CN112516138A - 化合物yx-2102在制备治疗肺纤维化药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种化合物YX‑2102在制备治疗肺纤维化药物中的应用,该药物通过抑制上皮‑间质转化,改善肺纤维化。
Description
技术内容
本发明属于生物医药领域,特别涉及一种化合物YX-2102在制备治疗肺纤维化药物中的应用。
背景技术
肺纤维化是一种慢性、进行性、纤维化性间质性肺疾病,其不可逆转,并最终可导致死亡。肺纤维化的发生率在全球范围内呈上升趋势,其发生频率与脑癌,胃癌和睾丸癌的发生频率相似。目前,尽管临床上已批准多个治疗肺纤维化的药物,但除肺移植以外,尚无其他治愈方法。因此,寻找一种能预防或治疗肺纤维化的活性化合物显得十分迫切。
目前对肺纤维化中纤维发生的病理机制仍不十分明确。但上皮-间质转化已越来越多地被认为是纤维化过程的关键事件。有人提出损伤的上皮肺泡细胞是成肌纤维细胞的重要贡献者,成纤维细胞是分泌大量细胞外基质和信号分子驱动纤维化的主要效应细胞。在肺纤维化期间,肺泡上皮细胞的反复损伤导致上皮-间质转化异常激活,从而导致上皮表型的丧失、间质表型的获得、成纤维细胞的激活、细胞外基质的积累以及肺实质损伤。上皮-间质转化过程受多种细胞内和细胞外配体的调节,其中转化生长因子β1是参与上皮-间质转化过程的特征因子之一。受损肺中转化生长因子β的产生持续上调可能会促进上皮细胞向胶原生成的病理性成纤维细胞的转分化,这是导致肺纤维化的一个重要过程。因此,在肺泡上皮细胞中抑制转化生长因子β1诱导的上皮-间质转化和信号通路被认为是肺纤维化的潜在治疗策略。
发明内容
本发明的目的是提供一种化合物YX-2102在制备治疗肺纤维化药物中的应用,该药物通过抑制上皮-间质转化,改善肺纤维化。
本发明的技术方案是:
化合物YX-2102在制备治疗肺纤维化药物中的应用,该化合物的结构式为:
所述化合物YX-2102抑制A549细胞中转化生长因子β1诱导的上皮间质转化。
所述化合物YX-2102用于抑制肺部炎症反应。
所述化合物YX-2102用于抑制肺纤维化。
所述药物为上皮-间质转化过程的抑制剂。
所述药物以口服、静脉注射方式给药。
所述药物用药量为每公斤每天5-100mg。
本发明所述的YX-2102是一种新型的上皮-间质转化过程的有效抑制剂。通过使用体外和体内模型,申请人系统地研究了YX-2102对肺纤维化的潜在治疗作用,通过实验验证,YX-2102通过抑制上皮-间质转化,改善肺纤维化。
附图说明
图1为YX-2102抑制肺泡上皮细胞中转化生长因子β1诱导的上皮间质转化;
图2为YX-2102体内抑制博来霉素诱导的肺部炎症实验;
图3为YX-2102在体内减轻博来霉素诱导的肺纤维化水平;
图4为促炎细胞因子(白介素-6,单核细胞趋化蛋白1和白介素-1β)的mRNA表达水平;
图5为大鼠肺纤维化程度的病理评价结果;
图6为大鼠肺脏器系数;
图7为大鼠肺组织中羟脯氨酸含量;
图8为大鼠肺部MicroCT扫描图像。
具体实施方式
一.试剂
Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)和胎牛血清(FBS)购自Hyclone(美国犹他州南洛根),
青霉素和链霉素购自Beyotime(中国江苏),
人重组转化生长因子β1购自Peprotech(Rocky Hill,NJ),
硫酸博来霉素购自Nippon Kayaku Co.LTD(日本),
Prime ScriptTMRT试剂盒购自Takara Bio(日本),
BCA分析试剂盒购自上海生工生物有限公司(中国上海),
其他试剂均采用生物级或分析纯试剂。
二.YX-2102的生物学实验方法
1.实验动物与处理
雄性Sprague-Dawley大鼠(6-8周大,体重180-200g)从中国人民解放军陆军军医大学(中国重庆)实验动物中心购买。所有动物实验均遵循中国人民解放军陆军军医大学医学伦理委员会的规定并已获批准。
采用气管暴露法建立肺纤维化大鼠模型,无菌条件下分离大鼠气管,以1ml注射器气管内一次性注射博莱霉素(5mg/kg),同法对照组大鼠气管内注入等体积生理盐水。所有大鼠随机分为四组(每组6只):
1)对照组:对照组大鼠仅接受溶剂处理;
2)YX-2102组:对照组大鼠仅接受YX-2102治疗;
3)博来霉素组:博来霉素诱导的大鼠接受溶剂处理;
4)博来霉素+YX-2102组:博来霉素诱导的大鼠接受YX-2102治疗。
将YX-2102溶解在盐水﹕DMSO﹕Tween-80(18﹕1﹕1)的溶剂中,每天向大鼠腹膜内注射25mg/kg YX-2102,在第3、7、14和21天通过颈椎脱臼法处死所有大鼠。通过心脏穿刺收集血样,并将血清保存在-80℃进行进一步实验。收集支气管肺泡灌洗液后,将整个肺叶切除,左叶经过处理以进行组织病理学检查和免疫组化分析,右叶在-80℃下存储以进行分子和生化分析。所有实验均按照有关动物护理和使用的相关准则进行。
2.细胞培养与处理
将人肺泡上皮腺癌细胞系A549(中国科学院细胞库)和大鼠肺泡II型细胞系RLE-6TN(美国模式培养物集存库)在含10%胎牛血清的DMEM中于5%CO2和37℃中培养。YX-2102溶于二甲亚砜中,浓度为10mg/ml,储存在-20℃下备用。将细胞血清饥饿18小时,并与指定浓度的YX-2102预孵育2小时,然后与5ng/ml转化生长因子β1再孵育48小时。从总细胞裂解液中提取的蛋白质进行免疫印迹分析。所有测量至少重复三次。
3.组织病理学检测
将肺组织固定在4%多聚甲醛中,切成4μm厚薄片,H&E染色,然后用马松染色,可以观察到完整的组织结构和胶原沉积。为了获得肺泡炎和纤维化评分,在显微镜下(奥林巴斯,东京,日本)以200倍的放大倍数独立检查至少10个随机视野。半定量法计算每组的肺泡炎和纤维化程度。
4.定量RT-PCR
使用定量RT-PCR方法确定mRNA表达水平。从细胞或大鼠的肺组织中使用Trizol试剂提取总RNA。使用Prime ScriptTMRT试剂盒将RNA反转录为cDNA。使用SYBR Premix ExTaqTMII在CFX96 TouchTMRT-PCR系统上进行定量RT-PCR。以GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)作参考标准。
5.蛋白免疫印迹分析
将肺组织或细胞在冰上使用RIRA缓冲液裂解20分钟,然后使用BCA分析试剂盒对其进行定量分析。通过SDS-PAGE分离等量的蛋白质,并通过电泳将其转移到聚偏二氟乙烯膜上。膜用溶解在含0.05%Tween-20的磷酸盐缓冲液中的5%脱脂奶试剂封闭,然后与一抗在4℃下孵育过夜(12h)。随后,蛋白带用辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二抗染色,并使用增强型化学发光试剂观察免疫反应蛋白。图像使用ChemiDocTM触摸成像系统进行显影,并使用ImageLab软件包进行分析。
6.羟脯氨酸含量测定
作为组织胶原蛋白含量的指标,肺羟脯氨酸含量根据制造商的说明书,使用羟脯氨酸分析试剂盒(南京建成)进行测量。肺羟脯氨酸含量表示为每毫克湿重肺中羟脯氨酸的微克数(μg/mg)。
7.小动物MicroCT成像
实验大鼠用异氟烷麻醉后,用Quantum FX Micro-CT扫描仪进行大鼠肺部成像。扫描仪采集参数选择:X射线管电压为90kV;CTX射线管电流,160μA;实时X射线管电流为80μA;FOV,36毫米。图像投影射线照片是在整个360°机架旋转过程中拍摄的,总扫描时间为4.5分钟。使用Mimics 17.0将获取的数据转换为气道,肺叶和纤维化的3D模型。
8.支气管肺泡灌洗
通过气管插管并注入10ml冷的0.9%盐水3次来获得支气管肺泡灌洗液,大约回收60-80%的馏分。将支气管肺泡灌洗液液离心(2000rpm,10分钟,4℃),并将上清液保存在-80℃进行进一步实验。将细胞沉淀物重悬,并用改良版吉姆萨溶液染色。从400个肺炎性细胞中确定差异细胞计数。
9.统计分析
数据为平均值±平均值的标准误差,并且P<0.05的差异被认为具有统计学意义。
三.实施例
实施例1 YX-2102抑制A549细胞的上皮间质转化过程
A549细胞用0.1、1或5μMYX-2102预处理2小时,再用5ng/ml转化生长因子β1刺激48小时。在经转化生长因子β1处理的A549细胞中观察到了间充质表型标志物α-平滑肌肌动蛋白增加和上皮表型标志物E-钙粘蛋白的mRNA表达降低。结果表明,转化生长因子β1刺激后,YX-2102预处理细胞随着剂量增加,E-钙粘蛋白的mRNA表达显著增加,而α-平滑肌肌动蛋白mRNA的水平被显著抑制。YX-2102以剂量依赖性方式预防转化生长因子β1诱导的上皮间质转化。为进一步验证YX-2102对A549细胞上皮间质转化的影响,申请人通过蛋白质印迹检测了E-钙粘蛋白和α-平滑肌肌动蛋白的表达水平。结果表明,YX-2102(5μM)预处理可提高转化生长因子β1诱导的A549细胞中E-钙粘蛋白的表达,并降低α-平滑肌肌动蛋白、波形蛋白和纤连蛋白的表达。
A549细胞用0.1、1或5μM YX-2102预处理2小时,再用5ng/ml转化生长因子β1刺激48小时。以DMSO处理的细胞作空白对照。
图1,定量RT-PCR分析细胞中E-钙粘蛋白和α-平滑肌肌动蛋白的mRNA表达水平;
图2,E-钙粘蛋白和α-平滑肌肌动蛋白表达的免疫印迹。
实验结果表明,YX-2102可以作为新的潜在肺泡上皮细胞上皮间质转化的抑制剂。
实施例2 YX-2102减轻博来霉素诱导的大鼠肺早期炎症反应
炎症被认为是肺纤维化发病机制中的病因。申请人评估了用YX-2102治疗对博来霉素诱导的大鼠肺纤维化的早期炎症阶段(第7天)的影响。首先,相对于空白对照组的大鼠,博来霉素气管滴注导致大鼠支气管肺泡灌洗液的巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞细胞数量显著升高,而YX-2102治疗后能够显著降低炎性细胞数量。采用定量RT-PCR计算检测大鼠肺组织中促炎细胞因子(白介素-6,单核细胞趋化蛋白-1和白介素-1β)和抗炎细胞因子(白介素-10和白介素-4)的mRNA表达水平。博来霉素组中的促炎细胞因子表达水平高于空白对照组,而YX-2102处理可显著降低促炎细胞因子的表达。大鼠第0天以5mg/kg剂量通过气道给予博来霉素,随后以每天25mg/kg的剂量腹腔注射YX-2102或空白溶剂,于第7天处死大鼠并取样检测。
图3,大鼠支气管肺泡灌洗液中巨噬细胞,淋巴细胞和嗜中性粒细胞的分类计数;
图4,促炎细胞因子(白介素-6,单核细胞趋化蛋白1和白介素-1β)的mRNA表达水平;
上述结果提示YX-2102可以减弱博莱霉素诱导的大鼠肺部早期炎症反应。
实施例3 YX-2102减轻博来霉素诱导的肺纤维化的体内实验
向雄性Sprague-Dawley大鼠气管内滴注博来霉素(5mg/kg)建立大鼠肺纤维化模型。YX-2102以每天25mg/kg剂量腹膜注射给药。该化合物安全且耐受性良好,未观察到药物相关的不良反应。
在博来霉素组中,肺的形态表现为明显的充血和水肿,经YX-2102治疗后,肺形态得到明显改善。肺切片H&E染色后与空白对照组相比,博来霉素组的肺组织显示出明显的肺泡壁增厚、肺泡塌陷,间质组织增加和明显的炎症病理变化。而用YX-2102治疗后显著改善了博来霉素诱导的肺损伤的严重程度。使用Ashcroft评分对博来霉素诱导的组织学变化进行半定量分析表明,YX-2102治疗组仅有较轻的纤维化病变。此外,博来霉素刺激导致肺系数显著增加(肺湿重/体重),并在用YX-2102治疗后明显降低。肺部Micro-CT扫描还显示,给予博来霉素的大鼠受到肺纤维化的影响,而用CYX-2102治疗减弱肺纤维化程度。同样,YX-2102治疗后细胞外基质的过度沉积大量减少。进一步通过测量大鼠肺组织中的羟脯氨酸含量以评估肺纤维化程度,观察到博来霉素组的羟脯氨酸水平高于空白对照组,而YX-2102治疗显著降低了肺组织中羟脯氨酸水平。
在第0天对大鼠进行5mg/kg博来霉素气管内给药,然后每天以25mg/kg剂量通过腹腔注射YX-2102或空白溶剂,参见图5-图8。
以上结果表明,YX-2102能够降低博来霉素诱导的肺纤维化。
Claims (7)
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述化合物YX-2102抑制A549细胞中转化生长因子β1诱导的上皮间质转化。
3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述化合物YX-2102用于抑制博莱霉素诱导的肺部炎症反应。
4.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述化合物YX-2102用于抑制博莱霉素诱导的肺纤维化。
5.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述药物为上皮-间质转化过程的抑制剂。
6.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述药物以口服、静脉注射方式给药。
7.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述药物用药量为每公斤每天5-100mg。
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