小鼠(n = 5)的血清人类胰岛素。通过单侧配对t检验** P <0.01。显示的所有数据均用HUES8进行。小图(A-B)为SCID/Beige和小图(C-H)为NOD/SCID小鼠。
图4A-图4C显示SC-β细胞在体外具有瞬时动态功能，对多种刺激作出反应，并在高葡萄糖下维持第二时相胰岛素分泌。(A) 第6阶段的细胞在灌注GSIS测定中5、9、15、22、26和35 d的动态人类胰岛素分泌。每个单个时间点的数据显示为平均值±SEM，并且最终图表仅显示每个图表的平均值。用低葡萄糖(2 mM)灌注细胞，除非当指示高葡萄糖(20 mM)之外(每个第6阶段时间点n = 3)。(B) 在用多种促分泌素处理的灌注GSIS测定中，第6阶段细胞的动态人类胰岛素分泌。用低葡萄糖(2 mM)灌注细胞，除非当指示高(20 mM)葡萄糖(Glu)之外，然后用单独的或与另外的化合物(甲苯磺丁脲、IBMX和Extendin-4在左侧；KCL和L-精氨酸在右侧)一起(当指示为(Glu +因子)时)的高葡萄糖的第二次攻击灌注。(C) 在具有扩展的高葡萄糖处理的灌注GSIS测定中，第6阶段细胞的动态人类胰岛素分泌。用低葡萄糖(2mM)灌注细胞，除非当指示高葡萄糖(20 mM)之外(n = 3)。显示的所有数据均用HUES8进行。
图5A-图5F显示II型Alk5抑制剂减少SC-β细胞GSIS。(A) 在用DMSO或Alk5i处理的静态GSIS测定中，第6阶段细胞的人类胰岛素分泌的盒须图(n = 9)。通过双因素配对t检验*** P <0.001，**** P <0.0001；通过双因素非配对t检验#### P <0.0001。(B) 用DMSO或Alk5i处理的第6阶段细胞的细胞胰岛素含量(n = 18)。通过双因素非配对t检验**** P<0.0001。(C) 用DMSO或Alk5i处理的第6阶段细胞的细胞胰岛素原/胰岛素含量比率(n =17)。通过双因素非配对t检验ns。(D-E) 单细胞分散并对嗜铬粒蛋白A和PDX1 (D)或C-肽和NKX6-1 (E)免疫染色的第6阶段簇的代表性流式细胞术点状图。(F) 在灌注GSIS测定中用DMSO或Alk5i处理的第6阶段细胞的动态人类胰岛素分泌。用低葡萄糖(2 mM)灌注细胞，除非当指示高葡萄糖(20 mM)之外(n = 12)。显示的所有数据均用HUES8进行。
图6A-图6E显示在第6阶段期间阻断TGFβ信号传导阻碍GSIS。(A) 用DMSO或Alk5i培养的对磷酸化的SMAD 2/3 (pSMAD2/3)、总SMAD 2/3 (tSMAD2/3)和肌动蛋白染色的第6阶段细胞的Western印迹。显示的数据来自HUES8。(B) 用含有针对GFP的shRNA (对照)或针对TGFBR1的两个序列(TGFBR1 #1和#2)之一的慢病毒转导的第6阶段细胞的实时PCR (n =3)。通过单因素ANOVA Dunnett多重比较检验与GFP相比较**** P <0.0001。(C) 用含有GFP或TGFBR1 #1 shRNA的慢病毒转导的第6阶段细胞的Western印迹。显示的数据来自1013-4FA。(D) 用含有GFP、TGFBR1 #1或TGFBR1 #2 shRNA的慢病毒转导的第6阶段细胞在静态GSIS测定中的人类胰岛素分泌(n =3)。通过配对双因素t检验**P <0.01。通过单因素ANOVADunnett多重比较检验与GFP相比较## P <0.01。显示的数据来自HUES8。(E) 在灌注GSIS测定中用含有GFP或TGFBR1 #1 shRNA的慢病毒转导的第6阶段细胞的动态人类胰岛素分泌。用低葡萄糖(2 mM)灌注细胞，除非当指示高葡萄糖(20 mM)之外(n = 4)。显示的数据来自HUES8。
图7A-图7G显示第5阶段期间的II型Alk5抑制剂处理对于产生胰岛素产生细胞是重要的。(A-B) 单细胞分散并对嗜铬粒蛋白A和NKX6-1 (A)或C-肽和NKX6-1 (B)免疫染色的第5阶段簇的代表性流式细胞术点状图。(C) 表达指示的标志物的细胞比例(n = 4，除CHGA(其为n = 3)之外)。通过非配对双因素t检验* P <0.05，** P <0.01或ns。(D-F)测量用DMSO或Alk5i培养的第5阶段细胞的胰腺激素(D)、β细胞标志物(E)或内分泌标志物(F)的相对基因表达的实时PCR (n = 6)。通过非配对双因素t检验* P <0.05，** P <0.01，****P <0.0001或ns。(G) 第5阶段中以DMSO或Alk5i培养加另外7 d在第6阶段中没有Alk5i且没有簇大小调整培养的细胞在20 mM葡萄糖下的人类胰岛素分泌(n = 3)。通过非配对双因素t检验** P <0.01。显示的所有数据均来自HUES8。
图8A-图8D显示导致新的分化策略和hiPSC繁殖的数据。(A) 在静态GSIS测定中，在调整大小或不调整大小的情况下以及具有或不具有因子(Alk5i和T3)的情况下，在CMRLS或ESFM中生成的第6阶段细胞的人类胰岛素分泌。研究的组合为(1) CMRLS，无调整大小，无因子(n = 3)，(2) CMRLS，有调整大小，无因子(n = 6)，(3) ESFM，无调整大小，无因子(n =3)，(4) ESFM，有调整大小，无因子(n = 3)，(5) ESFM，有调整大小，有因子(n = 3)。使用HUES8细胞系。(B) 在调整大小或不调整大小的情况下以及具有或不具有因子(Alk5i和T3)的情况下，在CMRLS或ESFM中生成的对C-肽和NKX6-1免疫染色的第6阶段细胞的流式细胞术点状图。使用HUES8细胞系。(C) 3个hiPSC系(每个n = 3)的静态GSIS测定中的人类胰岛素分泌。通过单侧配对t检验* P <0.05，** P <0.01和*** P <0.0001。(D) 在灌注GSIS测定中用两个hiPSC系生成的第6阶段细胞的动态人类胰岛素分泌。用低葡萄糖(2 mM)灌注细胞，除非当指示高葡萄糖(20 mM)之外(对于1013-4FA为n = 3和对于1016SeVA为n = 4)。
图9A-图9C显示第6阶段细胞的另外的免疫染色数据。(A) 单细胞分散，平板接种过夜，并对指示的标志物染色的第6阶段簇的免疫染色。第6阶段细胞用来自本文的方案从两个hiPSC系和用Pagliuca方案从HUES8细胞系生成。比例尺=对于1016SeVA和1013-4FA为50 μm和对于Pagliuca方案为25 μm。(B-C) 对指示的标志物染色的用来自本文的方案从两个hiPSC系和用Pagliuca方案从HUES8细胞系生成的第6阶段细胞的流式细胞术点状图。
图10显示第6阶段细胞的另外的基因表达数据。用新的分化方案从HUES8 (n = 8)和1013-4FA (n = 10)系生成的第6阶段细胞和人类胰岛(n = 7)的用实时PCR测量的基因表达数据。在此绘制的HUES8和人类胰岛与图2相同。
图11A-图11D显示另外的免疫染色、血清人类胰岛素测量和小鼠C-肽测量。(A) 移植之后6个月非经STZ处理的小鼠的切片的石蜡包埋的外植肾脏的C-肽(CP；β细胞标志物)、PDX1 (β细胞标志物)、胰高血糖素(GCG；α细胞标志物)、生长抑素(SST；δ细胞标志物)、KRT19 (导管标志物)和胰蛋白酶(腺泡标志物)的免疫染色。比例尺= 25 μm。(B) 注射2 g/kg葡萄糖之后0和60分钟，禁食过夜的STZ，无Txp小鼠(n=6)和无STZ，无Txp (n=5)的血清人类胰岛素。(B) STZ，无Txp (n = 6)；无STZ，无Txp (n = 4)；和STZ，TXP (n = 5)的血清小鼠C-肽。通过单因素ANOVA Tukey多重比较检验**** P <0.0001和ns。(C) 移植之后11 wk经STZ处理的小鼠的切片的石蜡包埋的外植肾脏对指示的标志物的免疫染色。比例尺= 25μm。使用HUES8细胞系。
图12A-图12B显示在人类胰岛的第6阶段和KCl攻击期间的时间流式细胞术。(A)在早期(9 d)和晚期(26 d)时间点对C-肽和NKX6-1染色的第6阶段细胞的流式细胞术点状图。使用HUES8细胞系。(B) 在灌注GSIS测定中人类胰岛的动态人类胰岛素分泌，所述测定用低葡萄糖(2 mM)灌注，除非当指示高葡萄糖(20 mM) (Glu)之外，然后当指示为(Glu +因子)时，用高葡萄糖与KCl的第二次攻击灌注(n = 4)。
图13A-图13C显示从hiPSC生成的第6阶段细胞经历被Alk5i抑制的GSIS、流式细胞术对照和基因表达数据。(A) 在静态GSIS测定中，用DMSO或Alk5i处理的从3种hiPSC系(1013-4FA，n = 4；1016SeVA，n = 3；1019SeVF，n = 3)生成的第6阶段细胞的人类胰岛素分泌。通过双因素配对t检验* P <0.05，** P <0.01，**** P <0.0001；通过双因素非配对t检验## P <0.01，### P <0.001，#### P <0.0001。在此的对照数据与图21中的数据相同。(B)图19的流式细胞术对照。C-肽/NKX6-1对照与图16所示的相同。(C) 在调整大小或不调整大小的情况下用Alk5i或DMSO处理的第6阶段细胞的实时PCR分析(n = 3)。用1013-4FA细胞系生成数据。
图14A-图14B显示经调整大小和未经调整大小的第6阶段簇具有SMAD2/3磷酸化和用Alk5i处理减少的GSIS。(A) 在调整大小和不调整大小的情况下对磷酸化的SMAD 2/3(pSMAD2/3)、总SMAD 2/3 (tSMAD2/3)和肌动蛋白染色的第6阶段细胞的Western印迹。(B)在静态GSIS测定中，用DMSO或Alk5i处理的经调整大小或未经调整大小的第6阶段细胞的人类胰岛素分泌。显示的所有数据均来自1013-4FA。
图15A-图15I为描绘细胞骨架状态控制转录因子的表达的一系列图示、图像和图表。胰腺祖细胞中的NEUROG3和NKX6-1。(a) 用于悬浮分化和平板沉降研究的分化方案5的示意图。(b) 分散并平板接种到ECM包被的TCP上，以进行培养用于方案其余部分的在第4阶段开始时的簇的图像。比例尺= 100 µm。(c) 与分散之后重新聚集的一个或多个常规悬浮簇相比较(Tukey HSD检验，n = 4)，第4阶段开始时平板接种于胶原蛋白I上的细胞在第4阶段结束时的胰腺基因的qRT-PCR。(d) 在第4阶段开始时平板接种于不同高度的胶原蛋白I凝胶上的细胞在第4阶段结束时的胰腺基因的qRT-PCR。增加固定于TCP的胶原蛋白I凝胶的高度与降低细胞经受的有效刚度相关(ANOVA，n = 4)。(e)用一系列细胞骨架修饰化合物处理，以鉴定拉春库林A为有效的内分泌诱导剂的平板接种的第4阶段细胞的qRT-PCR。XXi为一种γ-分泌酶抑制剂，用作阳性对照(Dunnett多重比较检验，n = 4)。(f) 第4阶段结束时对平板接种的细胞进行的免疫染色，表明1 µM拉春库林A处理可增加NEUROG3+和减少NKX6-1+细胞。比例尺= 50 µm。(g) 用qRT-PCR测量的在第4阶段期间添加的拉春库林A的胰腺基因表达的剂量反应(ANOVA，n = 4)。(h) 用1 µM拉春库林处理24小时的平板接种的第4阶段细胞的免疫染色，表明F-肌动蛋白解聚但保持PDX1表达。(i) 在不同培养方式下和用拉春库林A处理的细胞内G/F肌动蛋白比率的Western印迹量化(n = 3)。所有数据均用HUES8生成。所有数据误差条代表SEM。ns =不显著，* = p <0.05，** = p <0.01，*** = p <0.001。
图16A-图16C为描绘单细胞RNA测序的一系列投影图、绘图和图表，表明细胞骨架状态指导胰腺祖细胞的命运。(a) 对平板接种并用0.5 µM拉春库林A或5 µM诺考达唑处理的第4阶段细胞进行的单细胞RNA测序的tSNE投影图。来自所有3种条件的组合细胞群的无指导聚集显示4种单独的簇。(b) 小提琴图，其显示每个簇中重要的上调基因。(c) 每种条件下每种簇内的细胞百分比。所有数据均用HUES8生成。
图17A-图17I为一系列绘图和图像，其描绘在第5阶段期间的拉春库林A处理急剧增加平板接种的胰腺祖细胞的SC-β细胞特化。(a) 未经处理或在整个第4、5或6阶段用0.5µM拉春库林A处理的按照图15(a)的平板接种的细胞的NKX6-1、CHGA和C-肽进入第6阶段两周的流式细胞术(Dunnett多重比较检验，n = 4)。(b) 未经处理或在整个第4、5或6阶段用0.5 µM拉春库林A处理的平板接种的细胞进入第6阶段两周的静态GSIS (配对t检验对于特定样品在低和高葡萄糖之间进行比较，Dunnett检验比较相对于对照的在高葡萄糖下的胰岛素分泌，n = 4)。(c) 在第5阶段期间用于平板接种的细胞的拉春库林A浓度和时机的优化。在第6阶段2周之后进行静态GSIS (t检验，n = 4)。(d) 未经处理或用1 µM拉春库林A处理24小时的进入第6阶段两周的平板接种的细胞的胰岛素含量(非配对t检验，n = 4)。(e)未经处理或用1 µM拉春库林A处理24小时的进入第6阶段两周的平板接种的细胞的胰岛素原/胰岛素比率(非配对t检验，n = 4)。(f) 测量未经处理或用1 µM拉春库林A处理24小时的进入第6阶段两周的平板接种的细胞的胰腺(左)和非胰腺(右)基因表达的qRT-PCR (非配对t检验，n = 4)。(g) 对未经处理或用1 µM拉春库林A处理24小时的进入第6阶段两周的平板接种的细胞的AFP和C-肽的免疫染色。比例尺= 100 µm。(h) 在第6阶段一周之后平板接种的细胞的聚集图像。(i) 显示第一和第二时相胰岛素释放的第6阶段细胞的动态葡萄糖刺激的胰岛素分泌。所有数据均用HUES8生成。所有数据误差条代表SEM。ns =不显著，* =p <0.05，** = p <0.01，*** = p <0.001。
图18A-图18J为一系列图示、图表和图像，其描绘用新的平面方案分化的表达β细胞标志物的SC-β细胞和体外功能。(a) 用于在第5阶段的前24小时中包含1 µM拉春库林A处理制备SC-β细胞的新的平面方案示意图。(b) 来自具有和不具有第5阶段拉春库林A处理的HUES8的细胞在第6阶段一周之后测量内分泌诱导(CHGA+)和SC-β细胞特化(C-肽+/NKX6-1+)的流式细胞术(非配对t-检验，n = 4)。(c) 从HUES8、1013-4FA和1016SeVA hPSC系分化的第6阶段细胞的胰岛和SC-β细胞标志物的流式细胞术(n = 4)。(d) 第6阶段细胞和人类胰岛的胰岛和不允许基因的qRT-PCR (Dunnett多重比较检验，对于SC-β细胞为n = 4，对于人类胰岛为n = 3)。(e) 来自HUES8的聚集的平面第6阶段细胞的免疫染色。(f) 第6阶段细胞的胰岛素含量(n = 4)。(g) 第6阶段细胞的胰岛素原/胰岛素含量比率(n = 4)。(h) 第6阶段细胞的静态GSIS (配对t检验，n = 4)。(i) 从HUES8 (n = 7)、1013-4FA (n = 3)和1016SeVA (n = 4)生成的平面第6阶段细胞的动态GSIS。从Velazco-Cruz等5(HUES8，n =12；1013-4FA，n = 3；1016SeVA，n = 4)重新绘制悬浮第6阶段的数据。(j) 绘制在一起的来自(i)的平面静态GSIS数据，其与从Velazco-Cruz等5重新绘制的人类胰岛数据相比较(n =12)。除非另外说明，否则该图中显示的所有数据均具有用平面分化方案生成的细胞。所有数据误差条代表SEM。ns =不显著，* = p <0.05，** = p <0.01，*** = p <0.001。
图19A-图19C为一系列图表和图像，其描绘用新的平面方案生成的SC-β细胞可快速治愈小鼠中预先存在的糖尿病。(a) 在总共19只小鼠中用STZ诱导糖尿病。注射之后4周，将用平面方案生成的SC-β细胞移植到其中的12只小鼠中。5只非糖尿病小鼠用作对照。移植之后3、10和13周进行葡萄糖耐量测试。移植之后12周进行肾切除术(Tukey HSD检验，‡=与未移植不同，§=与移植不同，#=与未经处理的对照不同)。(b) 移植之后2和10周接受SC-β细胞移植的小鼠的测量人类胰岛素的体内GSIS。ns =不显著，* = p <0.05，** = p <0.01，*** = p <0.001。(c) 移植之后3周移植有SC-β细胞的切片肾脏的显示C-肽+细胞的免疫染色。所有数据均使用图19A 中概述的平面方案用HUES8生成。所有数据误差条代表SEM。
图20A-图20G为一系列热图、绘图和图像，显示细胞骨架的状态影响内胚层细胞的命运。(a) 未经处理、在整个第4阶段用0.5 µM拉春库林A处理或在第5阶段的前24小时中用1 µM拉春库林A处理的根据图15(a)分化为第6阶段的悬浮和平板接种的胰腺祖细胞。在进入第6阶段两周时进行的批量RNA测序用于生成第5阶段拉春库林A处理和平板接种的对照之间1000个表达差异最大的基因的热图。(b) 来自多个内胚层谱系的选定基因的批量RNA测序的热图。(c) 来自批量RNA测序数据的火山图，其显示未经处理的平板接种的细胞和经第5阶段拉春库林处理的细胞之间选定基因的表达差异。(d) 对来自多个内胚层谱系的选定基因集的批量RNA测序的基因富集分析。(e) 用拉春库林A或诺考达唑处理的以外分泌分化方案分化的细胞的免疫染色(左)和qRT-PCR (右) (Dunnett多重比较检验，n = 4)。(f)用拉春库林A或诺考达唑处理的以肠分化方案分化的细胞的免疫染色(左)和qRT-PCR (右)(Dunnett多重比较检验，n = 4)。(g) 用拉春库林A或诺考达唑处理的以肝分化方案分化的细胞的免疫染色(左)和qRT-PCR (右) (Dunnett多重比较检验，n = 4)。比例尺= 50 µm。所有数据均用HUES8生成。所有数据误差条代表SEM。ns =不显著，* = p <0.05，** = p <0.01，*** = p <0.001。
图21A-图21D为一系列图像和条形图。(a) 根据图15(a)在第4阶段开始时平板接种到ECM包被的TCP上的胰腺祖细胞的图像。比例尺= 200 µm。(b) 在第4阶段结束时平板接种的细胞的qRT-PCR (n = 4)。(c) 在第4阶段开始和结束时进行的基于抗体的整联蛋白粘附比色测定证实结合于胶原蛋白I和IV (α1，α2，β1)、纤连蛋白(αV，β1，α5β1)、玻连蛋白(αV，β1，αVβ5)和一些但不是全部层粘连蛋白同种型(α3，β1)的整联蛋白亚基的高表达。将数据针对同型对照归一化。所有数据均用HUES8生成。
图22A-图22H为一系列绘图和热图。(a) 从1013-4FA和1016SeVA开始的在第4阶段期间添加的拉春库林A的用qRT-PCR测量的胰腺基因表达的剂量反应(n = 4)。(b) 在第4阶段结束时响应拉春库林B对平板接种的HUES8的给药的胰腺基因表达的qRT-PCR (ANOVA，n= 4)。(c) 未经处理的HUES8平板接种的第4阶段细胞、未经处理的重聚聚集的簇和用肌动蛋白聚合剂jasplakinolide处理的重聚聚集的簇的qRT-PCR (非配对t检验，n = 4)。(d)从平板接种的HUES8胰腺祖细胞的单细胞RNA测序数据生成的显示胰腺基因的表达的tSNE图热图。所有数据根据图15(a)生成。所有数据误差条代表SEM。ns =不显著，* = p <0.05，** = p <0.01，*** = p <0.001。
图23A-图23H (a) 用新的平面方案分化到第4阶段结束时的、未经处理或在整个第4阶段用0.5 µM拉春库林A处理的HUES8细胞的qRT-PCR (非配对t检验，n = 4)。(b-d) 在第5阶段开始时进行或不进行24小时1 µM拉春库林A处理的以平面方案分化到第6阶段的HUES8细胞的qRT-PCR。(b,c)显示胰岛和β细胞基因的表达和(d)显示非胰腺基因的表达(非配对t检验，n = 4)。(e,f) 用(e) 1013-4FA和(f) 1016SeVA iPSC系从平面方案生成的聚集体的免疫染色。比例尺= 50 µm。(g) 用ELISA对来自小鼠的血清的小鼠C-肽的量化。(h)没有移植的小鼠血清中人类胰岛素的量化。所有数据均用HUES8以按照图18(a)的新的平面方案生成。所有数据误差条代表SEM。ns =不显著，* = p <0.05，** = p <0.01，*** = p <0.001。
发明详述
本公开至少部分地基于以下发现：修改的方法可产生细胞，其可以接近胰岛样水平对葡萄糖适当地作出反应，表明第一时相和第二时相两者反应。本文所述的为从人类多能干细胞生成具有动态胰岛素分泌的β样细胞的方案。此外，本公开至少部分地基于以下发现：肌动蛋白细胞骨架的调节可增强人类多能干细胞的胰腺分化。
从人类多能干细胞生成具有动态胰岛素分泌的β样细胞。
已经发现，目前描述的方法生成的干细胞衍生的β (SC-β)细胞比已发表的文献(Pagliuca et al. Cell 2014)中的细胞功能更好(经历葡萄糖刺激的胰岛素分泌)并表达β细胞标志物。这包括在静态测定的情况下增加的胰岛素分泌以及在动态测定中具有第一和第二时相胰岛素反应。
本文所述的干细胞衍生的β (SC-β)细胞可用作糖尿病的细胞疗法或用于药物筛选。目前公开的方法增强人类多能干细胞向产生胰岛素的β细胞的分化。该方法为从Pagliuca et al. Cell 2014发表的先前描述的6步分化方案修改的。用这种新方法，已经生成可以接近胰岛样水平对葡萄糖适当地作出反应的细胞，其显示第一时相和第二时相两者反应。
为了实现上述调节，进行以下内容：(1) 将第3阶段缩短至1天；(2) 通过去除Alk5抑制剂II (当前文献包括该抑制剂)，允许在第6阶段中进行TGFb信号传导；(3) 从第6阶段中去除T3 (当前文献包括该抑制剂)；(4) 在无血清基础培养基(所包括的配方)中进行第6阶段；和(5) 在第6阶段开始时将簇分开并重新聚集。
使用上述调节，生成了更好地进行葡萄糖刺激的胰岛素分泌的增强的干细胞衍生的β细胞。目前本领域包括在培养为成熟的干细胞衍生的β细胞的最后阶段期间的Alk5抑制剂II和T3。本领域无法生成具有第一时相和第二时相两者胰岛素分泌的功能性干细胞衍生的β细胞(对于本领域中干细胞衍生的β细胞具有的差的动态功能，参见Rezania et al.Nature Biotechnology 2014)。
例如，实施例1描述用于生成干细胞衍生的β样(SC-β)细胞的方法。发现一种分化策略，其侧重于调节TGFβ信号传导、控制细胞簇大小和使用富集的无血清培养基(ESFM)生成表达β细胞标志物并经历具有第一时相和第二时相两者动态胰岛素分泌的GSIS的SC-β细胞。
肌动蛋白细胞骨架的调节增强人类多能干细胞的胰腺分化。
如本文所述，这项工作已将肌动蛋白细胞骨架鉴定为人类胰腺细胞命运的关键调控剂。通过用细胞排列(二维相对于三维)、基底刚度或直接用化学处理控制细胞骨架的状态，本文显示聚合的细胞骨架可防止胰腺祖细胞中NEUROG3表达的过早诱导，而且也可抑制随后分化为SC-β细胞。
如本文所示，发现在分化期间的特定时间点，肌动蛋白细胞骨架及其下游效应子Yes相关蛋白(YAP)的调节可增强人类多能干细胞向内胚层谱系细胞、胰腺祖细胞和产生胰岛素的β细胞的分化。使用从Pagliuca et al. Cell 2014修改的6步分化方案，观察到以下具体特征：(1) 第4阶段期间的肌动蛋白聚合和YAP活性增强胰腺祖细胞(PDX1+/NKX6-1+/SOX9+)的生成；(2) 在第5阶段期间，优选地在第5阶段的前24-48小时期间，肌动蛋白解聚和YAP活性丧失会增强内分泌细胞，特别是显示出葡萄糖刺激的胰岛素分泌增强的β细胞的生成。
为了实现上述调节，可进行以下内容：(1) 通过平板接种到硬质表面(比如带有薄的ECM蛋白层以促进贴壁的组织培养塑料)上来促进肌动蛋白聚合；(2) 通过平板接种到软质表面(比如水凝胶)上或通过用拉春库林A和/或拉春库林B处理细胞来促进肌动蛋白解聚；(3) 使用相同的促进肌动蛋白聚合的方法来促进YAP转录活性；和/或(4) 使用相同的促进肌动蛋白解聚的方法或通过用维替泊芬处理来抑制YAP转录活性。
使用上述调节，生成了增强的干细胞衍生的β细胞以比先前的方法更好地进行葡萄糖刺激的胰岛素分泌，并且其可基于贴壁培养生成。目前在本领域中，可生成干细胞衍生的β细胞，但功能不如目前公开的方法好。本领域在其方案中未利用肌动蛋白细胞骨架和YAP信号传导。本领域还无法用细胞以贴壁培养生成功能性干细胞衍生的β细胞-其必须以悬浮聚集体(所附数据集中许多实验的对照，首次报道于Pagliuca et al. Cell 2014中)或以气-液界面上的聚集体(首先报道于Rezania et al. Nature Biotechnology 2014中)完成。
本文描述的为比已发表的文献(Pagliuca et al. Cell 2014)中的细胞功能更好(经历葡萄糖刺激的胰岛素分泌)并表达β细胞标志物的干细胞衍生的β细胞的生成。
本文还描述用于以平面方案生成可经历葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)的干细胞衍生的β细胞的方法。
本文还描述可使用不需要细胞分散的UpCell技术或者通过分散和重新聚集细胞，将细胞与平板分离，并保持胰岛素分泌能力，更好地实现移植的示范。
本文还描述具有减少的内分泌表达(比如NGN3、NEUROD1的表达)和增加的胰腺祖细胞表达(比如NKX6-1、SOX9的表达)的胰腺祖细胞的生成。
胰腺祖细胞和干细胞衍生的β细胞可用作糖尿病的细胞疗法。干细胞衍生的β细胞也可用于药物筛选。目前公开的贴壁培养方法为药物筛选研究提供便利的平台。
目前公开的培养方法还可促进提高分化的质量和重现性，并且可益于分化过程的自动化以用于商业化。
例如，如实施例2中所述，通过细胞骨架调节的分化方案可生成几种谱系的细胞(例如SC-β、β样细胞)。发现肌动蛋白细胞骨架的状态对内胚层细胞命运的选择至关重要。通过利用细胞-生物材料相互作用以及肌动蛋白细胞骨架的小分子调控剂(例如细胞骨架调节剂)的组合，可控制内分泌转录因子表达的时机以调节分化命运并开发出用于分化细胞的二维方案。重要的是，这种新的平面方案大大地增强从诱导的多能干细胞(iPSC)系分化的SC-β细胞的功能并放弃三维细胞排列的要求。
在分化的特定点不同程度的肌动蛋白聚合会使细胞偏向不同的内胚层谱系，并因此非最佳的细胞骨架状态导致细胞特化的大大的低效率。
此外，本文描述的方法可控制肌动蛋白聚合以指导这些其他内胚层细胞的分化命运以调节谱系特化。
可根据提供的方法生成的其他谱系可为肝、食道、外分泌、胰腺、肠或胃。
细胞骨架调节剂可为促进或抑制肌动蛋白聚合或微管聚合的任何物质。例如，细胞骨架调节剂可为肌动蛋白解聚或聚合剂、微管调节剂或整联蛋白调节剂(例如化合物，比如抗体和小分子)。例如，细胞骨架调节剂可为拉春库林A、拉春库林B、诺考达唑、细胞松弛素D、jasplakinolide、布雷他汀、y-27632、y-15、gdc -0994或整联蛋白调节剂。细胞骨架调节剂可为本领域已知的任何细胞骨架调节剂(参见例如Ley et al. Nat Rev DrugDiscov. 2016年3月; 15(3): 173-183)。
细胞簇大小调整
可通过本领域已知的任何方法来进行细胞簇的大小调整。例如，细胞大小调整可包括将细胞簇分开并重新聚集。作为另一个实例，可通过在细胞解离试剂中温育并使其通过细胞过滤器(例如100 μm尼龙细胞过滤器)来调整细胞簇的大小。作为另一个实例，可通过用TrypLE进行单细胞分散并重新聚集来调整细胞的大小。
制剂
本文所述的物质和组合物可使用如在例如通过参考以其全部结合至本文中的Remington’s Pharmaceutical Sciences (A.R. Gennaro, Ed.), 第21版, ISBN:0781746736 (2005)中描述的一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂通过任何常规方式配制。这种制剂将含有治疗有效量的本文所述的细胞，其可以纯化形式，与合适量的载体一起，以便提供用于正常给予受试者的形式。
术语“制剂”是指以适合于给予受试者(比如人)的形式制备药物。因此，“制剂”可包含药学上可接受的赋形剂，包括稀释剂或载体。
本文使用的术语“药学上可接受的”可描述不会引起药理活性的不可接受的丧失或不可接受的不良副作用的物质或组分。药学上可接受的成分的实例可为在UnitedStates Pharmacopeia (USP 29)和National Formulary (NF 24), United StatesPharmacopeial Convention, Inc, Rockville, Maryland, 2005 ("USP/NF")或更新版本中具有专论的那些成分，以及不断更新的FDA非活性成分搜索(Inactive IngredientSearch)在线数据库中列出的组分。也可使用USP/NF等中未描述的其他有用组分。
本文使用的术语“药学上可接受的赋形剂”可包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗或吸收延迟剂。这种介质和试剂用于药用活性物质的用途为本领域众所周知的(通常参见Remington’s Pharmaceutical Sciences (A.R. Gennaro,Ed.), 第21版, ISBN: 0781746736 (2005))。除非任何常规介质或物质与活性成分不相容，否则考虑将其用于治疗组合物中。补充活性成分也可掺入到组合物中。
“稳定的”制剂或组合物可指以下组合物，其具有足够稳定性，以使得能够在便利的温度(比如约0℃-约60℃之间)下储存商业上合理的时间段，比如至少约一天、至少约一周、至少约一个月、至少约三个月、至少约六个月、至少约一年或至少约两年。
制剂应适合于给予模式。用于本公开的物质可通过已知方法配制以用于使用几种途径给予受试者，所述途径包括(但不限于)胃肠外、肺、口服、局部、皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外、眼科、颊和直肠。单独的物质也可与一种或多种另外的物质组合或与其他生物活性或生物惰性物质一起给予。这种生物活性或惰性物质可与物质流体或机械连通，或通过离子、共价、范德华、疏水性、亲水性或其他物理力附着于物质。
可配制控制释放(或持续释放)制剂以延长物质的活性并减少给药频率。控释制剂也可用于影响作用起效的时间或其他特征，比如物质的血液水平，并因此影响副作用的发生。可将控释制剂设计为最初释放一定量的产生期望的治疗效果的物质，然后逐渐和持续释放其他量的物质以在延长的时间段内保持治疗效果的水平。为了在体内保持物质的近乎恒定水平，物质可以替代从体内代谢或排泄的物质的量的速率从剂型中释放。物质的控制释放可通过各种诱因来刺激，例如pH变化、温度变化、酶、水或其他生理条件或分子。
如以下进一步描述的，本文所述的物质或组合物还可与其他治疗方式组合使用。因此，除本文所述的疗法之外，还可向受试者提供已知对疾病、障碍或病症的治疗有效的其他疗法。
治疗方法
还提供了使用生成的细胞进行细胞替代疗法或干细胞移植的方法。例如，所公开的组合物和方法可用于在需要给予治疗有效量的内胚层谱系细胞或β细胞，以诱导胰岛素分泌的受试者中治疗糖尿病或与功能障碍性内胚层细胞相关的其他疾病。
本文所述的方法通常对需要它的受试者进行。需要本文所述的治疗方法的受试者可为患有、诊断为、怀疑患有或有风险患有糖尿病或与功能障碍性内胚层细胞相关的其他疾病的受试者。一般地，通过与所讨论的疾病或病症相符的病史和体格检查来评估确定对治疗的需要。可通过本文所述的方法治疗的各种病症的诊断处于本领域技术的范围内。受试者可为动物受试者，包括哺乳动物，比如马、牛、狗、猫、绵羊、猪、小鼠、大鼠、猴子、仓鼠、豚鼠和鸡以及人类。例如，受试者可为人类受试者。
通常，内胚层谱系细胞(例如肝细胞、表达胰岛素的细胞(例如β细胞、SC-β细胞)、肠细胞)的安全有效量为例如会在受试者引起期望的治疗效果同时最小化不期望的副作用的量。
在各种实施方案中，有效量的本文所述的内胚层谱系或β细胞可通过胰岛素的分泌对葡萄糖作出反应。在各种实施方案中，有效量的本文所述的细胞可治疗糖尿病或与功能障碍性内胚层细胞相关的其他疾病，基本上抑制糖尿病或与功能障碍性内胚层细胞相关的其他疾病，减慢糖尿病或与功能障碍性内胚层细胞相关的其他疾病的进展，或限制糖尿病或与功能障碍性内胚层细胞相关的其他疾病的发展。
根据本文所述的方法，给予可为细胞移植、细胞植入、胃肠外、肺、口服、局部、皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外、眼科、颊或直肠给予。
当用于本文所述的治疗中时，可以纯净形式或以药学上可接受的盐形式(如果存在这种形式)以及与或不与药学上可接受的赋形剂一起使用治疗有效量的β细胞或内胚层谱系细胞。例如，可以适用于任何医学治疗的合理的益处/风险比，以足以诱导胰岛素分泌的量给予本公开的化合物。
可与药学上可接受的载体组合以产生单一剂型的本文所述的组合物的量将根据所治疗的宿主和特定的给予模式而变化。本领域的技术人员将意识到，每种剂型的单个剂量中所含的物质的单位含量本身不必构成治疗有效量，因为必要的治疗有效量可通过给予多个单个剂量来达到。
可通过在细胞培养物或实验动物中用于确定LD50 (对50%群体致死的剂量)和ED50 (在50%群体治疗有效的剂量)的标准药用程序来确定本文所述的组合物的毒性和治疗功效。毒性和治疗效果之间的剂量比为可表示为LD50/ED50比率的治疗指数，其中较大的治疗指数在本领域中通常理解为最佳。
用于任何特定受试者的具体治疗有效剂量水平将取决于多种因素，包括正在治疗的障碍和障碍的严重程度；所用具体化合物的活性；所用的具体组合物；受试者的年龄、体重、总体健康、性别和饮食；给予时间；给予途径；所用组合物的排泄速率；治疗的持续时间；与所用的具体化合物组合或同时使用的药物；以及医学领域众所周知的类似因素(例如参见Koda-Kimble et al. (2004) Applied Therapeutics: The Clinical Use of Drugs,Lippincott Williams & Wilkins, ISBN 0781748453; Winter (2003) Basic ClinicalPharmacokinetics, 4th ed., Lippincott Williams & Wilkins, ISBN 0781741475;Sharqel (2004) Applied Biopharmaceutics & Pharmacokinetics, McGraw-Hill/Appleton & Lange, ISBN 0071375503)。例如，以低于达到期望的治疗效果所需的那些水平开始组合物的剂量，并逐渐增加剂量直至达到期望的效果很好地处于本领域技术范围内。如果需要，可将有效日剂量分为多个剂量以进行给予。因此，单剂量组合物可含有这种量或其约数以组成每日剂量。然而，应当理解，本公开的化合物和组合物的总每日用量将由主治医师在合理的医学判断范围内决定。
再者，本文所述的每种状态、疾病、障碍和病症以及其他均可受益于本文所述的组合物和方法。通常，治疗状态、疾病、障碍或病症包括在可能患有或易患该状态、疾病、障碍或病症但尚未经受或未表现出其临床或亚临床症状的哺乳动物中预防或延迟临床症状的出现。治疗还可包括抑制状态、疾病、障碍或病症，例如阻止或减少疾病或其至少一种临床或亚临床症状的发展。此外，治疗可包括减轻疾病，例如引起状态、疾病、障碍或病症或其至少一种临床或亚临床症状的消退。对要治疗的受试者的益处可为统计学显著的，或者至少对受试者或医师而言为可感知的。
内胚层谱系细胞或β细胞的给予可作为单次事件或者经治疗的时间过程发生。例如，内胚层谱系细胞或β细胞可以每天、每周一次、每两周一次或每月一次给予。对于急性病症的治疗，治疗的时间过程通常为至少几天。某些病症可将治疗从几天延长至几周。例如，治疗可延长超过一周、两周或三周。对于更慢性的病症，治疗可从几周延长至几个月或者甚至一年或更长时间。
根据本文所述方法的治疗可在用于糖尿病或与功能障碍性内胚层细胞相关的其他疾病的常规治疗方式之前、同时或之后进行。
给予
本文所述的物质和组合物可按照本文所述的方法以本领域已知的多种方式给予。物质和组合物可作为外源性物质或作为内源性物质治疗性地使用。外源性物质为在体外产生或制造并给予身体的那些物质。内源性物质为通过某种类型的装置(生物或其他)在体内产生或制造以用于在体内递送或递送至体内其他器官的那些物质。
如上所述，给予可为植入、移植、胃肠外、肺、口服、局部、皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外、眼科、颊或直肠给予。
本文所述的物质和组合物可以本领域众所周知的多种方法给予。给予可包括例如涉及直接注射(例如全身或立体定向)、所生成的细胞的移植或植入、口服摄取、释放细胞的生物材料、聚合物基质、凝胶、渗透膜、渗透系统、多层包衣、微粒、可植入基质装置、微渗透泵、可植入泵、可注射凝胶和水凝胶、脂质体、胶束(例如最大30 μm)、纳米颗粒(例如小于1μm)、微球(例如1-100 μm)、储库装置、任何上述的组合或其他合适的递送工具，以提供不同比例的期望的释放曲线的方法。物质或组合物的控释递送的其他方法为技术人员已知的，并且处于本公开的范围内。
递送系统可包括例如输液泵，其可用于以类似于用于将胰岛素或化学疗法递送至特定器官或肿瘤的方式来给予细胞。一般地，使用这种系统，可将细胞与可生物降解的、生物相容的聚合物植入物组合给予，所述植入物含有或在选定位点于受控时间段内释放细胞。聚合物材料的实例包括聚酸酐、聚原酸酯、聚乙醇酸、聚乳酸、聚乙烯醋酸乙烯酯及其共聚物和组合。另外，可将控释系统置于接近治疗靶标，因此仅需要全身剂量的一小部分。
可将物质包封于各种载体递送系统中并进行给予。载体递送系统的实例包括微球、水凝胶、聚合物植入物、智能聚合物载体和脂质体(通常参见Uchegbu 和Schatzlein,eds. (2006) Polymers in Drug Delivery, CRC, ISBN-10: 0849325331)。用于分子或生物分子物质递送的基于载体的系统可以：改善治疗细胞向其作用部位的转运；使得与其他物质或赋形剂共定位沉积；提高细胞在体内的稳定性；通过减少清除来延长细胞在作用部位的停留时间；减少细胞向非靶组织的非特异性递送；改变物质的免疫原性；减少给药频率；或提高产品的保质期。
筛选
还提供了同于筛选的方法。筛选方法可包括提供通过本文所述的任何方法生成的细胞，并将化合物或组合物(例如促分泌素)引入到细胞。例如，筛选方法可用于对本文提供的任何内胚层谱系细胞或β细胞进行药物筛选或毒性筛选。
主题方法发现可用于筛选多种不同的候选分子(例如潜在的治疗性候选分子)。用于根据本文所述的方法进行筛选的候选物质包括(但不限于)组织或细胞部分、核酸、多肽、siRNA、反义分子、适体、核酶、三螺旋化合物、抗体和小(例如小于约2000 mw，或小于约1000mw，或小于约800 mw)有机分子或无机分子，包括(但不限于)盐或金属。
候选分子包括许多化学类别，例如有机分子，比如分子量大于50且小于约2500道尔顿的小有机化合物。候选分子可包含与蛋白进行结构相互作用，特别是氢键键合所必需的官能团，并且一般地至少包含胺、羰基、羟基或羧基，并且通常包含至少两个化学官能团。候选分子可包含用一个或多个上述官能团取代的环状碳或杂环结构和/或芳族或多芳族结构。
候选分子可为化合物库数据库中的化合物。本领域的技术人员将通常熟悉例如许多用于筛选的商业上可获得的化合物的数据库(参见例如ZINC数据库，UCSF，在12个不同的分子子集中具有270万种化合物；Irwin和Shoichet (2005) J Chem Inf Model 45, 177-182)。本领域的技术人员还将熟悉各种搜索引擎，以识别商业来源或期望的化合物以及化合物类别以进行进一步测试(参见例如ZINC数据库；eMolecules.com；以及供应商提供的商业化合物电子库，例如：ChemBridge, Princeton BioMolecular, Ambinter SARL,Enamine, ASDI, Life Chemicals etc.)。
用于根据本文所述的方法进行筛选的候选分子包括类先导化合物和类药化合物。类先导化合物通常理解为具有相对较小的骨架样结构(例如约150-约350 kD的分子量)，并具有相对较少的特征(例如少于约3个氢供体和/或少于约6个氢受体；疏水性特征xlogP为约-2至约4) (参见例如Angewante (1999) Chemie Int. ed. Engl. 24, 3943-3948)。相比之下，类药化合物通常理解为具有相对较大的骨架(例如约150-约500 kD的分子量)，并具有相对更多的特征(例如少于约10个氢受体和/或少于约8个可旋转键；疏水性特征xlogP小于约5) (参见例如Lipinski (2000) J. Pharm. Tox. Methods 44, 235-249)。初始筛选可用类先导化合物进行。
当从空间定向数据设计先导物时，了解某些分子结构表征为“类药”可能很有用。这种表征可基于一组通过比较整个药典内已知药物的相似性而得出的经验上公认的质量。尽管不需要药物满足所有或者甚至任何这些特征，但如果其为类药的，则药物候选物远更可能获得临床成功。
几种这些“类药”特征已概括为Lipinski的四原则(由于其中第5号的普遍性而通常称为“五原则”)。尽管这些原则通常涉及口服吸收并用于在先导物优化期间预测化合物的生物利用度，但是其可用作在合理药物设计努力期间构建先导物分子的有效指南，比如可通过使用本公开的方法来完成。
四项“五原则”规定，候选类药化合物应具有以下特征中的至少三个：(i) 重量小于500道尔顿；(ii) P的对数小于5；(iii) 不超过5个氢键供体(表示为OH和NH基团的总和)；和(iv) 不超过10个氢键受体(N和O原子的总和)。而且，类药分子的跨度(宽度)一般地在约8 Å-约15 Å之间。
试剂盒
还提供了试剂盒。这种试剂盒可包括本文所述的物质或组合物，并且在某些实施方案中，包括给予说明。这种试剂盒可促进本文所述方法的实施。当作为试剂盒提供时，组合物的不同组分可包装在单独的容器中，并在使用之前立即混合。组分包括(但不限于)本文所述的干细胞、培养基和因子。如果需要，组分的这种分别包装可以包、包装或分配器装置呈现，其可包含一个或多个含有组合物的单位剂型。包装可例如包含金属或塑料箔，比如泡罩包装。在某些情况下，组分的这种分别包装还可允许长期储存而不会丧失组分的活性。
试剂盒还可包含在单独容器中的试剂，比如待添加至单独包装的冻干活性组分中的无菌水或盐水。例如，密封的玻璃安瓿可含有冻干的组分，并且在单独的安瓿中含有无菌水、无菌盐水或无菌物，其每一种均已在中性非反应性气体比如氮气下进行包装。安瓿可由任何合适的材料，比如玻璃、有机聚合物比如聚碳酸酯、聚苯乙烯、陶瓷、金属或一般地用于容纳试剂的任何其他材料构成。合适的容器的其他实例包括可由与安瓿类似的物质制成的瓶子以及可由衬有箔的内部(比如铝或合金)构成的包封物。其他容器包括试管、小瓶、烧瓶、瓶子、注射器等。容器可具有无菌入口，比如具有可被皮下注射针刺穿的塞子的瓶子。其他容器可具有两个隔室，隔室由可易于移除的膜隔开，膜在移除后允许组分混合。可移除的膜可为玻璃、塑料、橡胶等。
在某些实施方案中，试剂盒可提供有说明材料。说明可打印在纸或其他基材上，和/或可作为电子可读介质提供，比如软盘、小型CD-ROM、CD-ROM、DVD-ROM、Zip磁盘、录像带、录音带等。详细说明可能与试剂盒没有物质关联；而是可将用户指向由试剂盒的制造商或分销商指定的Internet网站。
本文描述的利用分子生物学方案的组合物和方法可根据本领域已知的多种标准技术(参见例如Sambrook和Russel (2006) Condensed Protocols from MolecularCloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN-10:0879697717; Ausubel et al. (2002) Short Protocols in Molecular Biology, 5thed., Current Protocols, ISBN-10: 0471250929; Sambrook和Russel (2001)Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring Harbor LaboratoryPress, ISBN-10: 0879695773; Elhai, J.和Wolk, C. P. 1988. Methods inEnzymology 167, 747-754; Studier (2005) Protein Expr Purif. 41(1), 207-234;Gellissen, ed. (2005) Production of Recombinant Proteins: Novel Microbial andEukaryotic Expression Systems, Wiley-VCH, ISBN-10: 3527310363; Baneyx (2004)Protein Expression Technologies, Taylor & Francis, ISBN-10: 0954523253)。
提供本文所述的定义和方法以更好地定义本公开并指导本领域的普通技术人员实践本公开。除非另外说明，否则术语应由相关领域的普通技术人员根据常规用法来理解。
在一些实施方案中，用于描述和要求保护本公开的某些实施方案的表示成分的量、性质比如分子量、反应条件等的数字应理解为在某些情况下由术语“约”修饰。在一些实施方案中，术语“约”用于指示数值包括用于确定数值的装置或方法的平均值的标准偏差。在一些实施方案中，在书面说明书和所附权利要求中阐述的数值参数为近似值，其可根据试图通过特定实施方案获得的期望的特性而变化。在一些实施方案中，应根据报告的有效数字的数目并通过应用普通的舍入技术来解释数值参数。尽管阐述本公开的一些实施方案的广泛范围的数值范围和参数为近似值，但是在具体实例中阐述的数值尽可能准确地报告。在本公开的一些实施方案中呈现的数值可能含有必然地由在其各自的测试测量中发现的标准偏差产生的某些误差。本文中数值范围的列举仅旨在用作分别指代落入范围内的每个单独数值的简写方法。除非本文另外指明，否则每个单独的数值均被结合到说明书中，就好像其在本文中单独列举一样。
在一些实施方案中，在描述特定实施方案的上下文中使用的术语“一(a)”、“一个(an)”和“该(the)”以及类似指涉(尤其是在以下权利要求中某些的上下文中)可解释为涵盖单数和复数两者，除非另外特别说明。在一些实施方案中，本文(包括权利要求)使用的术语“或”用于意指“和/或”，除非明确指明仅指代备选方案或备选方案为互斥的。
术语“包含”、“具有”和“包括”为开放式连系动词。这些动词中一个或多个的任何形式或时态，比如“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“具有(has)”、“具有(having)”、“包括(includes)”和“包括(including)”也为开放式的。例如，任何“包含”、“具有”或“包括”一个或多个步骤的方法不限于仅具有那一个或多个步骤，并且还可涵盖其他未列出的步骤。类似地，“包含”、“具有”或“包括”一个或多个特征的任何组合物或装置不限于仅具有那一个或多个特征，并且可涵盖其他未列出的特征。
除非本文另外指明或以其他方式与上下文明显矛盾，否则本文描述的所有方法可以任何合适的顺序实施。关于本文的某些实施方案提供的任何和所有实例或示例性语言(例如“比如”)的使用仅旨在更好地说明本公开，并且不对在其他方面要求保护的本公开的范围构成限制。说明书中的语言不应解释为指示对于本公开的实践必不可少的任何非要求保护的要素。
本文公开的本公开的备选要素或实施方案的分组不应解释为限制。每个组成员可单独或以与本文发现的其他组成员或其他要素的任何组合提及或要求保护。出于便利或可专利性的原因，组中的一个或多个成员可包含在组中或从中删除。当发生任何这种包含或删除时，认为说明书在本文中含有经修改的组，从而满足所附权利要求中使用的所有马库什组(Markush groups)的书面描述。
本申请中引用的所有出版物、专利、专利申请和其他参考文献出于所有目的通过参考以其全部结合至本文中，至好像每个单个出版物、专利、专利申请或其他参考文献具体地和单独地指示出于所有目的通过参考以其全部结合的相同程度。本文中参考文献的引用不应解释为承认这是本公开的现有技术。
尽管已经详细描述了本公开，但将显而易见的是修改、变化和等同实施方案是可能的而不背离所附权利要求中定义的本公开的范围。此外，应当意识到，本公开中的所有实例均作为非限制性实例提供。
实施例
提供以下非限制性实施例以进一步说明本公开。本领域的技术人员应当意识到，以下实施例中公开的技术代表发明人已经发现在本公开的实践中良好地起作用的方法，并因此可认为构成其实践模式的实例。然而，鉴于本公开，本领域的技术人员应当意识到，可在所公开的特定实施方案中进行许多变化并且仍然获得类似或相似的结果而不背离本公开的精神和范围。
实施例1：在人类干细胞衍生的β细胞中获得动态功能
以下实施例描述一种新的6阶段分化策略，以改善干细胞衍生的β (SC-β)细胞的功能性成熟，该细胞分泌大量胰岛素并且为葡萄糖反应性的，显示出第一和第二时相两者胰岛素释放。本文还描述了干细胞衍生的β细胞中的动态功能。
人类多能干细胞(hPSC)分化方案的最新进展已经生成了类似于胰腺β细胞的产生胰岛素的细胞。尽管这些干细胞衍生的β (SC-β)细胞能够经历葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)，但与胰岛相比较，每细胞的胰岛素分泌仍然低，并且缺少明显的第一和第二时相动态胰岛素释放。在本文中，这项工作报告一种分化策略，其侧重于调节TGFβ信号传导、控制细胞簇大小和使用富集的无血清培养基(ESFM)生成表达β细胞标志物并以第一和第二时相动态胰岛素分泌经历GSIS的SC-β细胞。将这些细胞移植到小鼠中大大地提高葡萄糖耐量。这些结果显示，在SC-β细胞分化期间需要抑制和允许TGFβ信号传导的特定的时间范围(或时间段)，以实现动态功能。这些细胞以动态胰岛素释放经历GSIS的能力使其成为用于糖尿病细胞疗法的有希望的细胞来源。
介绍
糖尿病为一个全球性健康问题，影响到全世界超过4亿人口，并且患病率正在上升。糖尿病主要由胰腺中的胰岛内发现的产生胰岛素的β细胞的死亡或功能障碍引起，导致胰岛素分泌异常和患者无法保持正常的血糖水平，在严重情况下会导致酮症酸中毒和死亡。患者通常依赖于胰岛素注射，但仍会遭受长期并发症的困扰，包括视网膜病、神经病、肾病和心血管疾病。一种备选治疗为通过胰岛移植来替代内源性β细胞。尽管这种疗法取得了临床成功，但尸体供体胰岛的有限可用性在很大程度上阻碍其广泛应用。
将hPSC分化为干细胞衍生的β细胞(SC-β细胞)为用于糖尿病细胞替代疗法以及其他应用(比如建模疾病和研究胰腺发育)的有希望的备选细胞来源。通过调节从胚胎发育中鉴定的途径，用hPSC进行的研究具有详细方案，以生成类似于早期内胚层和胰腺祖细胞的细胞，胰腺祖细胞可移植到啮齿动物中，并在几个月之后自发分化为β样细胞。
已经发表了用于体外生成SC-β细胞的方法，其部分地使用化合物II型Alk5抑制剂(Alk5i)以在分化的最后阶段期间抑制TGFβ信号传导30。这些方法首次产生了能够在静态温育中经历GSIS、表达β细胞标志物并在几周之后控制糖尿病小鼠血糖的SC-β细胞。然而，与人类胰岛相比较，这些细胞的功能较差，包括胰岛素分泌较低、响应高葡萄糖攻击的第一和第二时相胰岛素释放很少甚至没有，表明这些SC-β细胞不如来自胰岛的β细胞成熟。已经进行几项后续研究，引入新的分化因子或优化过程，但未能使SC-β细胞功能等同于人类胰岛14,26,36,55。
在此这项工作展示一种新的6阶段分化策略，其通过与细胞簇大小调整和ESFM培养组合，调节Alk5i暴露以在关键阶段期间抑制和允许TGFβ信号传导来生成几乎纯净的内分泌群(含有β样细胞)，所述细胞分泌高水平的胰岛素和表达β细胞标志物。这些细胞为葡萄糖反应性的，显示出第一和第二时相胰岛素释放，并对多种促分泌素作出反应。移植的细胞大大地提高小鼠的葡萄糖耐量。这项工作表明，在第6阶段期间抑制TGFβ信号传导会大大地降低这些分化细胞的功能，而在第5阶段期间用Alk5i进行处理对于稳健的β样细胞表型是必要的。
结果
体外分化为葡萄糖反应性的SC-β细胞
使用HUES8细胞系开发了改进的分化方案。在第3-4阶段期间包括Y27632和在第4阶段期间包括激活素A以助于保持簇完整性并将第3阶段从2天缩短至仅1天，以增强祖细胞。还为第6阶段开发了ESFM以替代先前使用的含血清培养基以具有无血清方案。在方案初步研究期间，观察到调整簇的大小以及去除Alk5i和T3两者均增加胰岛素分泌同时保持C-肽+群(参见例如图8A-图8B)。
组合这些修改产生了图1A中概述的新的6阶段分化方案。第6阶段细胞作为簇在悬浮培养中生长(参见例如图1B)，其直径平均为172±34 μm (平均值±标准偏差；n = 353个单个簇)，小于大小调整之前簇直径(其为364±55 μm (n = 155个单个簇))的一半。第6阶段簇对将β细胞染色的锌螯合染料双硫腙(DTZ)染成红色。除β细胞标志物PDX1+和NKX6-1+之外，切片的簇的免疫染色显示大多数细胞为C-肽+ (也是INS基因产生的蛋白) (参见例如图1C)。细胞的子集对胰高血糖素染色呈阳性(GCG+)或为多激素，对C-肽和GCG两者染色呈阳性。已知这些多激素细胞与成体β细胞不相似，并且没有功能。
使用静态(参见例如图1D-图1E、图8C)和动态GSIS测定(参见例如图1F、图8D)两者对用新的分化方案生成的第6阶段细胞测试功能，并发现当从低移动至高葡萄糖时，细胞不仅会分泌胰岛素，而且还会增加胰岛素释放。对于静态GSIS，尽管存在一定可变性，但当从2mM移动至20 mM葡萄糖时，第6阶段细胞使胰岛素分泌平均增加至3.0±0.1倍，与从先前发表的方案(在此称为Pagliuca方案30)生成的细胞(1.4±0.1)相比较有所改善，但平均少于人类胰岛(3.2±0.1) (参见例如图1D)。来自这项研究的第6阶段细胞并未响应5.6 mM葡萄糖而增加胰岛素分泌，但却响应较高浓度(11.1和20 mM)确实增加了分泌，表明细胞并未受到低葡萄糖阈值的刺激(参见例如图1E)。就每细胞的胰岛素分泌而言，在20 mM葡萄糖下，第6阶段细胞平均分泌5.3±0.5 μIU/103细胞，平均为用Pagliuca方案生成的细胞的9.2±1.1倍，并且为人类胰岛1/2.3±0.3(例如参见图1D)。
对于动态GSIS，第6阶段细胞在高葡萄糖暴露3-5分钟内显示出快速的第一时相胰岛素释放，使胰岛素分泌增加至7.6±1.3至159±21 μIU/μg DNA的倍数，高于从Pagliuca方案生成的第6阶段细胞(1.7±0.2x增加至11±1 μIU/μg DNA)但低于人类胰岛(15.0±2.4x增加至245±26 μIU/μg DNA) (参见例如图1F)。对持续的高葡萄糖暴露观察到第二时相胰岛素分泌，细胞保持的胰岛素分泌为初始低葡萄糖的2.1±0.3高，比Pagliuca方案(0.9±0.1)增加更高，但低于人类胰岛(6.7±0.8) (例如参见图1F)。当细胞恢复到低葡萄糖时，来自第6阶段细胞的胰岛素分泌恢复到下降的速率。对高葡萄糖攻击升高胰岛素分泌并显示第一和第二时相胰岛素释放为β细胞行为的关键特征。总体而言，用这种分化策略生成的第6阶段细胞产生的细胞具有明显的第一和第二时相胰岛素分泌，这通过Pagliuca30并没有得到证明，并且对用Pagliuca方案产生的第6阶段细胞也未见到。然而，当与含有β细胞的人类胰岛相比较，这些第6阶段细胞在高葡萄糖下每细胞的胰岛素分泌仍然较低，平均葡萄糖刺激较低，并且第一时相胰岛素释放略微更慢。
为了进一步表征用新的分化方案生成的第6阶段细胞，用一组胰岛标志物对细胞进行免疫染色(参见例如图2A-2C，图9)。绝大多数细胞表达泛内分泌标志物嗜铬粒蛋白A(96±1%)，并且大多数细胞表达C-肽(73±3%) (参见例如图2)。这些比例高于用Pagliuca方案生成的第6阶段细胞(参见例如图9)和先前报道的那些30。来自两种方案的许多C-肽+细胞表达在β细胞中发现的其他标志物，并且观察到其他胰腺激素的表达(参见例如图2、图9)。大多数C-肽+细胞表达NKX6-1 (参见例如图2)并且为单激素的，推测其为SC-β细胞群。与用Pagliuca方案生成的和先前报道30的第6阶段细胞相比较，不表达另一种激素的C-肽+细胞的比例增加，而这些细胞中表达另一种激素的比例却可比(参见例如图2、图9)。该数据表明，用这种新策略生成的第6阶段细胞主要是胰腺内分泌，大多数表达C-肽。
测量了几种基因的表达，比较用Pagliuca方案生成的第6阶段细胞、用来自这项工作的方案生成的第6阶段细胞以及人类胰岛(参见例如图2D和图10)。与Pagliuca方案相比较，许多胰岛和β细胞基因增加，包括INS、CHGA、NKX2-2、PDX1、NKX6-1、MAFB、GCK和GLUT1。有趣的是，与Pagliuca方案及人类胰岛(LDHA)和Pagliuca方案(SLC16A1)相比较，不允许的β细胞基因LDHA和SLC16A1在第6阶段细胞中的表达降低。与人类胰岛相比较，根据这项工作的方案生成的第6阶段细胞具有增加的CHGA、NKX6-1、MAFB、GCK和GLUT1表达。然而，与第6阶段细胞相比较，INS、GCG、SST并且特别是MAFA和UCN3的表达降低。然而，几项最新报道提供了证据，质疑MAFA和UCN3在评估人类SC-β细胞成熟中的效用。MAFA在幼稚的人类β细胞中表达较低。MAFB在人类而非小鼠β细胞中表达。UCN3在小鼠中的表达比人类β细胞中高得多，并且也由人类α细胞表达。该数据表明，与Pagliuca方案相比较，这项工作中生成的第6阶段细胞对许多标志物的基因表达均得到改善，尽管几种β细胞标志物的表达等于或大于人类胰岛，但其他标志物仍然低。
将SC-β细胞移植到不耐葡萄糖的小鼠中
为了在体内评估第6阶段细胞的功能潜力，首先在非糖尿病小鼠的肾被膜下移植细胞，并评估移植物对葡萄糖攻击作出反应的能力(参见例如图3A)。即使在延长的移植后时间(6个月)之后，移植物也通过将人类胰岛素增加至1.9±0.5倍来对葡萄糖注射作出反应。移植肾的切除和免疫染色显示除其他胰腺内分泌和外分泌标志物之外，倾向于聚集在一起的C-肽+细胞(参见例如图3B、图11A)。为了在体内更严格地评估的第6阶段细胞，移植了另一组用链脲佐菌素(STZ)化学诱导为糖尿病的小鼠，并在早期(10和16 d)和晚期(10wk)时间点评估功能。移植后仅10 d之后，与经STZ处理的假手术小鼠相比较，经STZ处理的接受第6阶段细胞的小鼠大大地提高葡萄糖耐量，并且与非经STZ处理的小鼠具有相似的葡萄糖清除(参见例如图3C-图3D)。移植之后16 d对人类胰岛素的测量显示高胰岛素浓度，其对葡萄糖注射增加到2.3±0.6倍至16.6±3.1 μIU/mL (参见例如图3E)。这些数值大于先前30在类似条件下的报道，后者具有1.4±0.3的胰岛素增加和3.8±0.8 μIU/mL的浓度。观察移植之后10 wk的组显示结果与10 d和16 d数据相似，移植的小鼠大大地提高葡萄糖耐量(参见例如图3F-图3G)和葡萄糖反应性胰岛素分泌(参见例如图3H)。未接受STZ的小鼠与接受治疗剂量的人类胰岛的小鼠具有相似的葡萄糖耐量。未接受第6阶段细胞的小鼠具有不可检测的人类胰岛素，并且接受STZ的小鼠与未经STZ处理的小鼠相比较具有急剧减少的小鼠C-肽(参见例如图11B-图11C)。来自这些经STZ处理的小鼠的移植物含有除其他内分泌和外分泌标志物之外还表达β细胞标志物的细胞(参见例如图11D)。总体而言，该数据表明，用新方案生成的第6阶段细胞在体内在早期和晚期时间点两者均为功能性的，大大地提高葡萄糖耐量至与非经STZ处理的小鼠相当。
SC-β细胞动态功能的表征
由于分化方案产生的细胞能够进行动态胰岛素分泌，因此对该表型进行了更详细的研究。随着细胞进展通过第6阶段，对其进行动态GSIS (例如参见图4A)。稳健的动态功能为瞬时的，5 d 时的细胞分泌少量的胰岛素并显示出弱的第一和第二时相，而后来的时间点(9-26 d)则分泌较高量的胰岛素，具有明显的第一和第二时相反应。在这段时间期间，C-肽+细胞的比例略有降低(参见例如图12A)。到35 d时，低葡萄糖下的胰岛素分泌增加，使得难以清楚地识别第一和第二时相。该数据表明，SC-β细胞在第6阶段需要9 d来获得动态功能，该功能持续存在数周，但在延长的体外培养之后葡萄糖反应性丧失。类似地，已知尸体人类胰岛在体外的功能寿命有限，并且其原因尚不清楚。该数据进一步表明这些细胞用于移植和药物筛选研究的最佳时间范围。为了进一步表征动态胰岛素分泌，进行灌注实验以测定SC-β细胞是否可用几种已知的促分泌素来对依序攻击作出反应(参见例如图4B)。初始高葡萄糖攻击之后，SC-β细胞能够对第二仅高葡萄糖的攻击作出反应，尽管强度不如第一攻击，并且在单独的实验中将第一葡萄糖攻击延长至1小时不会减少胰岛素分泌(例如参见图4C)。在第二攻击期间添加其他促分泌素进一步增加胰岛素分泌(参见例如图4B)。膜去极化剂KCl和L-精氨酸的增幅最大。甲苯磺丁脲(阻断钾通道)、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX；升高细胞溶质cAMP)和exendin-4 (GLP-1受体激动剂)也对单独的高葡萄糖增加胰岛素分泌。不仅胰岛素的分泌增加，而且其比对单独的高葡萄糖升高更快。然而，其他人将β样细胞与人类胰岛进行比较观察到，第6阶段细胞对KCl攻击的反应比人类胰岛中更强(参见例如图12B)，可能表明持续的未成熟或幼稚的β细胞表型。总的来说，这些数据表明SC-β细胞可对几种促分泌素作出反应，所述促分泌素具有不同的作用模式并且在药物筛选中具有潜在应用。
TGFβ信号传导在SC-β细胞分化和成熟中的作用
在评估了用新方案生成的SC-β细胞之后，对方案更改进行研究，以便深入了解SC-β细胞的分化和成熟。尽管在第6阶段期间包含Alk5i导致在静态测定中相对弱但统计学显著的GSIS，类似于来自Pagliuca方案的数据(参见例如图1D)，但省略Alk5i急剧增加胰岛素分泌和葡萄糖刺激(参见例如图5A和图13A)。胰岛素含量还随着在第6阶段期间去除Alk5i而增加(参见例如图5B)，但是胰岛素原/胰岛素比率保持相似(参见例如图5C)，表明胰岛素含量增加不是由于激素加工引起的。此外，表达胰腺内分泌标志物(包括C-肽)的细胞比例在经DMSO和Alk5i处理的细胞之间保持相似(参见例如图5D-图5E、图13B)。在使用和不使用Alk5i处理的情况下基因表达总体上相似，簇的大小调整一般地具有更大的作用(参见例如图13C)。在第6阶段期间用Alk5i处理的细胞还显著减少使用动态GSIS测定的胰岛素分泌，与用Pagliuca方案生成的细胞(参见例如图1F)相似，显示出弱至无第一和第二时相反应(参见例如图5F)。该数据表明，在第6阶段期间进行Alk5i处理会抑制SC-β细胞的功能性成熟。
在第6阶段期间用Alk5i进行的研究表明，允许TGFβ信号传导对于SC-β细胞的稳健的功能性成熟是必要的，因为抑制TGFBR1为Alk5i的典型功能。为了检验该假设，使用western印迹分析来验证TGFβ信号传导为经SMAD磷酸化在第6阶段细胞中发生(参见例如图6A)。Alk5i处理减少磷酸化的SMAD，证实TGFβ信号传导确实发生并被Alk5i抑制。不论是否对其调整大小，在第6阶段簇中均观察到SMAD磷酸化，这与不管大小调整，Alk5i处理均减少GSIS的观察结果一致(参见例如图14)。接下来，生成两种携带设计为敲减TGFBR1的shRNA的慢病毒(TGFBR1 #1和#2)。与在第6阶段细胞中靶向GFP的对照病毒相比较，这些病毒能够减少TGFBR1转录物(参见例如图6B)和减少SMAD磷酸化(参见例如图6C、图14)，尽管程度要比Alk5i处理小得多(参见例如图6A)。与Alk5i处理相似(参见例如图5A、图5F)，用针对TGFBR1的shRNA转导的第6阶段细胞在静态GSIS测定中减少胰岛素分泌和降低阳性葡萄糖反应性(参见例如图6C)，并且在动态GSIS测定中使葡萄糖反应变钝(参见例如图6D)。该数据表明，在第6阶段期间允许TGFβ信号传导对于SC-β细胞功能性成熟是重要的，而通过用Alk5i处理则抑制该功能性成熟。
最后，研究了Alk5i在分化的第5阶段期间的作用，以评估其对分化为胰腺内分泌细胞的影响。在存在或不存在Alk5i的情况下，这些实验如图1A中概述的那样进行。分化为内分泌细胞(CHGA+)的细胞比例没有变化，但通过省略Alk 5i降低了分化为C-肽+表型的细胞比例(参见例如图7A-图7C)。类似地，通过省略Alk5i降低了共表达C-肽和NKX6-1 (一种用于特化β细胞的重要转录因子)的细胞比例。INS和GCG基因表达随着Alk5i的省略而降低，但令人惊讶地，SST表达略有增加(参见例如图7D)。在没有Alk5i的情况下NKX6-1和PDX1的表达降低(参见例如图7E)，而几种胰腺内分泌标志物的表达则没有变化或仅略有变化(参见例如图7F)。为了进一步测试在第5阶段期间Alk5i的重要性，在第5阶段期间用或不用Alk5i处理的细胞均在第6阶段中在没有Alk5i也不调整簇大小的情况下进一步培养7天，并且在第5阶段期间用Alk5i处理的细胞中胰岛素分泌基本上更高(参见例如图7G)。总的来说，这些数据表明，在第5阶段期间进行Alk5i处理对特化为β样细胞的命运产生积极影响，对于特化内分泌细胞不是必要的，并且对于所得SC-β细胞的高胰岛素分泌是必要的。另外，这些观察结果说明TGFβ信号传导抑制剂Alk5i的阶段特异性处理对于生成SC-β细胞和使SC-β细胞功能性成熟的重要性。
讨论
这项工作表明，用新的6阶段分化策略实现增强的SC-β细胞的功能性成熟。这些细胞分泌大量胰岛素并且为葡萄糖反应性的，显示出第一和第二时相两者胰岛素释放。这种分化程序无需选择或分选即可生成几乎纯净的内分泌细胞群，并且大多数细胞表达C-肽和其他β细胞标志物。移植到经STZ处理的小鼠中后，葡萄糖耐量快速恢复并且功能持续存在数月。这些SC-β细胞在灌注测定中对多种促分泌素作出反应。调节TGFβ信号传导对于成功至关重要，第5阶段期间的抑制可增加SC-β细胞分化但第6阶段期间的抑制可降低功能和胰岛素含量。第6阶段期间允许TGFβ信号传导对于稳健的动态功能是必要的。
通过先前报道的方案30,32生成的SC-β细胞不响应葡萄糖刺激而产生稳健的第一和第二时相胰岛素释放。两种方案在分化的最后阶段期间均抑制TGFβ信号传导，并且许多后续报道也包括TGFβ信号传导的抑制剂，但没有表明恰当的动态功能。然而，当前研究的主要观察结果是，关键细胞过渡和成熟步骤期间TGFβ信号传导的正确调节对于成功分化为功能性SC-β细胞至关重要，而在第6阶段期间需要允许TGFβ信号传导来改善功能性成熟。
本报告中的SC-β细胞能够在10 d内快速控制经STZ处理的小鼠中的葡萄糖。目前，糖尿病细胞替代疗法的一个关键局限性为对功能性β细胞的可持续来源的需求，并且改善要移植的SC-β细胞的质量有助于克服这一挑战。通过这项工作证明的制备SC-β细胞的方法是可扩展的，在悬浮培养中细胞生长并分化为簇。在悬浮培养中使用细胞簇允许灵活性用于许多应用，比如大型动物移植研究或治疗(109级的细胞)。
由于其改善的动力学，该策略增强体外分化的SC-β细胞用于药物筛选的效用。恰当的动态胰岛素释放为通常在糖尿病中丧失的β细胞代谢的重要特征。这项工作建立了具有动态胰岛素释放的SC-β细胞的可再生资源(其可用于更好地研究糖尿病中的β细胞失效机制)并证明了其对几种促分泌素的反应。
对方案进行的许多修改的巅峰产生了显示动态葡萄糖反应的SC-β细胞。除调节TGFβ信号传导之外，其他显著变化还包括去除血清，减少簇大小以及缺少在最后阶段期间于其他报告中使用的几种另外的因子(T3、N-乙酰半胱氨酸、Trolox和R428)。尽管这项工作证明了该方案跨越多种细胞系的重现性，但标志物表达和功能在HUES8细胞系中最大。
方法
未分化细胞的培养
将未分化的hPSC系使用mTeSR1在以60 RPM旋转的旋转器搅拌板上的30 mL旋转瓶(spinner flask)中，于增湿的5% CO2和37℃温育箱中进行培养。使细胞通过单细胞分散每3-4天进行传代。HUES8 hESC系、1013-4FA (非糖尿病性hiPSC系)、1016SeVA (非糖尿病性hiPSC系)和1019SeVF (1型糖尿病性hiPSC系)已于先前发表26,30。将未分化的细胞使用mTeSR1 (StemCell Technologies; 05850)在以60 RPM旋转的旋转器搅拌板(Chemglass)上的30 mL旋转瓶(REPROCELL; ABBWVS03A)中，于增湿的5% CO2和37℃温育箱中进行培养。使细胞使用Accutase (StemCell Technologies; 07920)通过单细胞分散每3-4天进行传代，用Vi-Cell XR (Beckman Coulter)计数活细胞，并以6 x 105细胞/mL接种于mTeSR1+10 μM Y27632 (Abcam; ab120129)中。
细胞系分化
为了启动分化，使用Accutase使未分化的细胞进行单细胞分散，并以6 x 105细胞/mL接种于30 ml旋转瓶中的mTeSR1 + 10 μM Y27632中。然后将细胞在mTeSR1中培养72小时，并然后在以下分化培养基中培养进行。第1阶段(3天)：S1培养基+ 100 ng/ml激活素A(R&D Systems; 338-AC) + 3 μM Chir99021 (Stemgent; 04-0004-10)，持续1天。S1培养基+ 100 ng/ml激活素A，持续2天。第2阶段(3天)：S2培养基+ 50 ng/ml KGF (Peprotech;AF-100-19)。第3阶段(1天)：S3培养基+ 50 ng/ml KGF + 200 nM LDN193189 (Reprocell;040074) + 500 nM PdBU (MilliporeSigma; 524390)+ 2 μM视黄酸(MilliporeSigma;R2625) + 0.25 μM Sant1 (MilliporeSigma; S4572) + 10 μM Y27632。第4阶段(5天)：S4培养基+ 5 ng/mL激活素A + 50 ng/mL KGF + 0.1 μM视黄酸+ 0.25 μM SANT1 + 10 μMY27632。第5阶段(7天)：S5培养基+ 10 μM ALK5i II (Enzo Life Sciences; ALX-270-445-M005)+ 20 ng/mL β细胞素(R&D Systems; 261-CE-050)+ 0.1 μM视黄酸+ 0.25 μMSANT1 + 1 μM T3 (Biosciences; 64245) + 1 μM XXI (MilliporeSigma; 595790)。第6阶段(7-35天)：ESFM。
使用的分化培养基配方如下。S1培养基：补充有0.22 g葡萄糖(MilliporeSigma;G7528)、1.23 g碳酸氢钠(MilliporeSigma; S3817)、10 g牛血清白蛋白(BSA) (Proliant;68700)、10 μL ITS-X (Invitrogen; 51500056)、5 mL GlutaMAX (Invitrogen;35050079)、22 mg维生素C (MilliporeSigma; A4544)和5 mL青霉素/链霉素(P/S)溶液(Cellgro; 30-002-CI)的500 mL MCDB 131 (Cellgro; 15-100-CV)。S2培养基：补充有0.22 g葡萄糖、0.615 g碳酸氢钠、10 g BSA、10 μL ITS-X、5 mL GlutaMAX、22 mg维生素C和5 mL P/S 的500 mL MCDB 131。S3培养基：补充有0.22 g葡萄糖、0.615 g碳酸氢钠、10 gBSA、2.5 mL ITS-X、5 mL GlutaMAX、22 mg维生素C和5 mL P/S的500 mL MCDB 131。S5培养基：补充有1.8 g葡萄糖、0.877 g碳酸氢钠、10 g BSA、2.5 mL ITS-X、5 mL GlutaMAX、22mg维生素C、5 mL P/S和5 mg肝素(MilliporeSigma; A4544)的500 mL MCDB 131。ESFM：补充有0.23 g葡萄糖、10.5 g BSA、5.2 mL GlutaMAX、5.2 mL P/S、5 mg肝素、5.2 mL MEM非必需氨基酸(Corning; 20-025-CI)、84 μg ZnSO4 (MilliporeSigma; 10883)、523 μL微量元素A (Corning; 25-021-CI)和523 μL微量元素B (Corning; 25-022-CI)的500 mL MCDB131。细胞有时用0.01% DMSO进行培养。通过在Gentle Cell Dissociation Reagent(StemCell Technologies; 07174)中温育8分钟，用ESFM洗涤，通过100 μm尼龙细胞过滤器(Corning; 431752)并在设置为100 RPM的Orbi-Shaker (Benchmark)上的6孔板中的ESFM中进行培养来调整第6阶段第一天的细胞大小。除非另外说明，否则在第6阶段的10-16天之间进行评估测定。从Prodo Labs获得人类胰岛用于比较。用Alk5i和T3，用Alk5i和/或CMRL1066 Supplemented (CMRLS) (Mediatech; 99-603-CV) + 10%胎牛血清(FBS) (HyClone;16777) + 1% P/S而不是ESFM，如所示地在没有簇大小调整的情况下进行第6阶段实验的子集。为了进行Pagliuca方案，在30 mL旋转瓶中遵循在Pagliuca, Millman, Gürtler etal. 201430中概述的方案。
光学显微术
使用倒置光学显微镜(Leica DMi1)拍摄未经染色或用2.5 μg/mL DTZ(MilliporeSigma; 194832)染色的细胞簇的光学显微图像。
免疫染色
为了对体外细胞簇或小鼠肾脏内的离体移植的移植物进行免疫染色，将样品用4%多聚甲醛(Electron Microscopy Science; 15714)在4℃下固定过夜。固定之后，将细胞簇包埋在Histogel (Thermo Scientific; hg-4000-012)中。将包埋的细胞簇和移植物置于70%乙醇中，并提交进行石蜡包埋和切片。使用Histoclear (Thermo Scientific; C78-2-G)去除石蜡，使样品重新水化，并在压力锅(Proteogenix; 2100 Retriever)中用0.05 MEDTA (Ambion; AM9261)回收抗原。封闭样品并用染色缓冲液(5%驴血清(JacksonImmunoresearch; 017-000-121)和0.1% Triton-X 100 (Acros Organics; 327371000)在PBS中)透化30分钟，在4℃下用一抗染色过夜，在4℃下用二抗染色2小时，并用封固溶液DAPI Fluoromount-G (SouthernBiotech; 0100-20)进行处理。为了将平板接种的细胞进行免疫染色，使用TryplE Express (Fisher, 12604039)将簇单细胞分散，平板接种到Matrigel (Fisher, 356230)包被的平板上，在ESFM中培养16小时，并在RT下用4%多聚甲醛固定30分钟。封闭固定的细胞并在RT下用染色缓冲液透化45分钟，在4℃下用一抗染色过夜，在RT下用二抗染色2小时，并用DAPI染色5分钟。成像在Nikon A1Rsi共聚焦显微镜或Leica DMI4000荧光显微镜上进行。
除非另外说明，否则用以下抗体以1:300稀释度在染色缓冲液中制备一抗溶液：大鼠抗C-肽(DSHB; GN-ID4-S)、1:100小鼠抗nkx6.1 (DSHB, F55A12-S)、小鼠抗胰高血糖素(ABCAM; ab82270)、山羊抗pdx1 (R&D Systems; AF2419)、兔抗生长抑素(ABCAM;ab64053)、小鼠抗pax6 (BDBiosciences;561462)、兔抗嗜铬粒蛋白a (ab15160)、山羊抗neurod1 (R&D Systems; AF2746)、小鼠抗Islet1 (DSHB, 40.2d6-s)、1:100小鼠抗细胞角蛋白19 (Dako; MO888)、未经稀释的兔抗胰高血糖素(Cell Marque; 259A-18)、1:100绵羊抗胰蛋白酶(R&D Systems; AF3586)。用以下抗体以1:300稀释度在染色缓冲液中制备二抗溶液：抗大鼠alexa fluor 488 (Invitrogen; a21208)、抗小鼠alexa fluor 594(Invitrogen; a21203)、抗兔alexa fluor 594 (Invitrogen; a21207)、抗山羊alexafluor 594 (Invitrogen; a11058)。
静态GSIS
通过收集~20-30个第6阶段簇或尸体人胰岛，用KRB缓冲液(128 mM NaCl、5 mMKCl、2.7 mM CaCl2、1.2 mM MgSO4、1 mM Na2HPO4、1.2 mM KH2PO4、5 mM NaHCO3、10 mMHEPES (Gibco; 15630-080)和0.1% BSA)洗涤两次，重悬于2 mM葡萄糖KRB中，并置于24孔板的transwell (Corning; 431752)中进行测定。将簇在2 mM葡萄糖KRB下温育1小时进行平衡。然后排空transwell并转移到新的2 mM葡萄糖KRB孔中，弃去旧的KRB溶液。将簇再次在低葡萄糖下温育1小时，并然后排空transwell且转移到新的2、5.6、11.1或20 mM葡萄糖KRB孔中，保留旧的2 mM葡萄糖KRB。然后将簇在高葡萄糖下温育1小时，并然后排空transwell且保留旧的葡萄糖KRB。保留的KRB与人类胰岛素Elisa (ALPCO; 80-INSHU-E10.1)一起运行以量化胰岛素分泌。通过TrypLE处理使细胞进行单细胞分散，在Vi-CellXR上计数，并将活细胞计数用于归一化胰岛素分泌。
动态葡萄糖刺激的胰岛素分泌
如先前已经报道5的那样组装灌注系统。系统使用高精度的8通道分配器泵(ISMATEC; ISM931C)连同连接于275 μl细胞室(BioRep; Peri-Chamber)的0.015英寸入口和出口两阑式管路(ISMATEC; 070602-04i-ND)和使用0.04英寸连接管路(BioRep; Peri-TUB-040)的分配喷嘴(BioRep; PERI-NOZZLE)。将溶液、管路和细胞以水浴保持在37℃下。将第6阶段簇和尸体人类胰岛用KRB洗涤两次并重悬于2 mM葡萄糖KRB中。然后将细胞加载到夹在两层Bio-Gel P-4聚丙烯酰胺珠粒(Bio-Rad; 150-4124)之间的Biorep灌注室上。在收集样品之前，将细胞用2 mM葡萄糖KRB灌注90分钟进行平衡。对于单一高葡萄糖攻击，样品收集开始于使细胞暴露于2 mM葡萄糖KRB 12分钟，然后进行24分钟的20 mM葡萄糖KRB和回到2 mM葡萄糖KRB另外12分钟。对于多重促分泌素攻击，样品收集开始于使细胞暴露于2mM葡萄糖KRB中6分钟，然后进行12分钟的20 mM葡萄糖KRB、6 min 2 mM葡萄糖KRB、12分钟的20 mM葡萄糖KRB+处理和最后6分钟的2 mM葡萄糖KRB。用多种促分泌素的处理如下：仅20mM葡萄糖、10 nM Extendin-4(MilliporeSigma; E7144)、100 μM IBMX (MilliporeSigma;I5879)、300 μM甲苯磺丁脲(MilliporeSigma; T0891)、20 mM L-精氨酸(MilliporeSigma;A5006)和30 mM KCL (Thermo Fisher; BP366500)。以100 μl/min的流速和以2-4分钟的收集点收集流出物。样品收集之后，收集簇并使其于10 mM Tris (MilliporeSigma; T6066)、1 mM EDTA和0.2% Triton-X 100溶液中裂解，且使用Quant-iT Picogreen dsDNA测定试剂盒(Invitrogen; P7589)对DNA进行量化。使用Human Insulin Elisa试剂盒量化胰岛素分泌。
流式细胞术
将簇用TrypLE进行单细胞分散，在4℃下用4%多聚甲醛固定30分钟，封闭并在4℃下用染色缓冲液透化30分钟，在染色缓冲液中与一抗一起在4℃下温育过夜，在染色缓冲液中与二抗一起在4℃下温育2小时，重悬于染色缓冲液中，并在LSRII (BD Biosciences)或X-20 (BD Biosciences)上进行分析。使用FlowJo生成点状图和百分比。除另外说明之外，所有抗体均以1:300稀释度使用。使用的抗体为：大鼠抗C-肽、小鼠抗nkx6.1 (1:100)、小鼠抗胰高血糖素、兔抗生长抑素、兔抗嗜铬粒蛋白A (1:1000)、山羊抗pdx1、抗大鼠alexafluor 488、抗小鼠alexa fluor 647 (Invitrogen; a31571)、抗兔alexa fluor 647(Invitrogen; a31573)、抗山羊alexa fluor 647 (Invitrogen; a21447)、抗兔alexafluor 488 (Invitrogen; a21206)。
实时PCR
使用带有DNA酶处理(Qiagen; 79254)的RNeasy Mini Kit (Qiagen; 74016)提取RNA，并使用High Capacity cDNA Reverse Transcriptase Kit (Applied Biosystems;4368814)合成cDNA。在StepOnePlus (Applied Biosystems)上的PowerUp SYBR GreenMaster Mix (Applied Biosystems; A25741)中进行实时PCR反应，并使用ΔΔCt方法进行分析。TBP用作归一化基因。
表1. 使用的引物序列(基因、正向引物、反向引物).
基因名称 SEQ ID NO. 正向引物序列 SEQ ID NO. 反向引物序列
INS 1 CAATGCCACGCTTCTGC 2 TTCTACACACCCAAGACCCG
PDX1 3 CGTCCGCTTGTTCTCCTC 4 CCTTTCCCATGGATGAAGTC
GCG 5 AGCTGCCTTGTACCAGCATT 6 TGCTCTCTCTTCACCTGCTCT
SST 7 TGGGTTCAGACAGCAGCTC 8 CCCAGACTCCGTCAGTTTCT
TBP 9 GCCATAAGGCATCATTGGAC 10 AACAACAGCCTGCCACCTTA
NKX6-1 11 CCGAGTCCTGCTTCTTCTTG 12 ATTCGTTGGGGATGACAGAG
CHGA 13 TGACCTCAACGATGCATTTC 14 CTGTCCTGGCTCTTCTGCTC
NEUROD1 15 ATGCCCGGAACTTTTTCTTT 16 CATAGAGAACGTGGCAGCAA
NGN3 17 CTTCGTCTTCCGAGGCTCT 18 CTATTCTTTTGCGCCGGTAG
NKX2-2 19 GGAGCTTGAGTCCTGAGGG 20 TCTACGACAGCAGCGACAAC
TGFBR1 21 CGACGGCGTTACAGTGTTTCT 22 CCCATCTGTCACACAAGTAAA
GUSB 23 CGTCCCACCTAGAATCTGCT 24 TTGCTCACAAAGGTCACAGG
UCN3 25 GGAGGGAAGTCCACTCTCG 26 TGTAGAACTTGTGGGGGAGG
MAFA 27 GAGAGCGAGAAGTGCCAACT 28 TTCTCCTTGTACAGGTCCCG
GCK 29 ATGCTGGACGACAGAGCC 30 CCTTCTTCAGGTCCTCCTCC
MAFB 31 CATAGAGAACGTGGCAGCAA 32 ATGCCCGGAACTTTTTCTTT
LDHA 33 GGCCTGTGCCATCAGTATCT 34 GGAGATCCATCATCTCTCCC
GLUT1 35 ATGGAGCCCAGCAGCAA 36 GGCATTGATGACTCCAGTGTT
SLC16A1 37 CACTTAAAATGCCACCAGCA 38 AGAGAAGCCGATGGAAATGA
移植研究
所有动物工作均根据华盛顿大学国际动物护理和使用委员会(WashingtonUniversity International Animal Care and Use Committee)的规定进行。将小鼠随机分配至移植组或无移植组，将小鼠的数量基于先前研究选择为足以具有统计显著性。所有程序均由非盲个体进行。在该研究中使用两个小鼠组。第一组由购自Charles River的50-56日龄非经STZ处理的SCID/Beige雄性小鼠组成。第二组由购自Jackson Laboratories的6周龄经STZ处理和经对照处理的NOD/SCID雄性小鼠组成。小鼠用异氟烷麻醉，并与先前报道的相似在肾被膜下注射~5x106第6阶段细胞或盐水(无移植对照)。通过进行葡萄糖耐量测试和体内GSIS监测小鼠长达移植之后6个月。将小鼠禁食16小时，并然后注射2 g/kg的葡萄糖。经尾部出血采集血液。用手持式血糖仪(Contour Blood Glucose Monitoring SystemModel 9545C; Bayer)测量血糖水平。通过采集血液并在microvette (Sarstedt;16.443.100)中分离血清且使用Human Ultrasensitive Insulin ELISA (ALPCODiagnostics; 80-ENSHUU-E01.1)量化来测定人类胰岛素。通过从饲养的小鼠中采集血液，在microvette中分离血清并使用小鼠C肽ELISA (ALPCO Diagnostics; 80-CPTMS-E01)量化来测定小鼠的血清C-肽浓度。
胰岛素和胰岛素原含量
将第6阶段簇用PBS彻底洗涤，浸没在1.5% HCl和70%乙醇的溶液中，在-20℃下保持24小时，取回并剧烈涡旋，返回并在-20℃下保持另外24小时，取回并剧烈涡旋，并在2100RCF下离心15分钟。收集上清液并用等体积的1 M TRIS (pH 7.5)中和。人类胰岛素和胰岛素原含量分别使用Human Insulin Elisa和Proinsulin Elisa (Mercodia; 10-1118-01)量化。将样品针对使用Vi-Cell XR进行的活细胞计数归一化。
Western印迹
用PBS洗涤之后，通过置于western印迹裂解缓冲液(由50 mM HEPES、140 mM NaCl(MilliporeSigma; 7647-14-5)、1 mM EDTA (MilliporeSigma; 1233508)、1% Triton X-100、0.1%脱氧胆酸钠(MilliporeSigma: D6750)、0.1% SDS (ThermoScientific;24730020)、1mM Na3VO4 (MilliporeSigma; 450243)、10 mM NaF (MilliporeSigma;S7920)和1%蛋白酶抑制剂混合物(MilliporeSigma; p8340)组成中，在振荡器上于4℃下温育15分钟，并在10000 RCF下于4℃下离心10分钟，从细胞簇中提取蛋白。用Pierce BCAProtein Assay (Thermo Scientific; 23228)量化蛋白的量。将蛋白(30 μg)加载到4-20%梯度聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen; SP04200BOX)上，通过电泳分离，并转移到0.45 μm硝酸纤维素膜(BioRad; 1620115)上。硝酸纤维素膜用Blotting Grade Blocker (BioRad;170-6404)封闭，并与兔抗磷酸化-SMAD2/3 1:1000 (Cell Signaling Technologies;8828)和兔抗肌动蛋白1:1000 (Santa Cruz Biotechnology; SC1616)抗体一起在封闭剂中于4℃下温育过夜。洗涤膜，并用兔二抗1:2500 (Jackson Immuno ResearchLaboratories; 211-032-171)在封闭剂中于4℃下染色2小时，且使用SuperSignal WestFemto (Thermo Scientific; 34096)显影。图像在Odyssey FC (Li-COR)上拍摄。成像之后，使用Restore Western Blot Stripping Buffer (Thermo Scientific; 21059)剥离硝酸纤维素膜，与兔抗SMAD2/3 (Cell Signaling Technologies; 8685)抗体一起在4℃下温育过夜，洗涤并用兔二抗1:2500在封闭剂中于4℃下染色2小时，使用SuperSignal WestFemto显影，并使用Odyssey FC成像。
慢病毒
含有shRNA序列的pLKO.1 TRC质粒包含以下序列：shRNA GFP，GCGCGATCACATGGTCCTGCT (SEQ ID NO: 89)；shRNA TGFBR1 #1，GATCATGATTACTGTCGATAA(SEQ ID NO: 90)；shRNA TGFBR1 #2，GCAGGATTCTTTAGGCTTTAT (SEQ ID NO: 91)。使用pMD-Lgp/RRE和pCMV-G以及RSV-REV包装质粒生成并滴定慢病毒颗粒，以含有shRNA。第6阶段第1天的细胞使用TrypLE进行单细胞分散，并将300万个细胞在振荡器上以MOI 3-5接种于4 mL ESFM慢病毒颗粒中。转导后16小时，用新鲜的ESFM洗涤转导的细胞。在第6阶段第13天进行RNA提取和静态GSIS。
统计分析
使用所示的统计检验，使用GraphPad Prism计算统计显著性。斜率和斜率误差用Excel中的LINEST函数计算。除非另外说明，否则数据显示为平均值±SEM，或者如所示的显示最小至最大点的范围的盒须图。n表示独立实验的总数。
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实施例2：人类胰腺细胞命运的细胞骨架调控
以下实施例描述增强胰腺分化的细胞骨架调节。细胞骨架调节方法可用于生成数种谱系的细胞而不仅仅是胰腺细胞。此外，该实施例还描述用于从人类多能干细胞(hPSC)制备产生胰岛素的β样细胞以用于1型糖尿病(T1D)细胞替代疗法和进行药物筛选的疾病建模的方法。
在将人类多能干细胞(hPSC)分化为产生胰岛素的β细胞方面取得了最新进展，细胞替代疗法的最终目标是用于胰岛素依赖型糖尿病。这些方法利用可溶性因子的添加以激活发育信号转导途径来驱动胰腺命运。有趣的是，目前所有成功的方案均必须包括三维细胞聚集，但是此要求的原因尚不清楚。这项工作用驱动胰腺谱系的特化的关键胰腺转录因子的表达在微环境和肌动蛋白细胞骨架的状态之间建立联系。结果表明肌动蛋白细胞骨架的时间控制强烈地影响对内胚层谱系的细胞命运选择。细胞-生物材料相互作用和肌动蛋白解聚剂拉春库林A的组合用于开发新的二维分化方案，以生成干细胞衍生的β(SC-β)细胞，其在几种hPSC系中具有高度重现性，能够进行稳健的动态葡萄糖刺激的胰岛素分泌。此外，这项工作表明，这些SC-β细胞能够快速逆转小鼠中严重的预先存在的糖尿病。
介绍
用于产生SC-β细胞的方案的最新发展提供了用于治疗糖尿病的基于细胞的疗法的希望。这些分化策略依赖于特定发育途径用可溶性生长因子和小分子的精确激活和抑制，以实现功能性SC-β细胞命运。有趣的是，目前所有成功的SC-β细胞方案均必须利用细胞的三维排列，作为悬浮簇或气-液界面上的聚集体，以将胰腺祖细胞分化为SC-β细胞。此要求的原因尚不清楚，特别是在了解不溶性微环境对胰腺命运选择的影响方面。
当前生成SC-β细胞的方法通过中间内胚层和胰腺祖细胞阶段分化hPSC。给定适当的信号，这些祖细胞能够产生非胰腺谱系，比如肠或肝细胞(肝脏细胞)。在胰腺谱系内，在诱导NKX6-1+胰腺祖细胞之前，内分泌基因(比如NEUROG3)的过早诱导导致生成非β细胞多激素细胞。尽管仅已用三维细胞排列实现了完全分化为SC-β细胞命运，但在二维和三维细胞培养两者中均证明了该NKX6-1+表型的诱导。
细胞可经称为整联蛋白的跨膜蛋白感知其周围的微环境，α和β整联蛋白亚基的不同组合决定特定细胞可粘附的细胞外基质(ECM)蛋白。结合于ECM蛋白的整联蛋白聚集在一起并募集充当肌动蛋白细胞骨架组装的锚的其他粘附蛋白，为细胞产生机械力提供手段。这些力不仅允许细胞迁移并改变形状，而且其还可转导为细胞内的生化信号传导。ECM底物的特定物质特性可通过改变肌动蛋白的聚合程度来急剧地影响这一反应。例如，已显示出基底刚度、几何形状和粘附密度均指导干细胞分化。然而，这种操纵细胞骨架的概念尚未广泛应用于内胚层谱系的分化。
在本文中，这项工作鉴定出肌动蛋白细胞骨架的状态对内胚层细胞命运的选择至关重要。在SC-β细胞的背景下，细胞骨架的状态会急剧地影响NEUROG3诱导的内分泌诱导和随后的SC-β细胞特化。通过利用细胞-生物材料相互作用以及肌动蛋白细胞骨架的小分子调控剂的组合，控制内分泌转录因子表达的时机以调节分化命运并开发出用于制备SC-β细胞的二维方案。重要的是，这种新的平面方案大大地增强从诱导性多能干细胞(iPSC)系分化的SC-β细胞的功能并放弃对三维细胞排列的要求。在分化的特定点不同程度的肌动蛋白聚合使细胞偏向不同的内胚层谱系，并因此非最佳的细胞骨架状态导致SC-β细胞特化的大大地低效率。此外，这项工作表明，控制肌动蛋白聚合的这一概念可用于这些其他内胚层细胞命运的定向分化以调节谱系特化。
结果
肌动蛋白细胞骨架调控表达PDX1的祖细胞的维持
为了更好地了解微环境对SC-β细胞分化的作用，用基于悬浮的分化方案生成第3阶段PDX1+胰腺祖细胞，从这些簇中创建单细胞分散体，并将细胞接种到包被有广泛种类的ECM蛋白的组织培养聚苯乙烯(TCP)平板上(参见例如图15a-图15b、图21a)。方案的该阶段设计为生成NKX6-1+胰腺祖细胞，而随后的第5阶段通过诱导NEUROG3启动这些祖细胞的内分泌诱导。来自这些实验的最引人注目的观察结果是，相对于正常的悬浮簇，将细胞在大多数ECM蛋白上平板接种第4阶段的持续时间防止了NEUROG3的过早表达，而使细胞在单细胞分散之后又重新聚集成簇大大地增加表达(参见例如图15c、图21b)。下游NEUROG3靶标NKX2.2和NEUROD1遵循相同的下降趋势，而SOX9表达增加(参见例如图15c、图21b)。有趣的是，诱导最高NEUROG3表达的ECM蛋白为层粘连蛋白211，其对应于差的细胞粘附(参见例如图21b)。在第4阶段开始和结束时进行的基于抗体的整联蛋白粘附比色测定证实结合于胶原蛋白I和IV (α1，α2，β1)、纤连蛋白(αV，β1，α5β1)、玻连蛋白(αV，β1，αVβ5)和一些但不是全部层粘连蛋白同种型(α3，β1)的整联蛋白亚基的高表达(参见例如图21c)。因此，强烈附着于培养表面而不是特定ECM蛋白包被层的组成防止第4阶段期间的过早内分泌诱导。
与将细胞平板接种到TCP平板上相比较，作为簇悬浮培养细胞之间的一个主要差异是每个细胞经受的基底刚度差异大。为了测试基底刚度对内分泌诱导的影响，将表达PDX1的胰腺祖细胞平板接种到附着于TCP平板上的各种高度的1型胶原蛋白凝胶上，因为降低凝胶高度增加细胞经受的有效刚度。增加凝胶高度导致NEUROG3、NKX2.2和NEUROD1的增加和SOX9的减少，这与内分泌诱导一致(参见例如图15d)。NKX6-1表达遵循与NEUROG3相反的趋势，说明由软质基底诱导的过早NEUROG3表达不利于胰腺祖细胞中的NKX6-1诱导。
为了进一步探究细胞粘附如何影响内分泌诱导，用影响细胞粘附不同方面的因子进行化合物筛选。该筛选显示，结合并隔离细胞骨架肌动蛋白的单体形式的拉春库林A大大地增加NEUROG3及其下游靶标NKX2.2和NEUROD1的表达(参见例如图15e-图15f)。该增加甚至大于由γ-分泌酶抑制剂XXi诱导的增加，后者抑制NOTCH信号传导并已用于生成内分泌细胞。响应拉春库林A处理的NEUROG3表达对于HUES8 (参见例如图15g)和两种iPSC系(参见例如图22a)两者均为高度剂量依赖性的。化合物的较不有效的形式拉春库林B也以剂量依赖性方式增加NEUROG3的表达，但是需要~10x的更高浓度才能达到类似效果(参见例如图22b)。NKX6-1表达遵循与NEUROG3相反的趋势(参见例如图15f-图15g)，再次表明需要防止过早的NEUROG3表达，以便NKX6-1在第4阶段期间开启。
用1 μM拉春库林A处理平板接种的第4阶段细胞24小时，导致F-肌动蛋白的几乎完全解聚(参见例如图15h)和G/F-肌动蛋白比率增加(参见例如图15i)，对应于高NEUROG3表达。此外，所有条件下的G/F-肌动蛋白比率均与观察到的NEUROG3表达趋势一致(参见例如图15c)，其中平板接种的细胞水平最低，然后是正常的悬浮培养、重新聚集的簇，最后是平板接种的接受拉春库林A处理的细胞。相比之下，在分散之后的重新聚集期间向胰腺祖细胞中添加肌动蛋白聚合剂jasplakinolide使过早的NEUROG3表达减弱(参见例如图22c)。总体而言，这些数据表明肌动蛋白细胞骨架的聚合状态对于重要的胰腺转录因子NEUROG3和NKX6-1的表达至关重要。
细胞骨架状态指导胰腺祖细胞程序
为了进一步研究细胞骨架的状态如何影响胰腺祖细胞程序，对在整个第4阶段，用细胞骨架调节化合物拉春库林A或诺考达唑处理的平板接种的胰腺祖细胞进行单细胞RNA测序。尽管拉春库林A使这些平板接种的祖细胞的F-肌动蛋白解聚，但用诺考达唑处理则使微管解聚，从而导致F-肌动蛋白过度收缩。到第4阶段结束时，对于无指导聚集鉴定了4个群(例如参见图16a-图16b、图22d)。通过其SOX9和PDX1的表达鉴定两个胰腺祖细胞群，但基于差异的NKX6-1表达进行区分。相比之下，经历过早内分泌诱导的细胞具有高的标志物比如CHGA、NEUROG3、NKX2-2、NEUROD1和ISL1表达。然而重要的是，它们缺少NKX6-1表达。外分泌祖细胞的特征为高的导管标志物(KRT7和KRT19)和腺泡标志物PRSS1 (胰蛋白酶)表达。
第4阶段期间的细胞骨架状态对将细胞分布到这4个组中具有剧烈影响(参见例如图16c)。平板接种的对照中的最大细胞群(39.0%)为表达NKX6-1的胰腺祖细胞2，其为方案的该阶段期望的祖细胞群。很少这些平板接种的细胞表达内分泌基因(4.9%)。相反，拉春库林A处理可减少NKX6-1+群(2.5%)，同时急剧增加内分泌诱导(44.7%)。这些结果与前述qRT-PCR数据相对应，说明平板接种胰腺祖细胞可防止NEUROG3开启，但可促进NKX6-1表达，而拉春库林A为有效的内分泌诱导剂。相比之下，用诺考达唑处理可促进外分泌样祖细胞(67.0%)。这些数据表明第4阶段期间NKX6-1表达需要最佳的细胞骨架状态。具体地讲，第4阶段期间解聚的细胞骨架会导致内分泌诱导，之后才能开启NKX6-1，而过度激活的细胞骨架也会阻止NXK6-1表达，而是会促进外分泌祖细胞样命运。总的来说，这些数据表明肌动蛋白细胞骨架在胰腺祖细胞中的聚合状态为胰腺细胞命运的关键调控剂。
向SC-β细胞的分化受到肌动蛋白细胞骨架的时间调控
胰腺转录因子表达的时机，特别是NKX6-1和NEUROG3，对恰当的SC-β细胞分化至关重要。具体地讲，如果在NKX6-1之前表达NEUROG3，则出现非功能性多激素细胞或胰高血糖素阳性细胞，而在NKX6-1诱导之后表达NEUROG3则导致SC-β细胞命运。由于细胞骨架的状态对于这些基因的表达至关重要，因此在胰腺祖细胞平板接种于1型胶原蛋白包被的TCP之后，在整个SC-β细胞分化方案的不同阶段均添加了拉春库林A。在没有添加拉春库林A的情况下，平板接种的胰腺祖细胞的分化效率差(参见例如图17a)，并且所得细胞分泌很少胰岛素(参见例如图17b)。在整个第4阶段(胰腺祖细胞)或第6阶段(SC-β细胞成熟)中添加0.5 μM拉春库林A可增加一般内分泌诱导(CHGA+)和β细胞特化(NKX6-1+/c-肽+)两者。然而，在设计为诱导内分泌的第5阶段期间添加的拉春库林A导致内分泌诱导、SC-β细胞特化和葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)的增加最大(参见例如图17a-b)。这些数据表明，胰腺祖细胞附着到TCP上可抑制SC-β细胞分化，这可通过肌动蛋白细胞骨架用拉春库林A的阶段依赖性解聚来克服。
为了优化拉春库林A对SC-β细胞诱导的益处，在第5阶段期间测试了一系列持续时间和浓度(参见例如图17c)。持续时间和浓度两者均影响GSIS，在第5阶段的前24小时期间进行的1 μM处理以最短和最低的剂量获得最大益处。这种24小时的处理似乎足以挽救SC-β细胞的特化，而在第5阶段中用拉春库林A进行的延长培养则阻碍这一作用。随后的表征表明，该24小时1 μM拉春库林A处理可增加总胰岛素含量(参见例如图17d)，改善胰岛素原/胰岛素比率(参见例如图17e)和增加内分泌基因的表达(参见例如图17f)。与其他内胚层谱系相关的标志物的表达减少(参见例如图17f)，脱靶细胞类型的区域也减少，所述细胞类型易于通过细胞形态的差异进行视觉区分和用其他非胰腺标志物(比如AFP)染色(例如参见图17g)。尽管在第6阶段中用拉春库林A处理生成的平板接种的SC-β细胞在TCP上为功能性的(参见例如图17c)，但其也可在定轨振荡器上的6孔板内聚集成簇(参见例如图17h)。可通过灌注系统中的动态GSIS测定评估所得的簇，其显示出第一和第二时相两者胰岛素分泌(参见例如图17i)。
总体而言，这些数据表明，细胞骨架的状态对于维持胰腺祖细胞和特化胰腺细胞命运(特别是特化成SC-β细胞)至关重要。具体地讲，足够的细胞骨架聚合对于第4阶段期间的胰腺祖细胞程序很重要，但是向SC-β细胞的分化需要在第5阶段内分泌诱导期间进行肌动蛋白解聚。尽管TCP的高刚度会诱导肌动蛋白聚合(其第4阶段期间阻止过早的NEUROG3表达和促进NKX6-1表达)，但其还在第5阶段期间抑制NEUROG3的表达，从而阻断SC-β细胞的特化。用拉春库林A处理在第5阶段期间使细胞骨架解聚，使得能够在TCP上稳健地生成功能性SC-β细胞而无需三维细胞排列。
拉春库林A处理使平面方案能够用于制备SC-β细胞
先前的ECM和细胞骨架实验最初在前3个阶段内使用基于悬浮的分化方案分化细胞以产生胰腺祖细胞，然后附着到TCP上以继续分化和实验(参见例如图15a)。利用对细胞骨架在胰腺分化中的作用的新认识，这项工作开发了新的完全平面的SC-β细胞分化方案，以克服对三维细胞排列的本领域当前要求(参见例如图18a)。与较早的实验相似，在第4阶段期间添加拉春库林A显著增加NEUROG3及其下游靶标的过早表达，同时降低NKX6-1表达(参见例如图23a)，证实用两种方案生成的胰腺祖细胞对拉春库林A的反应相似。在平面培养中没有使用拉春库林A的情况下，几乎没有生成SC-β细胞(参见例如图18b)，这与先前报道中的三维培养的要求一致。然而，在平面分化期间第5阶段的前24小时中添加1 μM拉春库林A大大地增加内分泌诱导和SC-β细胞特化，同时减少脱靶谱系(参见例如图18b、图22b-图22d)。
为了进一步表征这种新的平面分化方案，用该平面方案分化来自先前工作的3种hPSC系(HUES8、1013-4FA和1016SeVA)。在第6阶段的一周之后，细胞可在定轨振荡器上聚集成簇，以用于与基于悬浮的分化相同的体外和体内评估方法。这产生具有高达约40%的SC-β细胞(NKX6-1+/c-肽+)和低百分比的多激素细胞(C-肽+/GCG+或C-肽+/SST+)的聚集的簇(参见例如图18c)。许多β细胞和胰岛基因的表达与人类胰岛中的表达相似，但是MAFA和UCN3表达仍然低(参见例如图18d)，类似于对悬浮方案的报道。这些簇内的大多数细胞用c-肽免疫染色，并且与几种重要的β-细胞标志物共同阳性(参见例如图18e、图23e-图23f)。所有3个系具有相似的胰岛素含量(参见例如图18f)、胰岛素原/胰岛素比率(参见例如图18g)、静态GSIS (参见例如图18h)和动态GSIS (参见例如图18h)。与使用基于悬浮的方案的HUES8相比较，先前报道了由1013-4FA和1016SeVA生成的SC-β细胞的动态功能弱得多5。然而，用这种新的平面方案的分化大大地增强这些iPSC系的第一和第二时相动态胰岛素释放两者，所有3个系的动态功能现接近人类胰岛(参见例如图18i-图18j)。因此，该平面方案使得从不同遗传背景生成的SC-β细胞能够具有更大的可译性。
为了评估这些细胞的体内功能，将用平面方案从HUES8生成的第6阶段簇移植到链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病小鼠的肾被膜下面(参见例如图23g)。在移植之后的两周内，空腹血糖水平开始接近未经处理的对照的水平，之后保持低于200 mg/dL(参见例如图19a)。在第3和10周进行的葡萄糖耐量测试表明，经STZ处理的接受SC-β细胞移植的小鼠与未经处理的对照小鼠具有相似的葡萄糖耐量(参见例如图19a)。此外，在移植小鼠的血清中检测到高水平的人类胰岛素，并受葡萄糖水平调控(参见例如图19b、图23h)。在移植之后的第12周期间，对4只移植的小鼠进行肾切除术以去除人类移植物，导致血糖控制快速丧失，并且证实从移植的细胞产生的葡萄糖稳态的恢复(参见例如图19a)。切除的肾脏的免疫染色显示出大区域的C-肽+细胞，并且未观察到过度生长(参见例如图19d)。总体而言，这些数据表明，这种新的平面分化方案可生成能够快速逆转小鼠中预先存在的糖尿病的功能性SC-β细胞。
细胞骨架调节影响内胚层命运的选择
为了进一步研究细胞骨架对内胚层细胞命运选择的影响，在SC-β细胞方案的第6阶段对在第4阶段期间平板接种并且在胰腺祖细胞阶段(第4阶段)期间或内分泌诱导(第5阶段)期间用拉春库林A处理的细胞进行批量RNA测序。还将这些细胞与未经处理的平板接种的和悬浮分化进行了比较。1000个表达差异最大的基因的热图表明，拉春库林A处理的时机对所得细胞的表达谱具有剧烈影响(参见例如图20a)。具体地讲，最佳的第5阶段拉春库林A处理使平板接种的细胞的基因表达谱移向基于悬浮的SC-β细胞分化的基因表达谱移，从而增加β细胞和胰岛基因的表达。有趣的是，许多其他差异表达的基因与非内分泌谱系相关(参见例如图20b-图20d)，其中第4阶段的拉春库林A处理增加肠和胃基因的表达，而平板接种的对照增加与肝脏和食道相关基因的表达。因此，细胞骨架调节的时机对于内胚层细胞命运至关重要，因为在特定时间点具有完整或解聚的细胞骨架会改变内胚层谱系特化。
总体而言，这些数据表明细胞骨架的状态不仅对β细胞特化，而且广泛地也对内胚层细胞命运很重要。由于细胞骨架调节会影响对SC-β细胞方案内几种内胚层谱系的命运选择，因此针对生成外分泌胰腺、肠和肝脏测试了将拉春库林A和诺考达唑掺入到其他已建立的分化方案中。对于外分泌分化，诺考达唑大大地增加胰蛋白酶基因表达(PRSS1、PRSS2)和免疫染色但抑制内分泌诱导(参见例如图20e)，这与我们之前的单细胞RNA测序结果相对应，表明诺考达唑正在驱动外分泌祖细胞程序。另一方面，诺考达唑在肠分化中大大地增加CDX2基因表达和免疫染色(参见例如图20f)。相比之下，拉春库林A处理大大地增加肠道干细胞以及Paneth细胞的标志物，已知其对于LGR5+肠道干细胞的生存力很重要。有趣的是，对于肝脏分化，诺考达唑和拉春库林A两者均增加肝细胞基因的表达(参见例如图20g)。然而，诺考达唑处理对白蛋白的免疫染色更为丰富，而拉春库林A处理对AFP的免疫染色更为普遍，表明肝表型存在差异。总体而言，这些数据提供了原理验证，即细胞骨架为定向分化期间内胚层细胞命运决定的关键组成部分。尽管这些方案肯定可受益于进一步的优化，因为这项工作已通过SC-β细胞分化得到证明，但这些数据表明，当以适当的时间和剂量使用时，使用特定细胞骨架调节化合物可助于提高其他内胚层分化方案的分化效率。此外，由于基底可对细胞骨架动力学具有影响，该数据进一步表明，培养形式最有可能对这些定向分化的成功至关重要。
讨论
在本文中，这项工作已鉴定了肌动蛋白细胞骨架为人类胰腺细胞命运的关键调控因子。通过用细胞排列(二维相对于三维)、基底刚度或直接用化学处理来控制细胞骨架的状态，这项工作表明聚合的细胞骨架防止胰腺祖细胞中NEUROG3表达的过早诱导，而且还抑制随后向SC-β细胞的分化。用拉春库林A进行适当定时的细胞骨架解聚可克服这种抑制作用，使得能够稳健地生成SC-β细胞。这项工作已将这些发现转化为开发出一种新的平面分化方案，该方案能够生成高度功能性的SC-β细胞，该细胞经历第一和第二时相动态胰岛素分泌，并在移植到小鼠中后快速逆转预先存在的糖尿病。单细胞和批量RNA测序显示出多种内胚层谱系(而不仅是SC-β细胞)均受到细胞骨架状态的影响，并且这些方法允许通过细胞骨架调节增强向外分泌、肠道和肝细胞命运的分化。
用于制备SC-β细胞的平面方案存在几个明显优势，包括对重要转录因子(如NEUROG3)的更好控制以及由于与大细胞簇相比较组织培养板具有更受控的均质微环境而提高了细胞系重现性。然而，该新方案最重要的益处可能是来自两个iPSC系的SC-β细胞的动态功能的大改进。先前已经发表了利用基于悬浮的方案，用这两个系产生的SC-β细胞具有相当较弱的动态功能。分化策略的可译性为本领域面临的长期挑战，并且当研究常常具有弱的体外和体内SC-β细胞表型的患者来源的iPSC时，特别成问题。此外，已经观察到某些iPSC系通常可能难以甚至适应悬浮培养。利用人类患者iPSC使用这种平面方法更好地促进对糖尿病进行严格研究，以进行糖尿病的药物筛选和自体细胞替代疗法。
这项研究还解决了为什么SC-β细胞生成需要三维细胞排列的本领域的一个长期谜团。这项研究突出细胞培养形式在干细胞分化研究中的重要性，并为SC-β细胞领域提供其他实际益处，即消除复杂、费力和昂贵的三维细胞培养要求。经平面培养和随后的拉春库林A处理来调节细胞骨架还可更好地促进推动功能性单激素SC-β细胞的NKX6-1和NEUROG3表达的正确时机。内分泌诱导开始时细胞骨架解聚的似乎短的时间要求可能是由于一旦开启就维持NEUROG3表达的正反馈回路。这些发现也似乎平行于体内肌动蛋白动力学，藉此在发育中的胰腺管细胞内重组细胞骨架，以诱导脱层和随后的胰岛形成。
来自这项工作的另一重要观察结果是，细胞骨架状态不仅调控SC-β细胞分化，而且更广泛地影响内胚层谱系特化。取决于拉春库林A处理在SC-β细胞分化期间的时机，在第6阶段中检测到外分泌、肝、食道、胃和肠的基因标签。通过在定向分化方案期间添加细胞骨架调节化合物将这些发现应用于这些其他谱系中的一些，通常改善分化结果。因此，细胞骨架状态的影响取决于期望的内胚层谱系以及这些定向分化方案内细胞骨架调节的类型和时机。尽管可进一步优化这些其他方案内的这些调节，但总体而言，这项工作强调细胞骨架动力学对于内胚层细胞命运至关重要，细胞骨架信号传导与可溶性生化因子协同作用以调控细胞命运决定。因此，可利用细胞-生物材料相互作用和细胞骨架调节化合物的组合来改善向内胚层谱系的分化结果。
方法
干细胞培养
在该项研究中使用先前用于SC-β细胞分化方案的3种干细胞系，包括HUES8 hESC系和两种非糖尿病性人类iPSC系(1013-4FA和1016SeVA)。除非另外指明，否则用HUES8系进行实验。将未分化的细胞用mTeSR1 (StemCell Technologies, 05850)在增湿的温育箱中于5% CO2和37℃下进行繁殖。对于悬浮培养，细胞每3天用Accutase (StemCellTechnologies, 07920)进行传代，并以0.6 x 106细胞/mL接种于磁力搅拌板(Chemglass)上60 RPM下的30 mL旋转瓶(REPROCELL, ABBWVS03A)中。对于平面培养，细胞每4天用TrypLE (Life Technologies, 12-604-039)进行传代，并以3-5百万细胞/孔接种到Matrigel (Corning, 356230)包被的6孔板上，密度取决于细胞系。将所有细胞接种于补充有10 μM Y-27632的mTeSR1中。
SC-β细胞分化
悬浮方案：传代之后72小时，使用以下配方以6阶段方案分化30 mL旋转瓶中的细胞。第1阶段(3天)：S1培养基+ 100 ng/ml激活素A (R&D Systems, 338-AC) + 3 μMCHIR99021(Stemgent, 04-0004-10)，持续1天。S1培养基+ 100 ng/ml激活素A，持续接下来2天。第2阶段(3天)：S2培养基+ 50 ng/ml KGF (Peprotech; AF-100-19)。第3阶段(1天)：S3培养基+ 50 ng/ml KGF + 200 nM LDN193189 (Reprocell; 040074) + 500 nM PdBU(MilliporeSigma; 524390)+ 2 μM视黄酸(MilliporeSigma; R2625) + 0.25 μM SANT 1(MilliporeSigma; S4572) + 10 μM Y27632。第4阶段(5天)：S3培养基+ 5 ng/mL激活素A+ 50 ng/mL KGF + 0.1 μM视黄酸+ 0.25 μM SANT1 + 10 μM Y27632。第5阶段(7天)：S5培养基+ 10 μM ALK5i II (Enzo Life Sciences; ALX-270-445-M005)+ 20 ng/mL β细胞素(R&D Systems; 261-CE-050)+ 0.1 μM视黄酸+ 0.25 μM SANT1 + 1 μM T3(Biosciences; 64245) + 1 μM XXI (MilliporeSigma; 595790)。第6阶段(7-25天)：富集无血清培养基(ESFM)。在第6阶段的第一天，通过用TrypLE进行单细胞分散并在100 RPM下的定轨振荡器(Benchmark Scientific, OrbiShaker)上的6孔板内于ESFM中重新聚集来调整簇的大小。
每个阶段中使用的基础分化培养基配方如下。S1培养基：补充有0.22 g葡萄糖(MilliporeSigma; G7528)、1.23 g碳酸氢钠(MilliporeSigma; S3817)、10 g牛血清白蛋白(BSA) (Proliant; 68700)、10 μL ITS-X (Invitrogen; 51500056)、5 mL GlutaMAX(Invitrogen; 35050079)、22 mg维生素C (MilliporeSigma; A4544)和5 mL青霉素/链霉素(P/S)溶液(Cellgro; 30-002-CI)的500 mL MCDB 131 (Cellgro; 15-100-CV)。S2培养基：补充有0.22 g葡萄糖、0.615 g碳酸氢钠、10 g BSA、10 μL ITS-X、5 mL GlutaMAX、22mg维生素C和5 mL P/S 的500 mL MCDB 131。S3培养基：补充有0.22 g葡萄糖、0.615 g碳酸氢钠、10 g BSA、2.5 mL ITS-X、5 mL GlutaMAX、22 mg维生素C和5 mL P/S的500 mL MCDB131。S5培养基：补充有1.8 g葡萄糖、0.877 g碳酸氢钠、10 g BSA、2.5 mL ITS-X、5 mLGlutaMAX、22 mg维生素C、5 mL P/S和5 mg肝素(MilliporeSigma; A4544)的500 mL MCDB131。ESFM：补充有0.23 g葡萄糖、10.5 g BSA、5.2 mL GlutaMAX、5.2 mL P/S、5 mg肝素、5.2 mL MEM非必需氨基酸(Corning; 20-025-CI)、84 μg ZnSO4 (MilliporeSigma;10883)、523 μL微量元素A (Corning; 25-021-CI)和523 μL微量元素B (Corning; 25-022-CI)的500 mL MCDB 131。
对于研究平板接种胰腺祖细胞的效果的实验，用悬浮方案将细胞分化持续第1-3阶段。在第3阶段结束时，将簇用TrypLE进行单细胞分散，并以0.625 x 106细胞/cm2平板接种到包被有各种ECM蛋白的组织培养板上。除第4阶段的第2-5天省略Y-27632和激活素A以外，用于该杂合方案其余部分的分化培养基与悬浮方案相同。如每个实验所示，添加另外的化合物：1 μM拉春库林A (Cayman Chemical, 10010630)、1 μM拉春库林B (CaymanChemical, 10010631)、1 μM细胞松弛素D ((MilliporeSigma, C2618)、1 μMjasplakinolide(Cayman Chemical, 11705)、10 μM布雷他汀(MilliporeSigma, 203389)、1 μM诺考达唑(Cayman Chemical, 13857)、1 μM Y-15 (Cayman Chemical, 14485)、10 μMY-27632和10 μM GDC-0994 (Selleckchem, S7554)。最初用这种平板接种方法对多种ECM包被层进行测试，包括胶原蛋白I (Corning, 354249)、胶原蛋白IV (Corning, 354245)、纤连蛋白(Gibco, 33016-015)、玻连蛋白(Gibco, A14700)、matrigel (Corning,356230)、明胶(Fisher, G7-500)和层粘连蛋白111、121、211、221、411、421、511和521(Biolamina, LNKT-0201)。该杂合方案的所有后续实验均在胶原蛋白I上进行。
平面方案：传代之后24小时，使用以下配方通过新的6阶段方案分化以0.313-0.521 x 106细胞/cm2接种到6或24孔板上的细胞，每天更换培养基。第1阶段(4天)： BE1培养基+ 100 ng/mL激活素A + 3 μM CHIR99021，持续前24小时，然后3天仅含100 ng/mL激活素A的BE1。第2阶段(2天)：BE2培养基+ 50 ng/mL KGF。第3阶段(2天)：BE3 + 50 ng/mLKGF、200 nM LDN193189、500 nM TPPB (Tocris, 53431)、2 μM视黄酸和0.25 μM SANT1。第4阶段(4天)：BE3 + 50 ng/mL KGF、200 nM LDN193189、500 nM TPPB、0.1 μM视黄酸和0.25μM SANT1。第5阶段(7天)：S5培养基+ 10 μM ALK5i II + 20 ng/mL β细胞素+ 0.1 μM视黄酸+ 0.25 μM SANT1 + 1 μM T3 + 1 μM XXI。仅在前24小时中将1 μM拉春库林A添加至该培养基中。第6阶段(7-25天)：将培养物保持在具有ESFM的平板上持续前7天。为了移至悬浮培养，可将细胞用TrypLE进行单细胞分散，并在100 RPM下的定轨振荡器上以4-5百万细胞/孔的浓度置于6孔板内的6 mL ESFM中。在簇聚集之后5-8天进行评估。
与悬浮方案不同的基础分化培养基配方如下。BE1培养基：补充有0.8 g葡萄糖、0.587 g碳酸氢钠、0.5 g BSA和5 mL GlutaMAX的500 mL MCDB 131。BE2培养基：补充有0.4g葡萄糖、0.587 g碳酸氢钠、0.5 g BSA、5 mL GlutaMAX和22 mg维生素C 的500 mL MCDB131。BE3培养基：补充有0.22 g葡萄糖、0.877 g碳酸氢钠、10 gBSA、2.5 mL ITS-X、5 mLGlutaMAX和22 mg维生素C的500 mL MCDB 131。
显微术和免疫细胞化学
用Leica DMi1倒置光学显微镜拍摄亮视野图像，和用Nikon A1Rsi共聚焦显微镜捕获荧光图像。为了进行免疫染色，将细胞用4%多聚甲醛(PFA)在室温下固定30分钟。然后将其封闭，并在室温下用免疫细胞化学(ICC)溶液(由PBS (Corning, 21-040-CV)中的0.1%triton X (Acros Organics, 327371000)和5%驴血清(Jackson Immunoresearch,017000-121)组成)透化45分钟。然后将样品与在ICC溶液中稀释的一抗一起在4℃下温育过夜，用ICC洗涤，与在ICC中稀释的二抗一起在室温下温育2小时，并在室温下用DAPI染色15分钟。对于组织学切片，将通过平面方案生成的全部SC-β细胞簇和含有移植细胞的小鼠肾脏在4℃下用4% PFA固定过夜。也将体外簇包埋在Histogel (Thermo Scientific; hg-4000-012)中。然后将这些样品进行石蜡包埋，并由St. Louis的Washington University的Division of Comparative Medicine (DCM) Research Animal Diagnostic LaboratoryCore进行切片。用Histoclear (Thermo Scientific; C78-2-G)从切片的样品去除石蜡，并在含有0.05 M EDTA (Ambion, AM9261)的压力锅(Proteogenix; 2100 Retriever)中进行抗原回收。将载玻片封闭并用ICC溶液透化45分钟，与ICC溶液中的一抗一起在4℃下温育过夜，并与二抗一起在室温下温育2小时。然后用DAPI Fluoromount-G (SouthernBiotech,0100-20)密封载玻片。
除非另外指明，否则一抗在ICC溶液中以1:300稀释：大鼠抗C-肽(DSHB, GN-ID4-S)、1:100小鼠抗NKX6-1 (DSHB, F55A12-S)、山羊抗PDX1 (R&D Systems, AF2419)、绵羊抗NEUROG3 (R&D Systems, AF2746)、1:200 TRITC缀合的鬼笔环肽(MilliporeSigma, FAK100)、兔抗生长抑素(ABCAM, ab64053)、小鼠抗胰高血糖素(ABCAM, ab82270)、小鼠抗NKX2-2 (DSHB, 74.5A5-S)、山羊抗NEUROD1 (R&D Systems, AF2746)、小鼠抗ISL1 (DSHB,40.2d6-s)、兔抗CHGA (ABCAM, ab15160)、1:100绵羊抗PRSS1/2/3 (R&D Systems,AF3586)、1:100小鼠抗KRT19 (Dako, MO888)、山羊抗KLF5 (R&D Systems, AF3758)、兔抗CDX2 (Abcam, ab76541)、小鼠抗AFP (Abcam, ab3980)、兔抗白蛋白(Abcam, ab207327)。
二抗在ICC溶液中以1:300稀释。所有二抗均在驴中产生：抗山羊alexa fluor 594(Invitrogen, A11058)、抗山羊alexa fluor 647 (Invitrogen, A31571)、抗小鼠alexafluor 488 (Invitrogen, A21202)、抗小鼠alexa fluor 594 (Invitrogen, A21203)、抗小鼠alexa fluor 647 (Invitrogen, A31571)、抗兔alexa fluor 488 (Invitrogen,A21206)、抗兔alexa fluor 594 (Invitrogen, A21207)、抗兔alexa fluor 647(Invitrogen, A31573)、抗大鼠alexa fluor 488 (Invitrogen, A21208)、抗绵羊alexafluor 594 (Invitrogen, A11016)。
qRT-PCR
用RNeasy Mini Kit (Qiagen, 74016)从直接在平板上的细胞或全部簇中提取RNA。提取期间用DNA酶试剂盒(Qiagen, 79254)处理样品。高容量cDNA逆转录酶试剂盒(High Capacity cDNA Reverse Transcriptase Kit) (Applied Biosystems, 4368814)用于在热循环仪(Applied Biosystems, A37028)上合成cDNA。将PowerUp SYBR GreenMaster Mix (Applied Biosystems, A25741)用于StepOnePlus (Applied Biosystems)上，并使用ΔΔCt方法分析实时PCR结果。TBP和GUSB两者用作管家基因。引物序列如下。
表2. 用于qRT-PCR的引物序列.
基因名称 SEQ ID NO. 正向引物序列 SEQ ID NO. 反向引物序列
TBP 9 GCCATAAGGCATCATTGGAC 10 AACAACAGCCTGCCACCTTA
GUSB 23 CGTCCCACCTAGAATCTGCT 24 TTGCTCACAAAGGTCACAGG
INS 1 CAATGCCACGCTTCTGC 2 TTCTACACACCCAAGACCCG
CHGA 13 TGACCTCAACGATGCATTTC 14 CTGTCCTGGCTCTTCTGCTC
NEUROD1 15 ATGCCCGGAACTTTTTCTTT 16 CATAGAGAACGTGGCAGCAA
SST 7 TGGGTTCAGACAGCAGCTC 8 CCCAGACTCCGTCAGTTTCT
GCG 5 AGCTGCCTTGTACCAGCATT 6 TGCTCTCTCTTCACCTGCTCT
PDX1 3 CGTCCGCTTGTTCTCCTC 4 CCTTTCCCATGGATGAAGTC
NKX2-2 19 GGAGCTTGAGTCCTGAGGG 20 TCTACGACAGCAGCGACAAC
NKX6-1 11 CCGAGTCCTGCTTCTTCTTG 12 ATTCGTTGGGGATGACAGAG
ISL1 39 TCACGAAGTCGTTCTTGCTG 40 CATGCTTTGTTAGGGATGGG
GCK 29 ATGCTGGACGACAGAGCC 30 CCTTCTTCAGGTCCTCCTCC
MAFB 31 CATAGAGAACGTGGCAGCAA 32 ATGCCCGGAACTTTTTCTTT
AFP 41 TGTACTGCAGAGATAAGTTTAGCTGAC 42 CCTTGTAAGTGGCTTCTTGAACA
PRSS1 43 TATCAGCAGGCCACTGCTAC 44 CCTCCAGGACTTCGATGTTG
CDX2 45 GAACCTGTGCGAGTGGATG 46 TAAGCCTGGGGCTCAAACT
SOX2 47 TTGCTGCCTCTTTAAGACTAGGA 48 GGTCAGTAACCTCGGACCTG
KRT19 49 AGGATGCTGAAGCCTGGTT 50 GGTCAGTAACCTCGGACCTG
SERPINA1 51 CCCTGTTTGCTCCTCCGATAA 52 GATGCCCCACGAGACAGAAG
FAH 53 GCCAGTGTGCTGGAAAAGTG 54 CTGGCAGGGAGGCTTTACAC
HNF4A 55 GGACATGGCCGACTACAGTG 56 CTCGAGGCACCGTAGTGTTT
CEBPA 57 TATAGGCTGGGCTTCCCCTT 58 AGCTTTCTGGTGTGACTCGG
CYP3A4 59 CACCCCCAGTTAGCACCATT 60 CCACGCCAACAGTGATTACA
FABP1 61 TCTCCGGCAAGTACCAACTG 62 GATTTCCGACACCCCCTTGA
LGR5 63 CTTGGTGCCCAAAGCTCA 64 TCTTTTCCAGGTATGTTCATTGC
ASCL2 65 CACTGGGGATCTGTGGACTG 66 TTCTGTAAGGCCCAAAGCGT
FABP2 67 GCCCAAGGACAGACCTGAAT 68 CAAGTGCTGTCAAACGCCAT
MUC2 69 CAGCTCATCTCGTCCGTCTC 70 GTGTAGGTGTGTGTCAGCGA
MMP7 71 CATGATTGGCTTTGCGCGAG 72 CTACCATCCGTCCAGCGTTC
LYZ 73 TCAGCCTAGCACTCTGACCT 74 GCCCTGGACCGTAACAGAAA
PRSS2 75 GCTACAAGTCGGCAATTAACTCA 76 CGATGTTGTGCTCTCCCAGT
AMY2B 77 GGAGCCTCTGTGTTTCTTTGTT 78 GCACTTGAAGGACACGGGA
NR5A2 79 CCGACAAGTGGTACATGGAA 80 TCCGGCTTGTGATGCTATTA
ALDH1 81 ATCAAAGAAGCTGCCGGGAA 82 GCATTGTCCAAGTCGGCATC
TAT 83 CAGTCCCCGAGGTGATGATG 84 CTGAGTGTGGGTGTGGTTGT
TBX3 85 AAACTCTGCGCGGAGAAAGA 86 CCCCCAGTAGCTCAATGCAA
HNF6 87 ATGTCCAGCGTCGAACTCTAC 88 TGCTTTGGTACAAGTGCTTGAT
LDHA 33 GGAGATCCATCATCTCTCCC 34 GGCCTGTGCCATCAGTATCT
SLC16A1 37 CACTTAAAATGCCACCAGCA 38 AGAGAAGCCGATGGAAATGA
MAFA 27 GAGAGCGAGAAGTGCCAACT 28 TTCTCCTTGTACAGGTCCCG
UCN3 25 GGAGGGAAGTCCACTCTCG 26 TGTAGAACTTGTGGGGGAGG
胶原蛋白凝胶
根据制造商的说明，使用10x PBS、无菌去离子水和1M NaOH产生浓度为5 mg/mL的1型胶原蛋白(Corning, 354249)凝胶。将各种体积的这种胶原蛋白溶液移液到24孔板的孔中心，并短暂离心以获得均匀的包被层。基于胶原蛋白凝胶溶液的体积、24孔板的半径以及圆柱体高度的公式计算胶原蛋白凝胶的高度。
G/F肌动蛋白比率
按照G-actin/F-actin In Vivo Assay Kit (Cytoskeleton, Inc, BK037)的说明，通过western印迹测定G/F肌动蛋白比率。Western印迹使用SuperSignal West PicoPLUS化学发光底物(ThermoScientific, 34577)和Odyssey FC (LI-COR)成像仪进行可视化。
整联蛋白测定
为了量化哪些整联蛋白在胰腺祖细胞的表面表达，将悬浮培养中生成的细胞在第3阶段或第4阶段结束时用TrypLE进行分散，并使用Alpha/Beta Integrin-Mediated CellAdhesion Array Combo Kit (MilliporeSigma, ECM532)将其平板接种到包被有针对不同α和β整联蛋白亚基的单克隆抗体的孔上。整联蛋白表达根据制造商的说明进行量化。
单细胞RNA测序
通过悬浮方案生成的细胞在第3阶段结束时用TrypLE从簇中进行单细胞分散，并以0.625 x106细胞/cm2接种到胶原蛋白1包被的24孔板上。在整个第4阶段中添加0.5 μM拉春库林A或5 μM诺考达唑。在第4阶段结束时，将细胞进行单细胞分散，悬浮于DMEM中，并提交给Washington University Genome Technology Access Center。使用Chromium SingleCell 3’ Library 和 Gel Bead Kit v2 (10x Genomics, 120237)完成文库制备。简而言之，使用微流体平台以乳液分离单细胞，并用一组独特的寡核苷酸对每个单细胞乳液进行条形码编码。使用GemCode平台在每个单细胞乳液内进行逆转录，然后将其扩增以构建文库。使用Illumina HiSeq2500用26x98引物bp (primerbp)的配对末端读出对文库进行测序。
使用Seurat v2.0进行单细胞RNA分析。使用FilterCells (对于未经处理的对照而言>9000个总基因和> 5%线粒体基因，对于拉春库林A而言> 6000个基因和> 6%线粒体基因，对于诺考达唑而言> 12000个基因和> 4%线粒体基因)滤出复制的细胞和具有高线粒体基因表达的细胞。使用全局缩放归一化对每个数据集进行归一化。FindVariableGenes使用缩放的z分数分散度鉴定并去除异常基因。然后合并数据集并用RunMultiCCA进行典型相关分析(CCA)。AlignSubspace用于对齐CCA子空间，并为集成分析生成新的维数缩减。使用RunTSNE生成无指导的TSNE图，并使用FindMarkers定义和标记所得的簇。VlnPlot (小提琴图)和FeaturePlot (tsne图)用于可视化跨越每个簇和条件的基因表达的差异。
流式细胞术
用TrypLE将细胞进行单细胞分散，并用4% PFA固定30分钟。然后将细胞用PBS洗涤，并与ICC溶液一起在室温下温育45分钟，与一抗一起在4℃下温育过夜，和与二抗一起在室温下温育2小时。然后将细胞用ICC溶液洗涤两次并过滤，之后在LSRII流式细胞仪(BDBiosciences)上运行。用FlowJo完成分析。
葡萄糖刺激的胰岛素分泌
静态GSIS：为了评估通过杂合方案产生的细胞的功能，对仍附着于96或24孔组织培养板上的细胞进行静态GSIS。为了评估通过平面方案生成的簇的功能，收集约30个簇并将其置于24孔板中的组织培养transwell插件(insert)(MilliporeSigma, PIXP01250)中。首先全部用KRB缓冲液(128 mM NaCl、5 mM KCl、2.7 mM CaCl2、1.2 mM MgSO4、1 mMNa2HPO4、1.2 mM KH2PO4、5 mM NaHCO3、10 mM HEPES (Gibco, 15630-080)和0.1% BSA)洗涤两次。首先将细胞在2 mM葡萄糖KRB溶液中于37℃下温育1小时，之后弃去该溶液，并用新鲜的2 mM葡萄糖KRB替代。再过一小时之后，收集上清液。接下来的一小时中添加20 mM葡萄糖KRB，之后再次收集上清液。在每次溶液更换期间用新鲜的KRB洗涤细胞。然后用TrypLE将细胞进行单细胞分散，并用Vi-Cell XR (Beckman Coulter)计数。用人类胰岛素ELISA(ALPCO, 80-INSHU-E10.1)对来自低和高葡萄糖攻击的上清液进行量化，并使用细胞计数使胰岛素分泌归一化。
动态GSIS：如我们所报道的5，通过灌注设置评估SC-β细胞的动态功能。0.015英寸的进口和出口管路(ISMATEC, 070602-04i-ND)用0.04英寸的连接管路(BioRep, Peri-TUB-040)连接至275 μl的细胞室(BioRep; Peri-Chamber)和分配喷嘴(BioRep, PERI-NOZZLE)。用KRB缓冲液将约30个SC-β细胞簇洗涤两次，并加载到夹在两层水化Bio-Gel P-4聚丙烯酰胺珠粒(Bio-Rad; 150-4124)之间的室中。这些室连接至高精度8通道分配器泵(ISMATEC, ISM931C)并浸没在37℃水浴中持续测定的其余部分。在前90分钟内，以100 μL/min的流速将2 mM葡萄糖KRB溶液灌注通过所述室。在该平衡期之后，以2分钟的时间间隔收集流出物，如下切换葡萄糖溶液：2 mM葡萄糖KRB进行12分钟，20 mM葡萄糖KRB进行24分钟和2 mM葡萄糖KRB进行16分钟。然后用10 mM Tris (MilliporeSigma, T6066)、1 mM EDTA(Ambion, AM9261)和0.2% Triton-X (Acros Organics, 327371000)的溶液裂解SC-β细胞簇。使用Quant-iTPicogreen dsDNA测定试剂盒(Invitrogen, P7589)对DNA进行量化，并用于归一化通过人类胰岛素ELISA量化的胰岛素值。
胰岛素和胰岛素原含量
将全部SC-β细胞簇或附着于培养板的细胞用PBS彻底洗涤两次。将一半簇或等效孔的平板接种的细胞浸没在TrypLE中，以在Vi-Cell XR上进行细胞计数。对于另一半样品，将1.5% HCl和70%乙醇的溶液添加至eppendorf管中的簇中，或直接添加到平板接种的细胞。15分钟之后，将平板接种的细胞用力吸移并转移至eppendorf管中。来自簇和平板接种的细胞两者的eppendorf管在-20℃下保持72小时，每24小时剧烈涡旋。然后将样品在2100RCF下离心15分钟。收集每个样品的上清液，用等体积的1 M TRIS (pH 7.5)中和，并使用胰岛素原ELISA (Mercodia, 10-1118-01)和人类胰岛素ELISA试剂盒进行量化。将胰岛素原和胰岛素分泌针对活细胞计数归一化。
移植研究
体内研究根据华盛顿大学国际护理和使用委员会(Washington UniversityInternational Care and Use Committee)的规定进行。7周龄的雄性免疫缺陷小鼠(NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)购自Jackson Laboratories。通过经腹膜内注射连续5天给予PBS中的45 mg/kg STZ (R&D Systems, 1621500)来诱导随机选择的小鼠患有糖尿病。STZ处理之后约一周，小鼠患上糖尿病。再过两周之后，通过在用异氟烷麻醉的糖尿病小鼠的肾被膜下注射约5百万通过平面方案生成的SC-β细胞进行移植手术。移植手术之后每周监测所有小鼠。在移植之后第12周期间，摘取随机选择的移植小鼠的含有SC-β细胞的肾脏。
进行空腹血糖测量、葡萄糖耐量测试和体内GSIS以进行体内评估。所有研究均将小鼠禁食4-6小时。对于禁食测量，使用手持式血糖仪(Bayer, 9545C)从尾部出血获得血糖水平。对于葡萄糖耐量测试，注射在0.9%盐水(Moltox, 51-405022.052)中的2 g/kg葡萄糖，每30分钟测量血糖，持续150分钟。对于体内GSIS，在注射葡萄糖之前和之后60分钟，使用microvette (Sarstedt, 16.443.100)经尾部出血收集约30 μL血液。将血样在4℃下以2500 rpm离心15分钟，并收集血清以用Human Ultrasensitive Insulin ELISA试剂盒(ALPCO Diagnostics, 80-ENSHUU-E01.1)和小鼠C-肽ELISA试剂盒(ALPCO Diagnostics,80-CPTMS-E01)量化。
批量RNA测序
在第3阶段结束时，用TrypLE将通过悬浮方案生成的细胞从簇中进行单细胞分散，并以0.625 x106细胞/cm2接种到胶原蛋白1包被的24孔板上。在整个第4阶段中添加0.5 μM拉春库林A，或在第5阶段的前24小时中添加1 μM拉春库林A。在第6阶段的两周之后，用包括在提取期间的DNA酶处理(Qiagen, 79254)的RNeasy Mini Kit (Qiagen, 74016)提取RNA。将样品递送至St. Louis的Washington University的 Genome Technology AccessCenter进行文库制备和测序。根据文库试剂盒制造商的方案，使用Ribo-Zero通过RNA耗尽制备样品，将其编索引、合并并在Illumina HiSeq上测序。
使用EdgeR进行差异基因表达分析。DGEList用于创建计数对象，并使用带有calcNormFactors的修剪平均M值(TMM)方法对数据进行归一化。使用exactTest进行成对比较，并使用topTags获得差异表达的基因及其各自的对数倍数变化(logFC)和调整后的p值(FDR)。这些数值用于使用ggplot2生成火山图。使用logCPM计算的表达水平，通过heatmap.2 (gplots)进行并生成分层聚类和热图。用基因集富集分析(GSEA)进行基因集分析。谱系特异性基因集(包括外分泌(GO: 0035272, M13401)、胰腺β细胞(Hallmark,M5957)和肠上皮(GO: 0060576, M12973))从分子标签数据库(Molecular SignaturesDatabase) (MdigDB)获得。使用人类蛋白图集(Human Protein Atlas)和文献对肝脏、食道和胃的基因集进行定制。
分化为其他内胚层谱系
为了分化为其他内胚层谱系，培养HUES8干细胞并正常传代。在以0.521 x 106细胞/cm2接种24孔板之后24小时启动分化。从文献中改编用于外分泌胰腺、肠和肝脏的方案。如每种方案所示添加拉春库林A或诺考达唑。所有3种分化方案均使用相同的第1阶段以诱导内胚层。第1阶段(4天)：BE1培养基+ 100 ng/mL激活素A + 3 μM CHIR99021，持续前24小时，然后3天仅含100 ng/mL激活素A的BE1。
外分泌胰腺：第2阶段(2天)：BE2培养基+ 50 ng/mL KGF。第3阶段(2天)：BE3 + 50ng/mL KGF、200 nM LDN193189、500 nM TPPB、2 μM视黄酸和0.25 μM SANT1。第4阶段(4天)：BE3 + 50 ng/mL KGF、200 nM LDN193189、500 nM TPPB、0.1 μM 视黄酸和0.25 μMSANT1。在该阶段的前24小时添加1 μM拉春库林A，或在整个第4阶段添加1 μM诺考达唑。第5阶段(6天)：S5培养基+ 10 ng/mL bFGF。最后两天添加10 mM烟酰胺(MilliporeSigma,72340)。
肠分化：第2阶段(4天)：BE2培养基+ 3 μM CHIR99021 + 500 ng/mL FGF4 (R&DSystems, 235-F4)。在该阶段的前24小时添加1 μM拉春库林A，或在整个第2阶段添加1 μM诺考达唑。第3阶段(7天)：BE3培养基+ 500 ng/mL R-spondin1 (R&D Systems, 4645-RS)+ 100 ng/mL EGF (R&D Systems, 236-EG) + 200 nM LDN193189。
肝分化：第2阶段(2天)：BE2培养基+ 50 ng/mL KGF。第3阶段(4天)：BE3培养基+10 ng/mL bFGF + 30 ng/mL BMP4 (R&D Systems, 314-BP)。仅在前24小时添加2 μM 视黄酸和1 μM拉春库林A或1 μM诺考达唑。第4阶段(5天)：BE3培养基+ 20 ng/mL OSM (R&DSystems, 295-OM) + 20 ng/mL HGF (R&D Systems, 294-HG) + 100 nM地塞米松(MilliporeSigma, D4902)。
统计分析
数据分析以GraphPad Prism版本7进行。分析的数据通过双侧t检验或ANOVA，然后是Dunnett多重比较检验或Tukey HSD检验进行评估。以下约定用于指示p值：ns =不显著，*= p <0.05，** = p <0.01，*** = p <0.001。所有数据误差条代表SEM。样本量(n)表示生物学重复的总数。
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Claims (35)

1.一种以悬浮生成产生胰岛素的β细胞的方法，其包括：
提供干细胞；
提供无血清培养基；和
使所述干细胞与TGFβ/激活素激动剂或糖原合酶激酶3 (GSK)抑制剂或WNT激动剂接触一定量的足以形成定形内胚层细胞的时间；
使所述定形内胚层细胞与FGFR2b激动剂接触一定量的足以形成原肠管细胞的时间；
使所述原肠管细胞与RAR激动剂和任选地rho激酶抑制剂、平滑化拮抗剂、FGFR2b激动剂、蛋白激酶C激活剂或BMP 1型受体抑制剂接触一定量的足以形成早期胰腺祖细胞的时间；
将所述早期胰腺祖细胞温育至少约3天，并任选地使所述早期胰腺祖细胞与rho激酶抑制剂、TGF-β/激活素激动剂、平滑化拮抗剂、FGFR2b激动剂或RAR激动剂接触一定量的足以形成胰腺祖细胞的时间；或
使所述胰腺祖细胞与Alk5抑制剂、γ分泌酶抑制剂、SANT1、Erbb1 (EGFR)或Erbb4激动剂或RAR激动剂接触一定量的足以形成内胚层细胞的时间；和
减小细胞簇的大小，其包括调整所述细胞簇的大小(任选地在约24小时温育内)，和使所述内胚层细胞在无血清培养基中成熟一定量的足以形成β细胞的时间。
2.权利要求1的方法，其中
所述TGFβ/激活素激动剂为激活素A；
所述糖原合酶激酶3 (GSK)抑制剂或WNT激动剂为CHIR；
所述FGFR2b激动剂为KGF；
所述平滑化拮抗剂为SANT-1；
所述RAR激动剂为视黄酸(RA)；
所述蛋白激酶C激活剂为PdBU；
所述BMP 1型受体抑制剂为LDN；
所述rho激酶抑制剂为Y27632；
所述Alk5抑制剂为Alk5i；或
所述Erbb4激动剂为β细胞素。
3.权利要求1或2中任何一项的方法，其中所述无血清培养基包含选自以下的一种或多种：MCDB131、葡萄糖、NaHCO3、BSA、ITS-X、Glutamax、维生素C、青霉素-链霉素、CMRL 10666、FBS、肝素、NEAA、微量元素A、微量元素B或ZnSO4。
4.权利要求1的方法，其包括减小所述内胚层的簇大小，其中调整细胞簇的大小包括将簇分开并在成熟为β细胞之前重新聚集。
5.权利要求1的方法，其中所述胰腺祖细胞不与血清、T3、N-乙酰半胱氨酸、Trolox和R428中的任何一种或多种一起温育。
6.权利要求1的方法，其中足以形成定形内胚层细胞、原肠管细胞、早期胰腺祖细胞、胰腺祖细胞、内胚层细胞的时间量在约1天-约8天之间或者足以形成β细胞的时间量在约1天-约9天之间或者超过9天。
7.权利要求1的方法，其中所述方法不包括在内胚层细胞成熟为β细胞中使用TGFβR1抑制剂(任选地Alk5抑制剂II)或甲状腺激素(任选地T3)。
8.权利要求7的方法，其中TGFβR1抑制剂的不存在允许进行TGFβ信号传导并促进内胚层细胞功能性成熟为β细胞或者允许响应增加的葡萄糖水平或增加的促分泌素水平而增加细胞胰岛素分泌。
9.权利要求7的方法，其中所述方法在内胚层细胞成熟为β细胞中不包含T3、N-乙酰半胱氨酸、Trolox或R428。
10.权利要求1的方法，其中
所述β细胞为表达至少一种β细胞标志物、至少一种胰岛细胞标志物的SC-β细胞，并经历包括第一和第二时相动态胰岛素分泌的葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)；
与尸体人类胰岛相比较，所述β细胞以基本上相似的量分泌胰岛素；或者
所述β细胞保持功能性达1天或更多天。
11.权利要求1的方法，其中所述干细胞为诱导性多能干细胞(iPSC) (比如患者来源的iPSC)、HUES8胚胎细胞、1013-4FA、SEVA 1016或SEVA 1019。
12.一种治疗需要它的受试者的方法，其包括：
给予受试者治疗有效量的产生胰岛素的β细胞，其中所述β细胞根据权利要求1生成。
13.一种将干细胞分化为内胚层谱系细胞的方法，其包括：
提供干细胞；
提供无血清培养基；和
使所述干细胞与TGFβ/激活素激动剂和糖原合酶激酶3 (GSK)抑制剂或WNT激动剂接触一定量的足以形成定形内胚层细胞的时间；
使所述定形内胚层细胞与FGFR2b激动剂接触一定量的足以形成原肠管细胞的时间；
使所述原肠管细胞与RAR激动剂和任选地平滑化拮抗剂/音猬因子抑制剂、FGF家族成员/FGFR2b激动剂、蛋白激酶3激活剂、BMP抑制剂或rho激酶抑制剂接触，任选地持续一定量的足以形成早期胰腺祖细胞的时间；
将所述早期胰腺祖细胞温育至少约3天，并任选地包括使所述早期胰腺祖细胞与平滑化拮抗剂、FGFR2b激动剂、RAR激动剂、rho激酶抑制剂或TGF-β/激活素激动剂接触一定量的足以形成胰腺祖细胞的时间；
使所述胰腺祖细胞与Alk5抑制剂/TGF-β受体抑制剂、甲状腺激素和γ分泌酶抑制剂和任选地SANT1、Erbb1 (EGFR)或Erbb4激动剂/EGF家族成员或RAR激动剂接触一定量的足以形成内胚层细胞或内分泌细胞的时间；
任选地使所述内胚层细胞或内分泌细胞与Alk5抑制剂/TGF-β受体抑制剂或甲状腺激素接触一定量的足以形成内胚层谱系细胞(例如胰腺细胞、肝细胞或β细胞/SC-β细胞)的时间；和
调节细胞骨架，其包括一次和在一定量的足以提高分化效率的时间内将细胞平板接种在硬质(比如带有ECM蛋白层以促进贴壁的组织培养塑料(TCP))或软质基底上或向细胞引入细胞骨架调节剂，任选地所述细胞骨架调节剂包括拉春库林A、拉春库林B、诺考达唑、细胞松弛素D、jasplakinolide、布雷他汀、y-27632、y-15、gdc -0994或整联蛋白调节剂。
14.一种将干细胞分化为内胚层谱系细胞的方法，其包括：
将干细胞在包含TGFβ/激活素激动剂、激活素A、WNT激动剂和CHIR的培养基中温育约24小时，然后将细胞在包含激活素A且没有CHIR的培养基中温育约3天，产生第1阶段定形内胚层细胞；和
生成外分泌胰腺细胞，其包括在包含FGFR2b激动剂KGF的培养基中将所述第1阶段定形内胚层细胞温育约2天，产生第2阶段细胞；在包含所述FGFR2b激动剂KGF、BMP抑制剂LDN193189、TPPB、RAR激动剂视黄酸(RA)和平滑化拮抗剂SANT1的培养基中将所述第2阶段细胞温育2天，产生第3阶段细胞；在包含所述FGFR2b激动剂KGF、BMP抑制剂LDN193189、TPPB、RAR激动剂视黄酸和平滑化拮抗剂SANT1的培养基中将第3阶段细胞温育约4天，产生第4阶段细胞，其中在温育的约前24小时中添加拉春库林A或在温育的整个约4天中添加诺考达唑；和在包含bFGF的培养基中将第4阶段细胞温育约6天，其中在这6天的最后两天期间添加烟酰胺；
生成肠细胞，其包括在包含WNT激动剂CHIR和FGF4的培养基中将所述第1阶段定形内胚层细胞温育约4天，其中在温育的约前24小时中添加拉春库林A或在温育的整个约4天中添加诺考达唑，产生第2阶段细胞；在包含R-spondin1和BMP抑制剂LDN193189的培养基中将第2阶段细胞温育约7天；或
生成肝细胞，其包括在包含FGFR2b激动剂KGF的培养基中将所述第1阶段定形内胚层细胞温育约2天，产生第3阶段细胞；在包含BMP4的培养基中将第3阶段细胞温育约4天，其中在温育的约前24-48小时中添加所述RAR激动剂视黄酸和拉春库林A或诺考达唑，产生第4阶段细胞；和在包含OSM、HGF和地塞米松的培养基中将所述第4阶段细胞温育约5天。
15.权利要求13或14的方法，其包括在形成内胚层谱系细胞之前调整簇的大小。
16.权利要求13的方法，其中
所述TGFβ/激活素激动剂为激活素A；
所述糖原合酶激酶3 (GSK)抑制剂或WNT激动剂为CHIR；
所述FGFR2b激动剂为KGF；
所述平滑化拮抗剂或音猬因子抑制剂为SANT-1；
所述FGF家族成员/FGFR2b激动剂为KGF；
所述RAR激动剂为RA；
所述蛋白激酶3激活剂为PDBU；
所述BMP抑制剂为LDN；
所述rho激酶抑制剂为Y27632；
所述Alk5抑制剂/TGF-β受体抑制剂为Alk5i；
所述甲状腺激素为T3；
所述γ分泌酶抑制剂为XXI；
所述Erbb1 (EGFR)或Erbb4激动剂/EGF家族成员为β细胞素；或
RAR激动剂为RA。
17.权利要求13或14中任何一项的方法，其中所述培养基为包含选自以下的一种或多种的无血清培养基：MCDB131、葡萄糖、NaHCO3、BSA、ITS-X、Glutamax、维生素C、青霉素-链霉素、CMRL 10666、FBS、肝素、NEAA、微量元素A、微量元素B或ZnSO4。
18.权利要求13的方法，其中所述足以形成定形内胚层细胞、原肠管细胞、早期胰腺祖细胞、胰腺祖细胞、内胚层细胞或β细胞的时间量在约1天-约15天之间。
19.权利要求13的方法，其中将所述早期胰腺祖细胞平板接种或用s1p (鞘氨醇-1-磷酸) YAP激活，以增加SC-β细胞的诱导，防止不期望的过早内分泌定型，或允许转录因子表达的正确时机。
20.权利要求13的方法，其中将拉春库林A、拉春库林B或诺考达唑引入到所述胰腺祖细胞，导致增强的平板接种细胞的内分泌诱导和增强的随后生成的β细胞的葡萄糖刺激的胰岛素分泌。
21.权利要求13的方法，其中将拉春库林A或拉春库林B引入到所述胰腺祖细胞，生成内胚层谱系细胞，比如肝细胞，或者所述拉春库林A或拉春库林B破坏细胞骨架肌动蛋白(例如第5阶段之前引入拉春库林A或拉春库林B产生肝细胞，或者在整个第5阶段引入拉春库林A或拉春库林B导致β细胞数量增加)。
22.权利要求13的方法，其中将YAP抑制剂(例如维替泊芬)引入到所述胰腺祖细胞。
23.权利要求13的方法，其中将拉春库林A或拉春库林B引入到所述胰腺祖细胞，从而增加葡萄糖介导的胰岛素分泌或胰岛素基因表达。
24.权利要求13的方法，其中所述内胚层谱系细胞选自β细胞、肝细胞或胰腺细胞。
25.权利要求13的方法，其中所述方法增强β细胞的诱导和功能。
26.权利要求13的方法，其中所述方法包括以平面(贴壁)培养进行培养。
27.权利要求13的方法，其包括将细胞平板接种在硬质基底上，其中与在软质基底上或悬浮培养中的NKX6.1表达相比较，在硬质基底上的NKX6.1表达增加。
28.任何权利要求13的方法，其中平面(贴壁)细胞被分散并重新聚集或与随着外部线索(例如温度)变化疏水性的表面组合，允许细胞脱离并保持细胞排列、细胞外基质蛋白和胰岛素分泌。
29.权利要求13的方法，其中所述β细胞为SC-β细胞。
30.权利要求13的方法，其中所述干细胞选自诱导性多能干细胞(iPSC) (比如患者来源的iPSC)、HUES8、1013-4FA、1016SeVA和1019SeVA。
31.一种筛选的方法，其包括：
提供从权利要求1、13或14中的任何一项生成的细胞；和
将化合物或组合物引入到所述细胞。
32.一种治疗需要它的受试者的方法，其包括：
给予受试者治疗有效量的内胚层谱系细胞，其中所述细胞根据权利要求1、13或14中的任何一项生成。
33.权利要求32的方法，其中所述受试者患有糖尿病或将所述细胞移植到受试者中，其中所述移植的细胞改善所述受试者的葡萄糖耐量并在移植之后至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月或至少约6个月具有持续功能。
34.一种通过权利要求1、13或14中任何一项的方法生成的细胞。
35.权利要求34的细胞或通过权利要求1、13或14中任何一项的方法生成的细胞，其中所述内胚层谱系细胞、β细胞或内胚层谱系的中间细胞表达CDX2、CHGA、FOXA2、SOX17、PDX1、NKX6-1、NGN3、NEUROG3、NEUROD1、NXK2-2、ISL1、KRT7、KRT19、PRSS1、PRSS2或INS。
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