CN112501331A - 一种章鱼寄生虫的鉴定方法及鉴定制品 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种章鱼寄生虫的鉴定方法及鉴定制品，鉴定方法为形态学分析与DNA条形码分析相结合，方法中的关键步骤是现场将含有白点状寄生虫的组织取下，直接固定在用海水配制8％‑12％福尔马林溶液中。固定一周左右，可转移到酒精中长期保存，故此寄生虫形态学测量不受运输条件制约。本发明还提供了用于章鱼寄生虫物种鉴定的DNA条形码，核苷酸序列为SEQ ID NO:1‑2，并公开了能用于扩增上述条形码的引物及PCR扩增方法。通过DNA条形码鉴定，能够用于以章鱼寄生虫DNA为模板，快速准确鉴定章鱼寄生虫。

Description

一种章鱼寄生虫的鉴定方法及鉴定制品

技术领域

本发明属于寄生虫鉴定技术领域，具体涉及一种章鱼寄生虫的鉴定方法及鉴定制品。

背景技术

头足类是一个古老而多样的类群，它们在海洋生态系统的营养结构中发挥着重要作用，同时也是欧洲和亚洲市场中的宝贵渔业资源。近年来，由于其生命周期短、产量与生物量比值高、蛋白质含量高、市场价值高等特点，引起了人们对头足类的重视，且已成为一个热门的研究领域。且因头足类动物的独特性，所以其一直作为神经生物学及相关学科中的模式动物。随着头足类动物的商业价值和科学价值日益重要，也促使人们更多地了解那些可能对头足类健康造成的潜在威胁。

球虫中的丛集球虫属是头足类消化系统中最常见的寄生虫之一，这类寄生虫是异主寄生的，其生命周期包括无性生殖阶段、配子生殖阶段和孢子生殖阶段。无性生殖阶段发生在在中间宿主甲壳类动物的肠道内，此感染阶段的裂殖子侵入甲壳类动物的肠组织，并在细胞内发育，直到甲壳类被头足类动物吃掉。头足类动物摄取了丛集球虫的无性生殖阶段后，丛集球虫在头足类体内继续发育，在头足类体内经历配子生殖阶段和孢子生殖阶段。丛集球虫在被研究的头足类宿主中高度流行并达到严重的感染水平，从而危及宿主的结构和功能，形成球虫病。因此尽早发现被感染的章鱼宿主并确定寄生虫种类显得非常重要。

目前在章鱼丛集球虫寄生虫的鉴定、分类研究主要依托于形态学结合分子学方法。在章鱼寄生虫的鉴定过程中，因其卵囊体积大、分布密集等特点，可以通过肉眼识别，但鉴定其具体种类，仍然需要进一步比较，因此对此寄生虫的形态学测量和分子学鉴定是必不可少的步骤，丛集球虫的鉴定依据包括成熟的孢子囊形状、大小，每个成熟孢子囊包含的子孢子数目以及子孢子的大小。但如今测量前处理五花八门，如何进行简单快速的鉴定依然存在较大的困难。目前使用的对新鲜寄生虫直接压片的方法，这就要求章鱼宿主必须保证活体，但在远距离运输过程中无法保证；而被寄生虫感染的组织固定后切片测量的方法耗时长、误差大，在实际工作中不能作为最优选择。

因此，章鱼寄生虫鉴定工作迫切需要一种操作简单、通用性强、规范化的鉴定流程。

发明内容

本发明的目的是提供一种章鱼寄生虫的鉴定方法及鉴定制品，即一种简单快速、通用性强、规范化的章鱼寄生虫形态学鉴定方法，并提供了一种用于章鱼寄生虫物种鉴定的DNA条形码，可以准确的对章鱼寄生虫鉴定、分类；从而弥补现有技术的不足。

本发明首先提供一种非疾病诊断治疗目的的章鱼寄生虫的鉴定方法，包括如下的步骤：

1)对章鱼体表和胴体部解剖观察，在章鱼嗉囊、盲囊或其他组织发现白色圆点状寄生虫；

2)将含有白色圆点状寄生虫的章鱼组织取出并放入福尔马林溶液中固定，放置后使组织完全固定；

3)用解剖针和手术刀将白色圆点分离出来，放在载玻片上压片，

4)在显微镜中观察孢子囊和子孢子大小，测量并拍照，测量孢子囊和子孢子的大小来鉴定种类。

本发明还提供用于章鱼寄生虫的鉴定的DNA条形码，其中包含有：

用于检测短蛸寄生虫的DNA条形码，其序列信息如下(SEQ ID NO:1)：

ctatcaatccttcttatgtctggacctaataaaatttactgtgttgagtcaaattaaaccgcatactccacttctggtggtgc ctttccgtcaattcctttaagtttcaatcttgcaaccatacttcccccaaaacctaaaaactttgatttctctaaaaaacaccaaat aaatcatacaatcaatcacatctaatctctaattggcatagtttataattaagactacgacggtatctgatcatcttcgatccctta acttttgttcttaattaaaaaaaatattcttaataaatgctttcgcaataatttaccgtcaacaaatccaagaatttcacctcttgca gttaaatacaaatacccccaactatttttaaaaattattaaccaacattttaaaaccaacaaaaaaattatattataatcaaaatat tccatactccattattcaattaaaaactcccgcttaaaacactctaatttcttcaaaataaatttttaaaactttctatacaaacatat ataattttttaaattattctaataattataaaataaattttacataaaataaaatcatttattattatcataattgcaactacgagcttttt aactgcaacaatattaatatatattattaaaactggaattaccgcggctgctggcaccagacttgccctttaattaaaatttaata aaatctttgtatttatctcattccaattacaaaataacttttgtactttgtattgttattcctaatcactacctctttttataaaaattgga taatt；

用于检测长蛸寄生虫的DNA条形码，其序列信息如下(SEQ ID NO:2)：

tatccaatttttataaaaagaggtagtgattaggaataacaatacaaagtacaaaagttattttgtaattggaatgagataa atacaaagattttattaaattttaattaaagggcaagtctggtgccagcagccgcggtaattccagttttaataatatatattaat attgttgcagttaaaaagctcgtagttgcaattatgataataataaatgattttattttatgtaaaatttattttataattattagaataa tttaaaaaattatatatgtttgtatagaaagttttaaaaatttattttgaagaaattagagtgttttaagcgggagtttttaattgaata atggagtatggaatattttgattataatataatttttttgttggttttaaaatgttggttaataatttttaaaaatagttgggggtatttg tatttaactgcaagaggtgaaattcttggatttgttgacggtaaattattgcgaaagcatttattaagaatattttttttaattaaga acaaaagttaagggatcgaagatgatcagataccgtcgtagtcttaattataaactatgccaattagagattagatgtgattga ttgtatgatttatttggtgttttttagagaaatcaaagtttttaggttttgggggaagtatggttgcaagattgaaacttaaaggaat tgacggaaaggcaccaccagaagtggagtatgcggtttaatttgactcaacacagtaaattttattaggtccagacataaga aggattgatagattaata；

本发明还提供能用于扩增上述条形码的引物对,其引物序列如下：

AGGREGATA-F：5′-ggagaaggagcttgagaa-3′(SEQ ID NO:3)、

AGGREGATA-R:5′-ctccaccaactaagaacg-3′(SEQ ID NO:4)。

上述DNA条形码和扩增引物用于鉴定章鱼寄生虫物种，具体步骤如下：

1)提取章鱼寄生虫的DNA。

2)用上述扩增引物对步骤(1)提取的DNA进行PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。

3)将扩增产物进行测序，得到测序结果。

4)对序列进行核酸序列比对分析，确定章鱼寄生虫的具体种类。

本发明的DNA条形码和扩增引物用于制备用于鉴定章鱼寄生虫物种的分子检测制品。

本发明方法具有取样方法简单、不受运输条件制约以及误差小等优点。本发明取样后,可直接常温运输并长期保存。本发明解决了章鱼寄生虫测量前处理方法不统一导致测量误差大的问题,为章鱼寄生虫检测提供了一种行之有效的方法。同时本发明通过DNA条形码鉴定，能够用于以章鱼寄生虫DNA为模板，准确快速鉴定章鱼寄生虫，补充未知物种的信息，本发明的条形码和扩增引物可以有效的鉴定章鱼寄生虫的具体种类。

附图说明

图1：分别为丛集球虫孢子囊、孢子囊释放子孢子过程、释放出的子孢子的照片图。

图2：分别为短蛸丛集球虫、长蛸丛集球虫引物检测电泳结果的照片图。

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明进一步解释和说明。

实施例1：

一、形态学鉴定方法

(1)对在江苏连云港采集的短蛸体表和胴体部解剖观察，并用剪刀剪开短蛸盲囊，在体视显微镜下检查，在短蛸嗉囊、盲囊、肠中发现白点圆点状寄生虫。

(2)用剪刀取出含有白色圆点状寄生虫的短蛸宿嗉囊5mm³并放入放入用海水配制的福尔马林溶液中固定，固定时间为一周左右，使组织完全固定。

(3)将固定后的短蛸嗉囊组织转移到用海水配的70％的酒精中永久保存。

(4)用解剖针和手术刀将白色圆点分离出来，将分离出来的寄生虫放在载玻片上，盖上盖玻片，再放一片载玻片压片，使孢子囊和子孢子释放。

(5)在油镜下观察孢子囊和子孢子的大小，测量孢子囊30个并拍照，分段测量子孢子10个并拍照，鉴定具体种类。

(6)对孢子囊和子孢子的测量均以微米为单位，用括号内的平均值后跟标准差表示。短蛸中成熟的孢子囊大小为：19.42—21.98(20.61±0.63)×19.12 —21.55(20.31±0.53)；子孢子大小为：17.81—24.90(22.77±2.02)×2.22— 3.42(2.74±0.41)，同其他已鉴定出的丛集球虫相比，孢子囊和子孢子的大小有显著性差异。

二、DNA条形码的筛选及扩增引物的筛选

(1)对形态学鉴定的短蛸寄生虫、长蛸寄生虫进行基因组测序，获得18S rRNA基因序列。用软件Primer5在保守区域设计引物，即上游引物 AGGREGATA-F和下游引物AGGREGATA-R。

其引物序列如下：

AGGREGATA-F：5′-ggagaaggagcttgagaa-3′(SEQ ID NO:3)、

AGGREGATA-R:5′-ctccaccaactaagaacg-3′(SEQ ID NO:4)。

(2)短蛸寄生虫DNA条形码鉴定基因制备步骤

短蛸来自江苏连云港，取短蛸体内寄生虫按照苯酚氯仿法提取DNA,PCR扩增在200μl的离心管中，反应体系为25μl。PCR扩增的条件为：94℃预变性10min, 94℃变性1min,51℃退火1min,72℃延伸1min,循环35次，72℃延伸10min。获得的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析。在电泳结果图中，短蛸寄生虫在950bp 分子量处有单一清晰地条带，电泳结果如图2所示，表示本发明扩增引物能够成功扩出18S rRNA基因序列。将PCR产物送至生物公司测序确定短蛸寄生虫的DNA条形码为正确的序列，其其序列信息如下(SEQ ID NO:1)：

ctatcaatccttcttatgtctggacctaataaaatttactgtgttgagtcaaattaaaccgcatactccacttctggtggtgc ctttccgtcaattcctttaagtttcaatcttgcaaccatacttcccccaaaacctaaaaactttgatttctctaaaaaacaccaaat aaatcatacaatcaatcacatctaatctctaattggcatagtttataattaagactacgacggtatctgatcatcttcgatccctta acttttgttcttaattaaaaaaaatattcttaataaatgctttcgcaataatttaccgtcaacaaatccaagaatttcacctcttgca gttaaatacaaatacccccaactatttttaaaaattattaaccaacattttaaaaccaacaaaaaaattatattataatcaaaatat tccatactccattattcaattaaaaactcccgcttaaaacactctaatttcttcaaaataaatttttaaaactttctatacaaacatat ataattttttaaattattctaataattataaaataaattttacataaaataaaatcatttattattatcataattgcaactacgagcttttt aactgcaacaatattaatatatattattaaaactggaattaccgcggctgctggcaccagacttgccctttaattaaaatttaata aaatctttgtatttatctcattccaattacaaaataacttttgtactttgtattgttattcctaatcactacctctttttataaaaattgga taatt；

在NCBI上进行比对，同其它已鉴定出的丛集球虫相比，短蛸体内寄生虫的DNA具有显著性差异。通过引物对进行检测，获得的DNA条形码鉴定结果与形态学结果一致，证明了DNA条形码在短蛸寄生虫的鉴定和分类中的有效性和可行性。

实施例2：

形态学鉴定方法

(1)对长蛸体表和胴体部解剖观察，并用剪刀剪开长蛸盲囊，在体视显微镜下检查，在长蛸嗉囊、肠中发现白点圆点状寄生虫。

(2)用剪刀取出含有白色圆点状寄生虫的长蛸宿嗉囊5mm3并放入放入用海水配制的福尔马林溶液中固定，固定时间为一周左右，使组织完全固定。

(3)将固定后的长蛸嗉囊组织转移到用海水配的70％的酒精中永久保存。

(4)用解剖针和手术刀将白色圆点分离出来，将分离出来的寄生虫放在载玻片上，盖上盖玻片，再放一片载玻片压片，使孢子囊和子孢子释放。

(5)在油镜下观察孢子囊和子孢子的大小，测量孢子囊30个并拍照，分段测量子孢子10个并拍照，鉴定具体种类。

(6)对孢子囊和子孢子的测量均以微米为单位，用括号内的平均值后跟标准差表示。长蛸中成熟的孢子囊大小为：19.89—22.32(20.90±0.57)×19.25 —21.30(20.26±0.52)；子孢子大小为：19.93—23.18(21.72±1.06)×2.05— 3.32(2.68±0.35)，同短蛸中的丛集球虫相比，孢子囊和子孢子的大小无显著性差异。

DNA条形码的筛选及扩增引物的筛选

(1)对获得的长蛸中的丛集球虫进行基因组测序，获得短蛸寄生虫、长蛸寄生虫的18S rRNA基因序列。用软件Primer5在保守区域设计引物，即上游引物AGGREGATA-F和下游引物AGGREGATA-R。

其引物序列如下：

AGGREGATA-F：5′-ggagaaggagcttgagaa-3′(SEQ ID NO:3)、

AGGREGATA-R:5′-ctccaccaactaagaacg-3′(SEQ ID NO:4)。

(2)长蛸寄生虫DNA条形码鉴定基因制备步骤

长蛸来自中国台湾宜兰地区，取长蛸体内寄生虫按照苯酚氯仿法提取 DNA,PCR扩增在200μl的离心管中，反应体系为25μl。PCR扩增的条件为：94℃预变性10min,94℃变性1min,51℃退火1min,72℃延伸1min,循环35次， 72℃延伸10min。获得的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析。在电泳结果图中，长蛸寄生虫在950bp分子量处有单一清晰地条带，如图2所示，表示本发明扩增引物能够成功扩出18S rRNA基因序列。将PCR产物送至生物公司测序，能够得到长蛸寄生虫的DNA条形码。其序列信息如下(SEQ ID NO:2)：

tatccaatttttataaaaagaggtagtgattaggaataacaatacaaagtacaaaagttattttgtaattggaatgagataa atacaaagattttattaaattttaattaaagggcaagtctggtgccagcagccgcggtaattccagttttaataatatatattaat attgttgcagttaaaaagctcgtagttgcaattatgataataataaatgattttattttatgtaaaatttattttataattattagaataa tttaaaaaattatatatgtttgtatagaaagttttaaaaatttattttgaagaaattagagtgttttaagcgggagtttttaattgaata atggagtatggaatattttgattataatataatttttttgttggttttaaaatgttggttaataatttttaaaaatagttgggggtatttg tatttaactgcaagaggtgaaattcttggatttgttgacggtaaattattgcgaaagcatttattaagaatattttttttaattaaga acaaaagttaagggatcgaagatgatcagataccgtcgtagtcttaattataaactatgccaattagagattagatgtgattga ttgtatgatttatttggtgttttttagagaaatcaaagtttttaggttttgggggaagtatggttgcaagattgaaacttaaaggaat tgacggaaaggcaccaccagaagtggagtatgcggtttaatttgactcaacacagtaaattttattaggtccagacataaga aggattgatagattaata；

基于上述基因序列数据，在NCBI上进行比对，同其它已鉴定出的丛集球虫相比，DNA有显著性差异。而长蛸DNA条形码与短蛸寄生虫DNA条形码无显著性差异，且长蛸丛集球虫与短蛸中的丛集球虫相比，孢子囊和子孢子的大小也无显著性差异。进一步证明了DNA条形码的引物的特异性和灵敏性，同时证明DNA条形码在长蛸寄生虫的鉴定和分类中的有效性和可行性。

序列表

<110> 中国海洋大学

<120> 一种章鱼寄生虫的鉴定方法及鉴定制品

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 796

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctatcaatcc ttcttatgtc tggacctaat aaaatttact gtgttgagtc aaattaaacc 60

gcatactcca cttctggtgg tgcctttccg tcaattcctt taagtttcaa tcttgcaacc 120

atacttcccc caaaacctaa aaactttgat ttctctaaaa aacaccaaat aaatcataca 180

atcaatcaca tctaatctct aattggcata gtttataatt aagactacga cggtatctga 240

tcatcttcga tcccttaact tttgttctta attaaaaaaa atattcttaa taaatgcttt 300

cgcaataatt taccgtcaac aaatccaaga atttcacctc ttgcagttaa atacaaatac 360

ccccaactat ttttaaaaat tattaaccaa cattttaaaa ccaacaaaaa aattatatta 420

taatcaaaat attccatact ccattattca attaaaaact cccgcttaaa acactctaat 480

ttcttcaaaa taaattttta aaactttcta tacaaacata tataattttt taaattattc 540

taataattat aaaataaatt ttacataaaa taaaatcatt tattattatc ataattgcaa 600

ctacgagctt tttaactgca acaatattaa tatatattat taaaactgga attaccgcgg 660

ctgctggcac cagacttgcc ctttaattaa aatttaataa aatctttgta tttatctcat 720

tccaattaca aaataacttt tgtactttgt attgttattc ctaatcacta cctcttttta 780

taaaaattgg ataatt 796

<210> 2

<211> 800

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tatccaattt ttataaaaag aggtagtgat taggaataac aatacaaagt acaaaagtta 60

ttttgtaatt ggaatgagat aaatacaaag attttattaa attttaatta aagggcaagt 120

ctggtgccag cagccgcggt aattccagtt ttaataatat atattaatat tgttgcagtt 180

aaaaagctcg tagttgcaat tatgataata ataaatgatt ttattttatg taaaatttat 240

tttataatta ttagaataat ttaaaaaatt atatatgttt gtatagaaag ttttaaaaat 300

ttattttgaa gaaattagag tgttttaagc gggagttttt aattgaataa tggagtatgg 360

aatattttga ttataatata atttttttgt tggttttaaa atgttggtta ataattttta 420

aaaatagttg ggggtatttg tatttaactg caagaggtga aattcttgga tttgttgacg 480

gtaaattatt gcgaaagcat ttattaagaa tatttttttt aattaagaac aaaagttaag 540

ggatcgaaga tgatcagata ccgtcgtagt cttaattata aactatgcca attagagatt 600

agatgtgatt gattgtatga tttatttggt gttttttaga gaaatcaaag tttttaggtt 660

ttgggggaag tatggttgca agattgaaac ttaaaggaat tgacggaaag gcaccaccag 720

aagtggagta tgcggtttaa tttgactcaa cacagtaaat tttattaggt ccagacataa 780

gaaggattga tagattaata 800

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggagaaggag cttgagaa 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctccaccaac taagaacg 18

Claims (7)

1.一种非疾病诊断治疗目的的章鱼寄生虫的鉴定方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：

1)对章鱼体表和胴体部解剖观察，在章鱼嗉囊、盲囊或其他组织发现白色圆点状寄生虫；

2)将含有白色圆点状寄生虫的章鱼组织取出并放入福尔马林溶液中固定，放置后使组织完全固定；

3)用解剖针和手术刀将白色圆点分离出来，放在载玻片上压片，

4)在显微镜中观察孢子囊和子孢子大小，测量并拍照，测量孢子囊和子孢子的大小来鉴定种类。

2.一种用于鉴定章鱼寄生虫的DNA条形码，其特征在于，所述的DNA条形码中包含有用于检测短蛸寄生虫的DNA条形码，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1；用于检测长蛸寄生虫的DNA条形码，其核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

3.一种引物对，其特征在于，所述的引物对用于扩增权利要求2所述的DNA条形码。

4.如权利要求3所述的引物对，其特征在于，所述的引物对中的引物序列为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。

5.权利要求2所述的DNA条形码和/或权利要求3所述的引物对在制备用于检测章鱼寄生虫物种的制品中的应用。

6.一种用于鉴定章鱼寄生虫物种的制品，其特征在于，所述的制品是用于检测权利要求2所述的DNA条形码。

7.一种非疾病诊断治疗目的鉴定章鱼寄生虫物种的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：

1)提取章鱼寄生虫的DNA；

2)用如权利要求3所述的引物对对步骤1)提取的DNA进行PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳；

3)将扩增产物进行测序，得到测序结果；

4)对序列进行核酸序列比对分析，确定章鱼寄生虫的具体种类。

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