CN112521465A - 丰原素、包括丰原素的组合物、编码丰原素的融合基因、重组质粒、重组菌及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种丰原素、编码脂肽类化合物的融合基因、重组质粒、重组菌及应用，属于植物病害防治技术领域；所述丰原素由贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)HN‑Q‑8产生，所述贝莱斯芽孢杆菌HN‑Q‑8的保藏编号为CGMCC No.19554。贝莱斯芽孢杆菌HN‑Q‑8具有高效生防作用。贝莱斯芽孢杆菌HN‑Q‑8产生的抑菌活性物质中，丰原素起主要抑菌作用。丰原素对马铃薯黑痣病菌有明显的抑制效果。

Description

丰原素、包括丰原素的组合物、编码丰原素的融合基因、重组 质粒、重组菌及应用
技术领域
本发明属于植物病害防治技术领域，尤其涉及丰原素、包括丰原素的组合物、编码丰原素的融合基因、重组质粒、重组菌及应用。
背景技术
马铃薯黑痣病(potato black scurf)由立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)引起。近年来，随着我国马铃薯种植面积的进一步加大，许多马铃薯主产区由于无法实现轮作倒茬而致使该病害的发生与危害日益严重，已经严重薯块的外观和商品价值。而当前主要依靠化学药剂进行防控。但由于多年来使用高毒农药导致病原菌对农药产生了抗药性，防治效果变差。因此，生物防治已成为当今各类植物病害防治研究的重点，是未来土传病害防治的重要研究方向。
发明内容
本发明的目的在于提供丰原素、包括丰原素的组合物、编码丰原素的融合基因、重组质粒、重组菌及应用，该丰原素对多种马铃薯病原菌具有良好的防治效果。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种丰原素，所述丰原素由贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)HN-Q-8产生，所述贝莱斯芽孢杆菌HN-Q-8的保藏编号为CGMCC No.19554。
本发明提供了一种包括上述方案所述丰原素的组合物，所述组合物还包括表面活性素；所述表面活性素由贝莱斯芽孢杆菌HN-Q-8产生。
本发明提供了一种上述所述丰原素的融合基因，所述融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明提供了一种包括上述方案所述的融合基因的重组质粒。
本发明提供了一种包括上述方案所述重组质粒的重组菌。
本发明提供了上述方案所述丰原素、所述组合物、所述融合基因、所述重组质粒或者所述重组菌在防治马铃薯病原菌中的应用。
优选的，所述马铃薯病原菌包括马铃薯黑痣病菌、马铃薯灰霉病菌或马铃薯干腐病菌中的茄病镰孢菌。
本发明还提供了上述方案所述丰原素、所述组合物、所述融合基因、所述重组质粒或者所述重组菌在构建马铃薯生防菌中的应用。
本发明的有益效果：本发明提供了一种丰原素，所述丰原素由贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)HN-Q-8产生，所述贝莱斯芽孢杆菌HN-Q-8的保藏编号为CGMCCNo.19554。贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)HN-Q-8具有高效生防作用。贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)HN-Q-8产生的抑菌活性物质中，丰原素起主要抑菌作用。丰原素对马铃薯黑痣病菌有明显的抑制效果。
生物保藏说明
贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)HN-Q-8，于2020年04月07日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC No.19554。
附图说明
图1为贝莱斯芽孢杆菌HN-Q-8产生的脂肽类化合物抑菌活性结果；
图2贝莱斯芽孢杆菌HN-Q-8产生的脂肽类化合物抑菌谱测定结果；
图3为贝莱斯芽孢杆菌HN-Q-8产生的脂肽类化合物对马铃薯黑痣病原菌菌丝形态的影响；
图4为贝莱斯芽孢杆菌HN-Q-8产生的脂肽类化合物抑菌活性物质鉴定结果；
图5为贝莱斯芽孢杆菌HN-Q-8产生的脂肽类化合物表面活性素和丰原素的抑菌活性结果；
图6为贝莱斯芽孢杆菌HN-Q-8产生的丰产素目的基因扩增结果；
图7为贝莱斯芽孢杆菌HN-Q-8产生的丰原素上下游及新霉素片段扩增结果；
图8为贝莱斯芽孢杆菌HN-Q-8产生的丰原素融合结果；
图9为贝莱斯芽孢杆菌HN-Q-8产生的丰原素融合片段的克隆结果。
具体实施方式
本发明提供了一种丰原素，所述丰原素由贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)HN-Q-8产生，所述贝莱斯芽孢杆菌HN-Q-8的保藏编号为CGMCC No.19554；所述丰原素通过溶解病原体的细胞壁或细胞膜，或者通过干扰病原菌蛋白合成、能量代谢和细胞分裂的方式来抑制病原菌。
本发明提供了一种包括上述方案所述丰原素的组合物，所述组合物还包括表面活性素；所述表面活性素由贝莱斯芽孢杆菌HN-Q-8产生。本发明中，所述组合物优选的采用以下制备方法得到：
1)对贝莱斯芽孢杆菌HN-Q-8菌液进行离心，收集上清液，调节上清液pH至2.0，4℃静置9～16h，离心，收集沉淀；
2)用甲醇溶解沉淀，用0.22μm滤膜过滤，收集滤液，得到脂肽类化合物。
本发明首先对贝莱斯芽孢杆菌HN-Q-8的菌液进行离心，收集上清液，调节所述上清液的pH值至2.0后，4℃静置9～16h，离心，收集沉淀；所述菌液优选的采用以下制备方法得到：将贝莱斯芽孢杆菌HN-Q-8单菌落接种于100mL LB培养基进行培养，得到菌液；所述培养的温度优选为37℃，时间优选为24h；所述培养的方式优选为震荡培养，所述震荡的转速优选为200rmp。
本发明中，所述离心的温度优选为4℃，转速优选为8000rmp，时间优选为15～25min，更优选为20min；所述静置的时间优选为12h。
得到沉淀后，本发明用甲醇溶解所述沉淀，用0.22μm滤膜过滤，收集滤液，得到脂肽类化合物。
本发明提供了一种上述所述丰原素的融合基因，所述融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：GGGCGAACTGGTTAAAGAGTGCCGTCGTCAAAAACAGAATCGTAATCCGGTTGGAAGAAAGATAATTGCCGAACCTCTCAGGGGCAAGCATTGTCGAGCGGTCAACCACATGAAGACATGCTCCGTTCAAAAGTGCTCCGAAGATTTCAAACGTCACTGCGTCAAAACCGATGGACCCTGTCAGAATGAGACGGTCCGACATGCCAGCCGACGTGTAATTGCTGTTTGACACGAGCGATATGACGTTTCGGTTGGAAATCATCACGCCCTTCGGTTTTCCTGTTGAACCGGATGTATACATAATATAGGCAAGGTCATCAGGTGCTGTATCGGTATTCAGTTTTCCCGCATCAGGTGTTTGTTTTTCAGCTGCAGCCGGGATAGAGATGATGTGAGAAAAGTCAATGTCAGTCTCAATTCCTTTTTGTACCGTTAACAGCTGTGCTCCGCTCTCAGTGAGCATATCGGCGATCCTGTCGGATGGCAGTTCTGCATCAAGGGGAAGGTACGTCCCTCCCGCTTTCAATACAGCGAGAACAGCGATGATAAATTCCGGTGAGCGTTCGGCCAGAATCCCGGCAATTCCCTTTGGCGCCAAACCGTTTTCCAGCAGGGTGCGGGCGAATGCAGTTGACCGTTCATCGAGCTCCCGGTACGTCATCGTCAGCCCGCCGGCGTGAAGCGCCTGATGGTCCGGGGTTTTCTTCACCTGTCGGCTGAACAGGCTGATGATGCTTTCATCTCTTTCATAAGTTGTTTTCGTGTCATTAAATTCGCCGGTTATTCTTGATTTTTCCTTTTGTCCGAGCATCGGAAGCCGATCAGCGGGAACATCGGGATTGAAGGCGGCGCCGCGCAGAGCTTCTTCCAAGTGTCCTTTTACGCTCTCTATCCATACTTCGTCATAAACGTTCGCATTGTAGCTGAATTTGATGAGCAGCTCATCGCCAGGCGCTATGATGAGGTTAAAATCGTAGCCCGATTGTTCCGAAACGTTGACATTCCCGATCCGGAATGGTGCATCCGATTCCTTTTCCGCGTCTTTCATCTGCTGCTGAATCGGATAATTTTCAAACACGATAATATGGTCGATTAAATCCTGTTTCAGCTCAGTCTGCGATTGGATGTCAGCAAGCGGATGATAGCTGAACGCCTCTGAGTCAAGCATTTCTTTCTGCAAGCGGCCCAGCAGTTCTCTAAAGCTTTCGTCACCCGTTTTAATGCGTACCGGAACGGTATTGATAAACAGCCCGATCATGCTTTCCACGCCGTCAATGA(丰原素基因上游片段)TGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTCCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAGATCGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAAGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGAGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTGACG(新霉素抗性基因)
CTCCCGCCAATACTCCGCCTGCTGAAGAAGCTGTTTACTTTCGGCATAATCGGCCAGCTGCTCCGTATATGTTTTGAATGACATGGTTTTCGAAGGGAGTTTGATTCCCTGTCCAGAGACGGCCTGTTCATAAGCAGAAGCCAAGTCTTCCAATAAAATCCGCCATGATATCCCGTCAACAGCGAGATGATGGACCGTCAGAAACAAGTAATCTTCTGCTTCAGAGCGGAACAGCCCCGCCTGTACAAGCGGCCCGTTCTCTAAATCCATGTTTCTCTGAAGCTCTGCGACGCGGCGTTTTACAAAACGTTCCTTCTCATGCTCATCGCCTTCCATTTCTAATATGGTCAGGCTGTAAAGCTGCTCATCTGCGAGGTCAGCCGGTCTGTTGAAGAGGAGAAGACCTTTCTCTTCGTCTTTTTTGCAGACAATGCGCAAGGCATCATGATGAACGGTAATAGCTTTTAACGTTTTCCTCAGAGCCTCTTCATCTATTGAATTTGCTCTCGTCAGCATGACGGACTGGTTAAAATGATTTGCTTCCTTCATGTCTTGTGTGAAGAACCATTTGTGAATCGGCGACCACTTCACTTCTCCTTCTGCAGGAGCTTGGCTGACCGGCTGCCGCTCTGTACGGACATAAGGCGCCAGCTCCCTAATTGTCGGCCGGCTGAAAATATCTTTTACGGCGATCTGTTTTCCTGCCTGATGTAATCGGGCTGATACTTGCAGGGCTTTGATGGAATCGCCGCCCAGTTCAAAAAATGATTGATCCGCGGCAATGTTTTCAGTTCCGAGCACTTCGCTCCAAATCGCGGACAGTTCTTTTTCCATGTCGCTTTCAGGCTCGGTAAATGCCCGTCCGGTGTGCGCTTTTTTCCGCGGCTCAGGAAGCGCGCGGCGGTCAAGCTTCCCGTTCGGTGTGACAGGCAGGGCTTCAAGTGTTTCAAAGAACGCCGGCACCATATAAGCGGGCATTTCATTTCTGAGTGCTTTCTGCACGGTTTCACTTTCTGTTCCTTCTTCTGTCACGATATAAGCGCATAGTTCCGTTTGGCCTGCTGATGCGGGCAGAGCGGTGACGGCTGCTTCTTTGACTCCTTTTATGCCTGTTAAGGCGGATTCAATTTCTTTCAGTTCCACCCGGTAGCCTCTGATTTTGACTTGCTCGTCCATTCGGCCGATATATTGCAGCGTGCCGTCCGGCAGCCATTTTGCCAGGTCGCCCGTGCGGTACATGCGCCGGTTCTTCTGGAACGGGTCTTGGACAAA(丰原素基因下游片段)；所述融合基因还包括新霉素抗性基因。
本发明所述融合基因优选的采用以下方法制备得到：
S1.提取贝莱斯芽孢杆菌HN-Q-8基因组DNA；
S2.以所述贝莱斯芽孢杆菌HN-Q-8基因组DNA为模板，采用丰原素基因的上游引物和丰原素基因的下游引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
S3.将PCR扩增产物和新霉素抗性基因连接，得到融合基因。
本发明首先提取贝莱斯芽孢杆菌HN-Q-8基因组DNA，本发明对所述提取贝莱斯芽孢杆菌HN-Q-8基因组DNA的方法没有特殊限制，采用本领域常规方法即可。
得到贝莱斯芽孢杆菌HN-Q-8基因组DNA，本发明以所述贝莱斯芽孢杆菌HN-Q-8基因组DNA为模板，分别采用丰原素基因的上游引物对和丰原素基因的下游引物对进行PCR扩增，得到丰原素基因上游片段和丰原素基因下游片段。
本发明中，所述丰原素基因的上游引物对包括上游F和上游R；所述上游F的的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：TGGGCGAACTGGTTAAAGAGTG；所述上游R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：AATAAACAAATAGGGGTTCCGCTCATTGACGGCGTGGAAAG；所述上游F和上游R扩增得到的丰原素基因上游片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，具体为：GGGCGAACTGGTTAAAGAGTGCCGTCGTCAAAAACAGAATCGTAATCCGGTTGGAAGAAAGATAATTGCCGAACCTCTCAGGGGCAAGCATTGTCGAGCGGTCAACCACATGAAGACATGCTCCGTTCAAAAGTGCTCCGAAGATTTCAAACGTCACTGCGTCAAAACCGATGGACCCTGTCAGAATGAGACGGTCCGACATGCCAGCCGACGTGTAATTGCTGTTTGACACGAGCGATATGACGTTTCGGTTGGAAATCATCACGCCCTTCGGTTTTCCTGTTGAACCGGATGTATACATAATATAGGCAAGGTCATCAGGTGCTGTATCGGTATTCAGTTTTCCCGCATCAGGTGTTTGTTTTTCAGCTGCAGCCGGGATAGAGATGATGTGAGAAAAGTCAATGTCAGTCTCAATTCCTTTTTGTACCGTTAACAGCTGTGCTCCGCTCTCAGTGAGCATATCGGCGATCCTGTCGGATGGCAGTTCTGCATCAAGGGGAAGGTACGTCCCTCCCGCTTTCAATACAGCGAGAACAGCGATGATAAATTCCGGTGAGCGTTCGGCCAGAATCCCGGCAATTCCCTTTGGCGCCAAACCGTTTTCCAGCAGGGTGCGGGCGAATGCAGTTGACCGTTCATCGAGCTCCCGGTACGTCATCGTCAGCCCGCCGGCGTGAAGCGCCTGATGGTCCGGGGTTTTCTTCACCTGTCGGCTGAACAGGCTGATGATGCTTTCATCTCTTTCATAAGTTGTTTTCGTGTCATTAAATTCGCCGGTTATTCTTGATTTTTCCTTTTGTCCGAGCATCGGAAGCCGATCAGCGGGAACATCGGGATTGAAGGCGGCGCCGCGCAGAGCTTCTTCCAAGTGTCCTTTTACGCTCTCTATCCATACTTCGTCATAAACGTTCGCATTGTAGCTGAATTTGATGAGCAGCTCATCGCCAGGCGCTATGATGAGGTTAAAATCGTAGCCCGATTGTTCCGAAACGTTGACATTCCCGATCCGGAATGGTGCATCCGATTCCTTTTCCGCGTCTTTCATCTGCTGCTGAATCGGATAATTTTCAAACACGATAATATGGTCGATTAAATCCTGTTTCAGCTCAGTCTGCGATTGGATGTCAGCAAGCGGATGATAGCTGAACGCCTCTGAGTCAAGCATTTCTTTCTGCAAGCGGCCCAGCAGTTCTCTAAAGCTTTCGTCACCCGTTTTAATGCGTACCGGAACGGTATTGATAAACAGCCCGATCATGCTTTCCACGCCGTCAATGA。
本发明中，所述丰原素基因的下游引物对包括下游F和下游R；所述下游F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，具体为：CGAAATGACCGACCAAGCATCTCCCGCCAATACTCCG；所述下游R的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，具体为：TTGTCCAAGACCCGTTCCA；所述下游F和下游R扩增得到的丰原素基因下游片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，具体为：CTCCCGCCAATACTCCGCCTGCTGAAGAAGCTGTTTACTTTCGGCATAATCGGCCAGCTGCTCCGTATATGTTTTGAATGACATGGTTTTCGAAGGGAGTTTGATTCCCTGTCCAGAGACGGCCTGTTCATAAGCAGAAGCCAAGTCTTCCAATAAAATCCGCCATGATATCCCGTCAACAGCGAGATGATGGACCGTCAGAAACAAGTAATCTTCTGCTTCAGAGCGGAACAGCCCCGCCTGTACAAGCGGCCCGTTCTCTAAATCCATGTTTCTCTGAAGCTCTGCGACGCGGCGTTTTACAAAACGTTCCTTCTCATGCTCATCGCCTTCCATTTCTAATATGGTCAGGCTGTAAAGCTGCTCATCTGCGAGGTCAGCCGGTCTGTTGAAGAGGAGAAGACCTTTCTCTTCGTCTTTTTTGCAGACAATGCGCAAGGCATCATGATGAACGGTAATAGCTTTTAACGTTTTCCTCAGAGCCTCTTCATCTATTGAATTTGCTCTCGTCAGCATGACGGACTGGTTAAAATGATTTGCTTCCTTCATGTCTTGTGTGAAGAACCATTTGTGAATCGGCGACCACTTCACTTCTCCTTCTGCAGGAGCTTGGCTGACCGGCTGCCGCTCTGTACGGACATAAGGCGCCAGCTCCCTAATTGTCGGCCGGCTGAAAATATCTTTTACGGCGATCTGTTTTCCTGCCTGATGTAATCGGGCTGATACTTGCAGGGCTTTGATGGAATCGCCGCCCAGTTCAAAAAATGATTGATCCGCGGCAATGTTTTCAGTTCCGAGCACTTCGCTCCAAATCGCGGACAGTTCTTTTTCCATGTCGCTTTCAGGCTCGGTAAATGCCCGTCCGGTGTGCGCTTTTTTCCGCGGCTCAGGAAGCGCGCGGCGGTCAAGCTTCCCGTTCGGTGTGACAGGCAGGGCTTCAAGTGTTTCAAAGAACGCCGGCACCATATAAGCGGGCATTTCATTTCTGAGTGCTTTCTGCACGGTTTCACTTTCTGTTCCTTCTTCTGTCACGATATAAGCGCATAGTTCCGTTTGGCCTGCTGATGCGGGCAGAGCGGTGACGGCTGCTTCTTTGACTCCTTTTATGCCTGTTAAGGCGGATTCAATTTCTTTCAGTTCCACCCGGTAGCCTCTGATTTTGACTTGCTCGTCCATTCGGCCGATATATTGCAGCGTGCCGTCCGGCAGCCATTTTGCCAGGTCGCCCGTGCGGTACATGCGCCGGTTCTTCTGGAACGGGTCTTGGACAAA。
本发明中，所述PCR扩增的程序为：94℃4min；94℃30s、58℃40s、72℃1min，35个循环；72℃10min；所述PCR扩增的反应体系为HN-Q-8菌株DNA 1μL，上下游引物各1μL，Mix12.5μL，ddH2O 9.5μL。
得到PCR扩增产物后，本发明将PCR扩增产物和新霉素抗性基因连接，得到融合基因；本发明利用DNA片段末端的反向互补序列(接头)自身退火并结合，使新霉素抗性基因两侧各与丰原素基因上下游DNA片段首尾相接；所述新霉素抗性基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示，具体为：TGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTCCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAGATCGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAAGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGAGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTGACG；所述连接的反应条件为：94℃4min；94℃30s、53℃2min、72℃4min，35个循环；72℃10min；所述连接的体系为Mix 12.5μL，上有片段、下游片段和新霉素基因片段质量1：1：1，补足水到25μL。
本发明提供了一种包括上述方案所述的融合基因的重组质粒；所述重组质粒优选的以pEASY-T1作为原始质粒。
本发明提供了一种包括上述方案所述重组质粒的重组菌；所述重组菌的原始菌优选为大肠杆菌。
本发明提供了上述方案所述丰原素、所述组合物、所述融合基因、所述重组质粒或者所述重组菌在防治马铃薯病原菌中的应用。
优选的，所述马铃薯病原菌包括马铃薯黑痣病菌、马铃薯灰霉病菌或马铃薯干腐病菌中的茄病镰孢菌。
本发明还提供了上述方案所述丰原素、所述组合物、所述融合基因、所述重组质粒或者所述重组菌在构建马铃薯生防菌中的应用。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如下实施例中采用生防菌株贝莱斯芽孢杆菌HN-Q-8和马铃薯黑痣病菌(Rhizoctonia solani)、马铃薯早疫病菌(Alternaria solani)、马铃薯晚疫病菌(Phytophthora infestans)、马铃薯干腐病中的茄病镰孢菌(Fusarium solani)和尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)、马铃薯灰霉病菌(Botrytis cinerea)、马铃薯黑胫病菌(Pectobacterium atrosepticum)、马铃薯疮痂病菌(Streptomyces scabies)、苹果斑点落叶病菌(Alternaria alternaria f.sp mali)，保存于河北农业大学马铃薯病害研究中心。
供试菌株贝莱斯芽孢杆菌HN-Q-8采用LB培养基，供试马铃薯黑胫病菌采用LB培养基，供试马铃薯晚疫病菌采用黑麦培养基，供试马铃薯疮痂病菌采用燕麦培养基，其余均采用PDA培养基。
各培养基配方如下：
1)LB液体培养基：5g酵母膏、10gNaCl、10g蛋白胨，1000mL蒸馏水，调pH至7.0。
2)LB固体培养基：5g酵母膏、10gNaCl、10g蛋白胨，20g琼脂粉，1000mL蒸馏水，调pH至7.0。
3)黑麦培养基：黑麦60g，琼脂10～15g，蔗糖20g，蒸馏水1000mL。
4)燕麦培养基：燕麦30g，琼脂15g，蒸馏水1000mL。
5)PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL。
所有培养基在121℃、1×105Pa灭菌30min备用。
实施例1贝莱斯芽孢杆菌HN-Q-8产生的脂肽类化合物的提取
采用十字划线法于37℃，24h培养单菌落，将新活化的HN-Q-8菌株接种于100mL LB液体培养基中37℃、200r/min培养24h，得到种子液；将种子液接种至100mL LB液体培养基的中，接种量为10％，继续以37℃、200r/min培养72h：将发酵液于4℃，8000rpm离心20min，收集上清液，在上清液中缓慢加入6mol/L的HCl调至pH至2.0，4℃静置沉淀过夜；然后4℃，8000rpm，离心20min，收集沉淀，将沉淀物置于通风厨中干燥后加入30mL甲醇将沉淀物充分溶解。用细菌过滤器过滤甲醇提取液得到脂肽类化合物。
实施例2贝莱斯芽孢杆菌HN-Q-8产生的脂肽类化合物抑菌活性
以马铃薯黑痣病菌ZB4菌株为模式菌，脂肽类化合物浓度配成10mg/mL、5mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL、0.1mg/mL。在平板中心接入模式病原菌菌饼(5mm)，在距离菌饼2.5cm的两边分别打孔，一边加入50μL甲醇，另一边加入50μL脂肽类化合物。每个浓度为一个处理，每个处理重复3次，用未处理的空白板作对照。等到空白对照组将要长满培养皿时，进行观察并拍照。
结果如图1所示，图1中A为浓度为10mg/mL脂肽类化合物抑菌活性；B为5mg/mL脂肽类化合物抑菌活性；C为1mg/mL脂肽类化合物抑菌活性；D为0.5mg/mL脂肽类化合物抑菌活性；E为0.1mg/mL脂肽类化合物抑菌活性；F为空白对照。实验结果表明，贝莱斯芽孢杆菌HN-Q-8产生的脂肽类化合物对马铃薯黑痣病菌的抑菌作用随着浓度的加大而增加，当脂肽类化合物浓度为5mg/mL时对黑痣病菌有抑制作用，但浓度为10mg/mL时抑制作用较明显，因此，脂肽类化合物抑菌谱的测定均采用的浓度为10mg/mL。
实施例3贝莱斯芽孢杆菌HN-Q-8产生的脂肽类化合物抑菌谱测定
1.脂肽类化合物对病菌的抑制测定：抑菌谱测定均采用的浓度为10mg/mL。在平板中心接入真菌病菌(5mm)，在距离菌饼2.5cm的两边分别打孔，一边加入50μL甲醇，另一边加入50μL脂肽类化合物。每个菌为一个处理，每个处理重复三次，用未处理的空白板作对照。待空白对照组长满培养皿时，进行观察并且拍照。
2.脂肽类化合物对细菌和放线菌抑制测定：将稀释倍数为1×10-5的马铃薯黑胫病菌和稀释倍数为1×10-2的马铃薯疮痂病菌各取100μL的菌液均匀涂布在平板上，然后在距离平板中心2.5cm的两边分别打孔，一边加入50μL甲醇，另一边加入50μL脂肽类化合物。每个菌为一个处理，每个处理重复三次，用未处理的空白板作对照。24h后进行观察拍照。
结果如图2所示，脂肽类化合物对马铃薯黑痣病菌(Rhizoctonia solani)、马铃薯灰霉病菌(Botrytis cinerea)和马铃薯干腐病菌中的茄病镰孢菌(Fusarium solani)有较明显的抑制效果；对苹果斑点落叶病菌(Alternaria alternaria f.sp mali)、马铃薯干腐病菌中的尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)以及马铃薯早疫病菌(Alternaria solani)也有一定抑制效果；对马铃薯晚疫病菌(Phytophthora infestans)、马铃薯黑胫病菌(Pectobacterium atrosepticum)和马铃薯疮痂病菌(Streptomyces scabies)没有抑制效果。
实施例4贝莱斯芽孢杆菌HN-Q-8产生的脂肽类化合物对马铃薯黑痣病菌菌丝形态的影响
当PDA培养基温度为40℃左右时倒入培养皿当中，晾干，使其固化、无水蒸气。然后在平板中心接入黑痣病原菌饼(5mm)，随后分别在距离其2.5cm的上下左右处打孔，然后加入50μL的10mg/mL脂肽类化合物，用未处理的空白板作对照。放入25℃培养箱，先正置培养，待甲醇和脂肽化合物充分扩散后进行倒置培养，待空白对照组将要长满培养皿时察结果并对菌丝形态进行显微镜观察。
结果参见图3，其中A为对照组；B为HN-Q-8菌株产生的脂肽类化合物处理；C为对照组；D为HN-Q-8菌株产生的脂肽类化合物处理；可以看出，对照组病原菌菌丝生长正常(A)，形态均匀(图C)；而在HN-Q-8菌株产生的脂肽类化合物的作用下，马铃薯黑痣病菌菌丝生长不均匀(图B)，形态呈现畸形、扭曲(图D)。
实施例5贝莱斯芽孢杆菌HN-Q-8产生的脂肽类化合物抑菌活性物质鉴定
取风干后的脂肽类化合物加入甲醇使其充分溶解、混匀后在C18柱上进行洗脱，所得到的溶液采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laserdesorption ionization time-of-flight mass spectrometry/MALDI-TOF MS)鉴定甲醇粗提物的成分。
操作方法：确定仪器真空度为10-7-mbar或无，开始样品分析时先进行分子量校正，使用337nm氮激光源解吸附和电离，采用α-氰-4-羟肉桂酸为基质，取1μL样品与等体积的基质混匀，置于仪器离子源进行测定。质量扫描范围为1000～2000Da。
将从HN-Q-8菌株中提取的的抑菌活性物质进行基质辅助解离质谱法测定。如图4所示，发现其质谱峰峰值m/z分别为1058.70000和1477.90000，分别为surfactin钠离子加合峰和fengycin质子加合峰。说明HN-Q-8菌株发酵液提取的活性物质中含有surfactin和fengycin两种脂肽类化合物。
实施例6贝莱斯芽孢杆菌HN-Q-8产生的脂肽类化合物表面活性素和丰原素的抑菌活性
脂肽类化合物表面活性素和丰原素加入适量的甲醇，将其浓度配成2.5mg/mL并且将配好的溶液使用细菌过滤器进行过滤。将黑痣病菌接入平板一侧，然后在其2.5cm处打孔后分别加入以下溶液：
50μL的表面活性素溶液、50μL的丰原素溶液、25μL表面活性素与25μL丰原素的混合液、50μL的甲醇溶液。每种溶液为一个处理，每个处理重复三次，未处理的空白板作对照。三天后进行观察测量并且拍照记录。
结果参见图5，其中A为丰原素处理；B为表面活性素处理；C为丰原素与表面活性素混合处理；D为空白对照；当浓度为2.5mg/mL时，丰原素对马铃薯黑痣病菌有明显的抑制效果(图A)；表面活性素对其没有抑制作用(图B)；当丰原素与表面活性素混合(体积比为1:1)时，对马铃薯黑痣病菌具有抑制作用(图C)。由此表明，在脂肽类化合物中对马铃薯黑痣病菌起到抑制作用的是丰原素。
实施例7丰原素缺失片段的构建
表1本实施例所用到的引物
Figure BDA0002467779380000141
1.引物稀释：将已经合成好的引物进行离心，4000r/min 4℃3min，然后在冰上加入aμL的ddH2O，使引物的浓度为100μm，加完之后用手轻轻弹振，上下轻微颠倒10min，随后进行瞬时离心。准备与引物数量相对应的1.5mL的离心管并标记名称和日期，使用移液枪向管内加入10μL的引物和90μL的ddH2O，最后置于-20℃保存备用。
2.第一轮PCR(常规PCR)：以HN-Q-8的DNA为模板，使用丰原素Fengycin的上游片段F/R(上游F的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，上游R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)、下游片段F/R(下游F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，下游R的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)和目的片段合成的丰原素目的基因F/R(丰原素目的基因F的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；丰原素目的基因R如SEQ ID NO.10所示)进行PCR扩增。
反应条件为：94℃4min；94℃30s、58℃40s、72℃1min，35个循环；72℃10min；反应体系为：DNA 1μL，上下游引物各1μL，Mix 12.5μL，ddH2O9.5μL，得到第一轮PCR产物。
3.琼脂糖凝胶电泳：向三角瓶内倒取TAE缓冲液，称取一定量的琼脂糖胶粉，制成浓度为1.2％的胶板，然后按照Loading Buffer与扩增产物样品量为1:5的比例混匀，使用移液枪缓慢的加入到胶槽当中，110V电压、30分钟，结束后进行观察并保存。参见图6，其中1为目的基因；2为空白对照。将丰原素的目的基因进行扩增，扩增结果长度与实验设计长度一致。
4.第二轮PCR(融合PCR)：不加入任何引物，以第1轮PCR得到的反应产物为模板，利用DNA片段末端的反向互补序列(接头)自身退火并结合，使从质粒PEGEP-N1中扩增的新霉素抗性基因(扩增新霉素抗性基因的引物包括新霉素F和新霉素R；所述新霉素F的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；所述新霉素R的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示)两侧与Fengycin基因上下游DNA片段首尾相接。反应条件为：94℃4min；94℃30s、53℃2min、72℃4min，35个循环；72℃10min。
5.进行琼脂糖电泳后使用凝胶成像分析仪进行观察，方法同上。结果参见图7，其中，1.上游片段2.下游片段3.新霉素片段4.CK。丰原素上下游及新霉素片段进行扩增，扩增结果长度与实验设计长度一致。
6.第三轮PCR(巢式PCR):以第二轮融合的PCR产物进行克隆并以菌液为模板，使用克隆试剂盒所提供的通用化引物M13F/M13R进行验证。反应条件为：94℃4min；94℃30s、53℃2min、72℃4min，35个循环；72℃10min。
结果参见图8，其中1.Tm＝53℃、DNA＝80ng/μL；2.Tm＝53℃、DNA＝150ng/μL；3.Tm＝55℃、DNA＝80ng/μL；4.Tm＝55℃、DNA＝150ng/μL；5.ck；将脂肽类化合物丰原素融合，融合后的长度与实验设计长度一致。
7.融合片段的克隆：向PCR管分别加入融合PCR产物1μL、pEASY-T1Simple CloningVector1μL、ddH2O 3μL放于25℃的环境条件下保持10min，结束后转入装有50μL大肠杆菌感受态的EP内管，冰浴30min后迅速放入42℃水浴锅内持续30s，结束后转入冰上2min。最后向管内加入250μL的LB培养基，在摇床上200r/min、60min、1h。
8.LB平板的制作：当LB培养基的温度降至40℃左右时加入氨苄青霉素贮存液，待其固化分别加入IPTG和X-gal进行涂布。进行此步骤时要在避光条件下进行。
9.1h后取上述液体200μL在平板上进行涂布，结束后置于37℃倒置培养24h后观察菌落生长情况并拍照记录。结果参见图9，在经过24h培养后，在平板上均长出含有载体的乳白色的菌落和不含载体的蓝色斑。
10.在LB培养基上用灭菌的白枪头挑取乳白色的菌落于加有氨苄青霉素贮存液的液体LB内，200rpm、37℃、6h。最后取1μL的单克隆菌液进行PCR验证。
11.将融合成功的克隆片段送上海生工测序后再与Gene-Bank进行序列比对。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 河北农业大学
<120> 丰原素、包括丰原素的组合物、编码丰原素的融合基因、重组质粒、重组菌及应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3788
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gggcgaactg gttaaagagt gccgtcgtca aaaacagaat cgtaatccgg ttggaagaaa 60
gataattgcc gaacctctca ggggcaagca ttgtcgagcg gtcaaccaca tgaagacatg 120
ctccgttcaa aagtgctccg aagatttcaa acgtcactgc gtcaaaaccg atggaccctg 180
tcagaatgag acggtccgac atgccagccg acgtgtaatt gctgtttgac acgagcgata 240
tgacgtttcg gttggaaatc atcacgccct tcggttttcc tgttgaaccg gatgtataca 300
taatataggc aaggtcatca ggtgctgtat cggtattcag ttttcccgca tcaggtgttt 360
gtttttcagc tgcagccggg atagagatga tgtgagaaaa gtcaatgtca gtctcaattc 420
ctttttgtac cgttaacagc tgtgctccgc tctcagtgag catatcggcg atcctgtcgg 480
atggcagttc tgcatcaagg ggaaggtacg tccctcccgc tttcaataca gcgagaacag 540
cgatgataaa ttccggtgag cgttcggcca gaatcccggc aattcccttt ggcgccaaac 600
cgttttccag cagggtgcgg gcgaatgcag ttgaccgttc atcgagctcc cggtacgtca 660
tcgtcagccc gccggcgtga agcgcctgat ggtccggggt tttcttcacc tgtcggctga 720
acaggctgat gatgctttca tctctttcat aagttgtttt cgtgtcatta aattcgccgg 780
ttattcttga tttttccttt tgtccgagca tcggaagccg atcagcggga acatcgggat 840
tgaaggcggc gccgcgcaga gcttcttcca agtgtccttt tacgctctct atccatactt 900
cgtcataaac gttcgcattg tagctgaatt tgatgagcag ctcatcgcca ggcgctatga 960
tgaggttaaa atcgtagccc gattgttccg aaacgttgac attcccgatc cggaatggtg 1020
catccgattc cttttccgcg tctttcatct gctgctgaat cggataattt tcaaacacga 1080
taatatggtc gattaaatcc tgtttcagct cagtctgcga ttggatgtca gcaagcggat 1140
gatagctgaa cgcctctgag tcaagcattt ctttctgcaa gcggcccagc agttctctaa 1200
agctttcgtc acccgtttta atgcgtaccg gaacggtatt gataaacagc ccgatcatgc 1260
tttccacgcc gtcaatgatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat 1320
aatattgaaa aaggaagagt cctgaggcgg aaagaaccag ctgtggaatg tgtgtcagtt 1380
agggtgtgga aagtccccag gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca tgcatctcaa 1440
ttagtcagca accaggtgtg gaaagtcccc aggctcccca gcaggcagaa gtatgcaaag 1500
catgcatctc aattagtcag caaccatagt cccgccccta actccgccca tcccgcccct 1560
aactccgccc agttccgccc attctccgcc ccatggctga ctaatttttt ttatttatgc 1620
agaggccgag gccgcctcgg cctctgagct attccagaag tagtgaggag gcttttttgg 1680
aggcctaggc ttttgcaaag atcgatcaag agacaggatg aggatcgttt cgcatgattg 1740
aacaagatgg attgcacgca ggttctccgg ccgcttgggt ggagaggcta ttcggctatg 1800
actgggcaca acagacaatc ggctgctctg atgccgccgt gttccggctg tcagcgcagg 1860
ggcgcccggt tctttttgtc aagaccgacc tgtccggtgc cctgaatgaa ctgcaagacg 1920
aggcagcgcg gctatcgtgg ctggccacga cgggcgttcc ttgcgcagct gtgctcgacg 1980
ttgtcactga agcgggaagg gactggctgc tattgggcga agtgccgggg caggatctcc 2040
tgtcatctca ccttgctcct gccgagaaag tatccatcat ggctgatgca atgcggcggc 2100
tgcatacgct tgatccggct acctgcccat tcgaccacca agcgaaacat cgcatcgagc 2160
gagcacgtac tcggatggaa gccggtcttg tcgatcagga tgatctggac gaagagcatc 2220
aggggctcgc gccagccgaa ctgttcgcca ggctcaaggc gagcatgccc gacggcgagg 2280
atctcgtcgt gacccatggc gatgcctgct tgccgaatat catggtggaa aatggccgct 2340
tttctggatt catcgactgt ggccggctgg gtgtggcgga ccgctatcag gacatagcgt 2400
tggctacccg tgatattgct gaagagcttg gcggcgaatg ggctgaccgc ttcctcgtgc 2460
tttacggtat cgccgctccc gattcgcagc gcatcgcctt ctatcgcctt ctgacgctcc 2520
cgccaatact ccgcctgctg aagaagctgt ttactttcgg cataatcggc cagctgctcc 2580
gtatatgttt tgaatgacat ggttttcgaa gggagtttga ttccctgtcc agagacggcc 2640
tgttcataag cagaagccaa gtcttccaat aaaatccgcc atgatatccc gtcaacagcg 2700
agatgatgga ccgtcagaaa caagtaatct tctgcttcag agcggaacag ccccgcctgt 2760
acaagcggcc cgttctctaa atccatgttt ctctgaagct ctgcgacgcg gcgttttaca 2820
aaacgttcct tctcatgctc atcgccttcc atttctaata tggtcaggct gtaaagctgc 2880
tcatctgcga ggtcagccgg tctgttgaag aggagaagac ctttctcttc gtcttttttg 2940
cagacaatgc gcaaggcatc atgatgaacg gtaatagctt ttaacgtttt cctcagagcc 3000
tcttcatcta ttgaatttgc tctcgtcagc atgacggact ggttaaaatg atttgcttcc 3060
ttcatgtctt gtgtgaagaa ccatttgtga atcggcgacc acttcacttc tccttctgca 3120
ggagcttggc tgaccggctg ccgctctgta cggacataag gcgccagctc cctaattgtc 3180
ggccggctga aaatatcttt tacggcgatc tgttttcctg cctgatgtaa tcgggctgat 3240
acttgcaggg ctttgatgga atcgccgccc agttcaaaaa atgattgatc cgcggcaatg 3300
ttttcagttc cgagcacttc gctccaaatc gcggacagtt ctttttccat gtcgctttca 3360
ggctcggtaa atgcccgtcc ggtgtgcgct tttttccgcg gctcaggaag cgcgcggcgg 3420
tcaagcttcc cgttcggtgt gacaggcagg gcttcaagtg tttcaaagaa cgccggcacc 3480
atataagcgg gcatttcatt tctgagtgct ttctgcacgg tttcactttc tgttccttct 3540
tctgtcacga tataagcgca tagttccgtt tggcctgctg atgcgggcag agcggtgacg 3600
gctgcttctt tgactccttt tatgcctgtt aaggcggatt caatttcttt cagttccacc 3660
cggtagcctc tgattttgac ttgctcgtcc attcggccga tatattgcag cgtgccgtcc 3720
ggcagccatt ttgccaggtc gcccgtgcgg tacatgcgcc ggttcttctg gaacgggtct 3780
tggacaaa 3788
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgggcgaact ggttaaagag tg 22
<210> 3
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aataaacaaa taggggttcc gctcattgac ggcgtggaaa g 41
<210> 4
<211> 1278
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gggcgaactg gttaaagagt gccgtcgtca aaaacagaat cgtaatccgg ttggaagaaa 60
gataattgcc gaacctctca ggggcaagca ttgtcgagcg gtcaaccaca tgaagacatg 120
ctccgttcaa aagtgctccg aagatttcaa acgtcactgc gtcaaaaccg atggaccctg 180
tcagaatgag acggtccgac atgccagccg acgtgtaatt gctgtttgac acgagcgata 240
tgacgtttcg gttggaaatc atcacgccct tcggttttcc tgttgaaccg gatgtataca 300
taatataggc aaggtcatca ggtgctgtat cggtattcag ttttcccgca tcaggtgttt 360
gtttttcagc tgcagccggg atagagatga tgtgagaaaa gtcaatgtca gtctcaattc 420
ctttttgtac cgttaacagc tgtgctccgc tctcagtgag catatcggcg atcctgtcgg 480
atggcagttc tgcatcaagg ggaaggtacg tccctcccgc tttcaataca gcgagaacag 540
cgatgataaa ttccggtgag cgttcggcca gaatcccggc aattcccttt ggcgccaaac 600
cgttttccag cagggtgcgg gcgaatgcag ttgaccgttc atcgagctcc cggtacgtca 660
tcgtcagccc gccggcgtga agcgcctgat ggtccggggt tttcttcacc tgtcggctga 720
acaggctgat gatgctttca tctctttcat aagttgtttt cgtgtcatta aattcgccgg 780
ttattcttga tttttccttt tgtccgagca tcggaagccg atcagcggga acatcgggat 840
tgaaggcggc gccgcgcaga gcttcttcca agtgtccttt tacgctctct atccatactt 900
cgtcataaac gttcgcattg tagctgaatt tgatgagcag ctcatcgcca ggcgctatga 960
tgaggttaaa atcgtagccc gattgttccg aaacgttgac attcccgatc cggaatggtg 1020
catccgattc cttttccgcg tctttcatct gctgctgaat cggataattt tcaaacacga 1080
taatatggtc gattaaatcc tgtttcagct cagtctgcga ttggatgtca gcaagcggat 1140
gatagctgaa cgcctctgag tcaagcattt ctttctgcaa gcggcccagc agttctctaa 1200
agctttcgtc acccgtttta atgcgtaccg gaacggtatt gataaacagc ccgatcatgc 1260
tttccacgcc gtcaatga 1278
<210> 5
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cgaaatgacc gaccaagcat ctcccgccaa tactccg 37
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ttgtccaaga cccgttcca 19
<210> 7
<211> 1272
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctcccgccaa tactccgcct gctgaagaag ctgtttactt tcggcataat cggccagctg 60
ctccgtatat gttttgaatg acatggtttt cgaagggagt ttgattccct gtccagagac 120
ggcctgttca taagcagaag ccaagtcttc caataaaatc cgccatgata tcccgtcaac 180
agcgagatga tggaccgtca gaaacaagta atcttctgct tcagagcgga acagccccgc 240
ctgtacaagc ggcccgttct ctaaatccat gtttctctga agctctgcga cgcggcgttt 300
tacaaaacgt tccttctcat gctcatcgcc ttccatttct aatatggtca ggctgtaaag 360
ctgctcatct gcgaggtcag ccggtctgtt gaagaggaga agacctttct cttcgtcttt 420
tttgcagaca atgcgcaagg catcatgatg aacggtaata gcttttaacg ttttcctcag 480
agcctcttca tctattgaat ttgctctcgt cagcatgacg gactggttaa aatgatttgc 540
ttccttcatg tcttgtgtga agaaccattt gtgaatcggc gaccacttca cttctccttc 600
tgcaggagct tggctgaccg gctgccgctc tgtacggaca taaggcgcca gctccctaat 660
tgtcggccgg ctgaaaatat cttttacggc gatctgtttt cctgcctgat gtaatcgggc 720
tgatacttgc agggctttga tggaatcgcc gcccagttca aaaaatgatt gatccgcggc 780
aatgttttca gttccgagca cttcgctcca aatcgcggac agttcttttt ccatgtcgct 840
ttcaggctcg gtaaatgccc gtccggtgtg cgcttttttc cgcggctcag gaagcgcgcg 900
gcggtcaagc ttcccgttcg gtgtgacagg cagggcttca agtgtttcaa agaacgccgg 960
caccatataa gcgggcattt catttctgag tgctttctgc acggtttcac tttctgttcc 1020
ttcttctgtc acgatataag cgcatagttc cgtttggcct gctgatgcgg gcagagcggt 1080
gacggctgct tctttgactc cttttatgcc tgttaaggcg gattcaattt ctttcagttc 1140
cacccggtag cctctgattt tgacttgctc gtccattcgg ccgatatatt gcagcgtgcc 1200
gtccggcagc cattttgcca ggtcgcccgt gcggtacatg cgccggttct tctggaacgg 1260
gtcttggaca aa 1272
<210> 8
<211> 1238
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tgtatccgct catgagacaa taaccctgat aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga 60
gtcctgaggc ggaaagaacc agctgtggaa tgtgtgtcag ttagggtgtg gaaagtcccc 120
aggctcccca gcaggcagaa gtatgcaaag catgcatctc aattagtcag caaccaggtg 180
tggaaagtcc ccaggctccc cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc 240
agcaaccata gtcccgcccc taactccgcc catcccgccc ctaactccgc ccagttccgc 300
ccattctccg ccccatggct gactaatttt ttttatttat gcagaggccg aggccgcctc 360
ggcctctgag ctattccaga agtagtgagg aggctttttt ggaggcctag gcttttgcaa 420
agatcgatca agagacagga tgaggatcgt ttcgcatgat tgaacaagat ggattgcacg 480
caggttctcc ggccgcttgg gtggagaggc tattcggcta tgactgggca caacagacaa 540
tcggctgctc tgatgccgcc gtgttccggc tgtcagcgca ggggcgcccg gttctttttg 600
tcaagaccga cctgtccggt gccctgaatg aactgcaaga cgaggcagcg cggctatcgt 660
ggctggccac gacgggcgtt ccttgcgcag ctgtgctcga cgttgtcact gaagcgggaa 720
gggactggct gctattgggc gaagtgccgg ggcaggatct cctgtcatct caccttgctc 780
ctgccgagaa agtatccatc atggctgatg caatgcggcg gctgcatacg cttgatccgg 840
ctacctgccc attcgaccac caagcgaaac atcgcatcga gcgagcacgt actcggatgg 900
aagccggtct tgtcgatcag gatgatctgg acgaagagca tcaggggctc gcgccagccg 960
aactgttcgc caggctcaag gcgagcatgc ccgacggcga ggatctcgtc gtgacccatg 1020
gcgatgcctg cttgccgaat atcatggtgg aaaatggccg cttttctgga ttcatcgact 1080
gtggccggct gggtgtggcg gaccgctatc aggacatagc gttggctacc cgtgatattg 1140
ctgaagagct tggcggcgaa tgggctgacc gcttcctcgt gctttacggt atcgccgctc 1200
ccgattcgca gcgcatcgcc ttctatcgcc ttctgacg 1238
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ataaggacag cgagcgtagc g 21
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cctttaggag gcggagatg 19
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gcggaacccc tatttgttta tt 22
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gcttggtcgg tcatttcg 18

Claims (8)

1.一种丰原素，其特征在于，所述丰原素由贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)HN-Q-8产生，所述贝莱斯芽孢杆菌HN-Q-8的保藏编号为CGMCC No.19554。
2.一种包括权利要求1所述丰原素的组合物，其特征在于，所述组合物还包括表面活性素；所述表面活性素由贝莱斯芽孢杆菌HN-Q-8产生。
3.一种编码权利要求1所述丰原素的融合基因，所述融合基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
4.一种包括权利要求3所述的融合基因的重组质粒。
5.一种包括权利要求4所述重组质粒的重组菌。
6.权利要求1所述丰原素、权利要求2所述组合物、权利要求3所述融合基因、权利要求4所述重组质粒或者权利要求5所述重组菌在防治马铃薯病原菌中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述马铃薯病原菌包括马铃薯黑痣病菌、马铃薯灰霉病菌或马铃薯干腐病菌中的茄病镰孢菌。
8.权利要求1所述丰原素、权利要求2所述组合物、权利要求3所述融合基因、权利要求4所述重组质粒或者权利要求5所述重组菌在构建马铃薯生防菌中的应用。
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