CN112501067A - 一株吡蚜酮降解菌iurm b56及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株吡蚜酮降解菌IURM B56及其应用，属于生物技术领域。实验证明，本发明的吡蚜酮降解菌IURM B56可以在以吡蚜酮为唯一碳源的环境中存活，具有很高的吡蚜酮降解活性，本发明所提供的吡蚜酮降解菌IURM B56可以应用于污染环境的吡蚜酮农药降解，在土壤污染处理和环境修复方面具有很好的应用价值。

Description

一株吡蚜酮降解菌IURM B56及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体为一株吡蚜酮降解菌IURM B56及其应用。

背景技术

我国是农业大国，随着社会经济和科学技术的发展，人们使用大量的农药来防御病虫害，提高农作物收成，增加经济收益。因此，农作物对农药的依赖性逐年增强，而在我国使用的1500多种农药当中，由于吡蚜酮对多种农作物的刺吸式的口器害虫(尤其是粉虱类害虫、蚜虫类害虫)表现出很好的防治效果，从而得到广泛应用。但随着这类农药的长期使用，在环境中不断蓄积，致使严重污染土壤、水体及大气环境，破坏生态系统的平衡，同时也影响了和农产品的食品安全和人畜健康等。因此，消除农药残留污染已经成为科研工作者亟待解决的社会科学问题。

目前，国内外对农药的去除方式有物理法、化学法、生化法和微生物降解法。在不同的降解方法中，微生物降解法是最重要、最清洁高效的方法之一。微生物因其种类多、分布广、繁殖快、易变异、生化适应能力强等特点，往往是污染物的最终降解途径。微生物修复是利用特定微生物体的代谢吸收、转化、清除或降解化学农药成分，实现环境净化、生态效应恢复的生物措施，具有高效经济、无二次污染等特点。在当前的技术条件下，已经被发现的可以用于降解农药残留的微生物包括真菌、细菌和放线菌，其多数可以在自然界的土壤中获取和培养。但是吡蚜酮的降解菌株很少有报道，分离和筛选吡蚜酮降解菌对消除环境中的吡蚜酮污染有着重大的现实意义，并且能够保证食品安全和净化生态环境。

发明内容

本发明的目的在于提供一株吡蚜酮降解菌，及其对土壤和水体中吡蚜酮降解等方面的应用。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一株吡蚜酮降解菌 IURMB56；其中吡蚜酮降解菌IURM B56已于2020年10月12日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo:20855，分类命名为肺炎克雷伯氏菌 (Klebsiella pneumoniae)。

上述吡蚜酮降解菌IURM B56，对被吡蚜酮污染的环境具有修复作用，尤其对被吡蚜酮污染的土壤环境，以及被吡蚜酮污染的水体，具有修复作用。

上述吡蚜酮降解菌IURM B56对土壤中的废弃吡蚜酮具有降解作用，对水体中所含的吡蚜酮具有降解作用，可直接应用于农田的净化处理领域。

上述的该吡蚜酮降解菌IURM B56的筛选方法，步骤如下：

1)从被吡蚜酮污染的污泥中称取泥土，加入吡蚜酮降解菌IURM B56筛选液体培养基进行富集，在35-40℃、150-200r/min恒温摇床中培养4-10天；

2)吸取步骤1中所得的培养基加入新的吡蚜酮降解菌IURM B56筛选液体培养基进行传代，如此传代3-6次；

3)取步骤2中所得菌液在LB平板上划线分离，得到吡蚜酮降解菌IURM B56；

其中吡蚜酮降解菌IURM B56筛选培养基成分为：每1L去离子水中含有吡蚜酮农药100mg/L,氯化铵0.66g，磷酸氢二钾(K₂HPO₄)1.5g，磷酸二氢钾 (KH₂PO₄)0.5g，硫酸镁(MgSO₄)0.1g，磷酸氢二钾(K₂HPO₄)1.5g，氯化钠0.35 g，pH 7.0-7.2；

LB固体培养基成分为：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，琼脂粉15g，以去离子水补足体积至1L。

上述吡蚜酮降解菌IURM B56的优选筛选方法，步骤如下：

1)从被吡蚜酮污染的污泥中称取泥土5g，加入100mL吡蚜酮降解菌IURM B56筛选液体培养基进行富集，在37℃、180r/min恒温摇床中培养5-7天；

2)吸取步骤1中所得的培养基3mL加入新的吡蚜酮降解菌IURM B56筛选液体培养基进行传代，如此传代4-5次；

3)取步骤2中所得菌液在LB平板上划线分离，得到吡蚜酮降解菌IURM B56；

上述吡蚜酮降解菌IURM B56的干粉剂，为用使用扩大培养后的吡蚜酮降解菌IURMB56，经过常规方法干燥而成。

所述吡蚜酮降解菌IURM B56是按照如下所述方法筛选获得：

一、从江苏常州武进区被吡蚜酮污染的污泥中称取泥土分离菌株

称取污泥5g，加入95mL吡蚜酮降解菌IURM B56筛选液体培养基进行富集，在37℃、180r/min恒温摇床中培养5-7天；然后吸取培养基加入新的吡蚜酮降解菌IURM B56筛选液体培养基进行传代，如此传代4-5次，在LB平板上划线分离，经过上百次分离试验筛选，最终得到一批能在以吡蚜酮作为唯一碳源的培养基中生存的菌种；

所述吡蚜酮降解菌IURM B56筛选培养基成分为：每1L去离子水中含有吡蚜酮农药100mg/L，氯化铵0.66g，磷酸氢二钾(K₂HPO₄)1.5g，磷酸二氢钾 (KH₂PO₄)0.5g，硫酸镁(MgSO₄)0.1g，磷酸氢二钾(K₂HPO₄)1.5g，氯化钠0.35g，pH 7.0-7.2；

所述LB固体培养基成分为：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，琼脂粉 15g，以去离子水补足体积至1L。

二、分析分离得到的不同菌种对培养基中吡蚜酮的降解效率，筛选获得吡蚜酮降解效果最佳的菌株。

具体测定方法如下：

1、培养基制备

基础盐培养基：NH₄Cl 0.66g，K₂HPO₄ 1.5g，KH₂PO₄ 0.5g，MgSO₄ 0.1 g，K₂HPO₄1.5g，NaCl 0.35g，pH 7.0-7.2；121℃灭菌20min。

LB液体培养基：酵母粉5g，氯化钠10g，蛋白胨10g，去离子水1000mL， pH 7.0，121℃灭菌20min。

2、吡蚜酮降解效率测定方法

2.1吡蚜酮标准曲线的绘制

取0.05g吡蚜酮标准品，用色谱乙腈溶解，定容至50mL容量瓶中，制成 1000mg/L的母液。再用色谱纯乙腈稀释母液，逐级配置10、20、40、50、60、 80和100mg/L浓度的系列标准溶液，利用高效液相色谱仪在波长298nm条件下，测定峰面积，作浓度-峰面积标准曲线。

2.2吡蚜酮降解率测定方法

取培养液，用高效液相色谱仪在波长298nm条件下，流动相为含甲醇/水/ 甲酸(100:900:2,v/v/v)的混合物以1.0mL/min流速输送洗脱。进样体积为20μL，柱温保持在40℃，测定峰面积。利用吡蚜酮标准曲线所建立的线性回归方程计算出吡蚜酮浓度，进一步计算得出吡蚜酮降解率。所有实验均设置三个重复。

2.3通过吡蚜酮降解菌IURM B56对吡蚜酮的降解率，得出最优菌种

将吡蚜酮降解菌IURM B56菌株在LB液体培养基中培养，离心收集菌体，用无菌水重悬，并稀释至OD₆₀₀＝1，将所选菌株接种1mL到100.0mL含100mg/L 吡蚜酮的基础液体无机盐培养基中，置于恒温摇床中180r/min、37℃培养，每 6小时取样测定降解率。

其中，筛选得到吡蚜酮降解菌IURM B56对吡蚜酮的降解效果明显，且菌株生长良好，其30h对吡蚜酮的降解率为92.58％。

2.4吡蚜酮降解菌IURM B56对废水中的废弃吡蚜酮的降解

将吡蚜酮降解菌IURM B56按1％的接种量接种于100mL灭菌的含吡蚜酮的废水中，经高效液相色谱仪测定该废水的吡蚜酮的含量为58mg/L，于37℃、 180r/min条件下培养30h，测定吡蚜酮降解率为71％。

2.5吡蚜酮降解菌IURM B56对土壤中的废弃吡蚜酮的降解

将吡蚜酮降解菌IURM B56按1％的接种量接种于100mL灭菌的土壤液中，经高效液相色谱仪测定，土壤中的吡蚜酮的含量为54mg/Kg，于37℃恒温条件下培养30h，测定吡蚜酮降解率为64.33％。

菌株鉴定

采用振荡破碎法获得吡蚜酮降解菌IURM B56基因组DNA，通过PCR方法对菌株16SrRNA基因进行扩增并送至上海捷瑞生物公司进行测序分析；用于扩增16S rRNA基因的上游引物序列为：5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3’，下游引物序列为5’GGTTACCTTGTTACGACTT 3’。

PCR反应条件是：98℃预变性5min，98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸40s，反应设置30个循环，10℃保温5min。使用NCBI的BLAST功能在 GeneBank数据库中进行序列比对，分析菌株的分类为：肺炎克雷伯氏菌 (Klebsiella pneumoniae)

吡蚜酮降解菌IURM B5616S rRNA基因序列见序列表。

本发明的有益效果为：

1.筛选出一株可以在吡蚜酮为唯一碳源的环境中存活的吡蚜酮降解菌IURM B56，经降解分析表明，该菌株可以在含100mg/L吡蚜酮筛选固体培养基和液体培养基中生长良好，具有很高的吡蚜酮降解特性。

2.该吡蚜酮降解菌IURM B56将在土壤中吡蚜酮降解、水体污染中吡蚜酮的降解、土壤中废弃吡蚜酮的降解和环境污染修复中具有应用前景。

3.本发明吡蚜酮降解菌IURM B56的应用，有利于避免因物理或化学方法降解吡蚜酮而造成的二次污染。

附图说明

图1为该吡蚜酮降解菌IURM B56单菌落形态图。

图2为将吡蚜酮降解菌IURM B56按1％的接种量接种于100mL的无菌 MSM中测得的吡蚜酮降解率。

图3为将吡蚜酮降解菌IURM B56按1％的接种量接种于100mL含吡蚜酮的废水中测得的吡蚜酮降解率。

图4为将吡蚜酮降解菌IURM B56按1％的接种量接种于100g灭菌的土壤中测得的吡蚜酮降解率。

具体实施方式

吡蚜酮降解菌IURM B56的筛选过程

(一)、主要材料

1、培养基

吡蚜酮筛选液体培养基成分：每1L去离子水中含有吡蚜酮农药100mg/L, 氯化铵0.66g，磷酸氢二钾(K₂HPO₄)1.5g，磷酸二氢钾(KH₂PO₄)0.5g，硫酸镁(MgSO₄)0.1g，磷酸氢二钾(K₂HPO₄)1.5g，氯化钠0.35g，pH 7.0-7.2；对应的固体培养基则在1L液体培养基中添加琼脂粉15g配制成。

每1L的LB液体培养基成分：蛋白胨10克，酵母粉5克，NaCl 10克，配制的液体培养基用HCl或者NaOH调节pH为7.0-7.2，然后再加入去离子水补足至1L。对应的LB固体培养基则在1L液体培养基中添加琼脂粉15g配制成。

2、仪器设备

FlexCycler PCR扩增仪、Tanon-3500凝胶成像系统、北京市六一仪器厂电泳仪、灭菌锅、英衡电子天平、UV1900紫外可见分光光度计、恒温培养箱、eppendorf 高速冷冻离心机、摇床、海尔低温冰箱。

(二)、吡蚜酮降解菌IURM B56的筛选过程

(1)从江苏常州武进区被吡蚜酮污染的污泥中称取泥土分离菌株，称取污泥5g，加入100mL吡蚜酮降解菌IURM B56筛选液体培养基进行富集，在37℃、 180r/min恒温摇床中培养5-7天；然后吸取培养基3mL加入新的吡蚜酮降解菌 IURM B56筛选液体培养基进行传代，如此传代4-5次，在LB平板上划线分离，经过上百次分离试验筛选，最终得到一批能在以吡蚜酮作为唯一碳源的培养基中生存的菌种；

所述吡蚜酮降解菌IURM B56筛选培养基成分为：每1L去离子水中含有吡蚜酮农药100mg/L,氯化铵0.66g，磷酸氢二钾(K₂HPO₄)1.5g，磷酸二氢钾 (KH₂PO₄)0.5g，硫酸镁(MgSO₄)0.1g，磷酸氢二钾(K₂HPO₄)1.5g，氯化钠0.35 g，pH 7.0-7.2；

所述LB固体培养基成分为：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，琼脂粉 15g，以去离子水补足体积至1L。

(2)将培养物在LB平板上划线分离，置于37℃恒温培养箱中培养12-26 小时，获得吡蚜酮降解菌IURM B56株IURM B56单菌落形态图(见图1)；

下面为具体实施例部分。

实施例1

将吡蚜酮降解菌IURM B56在LB液体培养基中培养，离心收集菌体，用无菌水重悬，并稀释至OD₆₀₀＝1，将所选菌株接种1mL至100mL含100.0mg/L 吡蚜酮的无机盐培养基中，置于恒温摇床中180r/min、37℃培养30h，吡蚜酮降解菌IURM B56有明显的生长，对吡蚜酮降解效率较高。

实施例2

将吡蚜酮降解菌IURM B56按1％的接种量接种于100mL的无菌MSM中，添加吡蚜酮至终浓度100mg/L，置于37℃、180r/min条件下培养30h，测定吡蚜酮降解率为92.58％(见图2)。

实施例3

将吡蚜酮降解菌IURM B56按1％的接种量接种于100mL含吡蚜酮的废水中，经测定该废水的吡蚜酮的含量为58mg/L，于37℃、180r/min条件下培养 30h，测定吡蚜酮降解率为71％(见图3)。

实施例4

将吡蚜酮降解菌IURM B56按1％的接种量接种于100g灭菌的土壤中，经测定，土壤中吡蚜酮的含量为54mg/Kg，于37℃恒温条件下培养30h，测定吡蚜酮降解率为64.33％(见图4)。

实施例5

吡蚜酮降解菌IURM B56干粉剂的制备，吡蚜酮降解菌IURM B56扩大培养后，经过常规方法干燥制得。

序列表

<110> 常州大学

江苏碧奥环保科技有限公司

河北慈心环保科技有限公司

<120> 一株吡蚜酮降解菌 IURM B56及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 599

<212> DNA

<213> 克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)

<400> 1

tctcgggtga cgagcggcgg acgggtgagt aatgtctggg aaactgcctg atggaggggg 60

ataactactg gaaacggtag ctaataccgc ataatgtcgc aagaccaaag tgggggacct 120

tcgggcctca tgccatcaga tgtgcccaga tgggattagc tagtaggtgg ggtaacggct 180

cacctaggcg acgatcccta gctggtctga gaggatgacc agccacactg gaactgagac 240

acggtccaga ctcctacggg aggcagcagt ggggaatatt gcacaatggg cgcaagcctg 300

atgcagccat gccgcgtgtg tgaagaaggc cttcgggttg taaagcactt tcagcgggga 360

ggaaggcgtt gaggttaata accttgtcga ttgacgttac ccgcagaaga agcaccggct 420

aactccgtgc cagcagccgc ggtaatacgg agggtgcaag cgttaatcgg aattactggg 480

cgtaaagcgc acgcaggcgg tctgtcaagt cggatgtgaa atccccgggc tcaacctggg 540

aactgcattc gaaactggca ggctagagtc ttgtagaggg gggtagaatt ccaggtgta 599

Claims (9)

1.一株吡蚜酮降解菌IURM B56，其特征在于，该吡蚜酮降解菌IURM B56为克雷伯氏菌，其中该吡蚜酮降解菌已于2020年10月12日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC NO.20855。

2.如权利要求1所述的吡蚜酮降解菌IURM B56的应用，其特征在于，所述吡蚜酮降解菌IURM B56对被吡蚜酮污染的环境具有修复作用。

3.如权利要求2所述的吡蚜酮降解菌IURM B56的应用，其特征在于，所述吡蚜酮降解菌IURM B56对土壤中被废弃的吡蚜酮污染的环境，具有修复作用。

4.如权利要求2所述的吡蚜酮降解菌IURM B56的应用，其特征在于，所述吡蚜酮降解菌IURM B56对被水体中的吡蚜酮污染的水环境，具有修复作用。

5.如权利要求1所述的吡蚜酮降解菌IURM B56的应用，其特征在于，所述吡蚜酮降解菌IURM B56对土壤中的废弃吡蚜酮具有降解作用。

6.如权利要求1所述的吡蚜酮降解菌IURM B56的应用，其特征在于，所述吡蚜酮降解菌IURM B56对水体中所含的吡蚜酮具有降解作用。

7.如权利要求1所述的该吡蚜酮降解菌IURM B56的筛选方法，其特征在于，步骤如下：

1）从使用过吡蚜酮农药的土壤中称取泥土，加入吡蚜酮降解菌IURM B56筛选液体培养基中进行富集，在35-40℃、150-200r/min恒温摇床中培养4-10天；

2）吸取步骤1中所得的培养物加入新的吡蚜酮降解菌IURM B56筛选液体培养基进行传代，如此传代3-6次；

3）取步骤2中所得的培养物在LB平板上划线分离，得到吡蚜酮降解菌IURM B56；

其中吡蚜酮降解菌IURM B56筛选培养基成分为：每1L去离子水中含有吡蚜酮农药100mg/L,氯化铵0.66g，磷酸氢二钾（K₂HPO₄）1.5 g，磷酸二氢钾(KH₂PO₄) 0.5g，硫酸镁（MgSO₄）0.1 g，磷酸氢二钾(K₂HPO₄) 1.5g，氯化钠0.35 g，pH 7.0-7.2；

LB固体培养基成分为：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，琼脂粉15g，pH 7.0-7.2，以去离子水补足体积至1L。

8.如权利要求7所述的该吡蚜酮降解菌IURM B56的筛选方法，其特征在于，步骤如下：

1）从被吡蚜酮污染的污泥中中称取泥土5克，加入100 mL吡蚜酮降解菌IURM B56筛选液体培养基进行富集，在37℃、180r/min恒温摇床中培养5-7天；

2）吸取步骤1中所得的培养物3 mL加入新的吡蚜酮降解菌IURM B56筛选液体培养基进行传代，如此传代4-5次；

3）取步骤2中所得的培养物在LB平板上划线分离，得到吡蚜酮降解菌IURM B56。

9.一株干粉剂，其特征在于，所述干粉剂采用了如权利要求1所述的吡蚜酮降解菌IURMB56，并经扩大培养后干燥而成。

Images